JP2004170977A - 分解能の深度で試料を光学的に把握する方法および配置 - Google Patents

Abstract

【課題】試料の上または中で作り出された少なくとも１つの波長の照明光の配分と、特に試料との相互作用に基づき影響された光の、特に蛍光および／または反射光および／またはルミネセンス光および／または分散されたおよび／または透過した光の検出とを有する、試料を深度分解能をもって光学的に把握するための方法および配置
【解決手段】照明光が少なくとも１つの空間方向において変調を有し、照明光と同様に変調された検出光が互いに位相移動を有する２つの成分Ｄ１（ｘ），Ｄ２（ｘ）に空間的に中間イメージＺＢ／Ｍ内で区分され、これらが別々に測定され、それらから試料の光学的断面像および／または部分試料が算出される。
【選択図】図２

Description

本発明は顕微鏡法、特に主として生物学上の試料、プレパラートおよび付随する部品を検査するための蛍光顕微鏡法における方法および配置に関する。
これには、蛍光検出に基づく作用物質をスクリーニングするための方法（高スループットスクリーニング）が含まれる。蛍光試料をリアルタイムに同時に検査することが、試料を数個の点で同時に照明することによって可能となる。

生物学上のプレパラートを検査するための古典的な光学顕微鏡法利用分野が、蛍光顕微鏡法である（文献：Ｐａｗｌｅｙ、「生物学共焦点顕微鏡法ハンドブック」；Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ １９９５）。ここでは細胞部分から表示される特定の色素を識別するために使用される。

入射する特定のエネルギーの光子は、色素分子を光子吸収によって基底状態から励起状態に励起する。この励起はふつう一光子吸収と名づけられる。こうして励起された色素分子はさまざまな仕方で基底状態に戻り着くことができる。蛍光顕微鏡法では、その過程は蛍光光子放出に基づいて行われるのが最も重要である。放出される光子の波長はストークス変位に基づき励起光と比較して一般に赤に押し動かされ、すなわちより長い波長を所有する。ストークス変位は蛍光光を励起光から分離することを可能とする。

蛍光光は、適合したダイクロイック・ビームスプリッタとそれに組み合わされたブロックフィルタによって励起光から分割され、別々に観察される。これによって、個別のさまざまな色素によって染められた細胞部分を表示することが可能である。原則的にはしかし、プレパラートの数か所の部分が同時に、さまざまな固有に付加された色素で染めることもできる（多重蛍光）。個別の色素から送出された蛍光信号を区別するため、やはり特別なダイクロイック・ビームスプリッタが使用される。

１個の高エネルギ光子によって色素分子を励起すること（一光子吸収）のほかに、数個のより低いエネルギの光子による励起も可能である。個々の光子のエネルギ総和は、このときおおよそ何倍もの高エネルギ光子に相当する。この種の色素励起は多光子吸収と名づけられる（文献：Ｃｏｒｌｅ、Ｋｉｎｏ；「共焦点走査型光学顕微鏡法と関連画像システム」；Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９６）。色素放出は、しかし、この種の励起によって影響されず、すなわち放出スペクトルは、多光子吸収の場合、負のストークス変位を受け、励起光に比較してより短い波長を所有する。励起光を放出光から分離することは一光子吸収の場合と同様の仕方で行われる。

現行技術に従う方法、いわゆる構造照明法では、振幅構造（たとえば格子）の光学イメージの変調深度が光学上のイメージの基準として用いられる。周期的構造のイメージは、変調の周波数と変調の位相位置（イメージ位相）とによって特徴付けられる。光軸に垂直な構造の位相移動によって、異なる投影シナリオを保有することができる。帯状構造のない、深度弁別することのできる光学的断面を算出することができるためには、一般に少なくとも０°，１２０°，２４０°における３つの位相イメージ（ＰＢ）が必要である。

これらの位相イメージは続いてイメージ・プロセッサにおいて（共焦点）光学的断面像へ、以下の公式によって計算される：
Ｉ_section（ｘ）＝Const_√（（Ｉ（ｘ，０°）−Ｉ（ｘ，１２０°））^２＋（Ｉ（ｘ，１２０°）−Ｉ（ｘ，２４０°））^２＋（Ｉ（ｘ，０°）−Ｉ（ｘ，２４０°））^２）
ここでＩ（ｘ，角度）は対応する位相イメージにおける各画素の強度を表す。

光学的断面像を発生させるための測定のチャート図を図１に模式的に示す。３個以上の位相イメージの特徴づけは最も簡単な場合逐次に行われる。このとき、試料がイメージ測定の間移動しないということが前提となる。こうして位相イメージから算出された断面像もしくは断面の積層は、続いて３−Ｄ評価ソフトウェアを介して標準的なＰＣおよびモニタ上で表示することができる。

光軸に沿う位置分解能は、光の波長、対物レンズの開口数および変調周波数に依存する。
算出アルゴリズムの詳細な記述は、Ｔ．Ｗｉｌｓｏｎら；「従来型顕微鏡における構造光を用いた光学的断面作成法」；非特許文献１ならびに特許文献1を参照のこと。
ＷＯ９７０６５０９ Ｏｐｔｉｃｓ・Ｌｅｔｔｅｒｓ２２（２４） １９９７

３次元に照明されたイメージから、対応する一光子吸収もしくは多光子吸収と結合して、対物レンズの焦平面に存在する平面（光学的断面）のみが再生される。試料のさまざまな深さｚにおけるｘ−ｙ平面内の数枚の光学的断面を特徴づけることにより、続いて計算機の助けにより試料の３次元イメージを発生させることができる。

構造化された照明はそれゆえ厚いプレパラートを検査するのに適している。励起波長は、固有の吸収特性を有する使用色素によって決定される。色素の放出特性に合致したダイクロイック・フィルタが、それぞれの色素から送出された蛍光光のみを点イメージ検出器によって測定されることを保証する。

貫流細胞計は細胞や他の粒子を検査し分類するのに役立つ。細胞は液体溶質のため、毛細管によって吸い出される。細胞を検査するため、レーザ光が側方から毛細管内に焦点を結ぶ。細胞はさまざまな色素または蛍光を発する生分子によって染められている。測定されるのは励起された蛍光光および分散された励起光である。試料の蛍光信号を励起光から分離するのはダイクロイック・ビームスプリッタ（ＭＤＢ、図２を見よ）を介して行われる。
現行技術は「Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ Ｓｏｒｔｉｎｇ」、第２版、Ｍ．Ｒ．Ｍｅｌａｍｅｄ、Ｔ．Ｌｉｎｄｍｏ、Ｍ．Ｌ．Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ、Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ株式会社、ニューヨーク、１９９０、８１−１０７ページに記載されている。

分散された信号から、細胞の大きさを決定することができる。個々の細胞の蛍光のスペクトル特性を介して、さまざまな細胞を分離／分類しまたは別々に数えることができる。細胞の分類はさまざまな毛細管内の静電場により行われる。結果は、すなわちたとえば色素Ｂを有する細胞に比較した色素Ａを有する細胞の数はヒストグラムで表示されることが多い。貫流速度は典型的には数十ないし数百ｃｍ／ｓである。したがって高感度検出が必要となる。検出容積を縮小させるためには、現行技術に従い共焦点検出が行われる。

色素を選別するための配置、たとえばいわゆるチップリーダのようなものは、それらの光学的構成においてレーザ走査型顕微鏡に似ている。それらは、しかし、巨視的な試料を検査するために、たとえば生体素子上の作用物質をスクリーニングするために、はっきりとより大きいイメージ視野を走査する。走査場の縁の長さはこの場合数十ｍｍである。これらの走査場は、たとえばガルボスキャナの走査角を拡大することによって、試料を顕微鏡配置の中間イメージ内で規範的に図７Ａのように配置することによって、または中間イメージを拡大して試料上に結像する特別な対物レンズ配置（マクロ対物レンズ）によって達成することができる。

現行技術で不利な点は、数個のイメージが逐次に記録され、読み出され、計算されなければならないことである。このことはさまざまな投影シナリオについて調節ユニットの必要性が特に高くなり、さもなければ残留変調（残留構造）がイメージ中に残る。加えて、３枚の位相イメージを撮像する速度は、共焦点断面像を作り出すことのできる速度からファクタ３だけ減少する。さらに、試料の非共焦点背景信号（たとえば焦平面外部の信号）の強さに応じて、利用可能な検出器のダイナミックレンジが縮小する。

本発明の配置を介して、光学的断面像を検出器に作り出すことはすでに可能である。それゆえ、検出器のダイナミックレンジが、非共焦点背景信号によって縮小することを避けられる。位相イメージをＰＣにおいて計算するために逐次記録し読み出すことももはや不必要で、これによって検出器の速度は、十分に共焦点断面像を撮像するために利用状態となる。残留変調が共焦点断面像中に生じることは避けられる。

本発明に記載の解決法は、イメージ作成顕微鏡システムにも、解析顕微鏡システムにも投入可能である。

図２Ａ（側面図）および図２Ｂ（平面図）は、本発明に従う線形スキャナ用配置を図示する。光路内の実線は照明光路を、破線は検出光路を表す。
線形スキャナの場合、試料ＰＲはたとえばＸ軸に沿う線形焦点で照明され、線に垂直な座標軸内で押し動かされる。このため、１波長でも数波長でも射出する光源ＬＱ（部分図Ａ）は、波長帯の光源あるいは白色光源でもよく、顕微鏡装置の中間イメージ平面ＺＢ内のレンズ系、円筒レンズＺＬと伝達レンズＲＬを介して線形に焦点を結ぶ。

第２の中間イメージＺＢ／Ｇ、ここでは振幅格子Ｇ、にＹ方向で焦点を結ぶことにより、回折を抑えられた線形の強度配分が、スキャナＳＣ、走査レンズ系ＳＯ、円筒レンズＴＬおよび対物レンズＯ通過後に、Ｘ軸に沿って試料ＰＲ上で得られる。Ｐは顕微鏡配置の瞳孔である。Ｘに沿った試料上の線形強度配分は、さらに回折素子またはホログラフィ素子によって現行技術に従い行うことができる（文献：「回折光学系が製品設計を改善する」、Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｓｐｅｃｔｒａ、Ｌａｗｒｉｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ株式会社、１９９５年９月）。このため回折素子は顕微鏡の瞳孔内で特に励起光内で配置される。

さらに、特許文献1（ＵＳ４８２６２９９）に記載されているいわゆるパウエルレンズを投入することができる。後者の素子は円筒レンズに比較してガウス型照明強度配分の場合、これはたとえば単一モードレーザについて典型的なものであるが、線に沿ってより均一な強度配分を作り出す。パウエルレンズおよび回折もしくはホログラフィ素子は、このためたとえば顕微鏡装置の瞳孔平面内で特に有利に光源とスキャナとの間に配置される。

リレーレンズ系ＲＬにより光は顕微鏡配置の瞳孔ＳＣ内へ結像される。顕微鏡配置の瞳孔平面Ｐ，ＳＣおよびＭＤＢ内ではそれぞれ１本の線形焦点がＹ軸に沿ってできる。瞳孔平面ＳＣおよび主カラースプリッタＭＤＢが存在する平面は、互いにかつ対物レンズ（Ｐ）の後方焦平面に共役な顕微鏡配置瞳孔平面であるから、スキャナは線形かつ回折が抑えられて焦点を結ぶ強度配分をこれに垂直に移動させることができる（試料内のＹ軸）。

ＺＢの結像は、走査レンズ形（ＳＯ）、円筒レンズ（ＴＬ）および対物レンズ（Ｏ）を通じて試料内へ行われる。リレーレンズ系（ＲＬ）は顕微鏡配置の共役瞳孔平面ＭＤＢおよびＳＣを作り出す。リレーレンズ系は特別な配置内では技術の状況に従い省くこともできる。たとえばＭＤＢとＳＣとの間の距離を短縮する場合は無しで済ますことができる。
さらに直接素子ＭＤＢをＳＣ、スキャナ上に持ち込み、線形焦点をＹ方向に走査するために使用することもできる。この配置の場合、リレーレンズ系およびそれによって瞳孔平面ＭＤＢは完全に無しで済ますことができる。

線を作るための伝達レンズ系ＺＬは、原理的に反射素子、たとえば焦点がＭＤＢ上にある円筒鏡によって置き換えることができる。円筒鏡はそのとき（示さない）、図７Ａで名づけたｘｚ平面内に４５°で配置される。この平面内で鏡はその焦点作用をも所有する。さらに鏡によって光源への光路は９０°偏角される。

検出器ＤＥ（位置分解能のある）への背後方向の観察光路は、たとえば蛍光励起の場合、破線で記入されている。試料交換作用の種類に基づき、たとえば蛍光励起またはルミネセンス励起の場合、試料から放出される光は空間コヒーレンスが小さい。すなわち試料内で励起される各点は本質的に隣接点に依存せず点放射体として全空間方向へ放射する。

レンズ系Ｏ（たとえば顕微鏡対物レンズ）は個々の点放射体を共通に円筒レンズＴＬにより顕微鏡装置の中間イメージ平面ＺＢ内へ結像し、このとき瞳孔Ｐは同じ形で互いに本質的に非コヒーレントなさまざまな広がり方向の波面内で照明される（破線の光路）。
続いて試料の光は結像レンズ系（ＰＯ）の力で、共焦点検出の場合スリット絞り（ＳＢ）（姿勢―スリット縦方向が図上のＸ方向）によって焦点を結び、それによって焦点の外部に生じる検出光が抑制される。

スリット絞りの後ろには、位置分解能のある（線形焦点に沿って）ライン検出器または面検出器（ＤＥ）（姿勢―ラインＸ方向）が存在し、これが試料内で励起および／または分散された光放射を検出する。線形焦点はガルボスキャナＳＣにより空間方向に走査される。蛍光またはルミネセンスを撮像する際、試料から分散された励起光を抑制するため、放射フィルタが検出光路内で特にＰＯとＳＢ（ダイクロイック・フィルタＦ）の間に出し入れされる。

素子ＭＤＢおよびＺＢ／Ｇを図３および４に基づき説明する。
瞳孔内に、図３に示した励起光を検出光から分離する素子ＭＤＢが存在する。説明のため素子ＭＤＢは拡大して示している。ＭＤＢはハッチで示した領域ＨＲ内で鍍金されている。無地の領域ＨＴは特に試料励起が行われるべき波長領域について特に透過性が高い。他のＭＤＢの縁取りは顕微鏡ユニットの瞳孔直径を示す。最も簡単な場合ＨＲ領域は、ラインを反射させるのに十分な狭幅の鏡であってよい。

励起光はＨＲ領域上へ焦点を結ぶ。試料から直接反射した光は、再びＨＲ領域上に到達し、光源へと向かう。試料内で拡散性に分散された励起光および／または励起された光は、顕微鏡光学系の瞳孔サイズに応じてＭＤＢの全面上に当たり、このときＨＴ領域上に当たった成分は観察のために中間イメージＳＢ／ＤＥ内に到達する。この配置ではＭＤＢにおいてＨＲ領域上に落ちた検出光成分のみが失われることとなる。

ＨＴのＨＲに対する面積比は：
Ｒ＝（Ａ_Pupille_Ａ_ＨＴ）／Ａ_Pupille＝（πｒ_Pupille−ｂ_ＨＴ）／πｒ_Pupille
ここで顕微鏡のＨＴ領域についての瞳孔半径は典型的には約５ｍｍであり、ＨＲ領域の幅は約ｂＨＴ＜０．２５ｍｍである。それゆえ比率と、それによりＭＤＢのビーム分配効率についてはＲ＝９７％となる。

図２の位置ＺＢ／Ｇにおいて（中間イメージ）、図２Ｂには格子構造が存在する。格子Ｇは交互に高透過領域および高反射領域を、特に周期的な直角格子または正弦波格子を有する。格子線はＹ軸に沿って存在し、すなわちＺＬによって作り出される線に垂直である。格子はｙｚ面内で（図２Ｂ）特に４５°だけＸ軸に傾いて配置され、特に励起光および検出光によって通過されている。他の傾き角で、空間的に部分ビームａおよびｂに分割することが可能なものも考え得る。励起光にはそれゆえ走査線にそって構造が刻印される。

図４はＺＢ／Ｇにおける格子の規範的な配置を図示する。焦点領域からの検出光は、この場合、後方検出器の方向に再び鮮明に構造ＳＴの場所に結像するので、矢印方向に構造ＳＴを有する格子上へ、優先的に、格子の高透過性を有する領域上へ到達する。これに反して、焦点の外部にある試料領域からの検出光は、それは構造ＳＴ上へ結像するのが鮮明でないから、一様に鍍金領域と非鍍金領域との上へ分配されて到達する。構造ＳＴはこのように焦点からの検出光について絞りのように作用し、それによって焦点外部からの信号が少なくとも５０％抑制される。

構造ＳＴの作用によって、照明細胞に沿って変調された検出光は、周期的構造が互いにＰ１から位相移動を有する２成分に分解される。両成分は以下インフェーズ成分ａおよびアウトフェーズ成分ｂと呼ぶ。主としてアウトフェーズ成分は全反射鏡ＳＰ２を通じて検出器区分Ｄ２の方向に到達し、インフェーズ成分は検出器区分Ｄ１上へ到達する。
インフェーズ成分ａはこのとき共焦点断面像からの信号Ａプラス背景信号Ｂに構造ＳＴのアウトフェーズ成分を乗じたもの（後記式参照）を含む。アウトフェーズ成分ｂは共焦点断面像Ａプラス背景信号Ｂに構造ＳＴのアウトフェーズ成分を乗じたものを含む。
両成分はピンホールレンズ系ＰＯによって２本の検出器ライン上へ結像する。図４のイメージカットは両ラインを有する検出器ＤＥを示す。模式的に記入されているのは、ｘ軸に沿って結像された構造ＳＴのインフェーズおよびアウトフェーズ成分である。

測定量の説明は、以下にｘ軸に沿って周期ｋを有する走査線の余弦型構造化を仮定して行う。それは解析的表現を導くのが単純化されるからである。他の構造化に当てはめることも制限なしに可能である。試料の信号Ｆ（ｘ）、インフェーズ成分Ｄ１（ｘ）およびアウトフェーズ成分Ｄ２（ｘ）についてｘ軸に沿って余弦型構造化を仮定して得られる：
試料の信号Ｆ（ｘ）＝Ｂ（ｘ）＋Ａ（ｘ）（ｃｏｓ（ｋｘ）＋１）
インフェーズ信号Ｄ_１（ｘ）＝Ｆ（ｘ）（ｃｏｓ（ｋｘ）＋１）
アウトフェーズ信号Ｄ_２（ｘ）＝Ｆ（ｘ）（ｓｉｎ（ｋｘ）＋１）

試料点を観察する際、この試料点は構造を走査線に沿って押し動かす際さまざまに明るく照明される。構造の一様な、たとえば周期的な押し動かしの際にも、走査線に沿う余弦型の構造は試料信号の余弦型時間変調へと当てはまり、それによって以下の表現が得られる：
試料の信号Ｆ（ｘ，τ）＝Ｂ（ｘ）＋Ａ（ｘ）（ｃｏｓ（ｋτ）＋１）
インフェーズ信号Ｄ_１（ｘ，τ）＝Ｆ（ｘ）（ｃｏｓ（ｋτ）＋１）
アウトフェーズ信号Ｄ_２（ｘ，τ）＝Ｆ（ｘ）（ｓｉｎ（ｋτ）＋１）

検出器ＤＥはインフェーズ成分Ｄ１（ｘ）およびアウトフェーズ成分Ｄ２（ｘ）をピクセル保持時間ｔの積分し、積分された個別信号は続いて相互に減じ、それによって以下の積分測定信号Ｓ（ｘ，ｔ−−＞無限大）についての解析的表現が余弦型構造化を仮定して得られる：
測定信号Ｓ；
Ｓ（ｘ，ｔ）＝_０∫^ｔＤ_１（ｘ，τ）ｄτ−_０∫^ｔＤ_２（ｘ，τ）ｄτ
Ｓ（ｘ，ｔ）＝１／ｔ（［ｓｉｎ（ｋｔ）＋ｃｏｓ（ｋｔ）］（Ｂ（ｘ）＋Ａ（ｘ）／２ｃｏｓ（ｋｔ）＋Ａ（ｘ））＋Ａ（ｘ）ｔ／２Ｂ（ｘ）３Ａ（ｘ）／２）
Ｓ（ｘ，ｔ→∞）＝Ａ（ｘ）／２
測定信号Ｓは、大きいピクセル保持時間ｔについては光学的断面像からの信号半分、すなわち、焦点外の平面から生じる背景信号なしの望ましい情報に相当する。

図５は測定信号Ｓ（ｔ）のピクセル保持時間ｔへの、ここでは一定の点位置ｘについての依存性を示す。注目すべきは、測定信号Ｓは１０周期ｋより大きいピクセル保持時間ｔについてすでに共焦点断面像からの信号Ａ／２に相当するということである。

構造を試料に相対的に押し動かすことは、たとえば格子Ｇをｘ方向に押し動かすことによって、またはｘ軸に沿う押し動かしが試料上に作り出す座標系内でスキャナＳＣを移動させることによって、行われる。

振幅格子を使用する際、通常励起光のエネルギの５０％が失われる。励起光路内で透過効率を高めるため（図６を見よ）、追加してすでに図４に記述した振幅格子の前にＧ２を挿入し、また光源方向にはＧ２の場所に干渉構造を作り出すために振幅格子Ｇ２と同じ格子周波数を有する位相格子あるいは振幅格子Ｇ１を、振幅格子Ｇ２に共役な、別のリレーレンズ系（記入していない）により作り出される励起光路内の別の中間イメージ平面内へ挿入することができる。これによって励起光のエネルギーが、効率的な結像が振幅格子Ｇ２によって行われるように再分配される。

別の長所として、検出器の方向に到達できるＧ２における励起光の迷光が最小となることがあげられる。干渉構造を通じて試料を照明する場合、図示したとおり光源とＭＤＢとの間で格子素子Ｇ２がその位置に留まるか、また検出器の前の中間イメージ（ＳＢ）内へ置かれて、本発明に従い試料から来る光について作用することができるかが長所となる。

図７は、励起光を検出光から分離するための別の有利な配置を示す。空間的な分離はこの場合中間イメージＺＢ／Ｍ内で行われ、このとき検出光もしくは励起光を傾けることがプリズム素子ＰＲ（素子の詳細は図８の説明を参照）により行われる。配置の長所は、励起光路および検出光路についてほとんどが高補正のレンズ系ＲＬを使用することにある。

図７には、構造化するための格子がチューブレンズＴＬとスキャナＳＣとの間の中間イメージ平面ＺＢ／Ｇ内（矢印）に記入されている。構造を試料に相対的に押し動かすことは、構造を押し動かすことによるか、または緩み板を投入することによって行うことができる。

構造化するための格子Ｇは、スキャナＳＣとプリズム素子Ｐとの間の中間イメージ平面内に配置される。これはたとえば、追加の中間イメージ平面を発生させるための追加のリレーレンズ系を投入することによって実現できる。これは、走査ラインが格子を通じて走査されず、それによって強度変動へはたとえば格子上の非一様性によって到達することができる長所を持つ。試料に対し相対的に構造を押し動かすことは、スキャナＳＣによっても行うことができる。リレーレンズ系は省くこともでき、検出器ＤＥは直接平面ＺＢ／Ｍ内に配置することができ、それによって光学的構成はさらに単純化される。

図８はプリズム素子の作用をｙｚ平面内に詳細に示す。示されているのは、基本走査レンズ系ＳＯ、プリズム素子ＰＲ／ＳＣ、走査レンズ系ＳＯ１、励起光を反射させて出すための平面ＺＢ／Ｍ内にある鏡Ｍである。規範的な素子Ｐの形成法は、部分図８Ａにｘｙ平面内およびｙｚ平面内で拡大して示す。右の図は、領域２外部の領域１内における素子ＰＲを通る断面を示す。

素子は透過性であり、うち領域１（薄色で示した領域）はプリズムを研磨してある。領域２は平面である（濃く示した領域）。これによって領域２上へ落ちるビーム（励起光）は、領域１上へ落ちるビーム（検出光）に対して、走査ラインに垂直（ｙ軸内）に偏向し、加えてスペクトルに分割される。

中間イメージ内では、さまざまに偏向した検出光（領域１から）のスペクトル成分および励起光（領域２から）はさまざまな場所に到達するから、励起光および検出光は空間的に分離することができる。
中間イメージＺＢ／Ｍ内で空間的に分離したスペクトル成分は、続いてたとえば図７でＸ−Ｙ平面内に配置されている検出器アレーによりスペクトル測定することができる。Ｙ軸に沿う検出器素子は、このときスペクトル情報を測定し、Ｘ軸に沿う素子は走査ラインに沿う情報、すなわち場所分解能情報を測定する。

プリズム素子ＰＲ上の領域１および２は原理的に交換することもできる。それによって励起光のスペクトル分割が行われ、公知技術から知られる手段により再び補償され、または光源のスペクトル成分を合成するために使用することができる。さらに透過性の素子Ｐは、適合する鏡配置によっても代替することができる。

構造化された照明の現行技術のチャート図 線形スキャナ用配置の側面図Ａおよび平面図Ｂ 素子ＭＤＢの拡大図 ＺＢ／Ｇにおける格子の規範的な配置 測定信号Ｓ（ｔ）のピクセル保持時間ｔへの依存性 振幅格子Ｇ２を追加した配置 励起光を検出光から分離するための別の配置 プリズム素子の作用を詳細に示す

符号の説明

ＰＲ 試料
ＬＱ 光源
ＺＢ イメージ平面
ＺＬ 円筒レンズ
ＲＬ 伝達レンズ
ＺＢ／Ｇ 中間イメージ
Ｇ 振幅格子
ＳＣ スキャナ
ＳＯ 走査レンズ系
ＴＬ 円筒レンズ
Ｏ 対物レンズ
Ｐ 瞳孔
ＳＢ スリット絞り

Claims (26)

1. 試料の面または中からの少なくとも１つの波長の照明光の配分と、特に試料との相互作用に基づき影響された光、特に蛍光および／または反射光および／またはルミネセンス光および／または分散および／または透過した光の検出とを有する、分解能の深度で光学的に試料を把握するための方法であって、
   少なくとも１つの照明光を変調し、照明光と同様に変調された２つに分れる検出光が互いに位相移動をして分割され、および少なくとも１つのインフェーズ成分あるいはアウトフェーズ成分が光学的断面像を撮像するために測定される方法。
2. 位相移動がＰｉ値である請求項１に記載の方法。
3. 検出光が互いに位相移動を有する２つの成分に空間的に区分され、これらが分離して測定され、それらから試料および／または部分試料の光学的断面像が算出される請求項１または２に記載の方法。
4. 分割して検出された位相移動が、互いに減じられる先行請求項のうちの１項に記載の方法。
5. 変調が少なくとも１次元空間的な、少なくとも１つの周期構造を刻印することにより行われる先行請求項のうちの１項に記載の方法。
6. 空間的な周期構造が照明光によっても試料光によっても照射される格子配置によって作り出される先行請求項のうちの１項に記載の方法。
7. 格子配置が試料の方向に反射させるように形成され、角度のある素子の配置によって照明光線に沿って変調され、分割して生じる検出光がそれらの構造を互いに位相移動で示す、照明光に関して透過性の低い領域を有する先行請求項のうちの１項に記載の方法。
8. 照明光路内および検出光路内にそれぞれ１基の同一格子周期を有する格子配置が配されている先行請求項のうちの１項に記載の方法。
9. 照明の走査移動が試料に相対的に行われる先行請求項のうちの１項に記載の方法。
10. 共焦点断面像を作り出すための、特に先行請求項のうちの１項に記載の方法を実施するための顕微鏡配置であって、
    構造化された試料の照明が行われ、試料光が構造および／または別の本質的に同一な構造を貫通し、照明光線に沿って変調された検出光が、構造が互いに位相移動を有する２つの成分に区分され、少なくともインフェーズ成分またはアウトフェーズ成分が光学的断面像を撮像するために測定される構造が配されている顕微鏡配置。
11. 位相移動がＰｉの量である請求項１０に記載の配置。
12. 成分が並行して検出され、検出信号から断面像が算出される先行請求項のうちの１項に記載の配置。
13. 構造および試料の相対移動が互いに行われる先行請求項のうちの１項に記載の配置。
14. 成分の測定が試料に共役な平面内の１基の検出器の２つの領域または２基の別々の検出器内で行われる先行請求項のうちの１項に記載の配置。
15. 成分の検出器信号の減算が行われる先行請求項のうちの１項に記載の配置。
16. レーザ走査型顕微鏡内の先行請求項のうちの１項に記載の配置。
17. 線形照明を有する請求項１６に記載の配置。
18. 広視野顕微鏡内の先行請求項のうちの１項に記載の配置。
19. 照明光内に少なくとも１基の振幅格子または１基の位相格子または１基の干渉型が配されている先行請求項のうちの１項に記載の配置。
20. 検出光内に照明光内の構造と本質的に同一の構造を有する振幅格子が配されている先行請求項のうちの１項に記載の配置。
21. 少なくとも１つの平行平面な領域、および励起光と検出光との間の角度偏向をもたらす第２のプリズム領域を有し、顕微鏡の瞳孔平面内に配置されている、特に先行請求項のうちの１項に記載のプリズム素子。
22. 検出光の励起光からの空間的分離が中間平面内で行われる、先行請求項のうちの１項に記載のプリズム素子。
23. 素子のプリズム面によって試料信号のスペクトル成分の空間的分離が行われ、これが検出器アレーにより測定される、先行請求項のうちの１項に記載のプリズム素子。
24. 素子のプリズム面によって励起光のスペクトル成分の空間的分離が行われ、スペクトル成分が試料内の共通ビームに集められる、先行請求項のうちの１項に記載のプリズム素子。
25. プリズム素子が中央に平行平面を有し、板の外ではプリズムの列を有する、先行請求項のうちの１項に記載のプリズム素子。
26. 線形スキャナの場合、平行平面板が長い形を有し、プリズム配置の楔型切り欠きが板の長さ方向に存在する、先行請求項のうちの１項に記載のプリズム素子。

Images