DE19851240C1

DE19851240C1 - Fluoreszenzmikroskop mit Mehrphotonenanregung

Info

Publication number: DE19851240C1
Application number: DE1998151240
Authority: DE
Inventors: Steffen Lindek; Ernst H K Stelzer
Original assignee: Europaisches Laboratorium fuer Molekularbiologie EMBL
Current assignee: Europaisches Laboratorium fuer Molekularbiologie EMBL
Priority date: 1998-11-06
Filing date: 1998-11-06
Publication date: 2000-03-02
Anticipated expiration: 2018-11-07

Abstract

Die Erfindung betrifft ein nicht-konfokales Fluoreszenzmikroskop mit Mehrphotonenanregung, insbesondere Zweiphotonenanregung, das als Theta-Mikroskop mit Einzelobjektiv oder mit Doppelobjektivsystem eingesetzt werden kann. Das Mikroskop zeichnet sich durch die Verwendung mehrerer Beleuchtungsrichtungen aus, wobei zwei Beleuchtungsrichtungen im Objektiv relativ zueinander um einen vorgegebenen Winkel geneigt sind, der derart gewählt ist, daß der Überlagerungsbereich der Beleuchtungsvolumina gegenüber einem konventionellen Mikroskop verringert ist.

Description

In der Lichtmikroskopie wird die Auflösung durch die Ausdehnung der Punktbildfunktion (engl. Point Spread Function, PSF) definiert, die eine mathematische Beschreibung der Intensitätsverteilung (im Falle der Beleuchtung) bzw. der Detektionswahrscheinlichkeit (im Falle der Detektion) im Fokalbereich eines Mikroskopobjektivs darstellt. Je geringer die Ausdehnung der PSF des Objektivs ist, desto besser ist die Abbildung einzelner Punkte und desto besser ist daher die Auflösung des Mikroskops. Die Auflösung ist bei allen Objektiven (und daher auch bei allen herkömmlichen Mikroskopen) schlechter entlang der optischen Achse als in der Brennebene. Daher kann man in grober Näherung das von der BeleuchtungsPSF beschriebene Beleuchtungsvolumen und das von der DetektionsPSF beschriebene Detektionsvolumen als längs der optischen Achse des Objektivs langgestreckte Ellipsoide betrachten.

Aus der US 3,013,467 ist bekannt, daß die Auflösung entlang der optischen Achse durch eine konfokale Anordnung verbessert wird, bei welcher das Objekt mit einer punktförmigen Lichtquelle beleuchtet und das von ihm ausgehende Licht mit einem punktförmigen Detektor detektiert wird. Dadurch ergibt sich die konfokale PSF des Systems aus dem Produkt der BeleuchtungsPSF und der DetektionsPSF, und das konfokale Beobachtungsvolumen entspricht im wesentlichen dem Überlagerungsbereich bzw. dem Schnittvolumen des Beleuchtungsvolumens mit dem Detektionsvolumen. Die konfokale PSF ist stärker um den Brennpunkt lokalisiert, und das konfokale Beobachtungsvolumen ist dementsprechend kleiner als die Beleuchtungs- und Detektionsvolumina, woraus sich die bessere Auflösung herleiten läßt. Dennoch ist die laterale Auflösung auch bei einem konfokalen Mikroskop im allgemeinen mindestens 3× besser als die axiale Auflösung.

Aus der DE 43 26 473 C2 ist ein konfokales Mikroskop bekannt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es ein erstes Objektiv zur Punkt beleuchtung und ein zweites Objektiv zur Abbildung des Objektlichts auf einen Punktdetektor verwendet, wobei die Detektionsrichtung relativ zu der Beleuchtungsrichtung um einen Winkel geneigt ist, der derart gewählt ist, daß der Überlagerungsbereich des Beleuchtungs volumens mit dem Detektionsvolumen gegenüber einem konventionellen konfokalen Mikroskop verringert ist. Dies geschieht aufgrund der langgestreckten Form der Beleuchtungs- und Detektionsvolumina dann, wenn die Detektionsrichtung annähernd senkrecht auf der Beleuchtungs richtung steht. Dieses als konfokales Theta-Mikroskop bezeichnete Mikroskop erreicht eine fast isotrope Auflösung, indem längs der Beleuchtungsachse die vergleichsweise große Ausdehnung der BeleuchtungsPSF durch die geringe Ausdehnung der DetektionsPSF kompensiert wird und längs der Detektionsachse die vergleichsweise große Ausdehnung der DetektionsPSF durch die geringe Ausdehnung der BeleuchtungsPSF kompensiert wird.

Aus der US 5,813,987 ist ein analytisches Gerät bekannt, bei der die Detektionsrichtung des von der Probe ausgehenden Lichts ebenfalls relativ zu der Beleuchtungsrichtung um einen Winkel geneigt ist. Bei diesem Instrument sind allerdings die Beleuchtungs- und Detektions lochblenden so groß, daß es sich nicht um eine punktförmige Licht quelle und einen punktförmigen Detektor handelt. Somit handelt es sich um ein nicht-konfokales Gerät, bei dem die Beleuchtungs- und Detektionsvolumina wesentlich größer als im beugungsbegrenzten Fall sind, der für das in der DE 43 26 473 C2 beschriebene Mikroskop zutrifft.

Aus der DE 43 26 473 C2 ist ebenfalls bekannt, daß zur Verbesserung der Auflösung die konfokale Theta-Mikroskopie auch mit der aus der DE 40 40 441 A1 bekannten doppelkonfokalen Mikroskopie, die in der wissenschaftlichen Literatur als 4Pi-konfokale Mikroskopie bezeichnet wird, kombinert werden kann.

Die 4Pi-konfokale Mikroskopie vergrößert die numerische Apertur eines konfokalen Mikroskops und verbessert damit die axiale Auflösung, indem das Beobachtungsvolumen durch Interferenz längs der optischen Achse reduziert wird [S. Hell und E. H. K. Stelzer, J. Opt. Soc. Am. A 9, 2159 (1992)]. Bei der als 4Pi(A)-konfokale Mikroskopie bezeichneten Technik wird die Probe kohärent von zwei sich entgegen gesetzt ausbreitetenden konvergenten Strahlen beleuchtet. Ist die Phasendifferenz zwischen den beiden Beleuchtungsteilstrahlen im Brennpunkt gleich null oder ein ganzzahliges Vielfaches von 2π, so ist die Interferenz im Brennpunkt konstruktiv und die BeleuchtungsPSF besteht aus einem räumlich stärker begrenzten Hauptmaximum und mehreren Nebenmaxima längs der Beleuchtungsachse. Die konfokale PSF, die das Produkt der BeleuchtungsPSF und der DetektionsPSF ist, wird durch die Interferenz ebenfalls moduliert. Die geringe Ausdehnung des Hauptmaximums im Vergleich zu einem konventionellen konfokalen Mikroskop ist für die höhere Auflösung verantwortlich. Die Nebenmaxima setzen die Auflösung herab, wenn sie nicht hinreichend unterdrückt werden können.

Bei der als 4Pi(B)-konfokale Mikroskopie bezeichneten Technik entsteht die Interferenz an dem punktförmigen Detektor und reduziert so die Ausdehnung der DetektionsPSF. Die 4Pi(C)-konfokale Mikroskopie genannte Methode kombiniert diese beiden Techniken.

Bei der Kombination der aus der DE 43 26 473 C2 bekannten konfokalen Theta-Mikroskopie und der aus der DE 40 40 441 A1 bekannten 4Pi- konfokalen Mikroskopie wird das Objekt wie in einem 4Pi(A)-konfokalen Mikroskop beleuchtet und das von ihm ausgehende Licht wie in einem konfokalen Theta-Mikroskop annähernd senkrecht detektiert. Durch die geringere Ausdehnung der DetektionsPSF längs der Beleuchtungsachse wird das außerhalb der Beleuchtungsbrennebene emittierte Licht kaum detektiert, und die Nebenmaxima der BeleuchtungsPSF werden so stark unterdrückt, daß die konfokale PSF eine axiale Ausdehnung hat, die im wesentlichen durch die des Hauptmaximums der BeleuchtungsPSF bestimmt wird. Aufgrund der Symmetrie des Aufbaus, die eine Vertauschung der Beleuchtungs- und der Detektionslichtpfade erlaubt, kann die konfokale Theta-Mikroskopie auch mit der 4Pi(B)- und der 4Pi(C)- konfokalen Mikroskopie kombiniert werden.

Für die Realisierung der sich bei der konfokalen Theta-Mikroskopie kreuzenden Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengänge ist gemäß der DE 43 26 473 C2 ein Spezialaufbau mit vollständiger Separation des Beleuchtungsstrahlenganges vom Detektionsstrahlengang vorgesehen. Ein solcher Spezialaufbau ist schwieriger zu handhaben als konventionelle Mikroskope, bei denen der Beleuchtungsstrahlengang und der Detektionsstrahlengang zusammenfallen und die Fokussierung des Beleuchtungslichtes und die Sammlung des von dem Objektpunkt ausgehenden Detektionslichtes durch dasselbe Objektiv erfolgt.

Daher wurde in der DE 196 29 725 A1 bzw. der WO 98/03892 A1 aufgezeigt, wie durch die Verwendung eines Doppelobjektivs, das im wesentlichen wie ein herkömmliches Objektiv bei einem konventionellen Mikroskop handhabbar ist, das in der DE 43 26 473 C2 beschriebene optische Prinzip bei einem konfokalen Mikroskop realisierbar ist, ohne vom konstruktiven Aufbau eines konventionellen konfokalen Mikroskops abzuweichen. Das in der DE 196 29 725 A1 beschriebene Doppelobjektiv besteht aus zwei Objektiven, von denen das eine zur Fokussierung von Beleuchtungslicht und das andere zur Sammlung von Detektionslicht dient, wobei die Detektionsachse des zweiten Objektivs annähernd senkrecht zur Beleuchtungsachse des ersten Objektivs steht.

Aus der DE 196 32 040 A1 bzw. der WO 98/07059 A1 ist bekannt, daß das Prinzip der konfokalen Theta-Mikroskopie auch mit einem einzigen Mikroskopobjektiv realisert werden kann. Ein solches als Einzel objektiv Theta-Mikroskop (engl. Single-Lens Theta Microscope, SLTM) bezeichnetes Gerät vermeidet die Komplexität, die mit Doppelobjektiv systemen verbunden ist, wie sie aus der DE 43 26 473 C2 sowie aus der DE 196 29 725 A1 bekannt sind.

Aus der US 5,034,613 ist ein Fluoreszenzmikroskop bekannt, bei dem die fluoreszierenden Stoffe durch die gleichzeitige Absorption von zwei Photonen angeregt werden. Dadurch werden physikalische Eigenschaften erreicht, wie sie von der konfokalen Mikroskopie her bekannt sind. Die Anregungswahrscheinlichkeit des fluoreszierenden Stoffs ist nicht wie bei der herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopie proportional zu der Intensität, sondern proportional zum Quadrat der Intensität, weil zwei Photonen gleichzeitig absorbiert werden. Dadurch ergibt sich die PSF eines Fluoreszenzmikroskops mit Zweiphotonenanregung aus dem Quadrat der BeleuchtungsPSF (also aus dem Quadrat der Intensitätsverteilung). Die Analogie zu der Multiplikation der BeleuchtungsPSF und der DetektionsPSF in der konfokalen Mikroskopie veranschaulicht die Auflösungserhöhung. Da die Multiplikation schon in der Beleuchtung geschieht, ist der Einsatz eines Punktdetektors (konfokales Fluoreszenzmikroskops mit Zwei photonenanregung) nicht notwendig für die axiale Diskriminierung, und es kann ein Detektor eingesetzt werden, der das ganze Feld erfaßt (z. B. eine CCD-Kamera).

In der US 5,034,613 wird für die Zweiphotonenanregung des fluoreszierenden Stoffs ein gepulster Laser verwendet, dessen Pulse kürzer als 1 ps sind. Aus der US 5,777,732 ist aber bekannt, daß für die Zweiphotonenanregung des fluoreszierenden Stoffs auch Laser mit längeren Pulsen oder nicht-gepulste Laser verwendet werden können.

In der US 5,034,613 wird diese Methode für die Absorption von zwei Photonen gleicher oder auch unterschiedlicher Wellenlänge beschrieben.

In der gattungsbildenden WO 97/11355 A1 wird darüber hinaus ein Mikroskop beschrieben, bei dem die Probe durch die gleichzeitige Absorption von drei oder mehr Photonen angeregt wird.

Dem Anspruch 1 liegt die Aufgabe zugrunde, die Auflösung eines Fluoreszenzmikroskops mit Mehrfachphotonenanregung in wenigstens zwei unterschiedlichen Wellenlängenbereichen zu vergrößern.

Durch die vorliegende Erfindung wird ein Weg aufgezeigt, wie das in der DE 43 26 473 C2 dargestellte optische Prinzip für die Auflösungs verbesserung in einem nicht-konfokalen Fluoreszenzmikroskop genutzt werden kann. Hierzu wird erfindungsgemäß vorgeschlagen, daß das Objekt aus zwei annähernd senkrechten Richtungen so beleuchtet wird, daß eine Mehrfachphotonenanregung des fluoreszierenden Stoffs durch mindestens jeweils ein Photon aus jedem der beiden Lichtstrahlen stattfinden kann. Hierdurch wird die erreichbare Auflösung gemäß dem in der DE 43 26 473 C2 beschriebenen optischen Prinzip verbessert, und das Beobachtungsvolumen ist kleiner als in den bekannten vergleichbaren Lichtmikroskopen. Das erfindungsgemäße Mikroskop wird als nicht-konfokales Theta-Mikroskop bezeichnet, da es das Prinzip der Theta-Mikroskopie in einem nicht-konfokalen Aufbau verwirklicht. Vorzugsweise handelt es sich bei der Mehrfachphotonen anregung um Zweiphotonenanregung.

Die Wirkungsweise des erfindungsgemäßen Mikroskops erklärt sich folgendermaßen. Das Licht des einen Strahlengangs wird in ein längs der Beleuchtungsrichtung elongiertes Beleuchtungsvolumen fokussiert. Das auf denselben Punkt hierzu senkrecht eingestrahlte Licht wird in ein längs dieser zweiten Beleuchtungsrichtung elongiertes Beleuchtungsvolumen fokussiert, welches also senkrecht zu der ersten Beleuchtungsachse elongiert ist. Das Schnittvolumen dieser beiden Beleuchtungsvolumina ist dadurch auf die unmittelbare Umgebung des gemeinsamen Brennpunkts beschränkt. Die Wahrscheinlichkeit einer Zweiphotonenanregung durch je ein Photon aus jedem Lichtstrahl ist nur in diesem gemeinsamen Beleuchtungsvolumen groß, dessen Ausdehnung durch das Produkt der beiden BeleuchtungsPSFs (also der beiden Intensitätsverteilungen) gegeben ist.

Vorzugsweise sind die Beleuchtungsstrahlengänge hinsichtlich der angestrebten hohen Auflösung so angeordnet, daß die Beleuchtungs richtungen senkrecht aufeinander stehen. Jedoch werden die Vorteile der Erfindung in ausreichendem Maße auch dann noch erzielt, wenn der Winkel zwischen den Beleuchtungsrichtungen in nicht zu großem Maße von einem rechten Winkel abweicht.

Die erfindungsgemäße Auflösungsverbesserung basiert auf der Mehrfach photonenanregung durch mindestens jeweils ein Photon aus jedem der beiden senkrechten Lichtstrahlen. Diese Anregung wird beispielsweise bei Zweiphotonenanregung vorzugsweise dadurch gewährleistet, daß für die beiden Beleuchtungsstrahlengänge unterschiedliche Wellenlängen gewählt werden und ein fluoreszierender Stoff gewählt wird, dessen Fluoreszenz sich durch je ein Photon jeder Wellenlänge besser induzieren läßt als durch zwei Photonen der gleichen Wellenlänge (sowohl der kürzeren als auch der längeren). Für die Bereitstellung von Licht zweier Wellenlängen können zwei verschiedene Laser verwendet werden (wie in den Ausführungsformen dargestellt); es kann aber auch ein einziger Laser verwendet werden, der beispielsweise durch Frequenzverdopplung oder durch die Verwendung eines optischen parametrischen Oszillators (OPO) zwei Wellenlängen bereitstellt.

Als fluoreszierende Stoffe können beispielsweise Fluoreszenz farbstoffe oder fluoreszierende Proteine verwendet werden. Gemäß einer Weiterbildung der Erfindung können auch phosphoreszierende Stoffe anstelle von fluoreszierenden Stoffen verwendet werden.

Vorteilhafterweise wird als Lichtquelle ein gepulster Laser eingesetzt, der hohe Intensitäten im langwelligen Bereich des sichtbaren oder im nahen Infrarotbereich bereitstellt. Werden zwei gepulste Lichtquellen eingesetzt, so muß dafür gesorgt werden, daß sie synchronisiert werden, so daß sich ihre Pulse im Fokalbereich überlagern. Werden ein gepulster und ein nicht-gepulster Laser eingesetzt, so ist keine Synchronisation nötig.

Die Detektion erfolgt vorzugsweise mit einem Detektor, der keine Ortsauflösung bietet, sondern das ganze Feld detektiert, beispiels weise einer CCD-Kamera. Dadurch wird die Lichtausbeute auf der Detektionsseite optimiert und ein gutes Signal-zu-Rausch-Verhältnis erreicht. Allerdings kann auch ein punktförmiger Detektor verwendet werden, wie er in der konfokalen Mikroskopie eingesetzt wird. Dadurch ergibt sich die PSF des Gesamtsystems aus dem Produkt der Zwei photonenanregungsPSF, die aus dem Produkt der beiden Beleuchtungs intensitätsverteilungen besteht, und der DetektionsPSF. Die Auflösung wird weiter verbessert.

Das System kann auch als nicht-konfokales 4Pi-Theta-Mikroskop betrieben werden. Hierbei wird die Probe wie in einem 4Pi(A)- konfokalen Mikroskop aus zwei entgegengesetzten Richtungen kohärent beleuchtet, so daß längs dieser Beleuchtungsachse ein Interferenz muster auftritt, das die PSF moduliert, ihre Ausdehnung verringert und so die Auflösung verbessert. Aus einer zu dieser Achse annähernd senkrechten Richtung wird die Probe erfindungsgemäß mit einer anderen Wellenlänge beleuchtet.

Darüber hinaus ist es möglich, auch längs dieser zweiten Beleuchtungsachse eine Interferenz zu erzeugen, die in gleicher Art und Weise die Auflösung verbessert, indem wie in einem 4Pi(A)- konfokalen Mikroskop aus zwei entgegengesetzten Richtungen kohärent beleuchtet wird. Die Verwendung von Interferenz längs beider senkrechter Beleuchtungsachsen, die sich aus der Übertragung des Prinzips der 4Pi(C)-konfokalen Mikroskopie auf das erfindungsgemäße Prinzip ergibt, liefert eine besonders hohe Auflösung.

Zum Fokussieren des Beleuchtungslichts und zur Detektion des Fluoreszenzlichts können erfindungsgemäß mehrere einzelne Objektive und/oder ein Doppelobjektiv gemäß der DE 196 29 725 A1 und/oder ein Strahlumlenker gemäß der DE 196 32 040 A1 verwendet werden.

Die Elemente, die zur Führung der Strahlengänge verwendet werden, können beispielsweise Spiegel, dichroitische Spiegel, Strahlteiler oder optische Fasern sein. Insbesondere können bei Verwendung von verschiedenen Wellenlängen zur Beleuchtung der Probe geeignete optische Elemente, welche die Wellenlänge des Lichtes beeinflussen, in den Strahlengängen vorgesehen sein, beispielsweise spektrale Filter.

Das zu untersuchende Objekt befindet sich im gemeinsamen Brennpunkt der Beleuchtungsstrahlengänge. Eine ein-, zwei- oder dreidimensionale Aufnahme des Objekts erfolgt entweder durch Rasterung des Objekts durch den raumfesten Brennpunkt oder durch Rasterung des Brennpunkts durch das Objekt (Strahlrasterung) oder eine Kombination der beiden Bewegungen. Falls Objektrasterung längs einer oder mehrerer Achsen durchgeführt wird, befindet sich das Objekt auf einem Tisch, der die Bewegung des Objekts erlaubt. Falls Strahlrasterung vorgesehen ist, bewegt eine Rastereinheit die Beleuchtungsstrahlengänge so, daß die Beleuchtungsbrennpunkte unter kontrollierten Bedingungen durch das Objekt bewegt werden.

Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung werden nachstehend unter Bezugnahme auf die Abbildungen näher erläutert.

Es zeigen:

Abb. 1 - Die schematische Darstellung des Strahlengangs in einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Mikroskops, wobei das Objekt durch zwei Objektive aus zwei senkrechten Richtungen beleuchtet und das emittierte Licht durch ein drittes Objektiv detektiert wird.

Abb. 2 - Die schematische Darstellung des Strahlengangs in einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Mikroskops, wobei die Beleuchtung wie in Abb. 1 erfolgt, das Fluoreszenzlicht jedoch durch eines der beiden Beleuchtungsobjektive detektiert wird.

Abb. 3 - Die schematische Darstellung des Strahlengangs in einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Mikroskops, wobei das Objekt aus drei verschiedenen Richtungen beleuchtet wird, von denen zwei entgegengesetzt sind, so daß längs dieser Achse Interferenz stattfinden kann.

Abb. 4 - Die schematische Darstellung des Strahlengangs in einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Mikroskops, wobei ein Doppelobjektiv verwendet wird.

Abb. 5 - Die schematische Darstellung des Strahlengangs in einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Mikroskops, wobei ein einzelnes Objektiv zusammen mit einer Umlenkeinheit verwendet wird.

Abb. 6 - Die schematische Darstellung des Strahlengangs in einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Mikroskops, wobei eine einzige Lichtquelle verwendet wird.

Abb. 1 stellt eine bevorzugte Ausführungsform dar, bei der das Objekt aus zwei senkrechten Richtungen beleuchtet wird. Hierzu wird das Licht einer ersten Lichtquelle (1) durch ein Mikroskopobjektiv (3) auf einen Punkt (4) im Objekt fokussiert (Beleuchtungsstrahlengang (2)) und das Licht einer zweiten Lichtquelle (5) wird durch ein weiteres Mikroskopobjektiv (7) senkrecht zur Beleuchtungsrichtung des Strahlengangs (2) auf denselben Punkt (4) im Objekt fokussiert (Beleuchtungsstrahlengang (6)). Das Fluoreszenzlicht, das von dem Objekt ausgeht, wird durch ein drittes Objektiv (8) gesammelt und von einem Detektor (10) detektiert (Detektionsstrahlengang (9)).

Abb. 2 stellt eine weitere bevorzugte Ausführungsform dar, bei der die Beleuchtung wie in Abb. 1 erfolgt: Das Licht zweier Lichtquellen (1, 5) wird durch zwei Objektive (3, 7) auf einen Punkt (4) im Objekt fokussiert, wobei die Beleuchtungsrichtungen im Brennpunkt (4) senkrecht zueinander sind. Das Fluoreszenzlicht, das von dem Objekt ausgeht, wird durch eines der beiden Objektive (8) gesammelt und durch einen dichroitischen Spiegel (11), der das langwellige Beleuchtungslicht transmittiert, das kurzwellige Detektionslicht jedoch reflektiert, in den Detektor (10) abgelenkt.

Abb. 3 stellt eine weitere bevorzugte Ausführungsform dar, bei der das Objekt aus drei verschiedenen Richtungen beleuchtet wird, von denen zwei entgegengesetzt sind. Hierzu wird das Licht einer Lichtquelle (5) durch einen Strahlteiler (13) in zwei Teilstrahlen (6, 12) aufgeteilt. Die Teilstrahlen werden so geführt (zur Führung der Strahlengänge sind in der Abbildung Spiegel (14) dargestellt), daß sie durch zwei gegeneinandergerichtete Objektive (7, 15) auf einen gemeinsamen Punkt (4) im Objekt fokussiert werden. Dieser Punkt (4) wird senkrecht zu der durch die beiden entgegengesetzten Strahlen gänge (6, 12) festgelegten Achse durch Licht beleuchtet, das aus einer weiteren Lichtquelle (1) stammt und von einem weiteren Objektiv (3) auf den Punkt (4) fokussiert wird. Die Detektion des Fluoreszenz lichts erfolgt wie in Abb. 2 durch eines der Objektive (8). Alternativ kann die Detektion auch durch ein zusätzliches Objektiv wie in Abb. 1 erfolgen.

In diesem Fall wird die Interferenz der Beleuchtungslichtstrahlen (6, 12) im Fokalbereich zur weiteren Verbesserung der Auflösung ausgenutzt. Gemäß einer Weiterbildung der Erfindung kann vorgesehen sein, daß der Strahlengang (2) analog zu dem Strahlengang (6) in zwei Teilstrahlen aufgespalten wird und deren Licht senkrecht zu der Beleuchtungsachse, die durch die Strahlen (6, 12) gebildet wird, auf den Punkt (4) fokussiert wird und dort interferiert. Ein solches Mikroskop nutzt also die Interferenz längs zweier senkrechter Beleuchtungsachsen zur Verbesserung der Auflösung. Sie kann aber gemäß der DE 43 26 473 C2 nur dann genutzt werden, wenn die Phase der interferierenden Lichtstrahlen kontrolliert werden kann. Vorteil hafterweise wird die Phase derart eingestellt, daß die Interferenz im Brennpunkt konstruktiv ist.

Abb. 4 stellt eine bevorzugte Ausführungsform dar, bei der ein Doppelobjektiv gemäß der DE 196 29 725 A1 verwendet wird. Dabei wird das Licht der beiden Lichtquellen (1, 5), die nicht dieselbe Wellenlängen haben, durch einen dichroitischen Spiegel (16) zusammen geführt und in das Doppelobjektiv (18) gelenkt. Dort wird es durch einen weiteren dichroitischen Spiegel (17) wieder in zwei Strahlen (2, 6) aufgespalten, die durch die einzelnen Objektive (3, 7), aus denen das Doppelobjektiv (18) aufgebaut ist, auf einen gemeinsamen Punkt (4) im Objekt fokussiert werden. Die Detektion des Fluoreszenz lichts erfolgt durch das Objektiv (8), welches das kurzwelligere Beleuchtungslicht fokussiert. Dadurch führt der Detektionsstrahlen gang (9) über die dichroitischen Spiegel (17, 11) zum Detektor (10). Alternativ kann die Detektion auch durch ein zusätzliches Objektiv wie in Abb. 1 erfolgen.

Im Doppelobjektiv (18) werden die Beleuchtungs- und Detektions strahlengänge (2, 6, 9) durch geeignete, in der DE 196 29 725 A1 näher erläuterte Elemente, beispielsweise Spiegel, geformt (in Abb. 4 nicht dargestellt).

Abb. 5 stellt eine bevorzugte Ausführungsform dar, bei der ein einzelnes Objektiv zusammen mit einem Strahlumlenker gemäß der DE 196 32 040 A1 verwendet wird. Hierzu wird wie in Abb. 4 das Licht zweier Lichtquellen (1, 5) gemäß dem in der DE 196 32 040 A1 beschriebenen Prinzip durch die Tubuslinse (20) und das Objektiv (3, 7) geführt und durch den Strahlumlenker (19) umgelenkt, so daß die Beleuchtungsstrahlengänge (2, 6) in ihrem gemeinsamen Brennpunkt (4) im Objekt senkrecht aufeinander stehen. Die Detektion erfolgt durch das Objektiv (8) längs der optischen Achse des Aufbaus. Das Detektionslicht wird durch einen dichroitischen Spiegel (11) in den Detektor (10) fokussiert. Alternativ kann die Detektion auch durch eine zusätzliche Vorrichtung erfolgen.

Abb. 6 stellt eine bevorzugte Ausführungsform dar, bei der eine einzige Lichtquelle (1, 5) verwendet wird, die Licht zweier Wellenlängen zur Verfügung stellt. Ihr Licht wird wie in dem Doppelobjektiv durch einen dichroitischen Spiegel (17) in zwei Strahlen (2, 6) aufgespalten, die senkrecht zueinander durch zwei Mikroskopobjektive (3, 7) auf einen Punkt (4) im Objekt fokussiert werden. Die Detektion des Fluoreszenzlichts erfolgt durch das Objektiv (8), welches das kurzwelligere Beleuchtungslicht fokussiert. Dadurch führt der Detektionsstrahlengang (9) über die dichroitischen Spiegel (17, 11) zum Detektor (10). Alternativ kann die Detektion auch durch ein zusätzliches Objektiv wie in Abb. 1 erfolgen.

Ein Fluoreszenzmikroskop mit Zweiphotonenanregung, welches das in der DE 43 26 473 C2 beschriebene optische Prinzip auf einen nicht- konfokalen Aufbau überträgt, erlaubt Aufnahmen mit der höchsten räumlichen Auflösung, die ein nicht-konfokales Fernfeld- Lichtmikroskop haben kann.

Bezugszeichenliste Abb. 1

1

,

5

Lichtquelle

2

,

6

Beleuchtungsstrahlengang

3

,

7

Beleuchtungsobjektiv

4

Brennpunkt

8

Detektionsobjektiv

9

Detektionsstrahlengang

10

Detektor

Abb. 2 wie Abb. 1 und zusätzlich:

11

Dichroitischer Spiegel

Abb. 3 wie die vorigen Abbildungen und zusätzlich:

12

Beleuchtungsstrahlengang

13

Strahlteiler

14

Spiegel

15

Beleuchtungsobjektiv

16

,

17

Dichroitischer Spiegel

Abb. 4 wie die vorigen Abbildungen und zusätzlich:

18

Doppelobjektiv, bestehend aus zwei Einzelobjektiven (

3

,

7

)

Abb. 5 wie die vorigen Abbildungen und zusätzlich:

19

Umlenkeinheit

20

Tubuslinse

Abb. 6 wie die vorigen Abbildungen.

Claims

1. Fluoreszenzmikroskop,

1. mit wenigstens einem Detektionsstrahlengang und wenigstens einem Beleuchtungsstrahlengang, der im Fokus des Fluoreszenzmikroskops ein in Beleuchtungsrichtung elongiertes Beleuchtungsvolumen erzeugt,
2. wobei das Fluoreszenzmikroskop zur Mehrfachphotonenanregung eines Objektes und zur Beobachtung des aus dieser Mehrfachphotonenanregung resultierenden Fluoreszenzlichtes ausgebildet ist,

dadurch gekennzeichnet,

1. daß pro Anregungsschritt der Mehrfachphotonenanregung eine eigene, separate Beleuchtungsrichtung vorgesehen ist, in welcher der diesen Anregungsschritt bewirkende Anteil des Beleuchtungslichtes in den gemeinsamen Fokus eingestrahlt wird,
2. daß wenigstens zwei Beleuchtungsrichtungen der Mehrfachphotonen anregung sich im Fokus unter größeren Winkeln schneiden, die insgesamt gegenüber den einzelnen, elongierten Beleuchtungsvolumina ein deutlich verkleinertes, gemeinsames Schnittvolumen aller Beleuchtungsvolumina gewährleisten
3. und daß die Mehrfachphotonenanregung in wenigstens zwei Beleuchtungsrichtungen mit einer unterschiedlichen Wellenlänge erfolgt.

2. Fluoreszenzmikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Winkel im Bereich von 90 Grad variierbar sind.

3. Fluoreszenzmikroskop nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn zeichnet, daß das Fluoreszenzmikroskop einen konfokal angeordneten, punktförmig registrierenden Detektor aufweist.

4. Fluoreszenzmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Mehrfachphotonenanregung eine Zweiphotonen anregung ist.

5. Fluoreszenzmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß pro Beleuchtungsstrahlengang ein eigenes Objektiv vorgesehen ist, oder daß für alle Beleuchtungsstrahlengänge ein gemeinsames Objektiv und pro Beleuchtungsstrahlengang objektseitig von diesem ein Strahlumlenker vorgesehen ist, der das zu diesem Beleuchtungsstrahlengang gehörende Anregungslicht in den gemeinsamen Fokus reflektiert.

6. Fluoreszenzmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß mehrere Detektionsstrahlengänge mit einem gemeinsamen oder mit mehreren Detektionsobjektiven vorgesehen sind, von denen vorzugsweise wenigstens eines mit einem Beleuchtungs objektiv übereinstimmt.

7. Fluoreszenzmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß zwei Beleuchtungsrichtungen im Fokus entgegen gesetzt zueinander verlaufen und das Beleuchtungslicht längs dieser beiden Beleuchtungsrichtungen interferiert.

8. Fluoreszenzmikroskop nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die beiden Beleuchtungslichtbündel eine konstante, einstellbare Phase aufweisen.