JP2004102274A - 照明光および／または試料光のスペクトル組成および／または強度を制御下で変更するための方法および配置 - Google Patents

照明光および／または試料光のスペクトル組成および／または強度を制御下で変更するための方法および配置 Download PDF

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Abstract

　【課題】照明光および／または試料光のスペクトル組成および／または強度を制御下で変更するための方法および配置
　【解決手段】第１偏光手段（Ｐｏｌ　１）によって、異なった偏光を持つ光線成分への空間分離が行われるステップ、
第１分散手段（Ｄｉｓｐ　１）によって、少なくとも１つの光線成分のスペクトル空間分割が行われるステップ、
スペクトル空間分割された光線成分の少なくとも一部の偏光状態が変更されるステップ、
および第２偏光手段（Ｐｏｌ　２）によって、異なった偏光を持つ光線成分の空間分離および／または空間集合が行われるステップを含み、その場合に好ましくも第２分散手段（Ｄｉｓｐ　２）によって、偏光状態の変更された、および変更されなかった光線成分の空間集合が行われるという、
照明光および／または試料光のスペクトル組成および／または強度を調整下で変更するための方法。
【選択図】図４

Description

　本発明は、顕微鏡法、特に蛍光顕微鏡法、レーザ走査型顕微鏡法、蛍光相関分光法および走査型近視野顕微鏡法における、主として生物学上の試料、プレパラートおよび付属する構成成分を検査するための方法に関する。それと共に、作用物質を検査するための蛍光検出に基づく方法（ハイ・スループット・スクリーニング）も含まれる。従って、オーバーラップ部分を持つ蛍光スペクトルの場合では、複数試料点における試料の同時照射により、多重蛍光体を含む試料のリアルタイムでの同時検査が、厚い試料の空間構造においても可能となる。
　生物プレパラートを検査するための光学顕微鏡の古典的利用分野の１つに蛍光顕微鏡法（非特許文献１）がある。この場合では特定の色素が細胞部分への特殊標識付けのために使用される。
ＤＥ １９７０２７５３Ａ１ Pawley著、"Handbook of Biological Confocal Microscopy"（「生物共焦点顕微鏡法ハンドブック」、Plenum Press発行　１９９５年） Corle,Kino著；"Confocal Scanning Optical Microscopy and Related Imaging Systems"（「共焦点走査型光学顕微鏡法と関連画像システム」；Academic Press １９９６年発行） M.R.Melamed、T.Lindmo、M.L.Mendelsohn著"Flow Cytometry And Sorting"（「流動細胞の計量及び分類」第２版、Wiley & Sons, Inc.社（ニューヨーク）出版、１９９０年刊、８１〜１０７ページ） Ｔ.Wilsonおよび共著者の"Method of obtaining optical sectioning by using structured light in a conventional microscope"「従来型顕微鏡での構造化光線の使用による光学切断面の形成法」（光学レポート２２（Ｎｏ．２４）１９９７年刊）
　色素分子は、入射した一定エネルギを持つ光子１個の吸収により光子基底状態から励起状態へ励起される。この励起は多くの場合一光子吸収と称される（図１ａ）。色素分子は、このように励起された状態からさまざまな方法で基底状態に戻ることができる。蛍光顕微鏡法では蛍光光子の放射下での移行が最も重要である。放出される光子の波長はストークス変位のため励起光線に比較して原則的に赤側にずれる。すなわち長波長側である。ストークス変位が蛍光光線の励起光線からの分離を可能にする。
　蛍光は、ブロックフィルタと組み合わせた適当なダイクロイック・ビームスプリッタにより励起光線から分離して別途観察する。そうすることによって、さまざまな色素で着色された個々の細胞部分の描写が可能である。しかし原則的には、プレパラートのいくつかの部分を、独特な堆積の仕方をするさまざまな色素で同時に着色することもできる（多重蛍光）。個々の色素から送出される蛍光信号を区別するために、ここでも特殊なダイクロイック・ビームスプリッタを使用する。
　高いエネルギを持つ一光子による色素分子の励起（一光子吸収）のほかに、より小さいエネルギを持つ複数の光子による励起も可能である（図１ｂ）。この場合、個々の光子のエネルギ総和は高エネルギ光子の何倍にも相当する。この種の色素励起は多光子吸収と称される（非特許文献２）。しかし、色素放出はこの種の励起によっては影響されない。すなわち、多光子吸収の場合放出スペクトルは負のストークス・シフトを起すため、励起光線に比較するとその波長は短い。励起光線を放出光線から分離させるのは一光子吸収の場合と同じ方法で行う。
　以下に現状技術を共焦点レーザ走査型顕微鏡（ＬＳＭ）の例で説明する（図２）。
ＬＳＭは大きく分けて次の４つのモジュールから成っている：光源、走査モジュール、検出ユニット、顕微鏡。これらのモジュールは以下により詳しく説明する。それに加え、ＤＥ１９７０２７５３Ａ１（特許文献１）も参考になる。
　プレパラート中にあるさまざまな色素の個別励起には、さまざまな波長のレーザをＬＳＭ内で使用する。励起波長の選択は検査対象色素の吸収特性に従って行う。励起光線は光源モジュール内で生成される。この場合さまざまなレーザ（アルゴン、アルゴン・クリプトン、ＴｉＳａレーザ）が使用の対象になる。その他、光源モジュールでは波長の選択および必要な励起波長の強度調整を、例えば音響光学結晶の使用により行う。それに続き、レーザビームは、ファイバまたは適当なミラー装置を通じて走査モジュール内に導かれる。
　光源で生成されたレーザビームは、対物レンズを通り、回折の抑制下でスキャナ、走査レンズ系、鏡胴レンズを経由してプレパラート内へ集束される。スキャナにより試料をｘ−ｙ方向にドット走査する。試料走査における画素上の滞留時間は、多くの場合、マイクロ秒未満ないし数秒の範囲である。
　蛍光の共焦点検出（デスキャン検出）の場合、焦点面（試料）およびその上下にある平面から放出された光は、スキャナを通じてダイクロイック・ビームスプリッタ（ＭＤＢ）に達する。ＭＤＢは蛍光を励起光から分離する。続いて蛍光は、正確に焦点面と共役な平面内にある絞り（共焦点絞り／ピンホール）で焦点を結ぶ。これによって焦点外の蛍光成分が遮断される。絞りの寸法をさまざまに変化させることによって、顕微鏡の光学分解能を調節することが可能である。絞りの後ろに別のダイクロイック・ブロックフィルタ（ＥＦ）があり、これが再度励起ビームを差し止める。蛍光は、ブロックフィルタを通過した後、点像検出器（ＰＭＴ）によって測定される。
　多光子吸収を利用した場合、色素蛍光の励起は、励起強度が特に強い小ボリューム部分に起こる。この領域は、共焦点装置を使用した場合の検出領域より極わづかに大きいだけである。したがって共焦点絞りの使用を省くことができ、検出は対物レンズの直後で行うことができる（ノンデスキャン検出）。
　多光子吸収によって励起される色素蛍光を検出するための別の配置では、さらにデスキャン検出が行われるが、この場合、対物レンズのひとみは検出ユニット内へ結像する（非共焦点デスキャン検出）。
　３次元照明による像のうち、対応の一光子吸収もしくは多光子吸収と結合している２検出器の配置によって、対物レンズの焦点面内に存在する平面（光学的断面）のみが再現される。それに続いて、試料のさまざまな深さｚにおけるｘ−ｙ平面内のいくつかの光学的断面の描画により、コンピュータでサポートされた試料３次元像が生み出される。
　したがって、ＬＳＭは厚いプレパラートを検査するのに適している。励起波長は使用色素の固有吸収特性で決定される。色素の放出特性に合わせたダイクロイックフィルタにより、それぞれの色素から送出される蛍光のみが確実に点像検出器で測定されることになる。
　バイオメディカル分野においては、目下のところいくつかのさまざまな細胞領域がさまざまな色素で同時に標識付けされている（多重蛍光）。現状技術では、個々の色素はさまざまな吸収特性に基づき、または放出特性（スペクトル）に基づき別々に検出されている。
　それぞれ別個の検出には、複数色素の蛍光に対する追加分割を副ビームスプリッタ（ＤＢＳ）で行ない、個々の色素放出の検出を別々の点像検出器（ＰＭＴ　ｘ）で行なう。
　細胞およびその他粒子の検査および分類には細胞流量計が用いられる。その場合、細胞を液体に溶かし、毛管を通じてポンピングする。細胞検査には側面からレーザ光線を照射してそれを毛管に集束させる。細胞は各種の色素またはバイオ分子で着色しておく。励起された蛍光および後方散乱励起光を測定する。試料の蛍光信号を励起光から分離するのはダイクロイック・ビームスプリッタ（ＭＤＢ　図２参照）による。
　現技術状況については、非特許文献３に記述されている。
　後方散乱信号から細胞の大きさが測定できる。個々の細胞の蛍光スペクトル特性から様々な細胞を分離／分類することが、または個別に計量することができる。細胞の分類は、静電界において様々な毛管の使用下で行う。その結果は、例えば色素Ａ着色の細胞数と色素Ｂ着色の細胞数がしばしば棒グラフで描かれ比較される。流動速度は、典型例では数１０〜１００ｃｍ／秒である。従って、高感度の検出が必要になる。検出量の制限には、現状技術に基づく共焦点検出が行われる。
　現状技術では点スキャナの代りにいわゆるラインスキャナも使用されている（非特許文献２）。その原理構造は本質的には図２のＬＳＭに一致する。但し、点フォーカスでなくラインが試料（３）に結像するのであり、その場合検査試料は一方向（ｘまたはｙ方向）にのみ走査される。点走査の代りにライン走査することによって、撮像速度を相当高めることができる。それにより、この走査法はリアルタイムでのリアルタイム顕微鏡検査に使用できる。しかし、光軸方向の分解能は点スキャナよりファクタ１．４分劣っている。
　現状技術に基づくリアルタイム顕微鏡検査のためのさらに別な配置では、広角光源によって検査対象フィールド全体が完全に照明されるケースがある。しかし、走査フィールド全体の中で特殊な点模様だけは迅速回転ディスクでは捕らえられずに漏れている。この方法は非特許文献２では殆どがニポーディスク法と称されている。
　いわゆる構造化照明による、現状技術に基づくさらにまた別な方法では（図３）、振幅構造（例えば格子）の光学結像における変調度が焦点深度の判定基準として利用されている。この場合の画像は周期性構造で、その変調周波数および変調位相位置（画像位相）に特徴がある。
　光学軸に対し垂直に構造位相シフトすることにより様々な投影画面を得ることができる。
縞のない、深度差のある光学切断面を算定するためには、一般には少なくとも０°、１２０°および２４０°の三つの位相画像ＰＢが必要である。これらの位相画像（ＰＢ）から、続いて画像プロセッサにおける次式１を用いた算定より（共焦点）光学切断画像が得られる。
　　ＩＳｅｃｔｉｏｎ（ｘ）＝Ｃｏｎｓｔ√（（Ｉ（ｘ，０°）−Ｉ（ｘ，１２０°））2＋（Ｉ（ｘ，１２０°）−Ｉ（ｘ，２４０°））2＋（Ｉ（ｘ，０°）−Ｉ（ｘ，２４０°））2）　　　（式１）
　但し、式中Ｉ（ｘ、角度）は当該位相画像の各画素における強度を表わしている。
　最も簡単な例では３またはそれ以上の位相画像記録が、逐次的に行なわれる。その場合、画像測定中には試料は動かさないものとする。このように位相画像から算定された切断画像または断面成層は、続いて３次元評価ソフトウェアにより、標準ＰＣおよびモニタに表示することができる。
　光学軸に沿った方向での位置分解能は、光の波長、対物レンズの開口数および変調振動数に依存している。
　算定アルゴリズムに関する詳細については、非特許文献４が参考になる。
　例えば、いわゆるチップリーダで色素をスクリーニングするための配置は、その光学的構成がレーザ走査型顕微鏡に類似している。しかし、顕微鏡試料の検査では、たとえばバイオチップ上の作用物質のスクリーニングでは、これらによる方が走査画像フィールドが明らかに大きくなる。走査フィールドの縦横の長さはこの場合数１０ｍｍである。これらの走査フィールドは、例えば、ガルボスキャナの走査角を拡大することによって、図６Ａに示された顕微鏡配置における中間像での試料配置によって、または中間像を拡大して試料上に結像する特殊な対物レンズの配置（マクロ対物レンズ）によって得ることができる。
　試料放出光から励起光を分離するのは、現状技術に基づき、ストークス変位を利用しながらスペクトル分離するか、試料照明／検出のために使用される光学系の開口数を制限するか、あるいはさまざまな偏光方向に分割するかのいずれかで行われる。
　試料放出光から励起光をスペクトル分離するには、特別なダイクロイック・ビームスプリッタが使用される。これらの多くは、図３ａに示されているように、できる限り効率的に励起光を反射させて、試料放出光ができる限り効率的に透過するように設計されている。そこには波長に依存する反射度（反射能）が描かれている。
　偏光された励起光を使用した場合、反射波長領域の最小スペクトル帯域幅（ｓ）は約１０ｎｍであり、また側面峻度（ｆ）は多くの場合＞５ｎｍである。それゆえ、試料からの放出光は現状技術に基づき励起波長の使用下、ダイクロイック・ビームスプリッタにより効率的に分離することができる。
　しかし、複数の色素を複数の波長により同時に励起する場合（多重蛍光顕微鏡法）では、殆どが励起光と放出光間でスペクトルのオーバーラップを来たすから、効率が悪化する。
　さらに、さまざまな吸収特性を有するさまざまな色素を使用する場合、その都度特別なビームスプリッタを用意しなければならない。広域視野顕微鏡では、ほとんどが白色光源の光により試料の広帯域励起が行われるが、その場合、励起光線と放出光線とのスペクトルが部分的に重なり合う。それゆえ、現状技術に基づくダイクロイック・ビームスプリッタを使用する場合、励起光と放出光の分離効率が悪化する。
　試料照明光学系の開口数を制限することによる励起光の放出光からの分離は（図３ｂ）、たとえば、軸に近い光線（１）のみが試料（２）方向に達するよう、小さくした開口により試料を照明することによって行うことができる。放出はあらゆる空間方向に対して行われるので、残りの開口領域においては、この試料（２）からの光を収集することができる。
　放出光からの励起光の分離は、続いて部分的に完全鏡面（黒色部分）を持つ平板（３）により行われる。試料放出光の検出は光線方向（５）で行われる。現状技術（たとえば非特許文献１）から知られている開口数分割のための方法における短所は、開口を縮小させることによって、１つには検出効率が、また１つには当該配置の光学的分解能が悪化することである。両パラメータはこの場合相互に関連している。たとえば高い分離効率を求めれば、光学的分解能が悪くなる。
　現状技術に基づくいずれの方法でも、短所は、試料放出光からの励起光の分離が波長に依存することである。すなわちフレキシブルな調整が可能でないこと、あるいはそれが要求されているスペクトル特性および照明線の数に依存して、典型例では７０％〜９０％に低下した効率でなされることである。
　本発明に従えば、非常に好ましくも、試料内で励起された光線および／または後方散乱光線（たとえば蛍光／ルミネセンス）から励起光を高い効率で分離することのできる方法および配置が得られる（図３ｃ）。それによれば、分離は現状技術とは違い、機械的部品の移動なしにスペクトルのフレキシブルな調整が可能で、従って特に多重蛍光顕微鏡法での使用に、すなわちさまざまな色素の同時励起に非常に適している。加えて妨害光の抑制面では少なくともワンランク改善されている。それゆえ、複数の励起波長間もしくはスペクトル検出波長領域間での迅速な切換（特許文献１）、いわゆるマルチトラッキングを非常に簡単に実現することができる。
　さらに、試料から検出器の方向に散乱した光を、直接経路で反射した光から切り離して、別々に測定することが可能である。加えて試料から来る光の偏光方向を測定することができる。そのほかの長所は、グラスファイバへの不安定な連結に起因するレーザ出力変動を制御により防止できること、ひいては試料位置において出力を一定に保つことができる点である。
　本発明に基づく配置によれば、光学的分解能が現状技術に基づく検出光路からの励起光路分離のための配置に比較して悪化することはない。さらに照明の配分操作は試料相互作用の位置において行える。それによって、いわゆる対象領域（ＲＯＩ）をリアルタイムで走査することが可能である。加えて広域視野顕微鏡法により知られる照明方法、たとえば傾斜照明が実現できる。
　本発明に基づく解決法は、分析型および画像形成型のいずれの顕微鏡システムにも使用可能である。この顕微鏡システムとしては、画像形成システムのほかに生物学プレパラートを２００ｎｍまでの光学的分解能により３次元検査するためのレーザ走査型顕微鏡、表面を１０ｎｍまでの分解能により高分解能検査するための走査型近視野顕微鏡、分子濃度を定量的に決定するためおよび分子拡散を測定するための蛍光相関顕微鏡がある。さらに蛍光検出に基づく色素スクリーニングのための方法および細胞流量測定のための方法も含まれる。
　前記システムすべてにおいて、蛍光色素がプレパラートの特殊標識づけに使用される。
　前記課題は独立請求項に基づき解決される。好ましい実施態様は従属請求事項の対象である。
　本発明に基づく方法によって同時使用可能な色素の特徴数、すなわち、たとえば細胞の同時検査可能な特性数を増やすことができる。強くオーバーラップしている、もしくはたがいに近接している個別色素におけるスペクトルの特徴を求める場合、現状技術によれば、個別色素の蛍光信号を別々に検出するために、検出される波長領域または開口数を制限しなければならない。それにより検出感度が減少する。すなわち、検出器の雑音が増大する。それは増幅度を高める必要が出てくるからである。これは本発明に基づく方法および配置によれば防止される。
　以下では、試料中で励起された、および／または後方散乱した光線（以下では検出光の意）を非常に効率よく励起光から分離させることのできる様々な配置をより詳しく説明する。従って、それらの配置は、励起光と検出光の分離、それもスペクトル適合したフレキシブルな分離を伴う特に迅速なマルチトラッキングに適している。
　以下では、試料からの放出光線とは、主として大きな空間角で試料から放射される複合光のことを言う。これらの光線は偏光化されていない（非偏光）。これらの光線としては特に、試料中で励起された蛍光、ルミネセンス光および後方散乱光がある。
１．励起光を検出光から可変的に分離するための配置における作用原理
　図４は検出光路において、図５は励起光路において、励起光を検出光から分離するための配置を図式化したものである。この配置における主要機器は、少なくとも３つのダイス型偏光ビームスプリッタＰ１〜Ｐ３である。Ｐ４は、別タイプのダイス型偏光ビームスプリッタやミラーにすることもできる。ダイス型偏光ビームスプリッタとしては、例えばグラン・レーザ偏光スプリッタ、複屈折性材質タイプまたは特殊マイクロ構造型ビームスプリッタ（例えばＭｏｘｔｅｋ，Ｉｎｃ．／Ｏｒｅｍ（ＵＳＡ）のマイクロ・ワイア）が使用できる。
　それぞれ２つのダイス型ビームスプリッタ（Ｐ２とＰ１、およびＰ４とＰ３）の間に、光線をＹ座標に沿った空間でスペクトル分割する、あるいは再度集合させる２つの分散素子（例えばプリズムまたは格子）Ｄ１およびＤ２が配置されている（図６も参照）。光学系Ｌ１とＬ２は、分散素子Ｄ１、Ｄ２と偏光回転素子、例えば空間光変調器ＳＬＭ　Ｓとの間にあって、両者相違することもあるそれぞれの焦点距離ｆを隔てた位置にある。
　光学系Ｌ１とＬ２は分散素子Ｄ１、Ｄ２と共にＳＬＭ　Ｓの然るべき場所にスペクトル・フーリエ平面を生成するのに用いられる。この空間において、方向２または方向１から来た光のスペクトル成分がＹ座標に沿った空間で分離される。ＳＬＭ（例えばドイツＪｅｎｏｐｔｉｋ社のＳＬＭ６４０）は、個々に制御可能な連続する縞構造（ＳＬＭ６４０の場合６４０の縞構造）から成っている。それぞれのピクセルの制御如何により、通過光の偏光方向を変えることができる。
　ＳＬＭは現状技術に基づく、いわゆるパルス波形方式のものである（文献：Ｓｔｏｂｒａｗａその他、Ａｐｌ．Ｐｈｙ「応用物理」、第７２巻、６２７〜６３０ページ（２００２年））。この場合、分散素子と組み合わされたＳＬＭの作用により、位相遅延および／または光源スペクトル成分の振幅変更が行なわれる。光源はその場合、後述の配置とは異なり、直線偏光されていなければならない。そうでないとエネルギー損失が発生するからである。ＳＬＭの代わりとして、例えば、調整可能な多数のラムダ・ハーフプレートをフーリエ平面に配置して使用することも可能である。
　ＳＬＭを光が通るのは領域ａおよびｂ（図４、５、７参照）である。その場合、縞構造はＸ軸に沿う方向に向けられている。
　図６は、図４および図５のｙ−ｚ平面を示したもので、そこでは分散素子Ｄ１およびＤ２の作用により光線のスペクトル分割がなされる。これは、個々の光線スペクトル成分がＳＬＭ　Ｓの様々なピクセルを通ることで空間分離することにより行われる。
　図７はｘ−ｙ平面におけるピクセル（縞構造）を示している。Ｙ軸に沿う方向にそれぞれのピクセル（縞構造）が認められる。分散素子Ｄ１、Ｄ２により、この軸に沿って光線のスペクトル分割が行われる。Ｙ軸に沿う黒い縞は領域ａおよびｂを表わしているが、そこを通って異なった偏光方向Ｐｏｌ　１およびＰｏｌ　２に進むことになる。
　以下では、検出光路を描いた図４に基づき作用原理を説明する。
　矢印方向に入力された非偏光ＬＤは、偏光スプリッタＰ２により互いに直角をなす２つの成分、すなわち反射偏光成分Ｐｏｌ　１（丸印、偏光方向は注視方向）と通過偏光成分Ｐｏｌ　２（矢印、偏光方向は矢印方向）に分割される。丸印のハッチ（II）とブラック（I）の色分けは、異なった波長の光（例えば、ブラック（I）が蛍光で、ハッチ（II）が散乱励起光）を表わしている。
　様々な波長（λ１、λ２、λ３）を持つ光のうちＰｏｌ　１はＰ２からＰ４を経由して、Ｐｏｌ　２は、Ｐ２から直接Ｄ２およびＬ２を通ってＳＬＭ　Ｓの異なった領域（図６参照）、すなわちＰｏｌ　１が領域ｂに、Ｐｏｌ　２が領域ａに達する（図７参照）。ＳＬＭは、例えば領域λ２およびλ３に入射した光線（ブラック（I））に対して、偏光角を例えば丁度９０°回転させる（図４）。続いて、Ｌ１およびＤ１により、再度スペクトル成分の空間分離がなされ、光は偏光スプリッタＰ１とＰ３に到達する。その場合、ブラック（I）の成分とハッチ（II）の成分（すなわち、本例では蛍光光線と励起光線）が、両アームＰ２−Ｐ１、Ｐ４−Ｐ２で互いに垂直に偏光される（図４）。従って、励起光（ハッチ（II）成分）は、連結ポート１および５を通って外に出る。蛍光の両方向への偏光成分（ブラック（I）成分）は、共に連結ポート４を通って外に出る。
　このように、入力部２から入った光線は、この配置により偏光状態には係りなく、それぞれの異なったスペクトル組成に基づき別々の出力部１、５および４へと空間分離され、それによりそれ以降別々に光学加工することができる。
　蛍光測定のために、検出光路内で偏光を９０°以外の角度で回転させることは可能であるが、しかしそれはあまり得策ではない。その場合では蛍光成分が連結ポート（１）および（５）にも達するため、一検出器では検出されないからである。
　励起光路における作用原理も同様になるが、それは図５に基づいて説明する。入力部（１）を通って入った非偏光光線（矢印）は、Ｐ１において互いに直角方向の２偏光成分Ｐｏｌ　１およびＰｏｌ　２に分割される。ハッチ（II）とブラック（I）の色分けは、ここでも異なった波長の光（例えば、ブラックの励起光は波長λ１、ハッチの励起光は波長λ２）を表わしている。Ｐｏｌ　１は直接出力部６に達する。異なった波長（λ１、λ２）のＰｏｌ　２は、Ｐ１からＤ１およびＬ１を通ってＳＬＭ　Ｓの異なった領域に到達する（図６参照）。ＳＬＭは、例えば領域λ２に入射した光線（ブラックで表示）に対して、偏光角を例えば丁度９０°回転させる（図５）。波長λ１に対しては、ＳＬＭはその波長を例えば９０°と異なる角度（好ましくは０°〜１８０°の範囲）で回転させる。
　続いて、Ｌ２およびＤ２により、再度スペクトル成分の空間分離がなされ、光はＰ２に到達する。Ｐ２は、偏光の如何によりこの成分を出力部３または出力部２に分離する。上記の例では波長λ２についての偏光は、ＳＬＭにより丁度９０°回転させている。従って、この波長の光はＰ２によりすべて出力部３へと誘導される。それに対して波長λ１についての偏光は、９０°以外の角度でしか回転させていない。そのため、光の出力は出力部２と３の双方に分割されている。
　その分割比はＳＬＭにおける偏光の調整回転角如何にかかっている。励起光路における９０°以外の角度による偏光回転は、励起光の減衰化に適している。連結ポート２と３の出力比は、関係式　Ｐ２／Ｐ３＝ｔａｎ（回転角）　に従って無段調整することができる。
　このように、入力部１から入った光線はこの配置により、偏光度には係りなく、異なったスペクトル成分に基づき別々の出力部２、３および６へと空間分離され、それによりそれ以降別々に光学加工することができる。
２．レーザ走査型顕微鏡
　図８は、レーザ走査型顕微鏡（ＬＳＭ）のｘ−ｚ平面における照明光／試料光の分離に用いられるＭＤＢ（メインカラースプリッタ）を対象とした、本発明に基づく配置を図式化したものである。
　第１項で図４〜７を基に説明した作用原理は、顕微鏡において蛍光光線を励起光線からフレキシブルに分離させる場合にも準用することができる。
　ＬＳＭの場合、試料は、ｘ−ｙ平面上をスキャナＳＸおよびＳＹにより動かされる点フォーカスで照明される。その場合、主として直線偏光光源ＬＱがＰ１のポート１を通じてＭＤＢ（図５および図６参照）と連結している。光源ＬＱの光は、次に分散素子Ｄ１および光学系Ｌ１を通って、大部分がＳＬＭ　Ｓのピクセル（領域ａ）に到達する。励起光を試料に到達させるべき場合には、対応のピクセルを制御することなく、すなわち偏光方向を変えることなく、励起光をＭＤＢの出力部２に到達させる。
　ＳＬＭの上記ピクセル（領域ａ）を制御すれば、励起光の偏光方向が回転して、偏光方向次第では光の一部が出力部２に、残りの成分が出力部３に達する。出力部３には、例えばガラスファイバからの様々な偏光方向へのカップリングに起因する強度変動を補整するための制御量として利用できる励起光出力の測定用モニタ・ダイオードＭ２が配備されている。さらに、この作動方式は光源個別波長の迅速な遮断または減衰にも使用することができる。
　出力部２（図５参照）の方向に連結された直線偏光の励起光はスキャナＳＸおよびＳＹに達するが、これらスキャナは対物レンズ（Ｐ３）の後方焦点面に共役な顕微鏡装置のひとみ面にあるので、回折の制御下でフォーカシングされた励起点を試料のｘｙ平面で移動させることが、すなわち、試料を走査することができる。試料への結像は走査光学系（ＳＯ）、鏡胴レンズ（ＴＬ）および対物レンズ（Ｏ）を通じて行われる。リレー光学系（ＲＬ）は顕微鏡装置の共役ひとみ面（ＳＸ、ＳＹ）を生成する。リレー光学系は現状技術の特殊型配置では省略することが可能である。例えば、ＳＸとＳＹ間の距離を短縮した場合ではこれを省くことができる。
　試料から放出された光は、対物レンズＯ（例えば顕微鏡対物レンズ）を通って収束され、これと鏡胴レンズとの共同作用で顕微鏡装置の中間像平面ＺＢに結像する。そこから光はスキャナＳＸ／ＳＹおよびリレー光学系ＲＬを通ってＭＤＢの入力部２に戻る。試料から放出された光は殆どが非偏光の状態なので、ビームスプリッタＰ２（図４参照）で互いに直角な２つの偏光方向Ｐｏｌ　１とＰｏｌ　２に分割される。
　試料に例えば蛍光を励起させれば、そのスペクトルはストークスシフトにより励起光に対して位置ずれする。従って、蛍光は分散素子Ｄ１およびＤ２の作用により、ＳＬＭの領域ａとは異なる別のピクセル（領域ｂ）に到達する（これについては図６も参照のこと）。領域ｂのピクセルは、偏光角が入射光に対して好ましくは９０°回転した方向になるように制御されている。このようにして、蛍光は出力部４に到達する（図４参照）。しかし、後方散乱した非偏光励起光は領域ａのピクセルに達し、従って偏光回転されないので、出力部５に到達する。
　ＭＤＢの出力部４に達した試料光は、続いて、結像光学系（ＰＯ）により共焦点絞り（ＰＨ）を通されフォーカシングされる。それにより、焦点外の検出光は排除される。非共焦点検出の場合は絞りを省くことができる。共焦点絞りの後には、試料で励起された光線の検出のための検出器（ＤＥ１）が配置されている。蛍光またはルミネセンスの撮影では、試料から後方散乱した励起光の追加抑制またはスペクトル検出領域の制限のために、放出フィルタ（ダイクロイック・フィルタ）Ｆの向きを変えることができる。
　試料放出光の偏光を検出すべき場合、例えば、蛍光異方性の測定の場合、それは検出器ＤＥ１およびＤＥ２によって行うことができる。各場合の偏光は、互いに垂直方向に偏光されている２成分から合成することができる。互いに垂直方向にある両偏光成分は、例えば図には描かれていないラムダ・ハーフプレートのＰ１、Ｐ３間への挿入下でＤＥ１およびＤＥ２により別々に測定される。続いて、検出器ＤＥ１とＤＥ２の信号比率を求めることにより、それぞれの偏光を推定することができる。
　別法として、両検出器ＤＥ１およびＤＥ２の信号が同じになるように、対応のＳＬＭピクセルを制御する方法もある。ＳＬＭピクセルの制御技術から、対応の蛍光偏光を推定することができる。その場合、ＳＬＭのピクセルを個別色毎に逐次適合させることにより、蛍光異方性のスペクトル分割による測定が可能である。
　ＭＤＢの出力部５に達し（一部は光源ＬＱの方向に進む）、絞りを通った試料からの後方散乱または反射による励起光は、結像光学系（ＰＯ）により、共焦点絞り（ＰＨ）を通してフォーカシングすることもできる。それにより、焦点外の検出光は排除される。共焦点絞りの後には、試料から後方散乱した励起光線を検出するための検出器（ＤＥ２）が配置されている。
　図９は、ＭＤＢ１通過型でないもう１つの光源ＬＱ２が連結されているレーザ走査型顕微鏡（ＬＳＭ）のｘ−ｚ平面で適用される、本発明に基づく配置のまた別な態様を図式化したものである。
　既に図８を基に説明した配置に比べ、出力部６（図５参照）にモニタ・ダイオードＭ１が別途配備されている。励起光線を偏光方向Ｐｏｌ　１だけでなく、偏光方向Ｐｏｌ　２にも連結する場合では、Ｍ１が結合出力を測定する。測定信号Ｍ１が設定値からずれていれば、Ｍ２において別な然るべき設定値が決められるように、それ相応にＳＬＭを制御する。
　この制御によって、例えば、光源ＬＱとＭＤＢ入力部１との間に配置されているガラスファイバへの連結における効率のブレが補整できる。連結効率、つまり試料方向へ連結された光の出力は、例えば、ガラスファイバへの連結不調により、または偏光を維持するガラスファイバにおける様々な偏光方向への連結により影響を受けることがある。
　蛍光鏡検では、広いスペクトル域からの種々様々な光源が使用されている。例えばＵＶ光源（波長４００ｎｍ未満）や多光子励起（波長８００ｎｍ超）の場合など、特定波長領域ではＳＬＭの透過率が低いので、ＳＬＭ経由での光源の連結は好ましくない。その対応策として、これらの光源（ＬＯ２）は、出力部２と、第１スキャナ、例えばＳＸとの間に配置されている従来型ビームスプリッタＭＤＢ２により、ＳＬＭを通る光源ＬＱ１と結合させることができる。
　これらの光源の場合、検出は殆どが波長領域４００〜８００ｎｍで、すなわち、例えばＳＬＭを通して、または現状技術レベルの検出器により行われる。ＭＤＢ　１の出力部４に到達した試料放出光は、現状技術レベルのダイクロイック・ビームスプリッタＮＦＴの追加配備により、別々の共焦点検出器（例えばＤＥ１およびＤＥ２）へと分割される。
　図１１および図１２は、レーザ走査型顕微鏡のｙ−ｚ平面およびｘ−ｚ平面において適用された、本発明に基づくまた別な配置を示している。構成素子の作用は、上記構成素子の場合に準ずる。以下に説明する変形は検出光路に関するものである。
　ここでは、上記配置と異なり、検出対象である試料光線は、Ｐ２、Ｐ４の通過、Ｄ１によるスペクトル分離およびＳでの偏光成分操作の後に、ビームスプリッタＰ１およびＰ３（図ではＰ１の後に隠れている）により励起光線から分離される。図に描かれている通り、ここではＰ１およびＰ３はＹ軸に沿って延びているので、それらによりスペクトル分布の全体を転向させることができる。
　被検出光線については、個々のスペクトル成分の集合化は行わない。その代りに、Ｐ１で励起光とは別な偏光を示す検出光、つまり蛍光には線走査検出器ＺＤ　１によって、散乱光には、図１２に描かれているような長軸方向がｙ座標に沿って配置されている線走査検出器ＺＤ　２によって、検出方向に導かれる検出光のスペクトル分解測定が行われる。線走査検出器上への結像は、ピンホール光学系ＰＯから光学的分解の調整用共焦点スリット絞りを通して行われる。
　スリット絞りに代えて、あるいはそれに加えて中間像ＺＢ／ＰＨに、ピンホール絞りを配置することもできる。共焦点絞りＰＨは、スキャナＳＸ／ＳＹとＭＤＢ間に中間像ＺＢ／ＰＨを入れ、さらにリレー光学系ＲＬを付け加えることによって実現することもできる。それにより、スリット絞りに代えてピンホール絞りが使用できるので高い分解能が達成される。この配置によれば、偏光特性のスペクトル分解測定が上記方法に従い極めて有利に行える。
　本発明に基づくいずれの配置でも、その配置に対応して出力部を取り換えることも可能である。
　図４〜７のＭＤＢは、観察対象特定領域ＲＯＩ（特許文献１参照）の走査にも適している（図１０参照）。この場合では、使用者が予備選択した特定領域に限定して、特定波長および特定出力のレーザ光が利用される。図１０では走査フィールド内の２領域ＲＯＩ　１およびＲＯＩ　２が例示されている。波長の切換または励起出力の調整はＳＬＭの然るべき制御によって行われる。それにより、偏光状態に対応の変化が現われる。
　上記スキャナの機能は、原則として、対応の走査テーブル（対象物スキャナ）によって代用することもできる。
　本発明は、広域視野型顕微鏡、蛍光顕微鏡、点走査型レーザ走査顕微鏡または線走査型レーザ走査顕微鏡、細胞流量メータ、照明光路および／または検出光路にピンホール・ラスタの配備された平行型共焦点顕微鏡または周期性構造の対象物への結像のための構造位相シフト機能付き顕微鏡装置および対象物位相シフト像の撮影作業において特に有利に適用される。
一光子吸収（ａ）、多光子吸収 共焦点レーザ走査型顕微鏡 波長に依存する反射度（反射能）のグラフ（ａ）、試料照明光学系の開口数を制限することによる、励起光の放出光からの分離（ｂ）、本発明の配置（ｃ） 検出光路における励起光を検出光から分離するための配置 励起光路における励起光を検出光から分離するための配置 図４および図５のｙ−ｚ平面を示す ｘ−ｙ平面におけるピクセル 本発明に基く配置のレーザ走査型顕微鏡 本発明に基く別の配置のレーザ走査型顕微鏡 走査フィールド内の観察対象特定領域 本発明に基くさらに別の配置のレーザ走査型顕微鏡 本発明に基くさらに別の配置のレーザ走査型顕微鏡
符号の説明
　ＬＳＭ　　　　レーザ走査顕微鏡
　（１）　　　　光線
　（２）　　　　試料
　（３）　　　　平板
　（４）　　　　光学系
　（５）　　　　光線方向
　１〜６　　　　入出力部（ポート）
　ＳＸ、ＳＹ　　　　スキャナ
　ＲＯＩ　　　　走査対象領域
　Ｐ１〜Ｐ４　　　　ダイス型偏光ビームスプリッタ
　Ｄ１、Ｄ２　　　　分散素子
　ＳＬＭ　Ｓ　　　　空間光変調器
　Ｌ１、Ｌ２　　　　光学系
　Ｐｏｌ　１、Ｐｏｌ　２　　　　偏光方向
　ＬＤ　　　　非偏光
　Ｐ２　　　　偏光スプリッタ
　ＭＤＢ　　　　メインカラースプリッタ
　ＬＱ　　　　光源
　Ｍ２　　　　モニタ・ダイオード
　ＳＯ　　　　走査光学系
　ＴＬ　　　　鏡胴レンズ
　Ｏ　　　　　対物レンズ
　ＲＬ　　　　リレー光学系
　ＺＢ　　　　中間像平面
　ＰＯ　　　　結像光学系
　ＰＨ　　　　共焦点絞り

Claims (29)

  1. 　照明光および／または試料光のスペクトル組成および／または強度を制御下で変更するための方法であって、
    　その内訳として、第１偏光手段によって、異なった偏光を持つ光線成分への空間分離が行われるステップ、
    　第１分散手段によって、少なくとも１つの光線成分のスペクトル空間分割が行われるステップ、
    　スペクトル空間分割された光線成分の少なくとも一部の偏光状態が変更されるステップ、
    および第２偏光手段によって、異なった偏光を持つ光線成分の空間分離および／または空間集合が行われるステップ、
    を含む方法。
  2. 　第２分散手段によって、偏光状態が変更された、および変更されなかった光線成分の空間集合が行われる請求項１に記載の方法。
  3. 　照明光のスペクトル組成および／または強度を変更するための光学的配置であって、
    　少なくとも１つの光線成分のスペクトル空間分割のための第１分散手段（Disp １）が前置または後置されている、異なった偏光を持つ光線成分への空間分離のための第１偏光手段、
    　スペクトル空間分割された光線成分の少なくとも一部の偏光状態の変更のための手段、
    　および異なった偏光を持つ光線成分の空間分離および／または空間集合のための第２偏光手段、
    から構成される光学的配置。
  4. 　偏光状態が変更された、および変更されなかった光線成分の空間集合のために、第２分散手段が第２偏光手段に対して前置または後置されている請求項３に記載の配置。
  5. 　試料光のスペクトル組成および／または強度を変更するための光学的配置であって、
    　少なくとも１つの光線成分のスペクトル空間分割のための第１分散手段が前置または後置されている、異なった偏光を持つ光線成分への空間分離のための第１偏光手段、
    　スペクトル空間分割された光線成分の少なくとも一部の偏光状態の変更のための手段、
    　および異なった偏光を持つ光線成分の空間分離および／または空間集合のための第２偏光手段、
    から構成される光学的配置。
  6. 　試料光の位置別分割検出を行う請求項５に記載の配置。
  7. 　偏光状態が変更された、および変更されなかった光線成分の空間集合のために、第２分散手段が第２偏光手段に対して前置または後置されている請求項５に記載の配置。
  8. 　照明光と試料光の分離のための配置であって、
    　少なくとも１つの光線成分のスペクトル空間分割のための第１分散手段が前置または後置されている、異なった偏光を持つ光線成分への空間分離のための第１偏光手段、
    　スペクトル空間分割された光線成分の少なくとも一部の偏光状態の変更のための手段、
    　および異なった偏光を持つ光線成分の空間分離および／または空間集合のための第２偏光手段、
    から構成される配置。
  9. 　偏光状態が変更された、および変更されなかった光線成分の空間集合のために、第２分散手段が第２偏光手段に対して前置または後置されている請求項８に記載の配置。
  10. 　試料の照明が分離用配置の領域外にある光源によって行われ、試料光がその配置領域内を通過する請求項８または９に記載の配置。
  11. 　照明光および／または試料光を互いに垂直な偏光成分に分割する請求項３から１０のうちの１つに記載の配置。
  12. 　試料光の少なくとも一部が少なくとも１つの検出器によって検出される請求項３から１１のうちの１つに記載の配置。
  13. 　照明光源としてレーザが配備されている請求項３から１２のうちの１つに記載の配置。
  14. 　光源として白色光源が配備されている請求項３から１３のうちの１つに記載の配置。
  15. 　照明が複数の波長によって行なわれる請求項３から１４のうちの１つに記載の配置。
  16. 　試料から発せられる蛍光および／またはルミネセンス光および／またはりん光および／または散乱光を検出する請求項３から１５のうちの１つに記載の配置。
  17. 　撮像の間、照明光の強度および／またはスペクトル組成を変更させ、それにより試料の異なった箇所に対して異なった照明を行う請求項のうちの１つに記載の配置。
  18. 　分散ユニットに組み込まれた結像光学系が、スペクトル成分を焦点面に結像させるために配備されていて、焦点面にはスペクトル空間分割された光線成分の少なくとも一部の偏光状態を変更させるための手段が配置されている請求項３から１７のうちの１つに記載の配置。
  19. 　偏光状態の変更が、制御可能な液晶を有するＳＬＭ（空間光変調器）によって行われる請求項３から１８のうちの１つに記載の配置。
  20. 　検出光における偏光状態のスペクトル分割による捕捉のための同時または逐次方式による上記請求項の１つに記載の測定方法。
  21. 　光源および／または光学素子によって惹起された励起光の強度変動に対する上記請求項の１つに記載の補整方法。
  22. 　上記請求項の１つに記載の配置を持つ広域視野型顕微鏡。
  23. 　上記請求項の１つに記載の配置を持つ蛍光顕微鏡。
  24. 　上記請求項の１つに記載の配置を持つ点走査型レーザ走査顕微鏡。
  25. 　上記請求項の１つに記載の配置を持つ線走査型レーザ走査顕微鏡。
  26. 　デスキャン、部分デスキャンまたはノンデスキャン検出が行われる請求項２３〜２５の１つに記載の走査型顕微鏡。
  27. 　上記請求項の１つに記載の配置を持つ細胞流量メータ。
  28. 　照明光路および／または検出光路にピンホール・ラスタが配備されている上記請求項の１つに記載の配置を持つ平行型共焦点顕微鏡。
  29. 　上記請求項の１つに記載の配置を持つ、周期性構造を対象物上へ結像させるための装置、および当配置での構造の位相シフトおよび位相シフトされた像の撮影。
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