BRPI0115792B1 - sistema para separação de espermatozóides congelados/descongelados em populações portadoras de cromossomo-x e portadoras de cromossomo-y - Google Patents
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Abstract
"sistema para separação de espermatozóides congelados/descongelados em populações portadoras de cromossomo-x e portadoras de cromossomo-y". dispositivos, composições e métodos para manipulação, separação, armazenamento e utilização de espermatozóides (1) que podem ser obtidos de amostras de esperma préviamente congelado colhido de um mamífero macho. específicamente, técnicas para marcação uniforme (2) dna de espermatozóides mesmo quando obtidos de esperma préviamente congelado e técnicas de separação para separar e isolar espermatozóides mesmo quando obtidos de amostras de esperma préviamente congelado em populações portadoras de cromossomo x e populações portadoras de cromossomo y tendo alta pureza.
Description
RELATÓRIO DESCRITIVO
Patente de Invenção para SISTEMA PARA SEPARAÇÃO DE ESPERMATOZÓIDES CONGELADOS/DESCONGELADOS EM POPULAÇÕES PORTADORAS DE CROMOSSOMO-X E PORTADORAS DE CROMOSSOMO-Y”
A presente solicitação reivindica o reconhecimento de urna Patente Provisória US No. 60/253.787, depositada em 29 de Novembro de 2000 e de uma Patente Provisória US No. 60/253.785, depositada em 29 de Novembro de 2000 ambas associadas através de uma lista de referências.
I. CONSIDERAÇÕES TÉCNICAS
A invenção envolve a fixação uniforme de fluorocromo(s) ao DNA da célula de espermatozóides mamíferos (ou células espermáticas) permitindo que tais espermatozóides sejam separados em populações de alta pureza portando cromossomos-X e cromossomos-Y. Especificamente, métodos para a fixação uniforme de fluorocromo(s) ao DNA da célula de espermatozóides mamíferos contidos em sêmen congelado / descongelado. Além disso, a invenção envolve a apresentação de dispositivos, métodos e composições para a separação e o uso de populações de alta pureza de espermatozóides separados segundo portadores de cromossomo-X ou cromossomo-Y a partir do sêmen congelado e depois descongelado em processos envolvendo, mas limitadamente, inseminação artificial, inseminação cirúrgica, fertilização in vitro e técnicas de culturas embrionárias.
II. ANTECEDENTES
Pode-se coletar esperma de uma grande variedade de mamíferos e então separá-los em populações portadoras de cromossomo-X ou cromossomo-Y, com base na diferença do conteúdo do DNA. Em alguns métodos convencionais de separação de espermatozóides, o conteúdo do DNA do espermatozóide a ser separado pode ser marcado com fluorocromo(s) que por excitação emite(m) uma quantidade mensurável de fluorescência. Pelo fato do espermatozóide contendo cromossomo-X possuir uma maior quantidade de DNA do que o espermatozóide contendo cromossomo-Y, cada espermatozóide contendo cromossomo-X tem a capacidade de agregar uma maior quantidade de fluorocromo do que o espermatozóide contendo cromossomo-Y. A comparação da intensidade relativa da fluorescência emitida por excitação do fluorocromo permite o isolamento do espermatozóide contendo cromossomo-X do espermatozóide contendo cromossomo-Y, como foi descrito através da Patente US No. 5.135.759, incorporada ao presente relatório através de referência.
Ainda que durante muitos anos espermatozóides contendo cromossomo-X e espermatozóides contendo cromossomo-Y tenham sido diferenciados e separados através da diferença da fluorescência emitida e ainda que haja um grande mercado comercial para populações isoladas de espermatozóides contendo cromossomo-X e espermatozóides contendo cromossomo-Y, ainda restam importantes problemas a serem resolvidos.
Um importante problema envolvendo métodos convencionais de separação de espermatozóides contendo cromossomo-X e espermatozóide contendo cromossomo-Y, é o de que cada população resultante contenha um número significativo de espermatozóides incorretamente separados e pertencentes à outra população. Esse problema de diferenciação entre espermatozóides pode, em parte, ser atribuído à perda da uniformidade da quantidade de fluorocromo ligado ao DNA do espermatozóide. Assim, é produzido um intervalo da quantidade de fluorocromo ligado ao espermatozóide contendo cromossomo-X e um outro intervalo da quantidade de fluorocromo ligado ao espermatozóide contendo cromossomo-Y. Quando esses dois intervalos de quantidade de fluorocromo se superpõem, ou possuam valores semelhantes, pode ser difícil, ou mesmo impossível classificar individualmente espermatozóides como pertencentes à uma ou outra população com algum grau de certeza e podem mesmo ocorrer contaminação das populações.
Esse problema particular pode ser intensificado observando-se espermatozóides obtidos de congelamento e subseqüente descongelamento do sêmen de mamíferos. A pureza média de uma população de espermatozóides separados contendo cromossomo-Y derivada de sêmen congelado e depois descongelado pode ser de 85% ou menos. A pureza média de uma população de espermatozóides separados contendo cromossomo-X derivada de sêmen congelado e depois descongelado pode ser de 82% ou menos.
Outro problema significativo associado com a marcação do DNA espermático é que isso pode influir em detrimento das taxas de fertilização e do subseqüente desenvolvimento embrionário do(s) oócito(s) (oócito, oótide ou óvulo ou uma pluralidade do mesmo, conforme deva ser apropriado a uma específica aplicação). Um aspecto desse problema é o de que a quantidade de marcador ligada ao DNA pode afetar a fecundidade do espermatozóide resultando em baixas taxas de fertilização. Outro aspecto desse problema pode ser que a quantidade de tempo que decorre durante a marcação do DNA pode afetar a fecundidade do esperma resultando em baixas taxas de fertilização. Outro aspecto desse problema pode ser que a quantidade de tempo decorrido durante a marcação do DNA pode decrescer a subseqüente taxa de divisão dos ovos fertilizados com o correspondente espermatozóide marcado. Um declínio de 20% nas taxas de divisão foi observado nos oócitos quando o tempo de marcação requer 190 minutos comparados aos oócitos cujo tempo de marcação requer 60 minutos. Outro aspecto desse problema é o de que a percentagem de oócitos fertilizados com espermatozóides marcados que prosseguem na formação da blástula pode ser mais baixa, coforme descrita num artigo de revista intitulado “In-vitro Fertilization With Flow Cytometrically-Sorted Bovine Sperm”, Theriogenology, 52, 1393-1405 (1999), incorporado ao presente relatório através de referência.
Outro problema significativo é o de que esperma criogênicamente conservado pode demonstrar maior capacidade (de fecundação) e que o intervalo de tempo de sobrevivência de tais espermatozóides pode ser reduzido. Dessa forma, se espermatozóides préviamente congelados são separados em populações portadoras de cromossomo-X e populações portadoras de cromossomo-Y sendo subseqüentemente usados para diferentes empregos tais como: fertilização in vitro, inseminação artificial, ou outra, então os processos rotineiros de marcação devem ser abreviados de modo a manter um número razoável de células espermáticas ainda úteis.
Com relação aos problemas de marcação uniforme de espermatozóides, mesmo quando os espermatozóides são obtidos de sêmen congelado e depois descongelado mantendo útil o esperma, separando populações portadoras de cromossomo-X e populações portadoras de cromossomo-Y, mesmo quando os espermatozóides sob separação são obtidos de sêmen previamente congelado, gerando populações portadoras de cromossomo-X e populações portadoras de cromossomo-Y apresentando alta pureza e em seguida usando os espermatozóides separados para inseminação artificial, inseminação sirúrgica e técnicas de fertilização in vitro, pode-se compreender que haja problemas significativos com a tecnologia convencional para a qual está direcionada a presente invenção.
III. REVELAÇÃO DA INVENÇÃO
O amplo objetivo da realização da invenção é o de fornecer tecnologia de marcação do DNA que permita que quantidades substancialmente uniformes de fluorocromo sejam ligadas ao DNA de todos os indivíduos espermatozóides portadores de cromossomo-X e quantidades substancialmente uniformes de fluorocromo sejam ligadas ao DNA de todos os indivíduos espermatozóides portadores de cromossomo-Y numa certa quantidade de sêmen.
Um aspecto desse amplo objetivo da invenção é o de estreitar o intervalo de intensidade da fluorescência emitida de cada população de espermatozóides portadores de cromossomo-X e de espermatozóides portadores de cromossomo-Y quando passam através de uma fonte de excitação do fluorocromo.
Um outro aspecto desse amplo objetivo da invenção é o de incrementar a diferença entre os valores médios de intensidade de fluorescência emitidos por cada uma das populações de espermatozóides portadores de cromossomo-X e de espermatozóides portadores de cromossomo-Y quando passam através de uma fonte de excitação do fluorocromo.
Um outro aspecto desse amplo objetivo da invenção é o de decrescer o número de espermatozóides erradamente considerados como pertencentes a cada uma das populações de espermatozóides portadores de cromossomo-X e de espermatozóides portadores de cromossomo-Y.
Um outro aspecto desse amplo objetivo da invenção é o de gerar populações separadas de espermatozóides portadores de cromossomo-X e de espermatozóides portadores de cromossomo-Y tendo pureza maior do que 85% ou maior do que 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou mesmo 99% pura.
Um outro amplo objetivo da realização da invenção é o de permitir a utilização da genética de uma forma mais ampla. Em vez de estar limitada à genética de indivíduos de espécies de mamíferos para as quais há disponibilidades de técnicas de separação ou seleção de espermas, a genética representando uma grande variedade de indivíduos de numerosas espécies pode ser transportada à distância como sêmen congeldo através de técnicas disponíveis para subseqüente separação de populações portadoras de cromossomo-X e cromossomo-Y. Estas espécies de mamíferos podem incluir, embora não limitadamente, primatas, tais como: cipanzés, gorilas, ou similares, mamíferos marinhos tais como baleias, botos, ou similares, bovinos, ovinos, suínos, canídeos, felinos ou eqüinos, como poucos exemplos. Pode também incluir atributos genéticos que sejam considerados raros porque as espécies de mamíferos podem estar ameaçadas ou pouco numerosas, ou consideradas raras porque o indivíduo tenha desejados atributos morfológicos, fisiológicos ou intelectuais.
Outro amplo objetivo da realização da invenção é de que pode disponibilizar tecnologia de separação para diferenciação entre espermatozóides portadores de cromossomo-X e portadores de cromossomo-Y obtidos de sêmen congelado e depois descongelado.
Outro objetivo da realização da invenção é o de disponibilizar tecnologia de marcação de DNA para marcação mais uniforme de espermatozóides contidos em sêmen congelado e depois descongelado para melhorar a resolução aparente entre espermatozóides portadores de cromossomoX e portadores de cromossomo-Y.
Outro objetivo da realização da invenção é o de disponibilizar amostras com alta pureza para inseminação artificial preparadas a partir de espermatozóides provenientes de sêmen congelado e depois descongelado.
Outro objetivo da realização da invenção é o de disponibilizar amostras de baixa dose com alta pureza para inseminação artificial preparadas a partir de espermatozóides separados provenientes de sêmen congelado e depois descongelado.
Outro objetivo da realização da invenção é o de disponibilizar amostras de alta pureza para procedimentos de inseminação cirúrgical preparadas a partir de espermatozóides separados provenientes de sêmen congelado e depois descongelado.
Outro objetivo da realização da invenção é o de disponibilizar amostras de alta pureza para procedimentos de fertilização in vitro preparadas a partir de espermatozóides separados provenientes de sêmen congelado e depois descongelado.
Outro objetivo da realização da invenção é o de disponibilizar amostras de alta pureza para procedimentos de fertilização in vitro preparadas a partir de espermatozóides separados provenientes de sêmen congelado e depois descongelado.
Outro objetivo da realização da invenção é o de disponibilizar tecnologias para marcação e separação de espermatozóides provenientes de esperma congelado e depois descongelado em populações portadoras de cromossomo-X e populações portadoras de cromossomo-Y.amostras de alta pureza para procedimentos de fertilização in vitro de oócito(s) não em detrimento das taxas de divisão celular ou desenvolvimento embrionário.
Naturalmente outros objetivos da invenção serão revelados através de outras áreas de especificação.
IV BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A Figura 1 mostra uma particular realização da invençãopara marcação de DNA de espermatozóides contidos em sêmen congelado e depois descongelado.
A Figura 2 mostra uma particular realização da invenção para a separação de espermatozóides provenientes de sêmen congelado e depois descongelado em espermatozóides portadores de cromossomo-X e portadores de cromossomo-Y.
A Figura 3 mostra uma outra visão de uma particular realização da invenção para a separação de espermatozóides provenientes de sêmen congelado e depois descongelado em espermatozóides portadores de cromossomo-X e portadores de cromossomo-Y.
V. MANEIRA(S) DE COLOCAR EM PRÁTICA A INVENÇÃO
Para separar rotineiramente espermatozóides (vivos, mortosconservados, disponíveis para fecundação, não disponíveis para fecundação ou núcleos) em amostras de alta pureza de portadores de cromossomo-X e portadores de cromossomo-Y deve-se dispor de suficiente resolução para distinção entre espermatozóides portadores de cromossomo-X e portadores de cromossomo-Y tal que o(s) processo(s) de separação ou seleção possa(m) ser executado(s) sem substancial intercontaminação.
A resolução ou a diferenciação de espermatozóides pode ser baseada na determinação precisa da diferença na emissão fluorescente da quantidade de fluorocromo ligado ao DNA interior ao espermatozóide portador de cromossomo-X, por excitação e a emissão fluorescente da quantidade de fluorocromo ligado ao DNA interior ao espermatozóide portador de cromossomoY, por excitação. A separação de espermatozóides portadores de cromossomo-X e portadores de cromossomo-Y com base nessa diferença mensurável pode então, ser obtida através de um número de diferentes métodos tais como: medida de fluxo celular, cromatografia de líquido, eletroforese de gel e outras tecnologias que, de forma similar, comparam a relativa intensidade da luminescência para permitir diferenciação entre espermatozóides portadores de cromossomo-X e espermatozóides portadores de cromossomo-Y.
Sistemas separadores de espermatozóides podem apresentar problemas de diferenciação entre a emissão fluorescente gerada pelo fluorocromo ligado ao DNA dos espermatozóides portadores de cromossomo-X e a a emissão fluorescente gerada pelo fluorocromo ligado ao DNA dos espermatozóides portadores de cromossomo-Y por excitação, quando a quantidade de fluorocromo ligado ao DNA do indivíduo espermatozóide não é consistente com as respectivas populações de portadores de cromossomo-X e portadores de cromossomo-Y. Essas dificuldades de diferenciação entre a quantidade de emissão de fluorescência gerada pelo(s) fluorocromo(s) aumentam quando os espermatozóides são obtidos de esperma congelado e depois descongelado marcados por técnicas convencionais.
O erro de marcação do DNA do espermatozóide pode gerar uma larga extensão de espécies fluorescentes para ambas as populações de espermatozóides portadores de cromossomo-X e portadores de cromossomo-Y.
O decréscimo da resolução torna mais difícil a separação de espermatozóides portadores de cromossomo-X e espermatozóides portadores de cromossomo-Y e resulta em intercontaminação entre as populações tendo como conseqüência uma baixa pureza nas amostras de espermatozóides separados.
Particulares realizações da invenção disponibilizam tecnologia para marcar o DNA de espermatozóides vivos e ativos ou o DNA do espermatozóide de sêmen sucessivamante congelado e descongelado para permitir incrementação na resolução da distinção entre espermatozóides portadores de cromossomo-X e portadores de cromossomo-Y resultando em células espermáticas de alta pureza de populações portadoras de cromossomo-X e populações de alta pureza de portadoras de cromossomo-Y. Como tal, fica entendido que o termo alta pureza significa grande resolução na distinção entre espermatozóides portadores de cromossomo-X e portadores de cromossomo-Y, comparada com tecnologias convencionais de marcação para uma dada aplicação. Alta pureza pode também significar menor intercontaminação entre as populações separadas, quando comparadas com tecnologias convencionais de separação.
Por exemplo, em particulares realizações da invenção de medidas de fluxo celular, alta pureza para marcar espermatozóides vivos obtidos de congelamento e subseqüente descongelamento podem significar populações portadoras de cromossomo-X e portadoras de cromossomo-Y selecionadas em média com pureza maior do que aproximadamente 85%. Entretanto, se esperma vivo e útil (para fecundação) ou núcleos de esperma são selecionados com alta pureza isto significa populações em média portadoras de cromossomo-X e portadoras de cromossomo-Y tendo pureza maior do que aproximadamente 90%. Como pode ser compreendida, a definição de alta pureza é contextual, envolvendo a comparação dos resultados obtidos através de cada realização da invenção com os resultados obtidos quando da utilização de (outras) tecnologias para cada particular aplicação. No contexto de marcação de espermatozóides congelado e depois descongelado, comparamos o previamente mencionado DNA pobremente marcado, com populações médias de alta pureza de espermatozóides isolados maiores do que 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% com DNA portando um dos dois, cromossomo-X ou cromossomo-Y.
Realizações da invenção podem incluir espermatozóides colhidos de numerosas espécies de machos mamíferos. A invenção deve ser entendida como não limitada a machos de espécies descritas através dos exemplos específicos de aplicação. Além disso, os exemplos específicos de aplicação são entendidos como ilustrativos da variedade de numerosas espécies de machos de mamíferos dos quais sêmen pode ser colhido e utilizado em certas realizações da invenção. Realizações da invenção podem incluir, por exemplo, os espermatozóides de animais com valor comercial, para (extração) de carne ou produção leiteira tais como: suínos, ovinos, bovinos, eqüinos búfalo, ou similares (naturalmente os mamíferos usados como carne ou produção leiteira podem variar segundo diferentes culturas). Pode também incluir os espermatozóides de várias espécies de mamíferos domésticos abrangendo caninos e felinos. Pode também incluir espermatozóides de indivíduos de várias espécies de mamíferos que tenham atributo(s) incomuns, tais como características morfológicas incluindo peso, tamanho ou conformação, ou outras desejadas características tais como: rapidez, agilidade, intelecto ou similares. Pode também incluir espermatozóides de primatas, incluindo, mas não limitadamente, chipanzés ou gorilas e espermatozóides de mamíferos marinhos tais como baleias e golfinhos. Pode também incluir espermatozóides congelados e depois descongelados de todas as várias espécies de mamíferos acima descritas e além disso incluir, mas não limitadamente, espermatozóides de doadores falecidos de mamíferos exóticos ou raros, espécimes zoológicas ou espécies ameaçadas (de extinção).
Agora fazendo referência principalmente à Figura 1, particulares realizações da invenção podem incluir sêmens contendo espermatozóides (1) colhidos de um macho mamífero, incluindo, mas não limitadamente, conforme acima descrito. Os espermatozóides podem ser incubados numa concentração de marcação de Hoechst 33342 (2) maior do que mais ou menos 40 μΜ a uma temperatura entre mais ou menos 30° Centígrados e mais ou menos 40°
Centígrados para uma duração de tempo entre 50 minutos e 200 minutos para marcar o DNA dos espermatozóides com suficiente uniformidade de forma a permitir que os espermatozóides portadores de cromossomo-X sejam diferenciados dos espermatozóides portadores de cromossomo-Y com base na intensidade da fluorescência a uma razão maior do que mais ou menos 85%.
A concentração de marcação de Hoechst 33342 entre 40 μΜ e 2500 μΜ, temperatura entre 30° Centígrados e mais ou menos 40° Centígrados, e a duração do tempo entre 50 minutos e 200 minutos pode ser selecionada para ajustar a pureza das populações portadoras de cromossomo-X e portadoras de cromossomo-Y ou pode ser selecionada para se promover taxas de divisão e desenvolvimento embrionário, como será discutido abaixo.
Por exemplo, quando se marca DNA de espermatozóide de certas espécies de bovinos a concentração de Hoechst 33342 pode ser incrementada para entre mais ou menos 200 μΜ e mais ou menos 2500μΜ, incubada durante um período de tempo entre mais ou menos 60 minutos e mais ou menos 190 minutos a uma temperatura de mais ou menos 37° Centígrados. Especificamente, com relação a certos espermatozóides bovinos congelados e depois descongelados, a marcação Hoechst 33342 pode ser ajustada para estabelecer uma concentração de 2240μΜ e então encubada por mais ou menos 60 minutos a mais ou menos 39° Centígrados.
Com respeito a taxas de divisão de oócitos inseminados com células espermáticas de mamíferos tratados de acordo com a invenção, o acréscimo da concentração de marcação até pelo menos 2240μΜ não aparenta ter um efeito de decrescimento na divisão ou no desenvolvimento embrionário. Mais altas concentrações de marcação podem realmente apresentar benefícios com respeito a certas realizações da invenção porque a duração do tempo de incubação pode ser diminuída melhorando a percentagem da divisão ou da formação do blastocisto. De uma aplicação à outra, a concentração de Hoechst 33342, a duração do tempo de incubação, ou ambos, podem ser ajustados para a obtenção de máxima taxa de divisão e formação do blastocisto, se desejado.
Agora fazendo referência às Figuras 2 e 3, realizações da invenção de medida de fluxo celular podem incluir uma fonte de célula (3) que age para estabelecer ou prover espermatozóides marcados (frescos, préviamente congelados e descongelados, núcleos de esperma, ou similares) para serem analisados através de medida de fluxo celular. As células são depositadas no interior de um esguicho (4) de modo tal que as células espermáticas marcadas são cercadas por um envoltório flúido (5). O envoltório flúido (5) é usualmente abastecido por uma fonte de envoltório flúido (5) tal que à medida que a fonte de células (3) fornece células espermáticas, o envoltório flúido (5) é concorrentemente alimentado através do esguicho (4). Dessa forma, o envoltório flúido forma um ambiente flúido para as células espermáticas. Como os vários flúidos são fornecidos ao medidor de fluxo celular a alguma pressão, estes fluem para fora do esguicho saindo por orifício do próprio esguicho. Usando uma espécie de oscilador (8), que é muito bem controlado através do controlador (9), ondas de pressão podem ser estabelecidas dentro do esguicho (4) e transmitidas ao flúido que sai do esguicho (4) através do seu orifício (7). Como o oscilador (9) age sobre o envoltório flúido (5) uma corrente (10) sai pelo orifício do esguicho (7) formando regularmente gotas (11). Como as células espermáticas são, pelo menos parcialmente, envoltas pelo ambiente do envoltório flúido, as gotas (11) podem conter no seu interior células espermáticas isoladas individualmente.
Como as gotas (11) geralmente contêm células espermáticas individuais isoladas, o medidor de fluxo celular pode distinguir e separar gotículas com base na intensidade da fluorescência emitida pelo fluorocromo ligado ao DNA do espermatozóide, Isso é realizado através de um sistema de sensoriamento celular (12). Tal sistema de sensoriamento celular envolve pelo menos algum tipo de sensor (13) que responde à intensidade da fluorescência emitida por cada célula espermática contida no interior de cada gota (11). O sistema de sensoriamento celular (13) pode causar um efeito dependendo da relativa presença ou da relativa ausência da fluorescência emitida pelo fluorocromo ligado sob excitação por algum estimulante tal como um laser excitador (14). Como cada espermatozóide pode ser marcado pelo fluorocromo, tal como Hoechst 33342, conforme descrito acima, diferentes quantidades de DNA contendo cromossomo-X e cromossomo-Y causa diferentes quantidades de marcador a se ligar. Então, através da sensibilidade ao grau de fluorescência emitida pelo fluorocromo sob excitação é possível a discriminação entre espermatozóides portadores de cromossomo-X e espermatozóides portadores de cromossomo-Y através de seus diferentes níveis de emissão.
De forma a obter separação e isolamento de células espermáticas apropriadas, os sinais recebidos pelo sensor (14) são usados para alimentar algum tipo de sistema discriminador e selecionador (15) que muito rapidamente toma a decisão de diferenciação podendo carregar diferentemente cada gota (11), com base no que foi decidido, se determinada célula espermática deve ou não existir dentro da gota (11). Dessa forma,o sistema de separação ou discriminação (15) age no sentido de permitir através de placas de deflexão eletrostática (16) o desvio das gotas (11) com base no fato de que elas contenham ou não a célula espermática apropriada. Como resultado, o medidor de fluxo celular age para selecionar células causando suas quedas em um ou mais reservatórios coletores (17). Então, através do sensoramento de alguma propriedade das células espermáticas (tal como a intensidade da fluorescência), o medidor de fluxo celular pode disticriminar células espermáticas com base em particular característica e coloca-las no coletor ou reservatório apropriado (17). Em perticulares realizações da invenção usando medidor de fluxo celular para selecionar espermatozóides, as gotículas contendo células espermáticas com portadores de cromossomo-X são carregadas positivamente, e, então, defletidas em uma determinada direção e as gotículas contendo células espermáticas com portadores de cromossomo-Y são carregadas negativamente e então defletidas em outra direção. O fluxo descartável (contendo células espermáticas não selecionadas) permanece descarregado e então pode ser colhido numa corrente não defletida num tubo de sucção ou similar.
Agora, fazendo referência principalmente à Figura 3, o esguicho (4) emite uma corrente (10) que, por causa do oscilador (8) (não mostrado na Figura 3) forma gotas (11). Como a fonte de células espermáticas (3) (não mostrada na Figura 3) é capaz de fornecer células espermáticas (1) que podem ser marcadas de acordo com a invenção descrita acima, a emissão de luz do fluorocromo ligado, excitado por um laser excitador (13), podem ser diferencialmente determinadas pelo sensor (14) de modo que a existência ou não da carga em cada gota (11), quando estas são separadas na corrente (10), pode ser controlada pelo medidor de fluxo celular. Esse controle resulta em em gotas positivamente carregadas, negativamente carregadas ou neutras (8) dependendo da célula espermática contida no interior de cada gota (11). Como é mostrado na Figura 3, certas gotas são assinaladas como defletidas (18). Essa gotas defletidas são as que contêm espermatozóide diferenciado por portar um cromossomo-X ou um cromossomoY. Os espermatozóides separados são então isolados em uma apropriada coleção de elementos ou num reservatório (17) para uso posterior.
Realizações da invenção podem incluir gotículas (11) cada uma contendo uma célula espermática (15) portando um cromossomo-X ou um cromossomo-Y. Gotículas contendo células espermáticas portando cromossomoX podem ser isoladas em reservatório(s) (17) numa taxa de pelo menos 1000 por segundo ou a uma taxa maior do que mais ou menos 1000 por segundo, tal como 2000 por segundo, 3000 por segundo, 4000 por segundo, 5000 por segundo ou mais alta. Similarmente, células espermáticas portando cromossomo-Y podem ser isoladas numa taxa de pelo menos 1000 por segundo ou a uma taxa maior do que mais ou menos 1000 por segundo, tal como 2000 por segundo, 3000 por segundo, 4000 por segundo, 5000 por segundo ou mais alta. Em algumas realizações da invenção, gotículas contendo células espermáticas portando cromossomo-X e gotículas contendo células espermáticas portando cromossomo-Y são simultaneamente separadas e isoladas em reservatórios cada um a uma razão de pelo menos 1000 por segundo ou maior do que 1000 por segundo tal como 2000 por segundo, 3000 por segundo, 4000 por segundo, 5000 por segundo ou mesmo mais altas taxas.
Realizações da invenção podem também incluir amostras de inseminação artificial preparadas a partir de células espermáticas colhidas de machos de mamíferos (que podem ser congeladas e descongeladas dependendo de algumas realizações da invenção) que são então marcadas e separadas de acordo com as realizações da invenção acima descritas. As amostras de inseminação podem então ser utilizadas em procedimentos de inseminação artificial. Por exemplo, uma amostra de inseminação artificial de um bovino preparada com espermatozóides separados de acordo com a invenção pode conter menos do que x 106 espermatozóides úteis contidos dentro de um tubinho. Amostras de inseminação artificial de pequena dose para inseminação artificial de bovinos podem conter quantidades tão pequenas como 1-3 x 106 espermatozóides úteis, ou mesmo tão pequenas como 150.000 espermatozóides, conforme descrita no Pedido de Patente US 09/001.394 ou o no Registro de Patente PCT US 98/27909, incorporadas, por referência, ao presente relatório. Amostras de inseminação artificial apresentando um número regular ou uma baixa dose de células espermáticas podem ser usadas em programas de reprodução de animais como os descritos nos Registros de Patente US 60/224.050 e 60/21.093, ambos incorporados por referência ao presente relatório. Amostras de inseminação artificial contendo espermatozódes congelados e descongelados, marcados e separados segundo a invenção, podem ser também utilizadas em associação com programas sincronizados de reprodução de animais usando animais superovulados conforme descritos no Registro de Patente US 09/001.454, incorporado, por referência, ao presente relatório. Naturalmente, para células espermáticas que se encontrem no limite de utilidade em conseqüência da morte do macho mamífero ou quando o macho mamífero é raro ou animal exótico, uma amostra de inseminação artificial preparada de acordo com a invenção pode conter mesmo ainda menos espermatozóides.
O número de espermatozóides úteis que são marcados, separados e isolados em populações portadoras de cromossomo-X ou portadoras de cromossomo-Y, conforme a invenção, que são usados numa amostra de inseminação artificial pode variar segundo a espécie de mamífero a ser artificialmente inseminada. Por exemplo, amostras de inseminação artificial de equinos preparadas de espermatozóides separados podem exigir um número mais alto de espermatozóides úteis separados relativo ao de bovinos, como descrito no Registro de Patente PCT US 99/17165, incorporado por referência ao presente relatório. Uma realização de uma amostra de inseminação de eqüino pode, por exemplo, conter entre mais ou menos de quarenta milhões a mais ou menos cem milhões de espermatozóides.
Em certas realizações da invenção, as amostras contendo espermatozóides separados colhidos de um macho mamífero ou obtidos de esperma congelado e depois descongelado podem ser embaladas para uso em procedimentos de inseminação cirúrgica.
Células espermáticas marcadas, separadas ou isoladas, de acordo com a invenção podem também ser usadas para fertilizar oócito(s) in vitro (IVF). Uma atraente característica do IVF pode ser o fato de que são necessários menos espermas separados do que para uma inseminação artificial. Pode ser desejável o uso da menor quantidade possível de esperma, especialmente se o macho animal está morto, é raro ou exótico ou se os espermatozóides são marcados e separados de acordo com várias realizações da invenção. Também, disponibilidade comercial de células espermáticas separadas em populações portadores de cromossomo-X ou de cromossomo-Y, especialmente quando o macho mamífero está localizado à distância da fêmea, é exótico, raro ou possui atributos desejáveis provavelmente resultará numa grande expansão do uso de IVF em programas de reprodução. Certas realizações da invenção podem incluir dispositivos e metodologias para o uso de espermatozóides separados incluindo, mas não limitadamente, células espermáticas préviamente congeladas e descongeladas no que se refere a fertilização de oócitos in vitro, maturação de oócito in vitro, ou cultura de zigotos in vitro, tal como as descritas no artigo de Lu, K.H., Cran D.G., and Seidel, G. E., In-vitro Fertilization With Flow Cytometrically-Sorted Bovine Sperm, Theriogenology, 52, 1393-1405 (1999), incorporado ao presente relatório através de referência.
Certas realizações da invenção envolvendo a produção ou a geração de embriões de mamíferos podem incluir coleta de sêmen (1) de um macho mamífero ou obtenção de sêmen ou espermatozóides (1) préviamente congelados. Segundo realizações da invenção descritas acima, o sêmen é combinado com marcação de Hoechst 33342 (2) para estabelecer uma concentração entre 40 μΜ e 2500 μΜ. As células espermáticas são incubadas com marcação Hoechst 33342 (2) a uma temperatura entre mais ou menos 30° Centígrados e mais ou menos 40° Centígrados com duração entre mais ou menos 50 minutos e mais ou menos 200 minutos. As células espermáticas marcadas podem ser separadas e isoladas em populações portadoras de cromossomo-X ou de cromossomo-Y, segundo realizações da invenção acima descritas ou através de outras técnicas de separação de células espermáticas que possam também diferenciar espermatozóides portadores de cromossomo-X ou cromossomo-Y com base na intensidade de fluorescência. As células espermáticas isoladas podem então ser usadas para fertilizar oócitos de uma fêmea mamífera da mesma espécie e, em alguns casos, de fêmeas mamíferas de diferentes espécies, in vitro.
Como um exemplo de uma aplicação de realizações da invenção envolvendo esperma congelado de touro em aplicações de IVF, amostras de esperma de dois touros foram marcadas a concentrações de Floechst 33342 de 224 μΜ ou 2,240 μΜ e os espermatozóides marcados foram então selecionados num medidor de fluxo celular a 1000 espermas/seg em 2% de citrato de gema de ovo. Espermatozóides foram inseminados a lxlO6/mL e os embriões foram cultivados no sistema mSOF descrito por Tervit H.R. et al., Successful Culture In-Vitro of Sheep and Cattle Ova, J. Reprod. Fertil., 30:493-497 (1992), incorporado ao presente relatório através de referência.
Três réplicas foram realizadas para o touro 1 e uma réplica para o touro 2 (Tabela 1).
Tabela 1. Efeito da concentração da marcação na divisão e taxas de desenvolvimento de oócitos inseminados com espermatozóides marcados e separados de sêmen congelado e depois descongelado.
| No. | Cone. | Tempo de | No. de | % divisão | 0/ /0 | |
| Touro | Ejaculação | Hoechst | marcação | oócitos | blastocistos/ | |
| 33342 | requerido | oócitos | ||||
| (μΜ) | (min) | |||||
| 1 | 3 | 224 | 190 | 368 | 44a | 17 |
| 1 | 3 | 2240 | 60 | 373 | 60b | 23 |
| 2 | 1 | 224 | 190 | 86 | 23a | 0a |
| 2 | 1 | 2240 | 60 | 81 | 42b | 16b |
a b Percentagens correspondentes aos touros nas colunas com diferentes índices diferem de (P<0,025, χ2)
Conforme pode ser compreendido, pode demorar muito tempo para marcar esperma congelado e depois descongelado de tal forma que isso possa ser decidido durante a separação a uma concentração mais baixa do que a 10X a concentração de marcação. A diferença observada nas taxas de divisão entre duas concentrações de marcação pode ser mais provavelmente atribuída ao tempo de incubação alongado no mais baixo nível de marcação. Parece que um aumento de 10 vezes na concentração de marcação não tem efeito de diminuir nem a divisão e nem o desenvolvimento embrionário.
Como pode facilmente ser compreendido do que foi dito anteriormente, os conceitos básicos da presente invenção podem ser realizados por diversas formas. Ela envolve a marcação de espermatozóides, sejam espermatozóides frescos ou mesmo préviamente congelados e descongelados, técnicas de separação e isolamento que podem ser usadas com tais espermatozóides marcados, assim como dispositivos para executar a marcação, separação e isolamento de tais espermatozóides marcados em populações portadoras de cromossomo-X e cromossomo-Y. No presente pedido de patente, as técnicas de separação e marcação usadas para espermatozóides são reveladas como parte dos resultados mostrados e que podem ser atingidos através dos vários dispositivos e etapas descritos como inerentes à sua utilização. Eles são simplesmente os resultados naturais da utilização de dispositivos tais como concebidos e descritos. Além disso, enquanto alguns dispositivos são divulgados, compreende-se que eles não somente põem em prática alguns métodos que podem ser variados de diversas formas. Além de tudo o que foi dito, é importante que todos esses aspectos sejam bem compreendidos como satisfeitos pela revelação.
A discussão incluída nesse relatório de registro de depósito de patente PCT de invenção é para ser compreendida como uma descrição básica. O leitor deve estar ciente de que a discussão específica pode não descrever explicitamente todas as possíveis realizações da invenção e muitas alternativas estão implícitas. Pode não estar inteiramente definida a natureza genérica da invenção. Pode não estar explicitamente mostrado como cada característica ou elemento pode de fato ser uma representação da ampla função e da grande variedade de alternativas ou de elementos equivalentes. De novo, esses são implicitamente incluídos na presente revelação. Nos casos onde a invenção é descrita através de uma terminologia orientada para uma determinada função, cada aspecto dessa função é acompanhado de um dispositivo, subrotina ou programa. Reivindicações dos instrumentos não somente podem ser incluídas para os dispositivos descritos, como também reivindicações de métodos ou processos e os elementos para executar as funções previstas pela invenção. Entende-se que nem a descrição nem a terminologia possam limitar a abrangência das reivindicações a serem incluídas.
Além disso, cada um dos vários elementos da invenção e das reivindicações pode também ser atingido através de várias maneiras. A presente revelação pode ser entendida como capaz de envolver cada variação seja ela a variação de uma realização ou de um instrumento , um método ou processo, ou mesmo uma mera variação de algum desses elementos. Particularmente, entendese que como a revelação relaciona aos elementos da invenção, as denominações de cada elemento podem ser expressas por termos correspondentes a instrumentação e métodos equivalentes — mesmo se apenas a função ou o resultado é o mesmo. Tais termos, equivalentes, mais amplos, ou mesmo mais genéricos, devem ser considerados abrangidos na descrição ou na ação de cada elemento. Tais termos podem ser substituídos onde desejados, para tornar explícito o caráter implícito da abrangência para a qual a invenção é proposta. Como um exemplo a mais, deve ser entendido que todas as ações podem ser expressas como significando dizer ação ou como um elemento que a provoca. De modo semelhante, cada elemento físico revelado deve ser entendido como abrangendo a divulgação da ação que tal elemento efetua. Analisando esse último aspecto, como mais um exemplo, a revelação de um “classificador” deve ser enrtendida como abrangendo a revelação do ato de “classificar” - ainda que explicitamente discutido ou não - e, inversamente, tendo sido somente revelado o ato de “classificar”, tal revelação deve ser entendida como abrangendo a revelação de um “classificador” e ainda uma “capacidade de classificar”. Tais variações e termos alternativos devem ser entendidos estarem explicitamente incluídos na descrição. Também, as várias combinações e permutações de todos os elementos ou aplicações podem ser criados e apresentados. Tudo pode ser feito para otimizar a concepção ou o desempenho no caso de uma aplicação específica.
Quaisquer dispositivos legais, estatutos, regulamentos ou regras mencionadas no presente registro de patente, patentes, publicações ou outras 5 referências mencionadas nesse registro são pelo presente incorporadas através de referência. Especificamente: Registro Provisório de Patente No. US 60/253.787, depositado em 29 de Novembro de 2000 e Registro Provisório de Patente No. US 60/253.785, depositado em 29 de Novembro de 2000. são pelo presente incorporados através de referência.
Documentos de Patentes dos Estados Unidos
| DOCUMENTO NO. | DATA | NOME | CLASSE | SUB CLASSE | DATA DE DEPÓSITO |
| 32,350 | 02/10/87 | Bhattacharya | 11/22/74 | ||
| 3,687,806 | 08/29/72 | Van den Bovenkamp | 195 | 1.3 | 11/04/69 |
| 3,829,216 | 08/13/74 | Persidsky | 356 | 36 | 10/02/72 |
| 3,894,529 | 07/15/75 | Shrimpton | 128 | 1 R | 04/10/69 |
| 4,009,260 | 02/22/77 | Ericsson | 424 | 105 | 12/11/74 |
| 4,067,965 | 01/10/78 | Bhattacharya | 424 | 105 | 12/17/75 |
| 4,083,957 | 04/11/78 | Lang | 424 | 78 | 02/04/76 |
| 4,085,205 | 04/18/78 | Hancock | 424 | 105 | 01/24/77 |
| 4,092,229 | 05/30/78 | Bhattacharya | 204 | 180 R | 10/20/76 |
| 4,155,831 | 05/22/79 | Bhattacharya | 207 | 299 R | 02/23/78 |
| 4.191,749 | 03/04/80 | Bryant | 424 | 105 | 10/11/77 |
| 4,225,405 | 09/30/80 | Lawson | 204 | 180 R | 08/16/78 |
| 4,276,139 | 06/30/81 | Lawson | 204 | 180 R | 10/09/79 |
| 4,339,434 | 07/13/82 | Ericsson | 424 | 105 | 08/17/81 |
| 4,362,246 | 12/07/82 | Adair | 209 | 3.3 | 07/14/80 |
| 4,448,767 | 05/15/84 | Bryant | 424 | 85 | 02/15/80 |
| 4,474,875 | 10/02/84 | Shrimpton | 435 | 002 | 08/18/80 |
| 4,501,366 | 02/26/85 | Thompson | 209 | 556 | 12/14/82 |
| 4,511,661 | 04/16/85 | Goldberg | 436 | 503 | 12/30/83 |
| 4,605,558 | 08/12/86 | Shrimpton | 424 | 561 | 04/20/84 |
| 4,660,971 | 04/28/87 | Sage et al. | 356 | 39 | 05/03/84 |
| 4,680,258 | 07/14/87 | Hammerling et al | 435 | 7 | 08/09/83 |
| 4,673,288 | 06/16/87 | Thomas et al. | |||
| 4,683,195 | 07/28/97 | Mullis et al | |||
| 4,683,202 | 07/28/87 | Mullis | |||
| 4,698,142 | 10/06/87 | Muroi et al | 204 | 182.3 | 07/31/85 |
| 4,749,458 | 06/07/88 | Muroi et al | 204 | 182.3 | 03/02/87 |
| 4,790,653 | 12/13/88 | North, Jr. | |||
| 4,988,619 | 01/29/91 | Pinkel | 435 | 30 | 11/30/87 |
| 4,999,283 | 03/12/91 | Zavos et al | 435 | 2 | 08/18/89 |
| 5,021,244 | 06/04/91 | Spaulding | 424 | 561 | 05/12/89 |
| 5,055,393 | 10/08/91 | Kwoh et al | |||
| 5,135,759 | 08/04/92 | Johnson | 424 | 561 | 04/26/91 |
| 5,346,990 | 09/13/94 | Spaulding | 530 | 350 | 03/12/91 |
| 5,371,585 | 12/06/94 | Morgan et al. | 356 | 246 | 11/10/92 |
| 5,437,987 | 08/01/95 | Ten et al | |||
| 5,439,362 | 08/08/95 | Spaulding | 424 | 185.1 | 07/25/94 |
| 5,461,145 | 10/24/95 | Kudo et al | |||
| 5,466,572 | 11/14/95 | Sasaki et al. | 435 | 2 | 04/25/94 |
| 5,480,774 | |||||
| 5,483,469 | 01/09/96 | Van den Engh et al. | 364 | 555 | 08/02/93 |
| 5,494,795 | 2/27/96 | Guerry et al. | 435 | 6 | 5/5/93 |
| 5,503,994 | 04/02/96 | Shear et al. | 436 | 90 | 10/08/93 |
| 5,578,449 | 11/26/96 | Frasch et al. | 435 | 6 | 4/20/95 |
| 5,514,537 | 05/07/96 | Chandler | 435 | 002 | 11/28/94 |
| 5,589,457 | 12/31/96 | Wiltbank | 514 | 12 | 07-03-95 |
| 5,602,039 | 02/11/97 | Van den Engh | 436 | 164 | 10/14/94 |
| 5,602,349 | 02/11/97 | Van den Engh | 73 | 864.85 | 10/14/94 |
| 5,622,820 | 4/11/97 | Rossi | 435 | 5 | 11/3/94 |
| 5,641,457 | 03/09/99 | Tomiyama et al. | 250 | 207 | 06/16/97 |
| 5,643,796 | 07/01/97 | Van den Engh et al | 436 | 50 | 10/14/4 |
| 5,660,997 | 08/26/97 | Spaulding | 435 | 7.21 | 06/07/95 |
| 5,690,895 | 11/25/97 | Matsumoto et al. | 422 | 73 | 12/06/96 |
| 5,700,692 | 12/23/97 | Sweet | 436 | 50 | 09/27/94 |
| 5,726,364 | 03/10/98 | Van den Engh | 73 | 864.85 | 02/10/97 |
| 5,819,948 | 10/13/98 | Van den Engh | 209 | 158 | 08/21/97 |
| 5,876,942 | 3/2/99 | Cheng et al | 435 | 6 | 7/24/97 |
| 5,880,457 | 03/09/99 | Tomiyama et al. | 250 | 207 | 06/16/97 |
| 5,985,216 | 11/16/99 | Rens, et al. | 422 | 073 | 07/24/97 |
| 6,071,689 | 06/06/00 | Seidel et al. | 435 | 2 | 01/29/98 |
Documentos de Patentes Estrangeiras
| DOCUMENTO NO. | DATA | PAIS |
| WO 96/12171 | 10/13/95 | Estados Unidos |
| WO 98/34094 | 06/08/98 | NZ |
| WO 99/05504 | 07/24/98 | EUA |
| WO 99/33956 | 08/07/99 | EUA |
| WO 99/38883 | 05/08/99 | EUA |
| WO 99/42810 | 08/26/99 | EUA |
| WO 00/06193 | 10/02/00 | EUA |
Outros Documentos Citados como Referência
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| XP-002103478, File Biosis, one page. |
Além disso, para cada termo usado deve-se entender que, a menos que sua utilização no presente relatório seja inconsistente com tal interpretação, descrições de um dicionário comum poderiam ser entendidas como inerentes a cada termo, a todas as definições e a termos alternativos e sinônimos tais como contidos no “Random House Webster's Unabridged Dictionary” segunda edição, pelo presente incorporada ao relatório como referência. Entretanto, com relação a cada uma das considerações acima, na medida em que uma informação ou exposição incorporada através de referência seja considerada inconsistente com o privilégio da(s) invenção(ões) tal elemento é considerado expressamente como não solicitado pelo depositante.
Adicionbalmente, a menos que o contexto mereça outra interpretação, deve-se entender que o termo “contido” ou variações como “contém” ou “contendo”, são entendidas como implicando a inclusão de um elemento ou etapa de um grupo de elementos ou etapas isoladas. Tais termos devem ser interpretados na sua forma mais ampla de modo a proporcionar ao depositante do presente relatório a mais ampla cobertura legalmente permitida em países tais como a Austrália e outros.
Então, ao(s) depositante(s) é entendido ter garantia para reivindicar pelo menos: i) cada um dos processos de marcação, seperação, isolamento, inseminação ou fertilização como aqui revelados e descritos, ii) os métodos relacionados revelados e descritos, iii) variações similares, equivalentes ou mesmo implícitas de cada um desses dispositivos e métodos, iv) concepções alternativas que desempenhem cada uma das funções mostradas como as reveladas e descritas, v) concepções alternativas e métodos que desempenhem cada uma das funções mostradas são consideradas implícitas para desempenhar as funções reveladas e descritas, vi) cada característica, componente, e etapa mostradas como invenções independentes e separadas, vii) os pedidos reforçados pelos vários sistemas ou componentes revelados, viii) os produtos resultantes de tais sistemas ou componentes, ix) métodos e instrumentos tais como substancialmente descritos anteriormente no relatório e referênciados a qualquer um dos elementos que os acompanham, x) as várias combinações e permutações de cada um dos elementos revelados.
O conjunto de reivindicações que se segue no relatório é incorporado pelo presente como referência e como parte desta descrição da invenção. O depositante assegura-se expressamente ao direito de uso de todo ou parte do conteúdo incorporado, das reivindicações como descrição adicional para amparar qualquer outra ou todas as reivindicações, qualquer elemento ou componente delas, da descrição contida nas reivindicações ou vice-versa, como necessária para definir o conteúdo para o qual a proteção é pretendida pelo 5 presente registro ou por qualquer prolongamento, fracionamento, ou registro de prolongamento parcial do presente registro, para obter qualquer benefício dele, redução de taxas em conseqüência dele, para estar de acordo com as leis de patentes ou regulamentações de qualquer país ou tratado. Os conteúdos incorporados através de referência terão validade durante a pendência do presente 0 registro, inclusive qualquer subseqüente prolongamento, fracionamento ou prolongamento parcial dele ou qualquer reedição ou extensão dele.
Claims (57)
- REIVINDICAÇÕES1 - Método de marcação de células espermáticas coletadas de mamíferos, caracterizado por compreender as seguintes etapas:a) obtenção de sêmen congelado e descongelado de um mamífero não humano;b) incubação das células espermáticas contidas no interior do referido sêmen numa concentração de marcação de Hoechst 33342 maior do que 40 micro-molar;c) estabelecimento da temperatura na qual as referidas células espermáticas na referida concentração de marcação de Hoechst 33342 são incubadas entre 30° Centígrados e 40° Centígrados;d) ajuste da duração do tempo durante o qual as referidas células espermáticas são incubadas, numa referida concentração de marcação de Hoechst 33342, entre 50 e 200 minutos e;e) marcação uniforme do DNA das células espermáticas para permitir que células espermáticas portadoras de cromossomo X sejam diferenciadas de células espermáticas portadoras de cromossomo Y pela intensidade da fluorescência numa taxa maior do que 85%.
- 2 - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo referido macho mamífero não humano ser selecionado a partir de um grupo de mamíferos consistindo de: primatas, suínos, ovinos, bovinos, equinos, caninos, felinos e golfinhos.
- 3 - Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo referido macho compreender os referidos bovinos e a referida concentração de marcação de Hoechst 33342 estar entre 200 micro-molar e 2.500 micro-molar.
- 4 - Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelos referidos mamíferos compreenderem os referidos bovinos e pela referida concentração de marcação de Hoechst 33342 ser de 224 micro-molar.
- 5 - Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo referido macho mamífero não humano compreender o referido bovino e pela referida concentração de marcação de Hoechst 33342 ser de 2240 micro-molar.
- 6 - Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pela referida etapa de fixação da duração do tempo, na qual as referidas células espermáticas são incubadas com uma referida concentração de marcação de Hoechst 33342 entre 50 e 200 minutos, compreender o ajuste da referida duração do tempo no qual as referidas células espermáticas são incubadas com a referida concentração de marcação de Hoechst 33342 para 190 minutos.Petição 870170040080, de 12/06/2017, pág. 10/18
- 7 - Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pela referida etapa de fixação da duração do tempo, no qual as referidas células espermáticas são incubadas a uma referida concentração de marcação de Hoechst 33342 entre 50 e 200 minutos, compreender o ajuste da referida duração do tempo, no qual as referidas células são incubadas com a referida concentração de marcação de Hoechst 33342, para 60 minutos.
- 8 - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela referida etapa de marcação uniforme do DNA no interior da referida célula espermática para permitir que células espermáticas portadoras de cromossomo X sejam diferenciadas de células espermáticas portadoras de cromossomo Y baseado na intensidade da fluorescência numa razão selecionada do grupo consistindo de 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%.
- 9 - Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelas referidas células espermáticas portadoras de cromossomo X diferenciadas das referidas células espermáticas portadoras de cromossomo Y compreenderem células espermáticas úteis.
- 10 - Método de acordo com a reivindicação 1, 2, 6, 7, 8 ou 9, caracterizado por conter também a etapa de congelamento do referido sêmen.
- 11 - Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por conter também a etapa de descongelamento do referido sêmen.
- 12 - Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pela referida etapa de marcação uniforme do DNA no interior da referida célula espermática para permitir que células espermáticas portadoras de cromossomo X sejam diferenciadas de células espermáticas portadoras de cromossomo Y baseado na intensidade de fluorescência numa razão maior que 85% compreender a diferenciação da referida intensidade da fluorescência através de um medidor de fluxo celular.
- 13 - Método de marcação do DNA no interior de células espermáticas que foram congeladas e descongeladas, caracterizado por compreender as seguintes etapas:a) coleta do sêmen contido nas células espermáticas de um mamífero macho não humano;b) congelamento do referido sêmen contendo as referidas células espermáticas;c) descongelamento do referido sêmen contendo as referidas células espermáticas;d) combinação do processo congelamento e descongelamento com uma marcação de Hoechst 33342;Petição 870170040080, de 12/06/2017, pág. 11/18e) estabelecendo a concentração de marcação de Hoechst 33342 entre 200 micro-molar e 2.500 micro-molar;f) ajustando a temperatura de congelamento e descongelamento do referido sêmen na referida concentração de marcação de Hoechst 33342 entre 30° Centígrados e 40° Centígrados e,g) ajustando o tempo de congelamento e descongelamento do referido sêmen na referida concentração de marcação de Hoechst 33342 este incuba entre 50 minutos e 200 minutos, através do qual o DNA no interior das células espermáticas contidas no referido processo de congelamento e descongelamento são marcados uniformemente para permitir a diferenciação entre células espermáticas portadoras de cromossomo X e células espermáticas portadoras de cromossomo Y baseado na intensidade da fluorescência.
- 14 - Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo referido macho mamífero não humano ser selecionado a partir de um grupo de mamíferos consistindo de: primatas, suínos, ovinos, bovinos, equinos, caninos, felinos e golfinhos.
- 15 - Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo referido macho mamífero não humano compreender o referido bovino e pela referida concentração de marcação de Hoechst 33342 estar entre 200 micro-molar e 2.500 micro-molar.
- 16 - Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo referido mamífero macho não humano compreender o referido bovino e pela referida concentração de marcação de Hoechst 33342 ser de 224 micro-molar.
- 17 - Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo mamífero macho não humano compreender o referido bovino e pela referida concentração de marcação de Hoechst 33342 ser de 240 micro-molar.
- 18 - Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pela referida etapa de ajuste e duração do tempo, na qual as referidas células espermáticas são incubadas com a referida concentração de marcação de Hoechst 33342 está entre 50 minutos e 200 minutos, compreender o ajuste da referida duração do tempo no qual as referidas células espermáticas são incubadas com a referida concentração de marcação de Hoechst 33342 a 190 minutos.
- 19 - Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pela etapa de ajuste da duração do tempo, na qual referidas as células espermáticas são incubadas com a referida concentração de marcação de Hoechst 33342 está entre 50Petição 870170040080, de 12/06/2017, pág. 12/18 minutos e 200 minutos, compreender o ajuste da referida duração do tempo no qual as refridas células espermáticas são incubadas com a referida concentração de marcação de Hoechst 33342 é 60 minutos.
- 20 - Método de acordo com a reivindicação 13, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20, caracterizado pela referida etapa de marcação uniforme do DNA no interior da célula espermática, para permitir que células espermáticas portadoras de cromossomo X sejam diferenciadas de células espermáticas portadoras de cromossomo Y baseado na intensidade de fluorescência a uma razão maior do que 85%, compreender a diferenciação das referidas células espermáticas portadoras de cromossomo Y das referidas células espermáticas portadoras de cromossomo X baseado na intensidade da fluorescência a uma razão selecionada do grupo consistindo de 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%.
- 21 - Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelas referidas células espermáticas portadoras de cromossomo X diferenciadas das referidas células espermáticas portadoras de cromossomo Y por compreenderem células espermáticas úteis.
- 22 - Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pela referida etapa de marcação uniforme do DNA no interior da referida célula espermática para permitir que células espermáticas portadoras de cromossomo X sejam diferenciadas de células espermáticas portadoras de cromossomo Y baseado numa intensidade de fluorescência a uma razão maior do que 85% compreender a diferenciação da referida intensidade da fluorescência com um medidor de fluxo celular.
- 23 - Método de geração de embriões de mamíferos, caracterizado por compreender as seguintes etapas:a) obtenção de sêmen congelado e descongelado de um mamífero macho não humano;b) combinação do referido sêmen do referido macho mamífero não humano com uma quantidade de marcação de Hoechst 33342;c) estabelecimento de uma concentração de marcação de Hoechst 33342 combinado com o referido sêmen a uma concentração entre 40 micro-molar e 2.500 micro-molar;d) ajuste da temperatura na qual as referidas células espermáticas são incubadas com a referida marcação de Hoechst 33342 entre 30° Centígrados e 40° Centígrados;Petição 870170040080, de 12/06/2017, pág. 13/18e) Ajuste da duração do referido tempo durante o qual as referidas células espermáticas são incubadas a uma concentração de Hoechst 33342, entre 60 minutos e 200 minutos.f) Marcação do DNA no interior da célula espermática contida no sêmen com a referida marcação de Hoechst 33342 e;g) Fertilização de oócitos com células espermáticas marcadas através do incremento da concentração de marcação de Hoechst 33342 e decrescimento da duração do tempo no qual as referidas células espermáticas são incubadas na referida concentração de marcação de Hoechst 33342 aumenta a percentagem dos referidos embriões de mamíferos produzidos.
- 24 - Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo referido mamífero macho não humano ser selecionado a partir de um grupo de mamíferos consistindo de: primatas, suínos, ovinos, bovinos, equinos, caninos, felinos e golfinhos.
- 25 - Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo mamífero macho não humano compreender os referidos bovinos e pela referida concentração de marcação de Hoechst 33342 estar entre 200 micro-molar e 2.500 micro-molar.
- 26 - Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo mamífero macho não humano compreender o referido bovino e pela referida concentração de marcação de Hoechst 33342 ser de 224 micro-molar.
- 27 - Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo referido mamífero macho não humano compreender o referido bovino e pela referida concentração de marcação de Hoechst 33342 ser 240 micro-molar.
- 28 - Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pela etapa de ajuste da duração do tempo no qual as referidas células espermáticas são incubadas com uma referida concentração de marcação de Hoechst 33342, entre 50 minutos e 200 minutos, compreender o ajuste da referida duração do tempo no qual as referidas células espermáticas são incubadas com a referida concentração de marcação de Hoechst 33342 para 190 minutos.
- 29 - Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pela etapa de ajuste da duração do tempo, na qual as referidas células espermáticas são incubadas com a referida concentração de marcação de Hoechst 33342 está entre 50 minutos e 200 minutos, compreender o ajuste da referida duração do tempo no qual as células espermáticas são incubadas com a referida concentração de marcação de Hoechst 33342 para 60 minutos.Petição 870170040080, de 12/06/2017, pág. 14/18
- 30 - Método de acordo com a reivindicação 23, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30, caracterizado pela referida etapa de marcação uniforme do DNA no interior das referidas células espermáticas para permitir que células espermáticas portadoras de cromossomo X diferenciadas de células espermáticas portadoras de cromossomo Y baseado na intensidade de fluorescência, a uma razão maior do que 85%, compreender a diferenciação das referidas células espermáticas portadoras de cromossomo X das referidas células espermáticas portadoras de cromossomo Y baseado na intensidade da fluorescência a uma razão selecionada do grupo consistindo de 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%.
- 31 - Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelas referidas células espermáticas portadoras de cromossomo X diferenciadas das referidas células espermáticas portadoras de cromossomo Y compreenderem células espermáticas úteis.
- 32 - Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por: a referida etapa de marcação uniforme do DNA no interior da célula espermática para permitir que células espermáticas portadoras de cromossomo X sejam diferenciadas de células espermáticas portadoras de cromossomo Y baseado numa intensidade de fluorescência a uma razão maior do que 85% compreende a diferenciação da referida intensidade da fluorescência com um medidor de fluxo celular.
- 33 - Método de acordo com a reivindicação 32, além disso caracterizado por compreender a etapa de isolamento de células espermáticas diferenciadas portadoras de cromossomo X e células espermáticas portadoras de cromossomo Y em coleções separadas de elementos.
- 34 - Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pela referida etapa de isolamento das diferenciadas células espermáticas portadoras de cromossomo X e células espermáticas portadoras de cromossomo Y, em coleções separadas de elementos, compreender o isolamento das células espermáticas portadoras de cromossomo Y numa coleção de elementos separados a uma razão de 1.000 por segundo.
- 35 - Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pela referida etapa de isolamento das diferenciadas células espermáticas portadoras de cromossomo X e células espermáticas portadoras de cromossomo Y, em coleções separadas de elementos, compreender o isolamento das células espermáticas portadoras de cromossomo X numa coleção de elementos separados a uma razão de 1.000 por segundo.Petição 870170040080, de 12/06/2017, pág. 15/18
- 36 - Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por compreender também a etapa de congelamento do sêmen.
- 37 - Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por compreender também a etapa de congelamento do sêmen.
- 38 - Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizado por compreender também a etapa de descongelamento do sêmen.
- 39 - Método de acordo com a reivindicação 37, caracterizado por compreender também a etapa de descongelamento do sêmen.
- 40 - Método de produção de mamíferos tendo um sexo prédeterminado, caracterizado por compreender as seguintes etapas:a) coleta do sêmen de um mamífero macho não humano;b) congelamento do referido sêmen;c) descongelamento do referido sêmen;d) especificação da característica sexual de uma pluralidade de células espermáticas contidas dentro do referido sêmen submetido a congelamento e descongelamento;e) separação das referidas células espermáticas segundo a determinação de seus sexos característicos;f) isolamento de células espermáticas segundo a determinação de seus sexos característicos numa coleção de elementos;g) estabelecimento de uma amostra de inseminação artificial proveniente das referidas células espermáticas isoladas da referida coleção de elementos;h) inserção da referida amostra de inseminação artificial numa fêmea mamífera da mesma espécie da qual o referido sêmen foi coletado;i) fertilização de pelo menos um ovo na referida fêmea mamífera;j) produção de uma prole de mamíferos de determinado sexo.
- 41 - Método de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo macho mamífero não humano ser selecionado a partir do grupo de mamíferos consistindo de: primatas, suínos, ovinos, bovinos, equinos, caninos, felinos e golfinhos.
- 42 - Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado por compreender também a etapa de marcação do DNA no interior das células espermáticas com uma concentração de marcação de Hoechst 33342 maior do que 40 micro-molar.
- 43 - Método de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pela referida etapa de marcação do DNA no interior das referidas células espermáticasPetição 870170040080, de 12/06/2017, pág. 16/18 com uma concentração de Hoechst 33342 maior do que 40 micro-molar, compreender marcação uniforme para permitir que células espermáticas portadoras de cromossomo X sejam diferenciadas de células espermáticas portadoras de cromossomo Y baseado na intensidade da fluorescência numa taxa maior do que 85%.
- 44 - Método de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo referido macho mamífero não humano compreender o referido bovino, e pela referida concentração de marcação de Hoechst 33342 estar entre 200 micro-molar e 2.500 micro-molar.
- 45 - Método de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo referido macho mamífero não humano compreender o referido bovino e pela referida concentração de marcação de Hoechst 33342 ser de 224 micro-molar.
- 46 - Método de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo referido macho mamífero não humano compreender o referido bovino e pela referida concentração de marcação de Hoechst 33342 ser de 2.240 micro-molar.
- 47 - Método de acordo com a reivindicação 44, caracterizado por compreender também a etapa de ajuste da duração do tempo no qual as referidas células espermáticas são incubadas com a referida concentração de Hoechst 33342 entre 50 minutos e 200 minutos.
- 48 - Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pela referida etapa de ajuste da duração do tempo, na qual as referidas células espermáticas são incubadas com a referida concentração de marcação de Hoechst 33342 entre 50 minutos e 200 minutos, compreender o ajuste de duração do tempo no qual as referidas células são incubadas com uma referida concentração de marcação de Hoechst 33342 é de 190 minutos.
- 49 - Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pela referida etapa de ajuste da duração do tempo, na qual as referidas células espermáticas são incubadas com uma referida concentração de marcação de Hoechst 33342 entre 50 minutos e 200 minutos, compreender o ajuste de duração do tempo no qual as referidas células espermáticas são incubadas a uma referida concentração de marcação de Hoechst 33342 de 60 minutos.
- 50 - Método de acordo com a reivindicação 40, 41, 44, 45, 46, 47, 48 ou 49, caracterizado pela referida etapa de marcação do DNA no interior das células espermáticas, com uma concentração de Hoechst 33342 maior do que 40 micromolar, compreender marcação uniforme para permitir que células espermáticas portadoras de cromossomo X sejam diferenciadas de células espermáticas portadoras de cromossomo Y baseado na intensidade de fluorescência a uma razão maior do quePetição 870170040080, de 12/06/2017, pág. 17/1885% compreende a razão selecionada do grupo consistindo de 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%.
- 51 - Método de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pela referida etapa de marcação uniforme do DNA no interior das referidas células espermáticas para permitir que células espermáticas portadoras de cromossomo X sejam diferenciadas de células espermáticas portadoras de cromossomo Y baseado na intensidade de fluorescência a uma razão maior do que 85% compreende a diferenciação da referida intensidade da fluorescência com um medidor de fluxo celular.
- 52 - Método de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pela referida etapa de isolamento das células espermáticas, separadas de acordo com a determinação dos seus sexos numa coleção de elementos, compreender isolamento de células espermáticas portadoras de cromossomo Y numa coleção de elementos separados, a uma razão de 1.000 por segundo.
- 53 - Método de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pela referida etapa de isolamento das células espermáticas, separadas de acordo com a determinação dos seus sexos numa coleção de elementos, compreender o isolamento de células espermáticas portadoras de cromossomo X numa coleção de elementos separados, numa razão de 1.000 por segundo.
- 54 - Método de acordo com a reivindicação 40, caracterizado por compreender também a etapa de limitação do número de células espermáticas isoladas numa referida amostra de inseminação artificial de 10% a 50% do número de células espermáticas relativo a uma amostra típica de inseminação artificial não separada.
- 55 - Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo referido mamífero não humano compreender o referido bovino e pela referida amostra de inseminação artificial ter o número de células espermáticas isoladas limitado a um milhão a três milhões.
- 56 - Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo referido mamífero não humano ser um bovino e pela amostra de inseminação artificial ter o número de células espermáticas isoladas limitado entre cento e cinquenta mil e um milhão.
- 57 - Método de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo referido mamífero não humano compreender o referido equino e pela referida amostra de inseminação artificial ter o número de células espermáticas isoladas limitado entre quarenta milhões e cem milhões.
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