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Die
Erfindung betrifft einen achromatischen Hauptfarbteiler für
die Laser-Scanning-Mikroskopie, der eine effiziente Anregung und
Detektion in vorzugsweiser konfokaler Bildgebung erlaubt und die
Integration desselben in ein Mikroskop, insbesondere Laser-Scanning-Mikroskop.
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Stand der Technik
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In
einem Laser-Scanning-Mikroskop nach dem Stand der Technik (1)
gelangt Licht der Lichtquelle (LQ) über einen Strahlteiler
(MDB), die Scanner (SC), die Scanoptik (SO), die Tubuslinse (TL)
und das Objektiv (O) punktförmig auf die Probe (PR). In
der Probe wird beispielsweise Fluoreszenzlicht angeregt, welches
durch das Objektiv aufgesammelt wird und wiederum auf den Strahlteiler
gelangt. Der Strahlteiler ist so ausgelegt, dass dieser das Fluoreszenzlicht
aufgrund der gegenüber der Anregungswellenlänge
veränderten Spektraleigenschaften transmittiert, so dass
das Detektionslicht mit einer Pinholeoptik (PO) durch eine konfokale
Blende (PH) fokussiert wird und im Anschluss auf einen Detektor
(DE) gelangt. Vor dem Detektor ist in einem Fluoreszenzmikroskop
ein Emissionsfilter (EF) zur Unterdrückung des Anregungslichtes
vorgesehen. Mit Hilfe der Scanner wird der Beleuchtungsspot über die
Probe gerastert. Die Probensignale werden in einem Rechner zu einem
Bild zusammengesetzt.
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Derartige
Strahlteiler sind beispielsweise in
DE 19702753 A1 beschrieben. Aus dem Strand
der Technik ist weiterhin für die Strahlteilung (MDB) die Nutzung
des Polarisationszustandes des Lichtes bekannt. Hierzu wird die
Anregungsstrahlung linear polarisiert. Die Fluoreszenz ist jedoch
normalerweise unpolarisiert. Durch die Ausbildung des MDB als Polarisationsteiler
kann jedoch achromatisch nur 50% der Fluoreszenzstrahlung von der
Anregungsstrahlung absepariert werden.
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Weiterhin
ist aus dem Strand der Technik eine Pupillenteilung zur Realisierung
der Strahlteilung bekannt (
DE
10257237 A1 ). Hierzu wird das Anregungslicht mit einer
verkleinerten numerischen Apertur in die Probe abgebildet. Da die
Fluoreszenz in alle Raumrichtungen abgestrahlt wird, erfolgt die Sammlung
der Fluoreszenz hierbei in einer vergrößerten
Apertur.
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Zur
Fluoreszenzanregung werden verschiedenste Farbstoffe eingesetzt.
Dies bedeutet, dass für verschiedene Anregungs- und Detektionswellenlängen
verschiedene Farbteiler benötigt werden, die normalerweise
auf einem Filterrad in den Strahlengang ein- und ausgeschwenkt werden
können. Zusätzlich werden Präparate mit
mehreren Farbstoffen gleichzeitig versehen. Die Aufnahme der Probensignale,
so genannte Mehrfachfluoreszenzsignale, erfolgt dann mit mehreren
Detektoren.
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Nähere
Details zum Stand der Technik zu Strahlteilern in Laser-Scanning-Mikroskopen
sind weiterhin in „Handbook of biological confocal
microscopy", Kapitel 9, Editor J.P. Pawley, Plenum Press, 1995 zu
finden.
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Aufgabe
der Erfindung ist es, eine achromatische Strahltrennung des Anregungs-
vom Detektionslicht mit hoher Effizienz sowohl für das
Anregungslicht als auch für das Detektionslicht zu erreichen.
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Dies
wird durch die im Folgenden erläuterten Anordnungen realisiert.
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Beschreibung der Erfindung
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Die 1–6 und 9–11 beschreiben
jeweils Anordnungen zur Trennung des gemeinsamen Anregungs- und
Detektionstrahlenganges. Der prinzipielle Aufbau der Strahlteilung
ist in 1 anhand des Standes der Technik schematisch dargestellt.
Der Anregungsstrahlengang umfasst hierbei Strahlwege (3)
aus Richtung Lichtquelle (LQ), die über den Strahlteiler
(MDB) in Richtung der Probe (PR) reflektiert werden. Der Strahlweg
vom Strahlteiler (MDB) bis zur Probe (PR) wird als gemeinsamer Anregungs-
und Detektionsstrahlengang (1) bezeichnet. In der Probe
wird beispielsweise Fluoreszenzlicht (FL) angeregt. Zusätzlich
reflektiert die Probe einen Anteil des Anregungslichts (AL). Das Fluoreszenzlicht
wird vorzugsweise vom Strahlteiler (MDB) transmittiert und gelangt
in den Detektionsstrahlengang (2), der die Strahlwege von
MDB bis zum Detektor (DE) umfasst. Von der Probe (PR) reflektiertes
Anregungslicht gelangt über den MBD überwiegend
in Richtung des Anregungsstrahlenganges (3) und damit in
Richtung der Lichtquelle (LQ).
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In
einem Laser Scanning Mikroskop hat das Detektionslicht (beispielsweise
Fluoreszenzlicht) eine größere spektrale Bandbreite
als das Anregungslicht. Dies liegt daran, dass die Anregung in Bändern
von ca. bis zu 20 nm spektraler Breite erfolgt. Die spektrale Bandbreite
beeinflusst die zeitliche Kohärenzlänge des Lichtes.
Je breiter das Spektrum des Lichtes ist, desto kürzer ist
die zeitliche Kohärenzlänge des Lichtes. Fluoreszenzlicht
hat somit eine kürzere Kohärenzlänge
als das Anregungslicht.
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Erfindungsgemäß wurde
erkannt, dass sich durch Ausnutzung dieser Eigenschaft eine besonders
effiziente und achromatische Strahlteilung realisieren lässt.
Der erfindungsgemäße Strahlteiler verändert
vorteilhaft die Abbildungseigenschaften im Vergleich zum Stand der
Technik nicht oder nur unwesentlich.
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2a) zeigt ein optisch transparentes Stufenelement
(PM). Dieses Element zeichnet sich dadurch aus, dass es entlang
der optischen Achse (o. A.) Stufen mit einer Breite (B) und einer
Höhe (A) aufweist. Die Stufen können beispielsweise
durch aufeinander gesetzte Glasplatten mit einem seitlichen Versatz,
durch Ätzprozesse (diffraktive Optik) oder durch Mikromaterialbearbeitung
realisiert werden.
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Die
Höhe (A) ist dabei so gewählt, dass diese größer
ist als die zeitliche Kohärenzlänge des zu detektierenden
Lichtes. Jedoch ist die Höhe (A) kleiner als die Kohärenzlänge
des Anregungslichtes. Beispielsweise hat Licht mit einer Fluoreszenz
im Bereich von 500 bis 550 nm eine Kohärenzlänge
von 3.6 μm. Das anregende Laserlicht besitzt dagegen aufgrund
der Schmalbandigkeit je nach Lasermedium eine Kohärenzlänge
im cm-Bereich. Die Stufenhöhe könnte daher vorzugsweise
größer etwa 5–10 μm betragen.
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Die
Breite (B) des Stufenelements (PM) ist so gewählt, dass
sie größer als die räumliche Kohärenzlänge
ist, so dass das Stufenelement nicht lichtbeugend für das
Anregungs- und Fluoreszenzlicht wirkt.
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2b) zeigt das Verhalten des anhand von 2a) erläuterten Elements im Strahlengang. Detektions-
und Anregungslicht (1) gelangen entlang der optischen Achse
o. A. auf das Stufenelement (PM), welches senkrecht (die Stirnfläche
SF aus 2a) zur optischen Achse im
Strahlengang angeordnet ist. Das Licht wird an den Stufen in Teilstrahlen (T1–Tn) zerlegt,
wobei benachbarte Teilstrahlen eine diskrete Phasenverschiebung,
um die Höhe der Stufe (A) zueinander erhalten.
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Da
für das Detektionslicht die Höhe (A) größer
als die Kohärenzlänge des Detektionslichts ist, können
die an den Stufen generierten Teilstrahlen nicht mehr interferieren.
Somit treten die Teilstrahlen des Detektionslichts FL ohne Winkeländerung
(2) durch das Stufenelement hindurch.
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Das
Anregungslicht AL weist jedoch eine größere Kohärenzlänge
als die Stufenhöhe (A) auf. Somit können die Teilstrahlen
miteinander interferieren. Hierdurch ergibt sich eine Ablenkung
des Anregungslichtes aus der optischen Achse heraus entsprechend
des bekannten Snellschen Gesetzes. Hier wird vor allem die erste
Beugungsordnung betrachtet. Durch entsprechendes Design des Stufenelementes,
zum Beispiel über die Dimensionierung der Stufenbreite
(B) oder eine leichte Verdrehung des Stufenelements zur optischen
Achse können die nullte Ordnung bzw. höhere Ordnungen
weitgehend vermieden werden.
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Es
entsteht somit eine räumliche Separierung der Strahlwege
für das Anregungs- und Detektionslicht aufgrund der unterschiedlichen
Kohärenzeigenschaften des Lichts.
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3a) zeigt ein weiteres Verhalten des anhand
von 2a) erläuterten Elements
im Strahlengang. Detektions- und Anregungslicht (1) leuchten das
Stufenelement (PM) entlang der optischen Achse kreisförmig
aus (O in 3b), wobei das Stufenelement
wiederum senkrecht zur optischen Achse im Strahlengang angeordnet
ist. Das Licht wird an den Stufen in Teilstrahlen (T1–Tn) (3c) zerlegt,
wobei benachbarte Teilstrahlen eine diskrete Phasenverschiebung,
um die Höhe der Stufe (A) zueinander erhalten (Pupille
P). Dem Stufenelement nachgeordnet ist eine Linse (L).
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Da
für das Fluoreszenzlicht die Höhe (A) größer
als die Kohärenzlänge des Fluoreszenzlichts ist, können
die an den Stufen generierten Teilstrahlen nicht mehr interferieren.
Somit treten die Teilstrahlen des Fluoreszenzlichts FL ohne Winkeländerung
(3) durch das Stufenelement hindurch. Außerdem
wird jeder Teilstrahl für sich einzeln und unabhängig
von den anderen Teilstrahlen durch die Linse abgebildet. Maßgeblich
für die Abbildung durch die Linse ist die Ausdehnung der
Teilstrahlen, d. h. die Breite der Stufe (B) und der Strahldurchmesser.
Da der Strahldurchmesser größer als die Breite
(B) ist, entsteht im Fokus der Linse (Bild) für das Fluoreszenzlicht
eine linienförmige Verteilung entlang der x-Achse (a in 3d).
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Da
das Anregungslicht AL eine größere Kohärenzlänge
als das Fluoreszenzlicht besitzt erfährt es eine Ablenkung
in x-Richtung (3). Die Linse fokussiert weiterhin in beiden
Achsen, so dass ein Punktfokus (b in 3d)
entsteht.
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Es
entsteht somit wiederum eine räumliche Separierung der
Strahlwege für das Anregungs- und Detektionslicht aufgrund
der unterschiedlichen Kohärenzeigenschaften des Lichts.
Durch den Einsatz der Linse und damit durch die Fokussierung des
Anregungslichtes wird eine vereinfachte räumliche Trennung
von Anregungs- und Detektionslicht ermöglicht.
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4a) zeigt eine weitere Anordnung mit der
sich die Kohärenzeigenschaften des Anregungs- und Detektionslichtes
für eine effiziente Strahltrennung nutzen lassen. Das Stufenelement
PM weist hierbei eine rotationssymetrische Struktur um die optische
Achse (o. A.) auf. Zusätzlich beschreibt die Einhüllende
der Stufenstruktur (a) vorzugsweise eine konvexe Linsenform. Die
Stufenhöhe sei wiederum für das Detektionslicht
größer und für das Anregungslicht kleiner
als die Kohärenzlänge der Strahlung. Durch die
Struktur wird Licht in ringförmige Teilstrahlen mit gleicher
Phase zerlegt. Für das Detektionslicht interferieren diese
Teilstrahlen nicht. Dadurch wird die Strahlform und -richtung des
Detektionslichts FL nicht beeinflusst. Für das Anregungslicht interferieren
die Teilstrahlen und erzeugen einen Fokuspunkt im Brennpunkt des
Phasenelements PM. Der Brennpunkt ergibt sich aus der konvexen Form der
Einhüllenden des Stufenelements. Die Abb. zeigt eine vereinfachte
Darstellung der Linse mit einer geraden Endfläche. Auch
diese Fläche kann entsprechend geformt sein. Im Brennpunkt
kann mit einem kleinen Spiegel R im ansonsten transmittiven Strahlteiler
(MDB) eine räumliche Trennung des Anregungs- und Detektionslichtes
erfolgen, wobei das Anregungslicht AL in Richtung Ausgang (3)
reflektiert wird. Die Form des MDB ist im Teilbild 4b)
verdeutlicht. Er besitzt eine verspiegelte Region (R) und eine transparente
Region (T).
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Es
entsteht somit wiederum eine räumliche Separierung der
Strahlwege für das Anregungs- und Detektionslicht aufgrund
der unterschiedlichen Kohärenzeigenschaften des Lichts.
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5)
zeigt eine Anordnung mit der sich das Detektionslicht nach der Trennung
vom Anregungslicht wieder fokussieren lässt. Hierzu wird
ein Kompensationselement (cPM) nach dem Stufenelement (PM) angeordnet.
Das cPM ist so beschaffen, dass die durch PM eingeführte
modifizierte Phasenfront wieder kompensiert wird. Dazu muss das
cPM genau die invertierte (spiegelverkehrte) Form des PM aufweisen.
Setzt man beide Elemente PM und cPM zusammen, dann ergibt sich eine
planparallele Platte.
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6)
zeigt eine vorteilhafte Kombination der Anordnungen aus den 4 und 2b. 4 verwendet
einen speziellen Spiegel (MBD) zur räumlichen Aufspaltung
der Anregungs- (3) und Detektionslichts (2), wobei
der MDB einen Teil des Detektionslichts abschattet, so dass es zu
Effizienzverlusten kommt. Durch die Kombination des ablenkenden (PM1)
und eines fokussierenden (PM2) Stufenelements erfolgt die Fokussierung
nur des Anregungslichts außerhalb des Detektionsstrahlenganges
auf einen Reflektor M, so dass eine besonders effiziente Strahltrennung
ermöglicht wird.
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Analog
zu 5 sind Kompensationselemente cPM1 und cPM2 im
weiteren Strahlengang des Fluoreszenzlichtes vorgesehen, cPM1 zur
Kompensation von PM2 ist als Hohlelement HS mit zu PM2 spiegelverkehrten
Hohlräumen H ausgebildet, ansonsten aller als transmissives
Element ausgebildet, während cPM2 zu PM1 spiegelverkehrt
aufgebaut ist. Der Phasenversatz der Elemente PM1, PM2 wird hierdurch
wieder aufgehoben und am Ausgang von cPM2 liegt voll fokussierfähiges
Detektionslicht FL vor.
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Die
Stufenelemente (PM) können ohne Einschränkung
auch reflektierend ausgebildet werden. Ein Beispiel für
ein Stufenelement ist in 7) dargestellt.
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Das
gemeinsame Anregungs- und Detektionslicht wird aus Richtung (1)
auf das Stufenelement geleitet. Am Stufenelement werden Teilstrahlen
unterschiedlicher Phase erzeugt. Die Stufendifferenz (h) wird hierbei
so gewählt, dass die Kohärenzlänge des
Fluoreszenzlichts kleiner als die Stufendifferenz ist. Das Detektionslicht
(2) erfährt hierdurch eine klassische Reflexion,
wobei der Einfalls- (a1) und Ausfallswinkel (a2) gleich sind, da
die Teilstrahlen (die durch die Breite der Stufen (b) bestimmt sind) nicht
interferieren können. Die Stufendifferenz (h) ist jedoch
kleiner als die Kohärenzlänge des Anregungslichts.
Somit können die Teilstrahlen des Anregungslichtes nicht
interferieren. Durch Interferieren der Teilstrahlen des Anregungslichts
(2) erfährt dieses jedoch eine Beugung am einem
Gitter, wobei der Ausfallswinkel (a3), dann durch die Anzahl der
Streifen (Stufenbreite b) entsprechend der aus dem Stand der Technik
bekannten Gitterformel a3 = a1 + lambda/bgegeben
ist, wobei lambda die Wellenlänge des Anregungslichts ist.
Eine räumliche Trennung des Anregungs- vom Detektionslichts
(Winkel zwischen den Strahlengängen (2) und (3)
= a3 – a2) kann durch geeignete Wahl der Streifenzahl (Stufenbreite
b) bzw. des Einfallswinkels auf (PM) (a1) erfolgen. Die Verwendung
von reflektierenden Anordnungen hat den zusätzlichen Vorteil,
dass sie zumindest für das Detektionslicht achromatisch
sind.
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8)
zeigt zwei beispielhafte schematische Anordnungen in einem Laser-Scanning-Mikroskop,
wobei eine räumliche Separierung der Strahlwege für
das Anregungs- und Detektionslicht aufgrund der unterschiedlichen
Kohärenzeigenschaften des Lichts realisiert wird. Hier
wird das Anregungslicht der Lichtquelle in derselben Richtung über
das Stufenelement eingekoppelt wie es nach Rückkehr von der
Probe wieder ausgekoppelt wird.
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Teilbild
a) zeigt eine Anordnung entsprechend der 1, wobei
das Strahlteilerelement (MDB) durch einen erfindungsgemäßen
Strahlteiler (S) ersetzt wurde. Im Detektionsstrahlengang (2)
ist der Strahlteiler (S) so ausgelegt, dass die durch das Stufenelement
(PM) modifizierte Phasenfront wieder durch das Element cPM geglättet
wird. Hierdurch kann das Licht ausgangsseitig durch die konfokale Blende
(PH) fokussiert werden.
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Teilbild
b) zeigt eine weitere Anordnung, wobei die konfokale Blende (PH)
im gemeinsamen Anregungs- und Detektionsstrahlengang (1)
angeordnet ist. Eine Kompensation der durch das Stufenelement (PM)
modifizierten Phasenfront ist im Detektionsstrahlengang (2)
nicht erforderlich. Dies hat den Vorteil, dass sich die Justage
vereinfacht, da kein kompensierendes Element (cPM) verwendet wird.
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Auf
das in Teilbild a) gezeigte Kompensationselement CPM kann auch verzichtet
werden, wenn als konfokale Blende PH eine Rechteckblende zum Einsatz
kommt. Für den Strahlteiler kommt vorzugsweise eine Anordnung
nach 2b) zum Einsatz. Das Seitenverhältnis
der Länge zur Breite der Rechteckblende wird vorzugsweise
so gewählt, dass es dem Verhältnis der Breite
der Stufen des Stufenelements (B) zum Strahldurchmesser am Eingang
des Stufenelements entspricht.
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9)
zeigt beispielhaft eine detaillierte Darstellung der Anordnung nach 8a) mit dem Strahlteilerelement aus 6).
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Die
Strahlteilung, d. h. die Strahlwege für das Anregungs-
und Detektionslicht sind für die Hin- und Rückwege
identisch. Somit ist es beispielsweise für das Anregungslicht
egal, ob eine Einstrahlung der Lichtquelle LQ oder eine Auskopplung
des Anregungslichtes (das an der Probe reflektiert wurde) in Richtung
der Lichtquelle erfolgt – siehe auch Erläuterung
weiter oben, insbesondere zu 8a.
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10)
zeigt beispielhaft eine detaillierte Darstellung der Anordnung nach 8a) mit dem Strahlteilerelement aus 5).
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11)
zeigt beispielhaft eine detaillierte Darstellung der Anordnung für
ein Lichtmikroskop mit einem CCD Detektor, wobei zur Strahlteilung
das Strahlteilerelement aus 5) zum Einsatz
kommt. Gestrichelt eingezeichnet ist der Pupillenstrahlengang, durchgezogen
der Objektstrahlengang.
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Bei
der Beschreibung der Anordnungen wurde davon ausgegangen, dass das
Detektionslicht eine geringere Kohärenzlänge als
das Anregungslicht besitzt. Wird Anregungslicht mit einer geringeren Kohärenzlänge
im Vergleich zum Detektionslicht eingesetzt (Weißlichtquelle),
dann wird das Stufenelement so ausgelegt, dass die Stufenhöhe
kleiner als die Kohärenzlänge des Detektionslichts
aber größer als die des Anregungslichts ist. Das
bedeutet dass bezüglich der beschriebenen Anordnungen das
Anregungslicht durch das Stufenelement hindurchgehen würde
und das Detektionslicht (Fluoreszenz) interferiert und aus der optischen
Achse heraus gebeugt wird. In den beschriebenen Anordnungen wird dann
lediglich der Anregungs- und Detektionsstrahlengang vertauscht.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- - DE 19702753
A1 [0003]
- - DE 10257237 A1 [0004]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- - „Handbook
of biological confocal microscopy", Kapitel 9, Editor J.P. Pawley,
Plenum Press, 1995 [0006]