DE4326473C2

DE4326473C2 - Konfokales Mikroskop

Info

Publication number: DE4326473C2
Application number: DE4326473A
Authority: DE
Inventors: Ernst H K Dr Stelzer; Steffen Lindek; Rainer Pick
Original assignee: Europaisches Laboratorium fuer Molekularbiologie EMBL
Current assignee: Europaisches Laboratorium fuer Molekularbiologie EMBL
Priority date: 1993-08-06
Filing date: 1993-08-06
Publication date: 1997-05-15
Anticipated expiration: 2013-08-07
Also published as: DE4326473A1

Description

Die Erfindung betrifft ein konfokales Mikroskop nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

Für die genaue dreidimensionale Erfassung eines Objektpunktes durch ein Mikroskop ist die Auflösung entlang aller drei Raumachsen zu verbessern. Dieses kann mittels Vergrößerung der Apertur der Objektive oder/und mittels Verkleinerung der Wellenlängen des ein- und/oder ausgehenden Lichts erfolgen. Bisher wurde bei der Entwicklung von Mikroskopen besonderer Wert auf die Vergrößerung der Apertur der Objektive gelegt. Dadurch wird vor allem die Auf lösung senkrecht zu der Beleuchtungsrichtung, die üblicherweise als optische Achse bezeichnet wird, erhöht. Aus der technisch-wissenschaftlichen Literatur sind konfokale Rastermikroskope bekannt, die eine Auflösung entlang der optischen Achse (axiale Auflösung) aufweisen und Bilder mit einer deutlich verbesserten Schärfe erzeugen können. Ein Problem ist, daß Mikroskopobjektive maximal 35% der um die optische Achse zentrierten Fläche erfassen. Das führt dazu, daß die axiale Auflösung bestenfalls dreimal so schlecht wie die laterale Auflösung ist. Im allgemeinen ist das Verhältnis größer.

Für die zusätzliche Erhöhung der Auflösung in axialer Richtung wurde in der DE 40 40 441 A1 ein doppelkonfokales Rastermikroskop vorgeschlagen, das durch die Verwendung eines zweiten Objektivs auf der anderen Seite der Objektebene gekennzeichnet ist, wobei beide Objektive einen gemeinsamen Objektpunkt gleichzeitig beleuchten und/oder das von ihm ausgehende Licht detektieren. Wird das Objekt über die beiden Objektive kohärent beleuchtet, so wird das Beobachtungsvolumen durch Interferenz längs der optischen Achse reduziert. Zwei Probleme dieser Methode sind: a) Die Phasendifferenz im gemeinsamen geometrischen Fokus der Objektive ist a priori nicht zu bestimmen, so daß die Lichtverteilung zunächst unbekannt ist. Vorteilhafterweise muß die Phasendifferenz ein ganzzahliges Vielfaches von 2π sein, so daß die Interferenz konstruktiv ist. b) Im vorteilhaften Fall der konstruktiven Interferenz im geo metrischen Fokus treten neben dem schmalen Hauptmaximum weitere axiale Nebenmaxima auf, so daß außer dem abzubildenden Punkt im geometrischen Fokus noch andere Punkte erheblich zu dem Signal des doppelkonfokalen Rastermikroskops beitragen. Aus diesen Gründen führt das doppelkonfokale Rastermikroskop zunächst nicht zu Bildern mit einer höheren Auflösung.

Diese bekannten Mikroskope sind nicht dazu geeignet, Licht, das senkrecht zur Beleuchtungs richtung von dem abzubildenden Objektpunkt ausgeht, zu detektieren und unterscheiden sich dadurch von dem erfindungsgemäßen Mikroskop. Des weiteren unterscheiden sie sich durch die Definition einer Objektebene und einer optischen Achse und besitzen (im Fall des doppel konfokalen Rastermikroskops) vorzugsweise zwei Objektive, die gegeneinander gerichtet und zu dieser optischen Achse und zueinander zentriert sind.

Das doppelkonfokale Rastermikroskop dient im Gegensatz zu dem erfindungsgemäßen Mikroskop zur Verbesserung der Auflösung allein mittels Interferenz. Um die Phasendifferenz im gemeinsamen geometrischen Fokus zu kontrollieren, sind Interferenzveränderungsmittel notwendig. Das erfindungsgemäße Mikroskop hingegen kommt ohne Interferenz veränderungsmittel aus.

Aus der technisch-wissenschaftlichen Literatur sind außerdem Dunkelfeldmikroskope bekannt, die Licht unter einem Winkel zur Beleuchtung detektieren. In diesen Mikroskopen wird jedoch stets flächig beleuchtet, und die Detektion unter einem Winkel dient der Ausblendung der nullten Beugungsordnung, nicht jedoch der Erhöhung der Auflösung in Beleuchtungsrichtung. Insbesondere beschreibt die Druckschrift JP 05-164970 A2 ein nicht-konfokales Mikroskop zur Beobachtung von gebeugtem Licht, das von der Oberfläche eines Objekts ausgeht. Dieses Mikroskop unterscheidet sich von dem erfindungsgemäßen Mikroskop insbesondere dadurch, daß es keinen punktförmig registrierenden Detektor verwendet und daher nicht konfokal ist. Darüber hinaus detektiert es gebeugtes Licht.

Die Druckschrift JP 01-277812 A2 beschreibt ein Mikroskop zur Beobachtung von reflektiertem Licht, das von der Oberfläche eines Objekts ausgeht. Dieses Mikroskop unterscheidet sich von dem erfindungsgemäßen Mikroskop insbesondere dadurch, daß es einen zeilenweise registrierenden Detektor verwendet und daher nicht konfokal ist. Darüber hinaus detektiert es reflektiertes Licht.

Die Druckschrift DE 34 17 075 A1 beschreibt ein Auflichtmikroskop mit nahezu senkrecht zur Detektionsrichtung stattfindendem Lichteinfall. Dieses Mikroskop dient zur Beobachtung von Oberflächen, wobei durch den schrägen Lichteinfall ein dreidimensionaler Eindruck der Ober fläche erzeugt wird. Es unterscheidet sich von dem erfindungsgemäßen Mikroskop ins besondere dadurch, daß die Beleuchtung nicht in einem Objektpunkt erfolgt, d. h. das Licht wird nicht punktförmig in oder auf das Objekt fokussiert. Es handelt sich daher nicht um ein konfokales Rastermikroskop. Des weiteren wird aus diesem Grund kein Objektiv zur Beleuchtung verwendet, und das Mikroskop hat daher nur ein Objektiv. Darüber beschreibt diese Druckschrift einen einzelnen Beleuchtungsstrahlengang, während in dem erfindungs gemäßen Mikroskop die Anordnung von Beleuchtungs- und Detektionsvorrichtungen zu einander behandelt wird.

Die Druckschrift DE 39 06 555 A1 beschreibt ein Auflichtmikroskop mit einer Vielzahl von Beleuchtungsquellen, die schräg zur Detektionsrichtung angeordnet sind. Dadurch wird eine Kontrasterhöhung erzielt. Dieses Mikroskop unterscheidet sich von dem erfindungsgemäßen Mikroskop insbesondere dadurch, daß die Beleuchtung nicht punktförmig erfolgt. Es handelt sich daher nicht um ein konfokales Rastermikroskop. Des weiteren sind die Beleuchtungs vorrichtungen keine Objektive. Daher hat das Mikroskop nur ein Objektiv. Im übrigen sind die Beleuchtungsvorrichtungen daher nicht als Detektionsvorrichtungen zu verwenden.

Die Druckschrift US 43 50892 beschreibt ein Durchflußzytometer, bei dem die Detektions richtung senkrecht zur Beleuchtungsrichtung und zur Flußrichtung der zu untersuchenden Objekte ist. Dieses Gerät unterscheidet sich von dem erfindungsgemäßen Mikroskop ins besondere dadurch, daß die Beleuchtung nicht punktförmig erfolgt. Es handelt sich daher nicht um einen konfokalen Aufbau. Im übrigen geht es in diesem Patent nicht um die hochaufgelöste Erfassung der dreidimensionalen Struktur eines Objekts.

Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe besteht darin, ein konfokales Mikroskop vorzuschlagen, dessen Auflösung in Beleuchtungsrichtung verbessert ist, ohne daß die Phasendifferenz des Beleuchtungs- und des Detektionslichts bekannt sind.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß bei einem Mikroskop der eingangs genannten Art die Detektionsrichtung des Detektors relativ zu der Beleuchtungsrichtung der Beleuchtungsobjektivanordnung so weit geneigt ist, daß der Überlagerungsbereich des Beleuchtungsvolumens mit dem Detektionsvolumen gegenüber einem konventionellen konfokalen Mikroskop mit paralleler Beleuchtungs- und Detektionsrichtung deutlich verringert ist.

Zusätzlich können wie bei einem doppelkonfokalen Rasterlichtmikroskop Interferenz veränderungsmittel derart angeordnet sein, daß Licht, das ganz oder teilweise durch eines der Objektive hindurchgegangen ist, mit Licht, das ganz oder teilweise durch eines der anderen Objektive hindurchgegangen ist, am Objekt und/oder an mindestens einem der Detektoren kohärent oder teilweise kohärent überlagert wird, so daß es interferiert und eine gezielte Beeinflussung der Interferenzmuster durch Interferenzveränderungsmittel möglich ist.

Vorzugsweise sind bei dem erfindungsgemäßen Mikroskop zwei Objektive so angeordnet, daß sie auf denselben Objektpunkt fokussiert sind und ihre Achsen senkrecht aufeinander stehen.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind drei Objektive so angeordnet, daß sie auf denselben Objektpunkt fokussiert sind und die Achsen zweier Objektive senkrecht aufeinander stehen, während die Achse des dritten Objektivs auf der Achse eines der beiden anderen Objektive liegt. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind drei Objektive so angeordnet, daß ihre Achsen paarweise senkrecht aufeinander stehen.

Gemäß weiterer bevorzugter Ausführungsformen sind vier, fünf oder sechs Objektive so auf einer Kugeloberfläche um den gemeinsamen geometrischen Fokus und/oder den abzubildenden Punkt angeordnet, daß ihre Achsen beliebige Winkel zueinander einnehmen. Gemäß weiterer bevorzugter Ausführungsformen sind vier, fünf oder sechs Objektive senkrecht zu den Flächen eines Würfels angeordnet, in dessen Mitte der gemeinsame geometrische Fokus und/oder der abzubildende Objektpunkt liegt.

Vorteilhafterweise beleuchten die Objektive mindestens einen Objektpunkt gleichzeitig und/oder sammeln das von ihm ausgehende Licht.

Vorteilhafterweise haben die Objektive die gleiche numerische Apertur.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform befindet sich in mindestens einer der Ebenen, die zu den Fokalebenen der Objektive optisch konjugiert sind, mindestens, eine Blende. Eine Blende wird insbesondere dann vorgesehen, wenn sich die optisch zur Fokalebene konjugierte Ebene vor einem Detektor befindet, der das durch die Blende gegangene Licht registriert, und/oder wenn diese Blende im Beleuchtungsstrahl zur Formung der Lichtquelle dient. Diese Blende ist üblicherweise eine Lochblende.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird Interferenz bei der Überlagerung der Beleuchtungslichtstrahlen und/oder bei der Überlagerung der Detektionslichtstrahlen zur Verbesserung der Auflösung ausgenutzt. Dabei wird Licht, das ganz oder teilweise durch eines der Objektive hindurchgegangen ist, mit Licht, das ganz oder teilweise durch eines der anderen Objektive hindurchgegangen ist, am Objekt und/oder an mindestens einem der Detektoren kohärent oder teilweise kohärent überlagert, so daß es interferiert und eine gezielte Be einflussung der Interferenzmuster durch Interferenzveränderungsmittel möglich ist. Hierbei können die Objektive, durch welche die interferierenden Lichtstrahlen gehen, auf der gleichen Achse liegen oder auf Achsen, die einen Winkel bilden, der kleiner als π ist, liegen. Der Begriff der Objektebene verliert in diesem Aufbau seine übliche Bedeutung.

Vorteilhafterweise ruft die Kompensationsvorrichtung an dem abzubildendem Objektpunkt und/oder an mindestens einem der Detektoren zumindest zeitweise konstruktive Interferenz der Lichtstrahlen hervor. Vorteilhafterweise verändern die Interferenzveränderungsmittel die Interferenzmuster schnell oder auch langsam. Insbesondere verändert eine Kompensations vorrichtung die Phasendifferenz zwischen den Lichtstrahlen, die durch eines der Objektive hindurchgehen, und den Lichtstrahlen, die durch ein anderes der Objektive hindurchgehen, schnell oder auch langsam. Gemäß einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Veränderung der Interferenzmuster periodisch durchgeführt.

Das erfindungsgemäße konfokale Mikroskop kann ein Fluoreszenzmikroskop sein. Durch geeignete optisch aktive Elemente kann die Interferenz von Strahlen, die durch verschiedene Objektive fallen, bewirkt oder verhindert werden. Als Lichtquellen sind alle Punktlichtquellen bzw. Quellen, die sich punktförmig bzw. beugungsbegrenzt fokussieren lassen, geeignet, die eine ausreichende Intensität zur Verfügung stellen. Vorteilhafterweise wird bei Fluoreszenz mikroskopie ein gepulster oder auch nicht-gepulster Laser eingesetzt, der die Zwei- und/oder Mehrphotonenabsorption ermöglicht.

Die Umlenkung der Lichtstrahlen in dem Mikroskop findet über geeignete Umlenkelemente statt. Dies sind beispielsweise Spiegel, dichroitische Spiegel, Strahlteiler oder optische Fasern. Vorteilhafterweise, entfällt in der Fluoreszenzmikroskopie bei der Detektion senkrecht zu der Beleuchtungsrichtung die Verwendung von dichroitischen Spiegeln im Detektionslichtpfad.

Als Lichtdetektoren sind Photomultiplier gut geeignet, aber auch andere Empfänger, die Licht signale in elektrische Signale bzw. in elektrisch auswertbare Signale umwandeln.

Die Erfindung wird nun anhand der beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:

Zeichnung 1 eine Darstellung des Prinzips der Beobachtung unter einem Winkel zur Beleuchtung.

Zeichnung 2 die schematische Darstellung des Strahlengangs in einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Mikroskops.

Zeichnung 3 die schematische Darstellung des Strahlengangs in einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Mikroskops.

Zeichnung 1a stellt die Anordnung der Objektive und die Beleuchtungs- und Detektions volumina für eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Mikroskops dar, bei dem zwei Objektive (2, 4), deren Achsen senkrecht aufeinander stehen, um den Objektpunkt (3) angeordnet sind. Zeichnung 1b stellt die Anordnung der Objektive und die Beleuchtungs- und Detektionsvolumina für eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Mikroskops dar, bei dem drei Objektive (2, 4, 17) um den Objektpunkt (3) angeordnet sind, wobei zwei von ihnen (2, 4) senkrecht aufeinander stehen und das dritte Objektiv (17) auf einer gemeinsamen Achse mit einem der ersten beiden Objektive (2) liegt.

Links ist jeweils angegeben, wie die Objektive um den zu beobachtenden Objektpunkt (3) angeordnet sind. Die Pfeile deuten die Lichtwege für das Beleuchtungslicht (1) und für das Beobachtungslicht (5) an. In Zeichnung 1b erfolgt demgemäß die Beleuchtung über zwei gegenüberstehende Objektive (2, 17). Die beiden Beleuchtungsteilstrahlen sind hierbei kohärent und die Phasendifferenz ist so eingestellt, daß die Beleuchtungsteilstrahlen am Ort des Objekt punkts (3) im geometrischen Fokus konstruktiv interferieren.

Die zweite Graphik gibt jeweils das Beleuchtungsvolumen (18 bzw. 22), das längs der Beleuchtungsrichtung ausgedehnt ist, und die dritte Graphik das Detektionsvolumen (19 bzw. 23), das längs der Detektionsrichtung ausgedehnt ist, wieder. Die vierte Graphik (20 bzw. 24) stellt jeweils die Überlagerung des Beleuchtungsvolumens (18 bzw. 22) mit dem Detektionsvolumen (19 bzw. 23) dar. Rechts wird schließlich jeweils das resultierende Beobachtungsvolumen (21 bzw. 25) der Ausführungsform des erfindungsgemäßen Mikroskops dargestellt. Je kleiner das Volumen ist, desto besser ist die Auflösung des Mikroskops.

Wie in Zeichnung 2 dargestellt wird das Licht der Lichtquelle, die vorteilhafterweise ein Laser ist, kollimiert. Das Beleuchtungslicht (1) fällt auf ein Objektiv (2), das es auf den abzubildenden Objektpunkt (3) fokussiert. Ein zweites Objektiv (4) ist so angeordnet, daß es vorzugsweise auf den gleichen Objektpunkt (3) fokussiert ist, aber nicht auf einer gemeinsamen Achse mit dem Objektiv (2), das für die Beleuchtung verwendet wird, liegt. Das Objektiv (4) erfaßt das von dem abzubildenden Objektpunkt (3) ausgehende Licht. Dieses Beobachtungslicht (5) wird über eine Linse (6) in eine Lochblende (7) fokussiert. Der Detektor (8) mißt vorzugsweise die Intensität des durch die Lochblende (7) gelangten Lichts. In dem Lichtweg können auch Spiegel und/oder andere Umlenkelemente angeordnet sein.

Das Beleuchtungslicht wird durch das Objektiv (2) fokussiert. Die Intensitätsverteilung im Fokalbereich des Objektivs (2) wird durch die Beleuchtungs-Punktverschmierungsfunktion (B-PVF) |h_bel(x,y,z)|² beschrieben. Die Wahrscheinlichkeit, mit der das von dem Fokalbereich ausgehende Licht durch das Objektiv (4) detektiert wird, wird durch die Detektions-Punkt verschmierungsfunktion (D-PVF) |h_det(x,y,z)|² beschrieben. Die PVF eines konfokalen Mikroskops und also auch des erfindungsgemäßen Mikroskops ergibt sich aus dem Produkt der B-PVF und der D-PVF. Die räumliche Ausdehnung der PVF ist ein Maß für die Auflösung des Mikroskops. Durch die Drehung der D-PVF gegen die B-PVF um einen Winkel, der kleiner oder größer als π ist, wird die B-PVF mit einer D-PVF multipliziert, die eine wesentlich geringere Ausdehnung längs der Beleuchtungsachse hat. Die Beleuchtungsachse ist die Achse des Objektivs (2), das zur Beleuchtung verwendet wird. Dadurch wird die Ausdehnung der PVF längs dieser Achse deutlich geringer als bei den bisher bekannten konfokalen Mikro skopen. Die Ausdehnung längs der Achse des Objektivs (4), das für die Detektion verwendet wird, nimmt nur wenig zu, so daß insgesamt das Volumen der PVF des Mikroskops abnimmt und eine Auflösungsverbesserung eintritt.

Diese Ausführungsform des erfindungsgemäßen Mikroskops besitzt die höchste Auflösung, die ein Fernfeld-Lichtmikroskop mit zwei Objektiven ohne die Benutzung von Interferenz haben kann. Durch die Unabhängigkeit von einem Interferenzmuster ist das erfindungsgemäße Mikroskop nicht mit der Problematik der Phasendifferenz behaftet.

Falls Objektrasterung durchgeführt wird, befindet sich das Objekt auf einem - hier nicht eingezeichneten - Tisch, der die vorteilhafterweise beliebige Translation und/oder Rotation des Objekts erlaubt. Falls Strahlrasterung vorgesehen ist, ist eine - hier nicht eingezeichnete - Rastereinheit in dem Beleuchtungsstrahlengang angeordnet, die den Beleuchtungspunkt durch das Objekt bewegt. Gleichzeitig muß auch der Detektionspunkt verändert werden, so daß Beleuchtungs- und Detektionspunkt im Objekt unter kontrollierten Bedingungen verändert werden.

In Zeichnung 3 ist die schematische Darstellung einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Mikroskops dargestellt, das die Interferenz der Beleuchtungslicht strahlen im abzubildenden Objektpunkt zur Verbesserung der Auflösung ausnutzt.

Das Beleuchtungslicht (1) wird von einem Strahlteiler (9) in zwei zueinander kohärente Licht strahlen aufgespalten. Der nach oben abgespaltene Teil des Lichts wird mit Hilfe von Spiegeln (13, 14) oder anderen Umlenkelementen auf das Objektiv (2) gelenkt. Der nach unten abgespaltene Teil des Lichts wird mit Hilfe von Spiegeln (10, 11, 12) oder anderen Umlenk elementen auf das Objektiv (17) gelenkt. Das Objektiv (2) fokussiert das auftreffende Licht auf den abzubildenden Objektpunkt (3). Das zweite Objektiv (17) ist vorzugsweise so angeordnet, daß es auf derselben Achse liegt wie das erste Objektiv (2) und vorzugsweise auf den gleichen Objektpunkt (3) fokussiert ist. Ein drittes Objektiv (4) ist so angeordnet, daß es auf den gleichen Objektpunkt (3) wie die beiden Objektive (2, 17), die für die Beleuchtung verwendet werden, fokussiert ist, aber nicht auf einer gemeinsamen Achse mit den beiden Objektiven liegt. Dieses Objektiv (4) sammelt das von dem abzubildenden Objektpunkt (3) kommende Licht. Dieses Beobachtungslicht (5) wird über eine Linse (6) in eine Lochblende (7) gelenkt. Der Detektor (8) mißt das Signal des durch die Lochblende (7) gelangten Lichts. In beiden Teil beleuchtungsstrahlengängen sind Kompensationsvorrichtungen (15, 16) angeordnet, die zur Veränderung der Phasendifferenz zwischen den oberen und unteren Teilstrahlen dienen und die Interferenz der Teilstrahlen im Objekt gewährleisten.

Die räumliche Kohärenz der Beleuchtung ist durch die geeignete Wahl der Lichtquelle gewährleistet. Im Fokalbereich interferieren die Beleuchtungsteilstrahlen zu einer B-PVF |h_4Pi(x,y,z)|², die räumlich stärker begrenzt ist, als die B-PVF in einem herkömmlichen Mikroskop. Ist die Phasendifferenz zwischen den beiden Beleuchtungsteilstrahlen im Objekt punkt (3) gleich null oder ein ganzzahliges Vielfaches von 2π, so ist die Interferenz konstruktiv und die B-PVF hat ein Maximum im Objektpunkt (3). Die B-PVF weist aber mehrere Neben maxima längs der Beleuchtungsachse auf, welche die Auflösung herabsetzen. Das erste Intensitätsmaximum von |h_4Pi(x,y,z)|² liegt etwa eine halbe Wellenlänge vom absoluten Intensitätsmaximum im Brennpunkt entfernt. Diese Nebenmaxima werden aber nun durch eine Detektion unter einem Winkel von vorteilhafterweise π/2 effektiv unterdrückt, da die Aus dehnung der D-PVF längs der Beleuchtungsrichtung sehr klein ist. Dadurch hat die PVF des erfindungsgemäßen Mikroskops eine axiale Ausdehnung, die im wesentlichen durch die des Hauptmaximums der B-PVF |h_4Pi(x,y,z)|² bestimmt wird. Dies bedeutet, daß die Auflösung im erfindungsgemäßen Mikroskop substantiell verbessert wird.

Bezugszeichenliste

Zeichnung zur Zusammenfassung und Zeichnung 2
1 Beleuchtungslicht
2 Beleuchtungsobjektiv
3 Objektpunkt
4 Detektorobjektiv
5 Beobachtungslicht
6 Linse
7 Blende
8 Detektor

Zeichnung 1
a) Ausführungsform mit zwei Objektiven
b) Ausführungsform mit drei Objektiven
Jeweils von links nach rechts:
- Beleuchtungs- (2; 17) und Detektorobjektivanordnung (4) mit Beleuchtungslicht (1), Beobachtungslicht (5) und Objektpunkt (3)
- Beleuchtungsvolumen (18 bzw. 22); Detektionsvolumen (19 bzw. 23)
- Überlagerung (20 bzw. 24) des Beleuchtungsvolumens (18 bzw. 22) mit dem Detektions volumen (19 bzw. 23)
- resultierendes Beobachtungsvolumen (21 bzw. 25)

Zeichnung 3
1 Beleuchtungslicht
2 Beleuchtungsobjektiv
3 Objektpunkt
4 Detektorobjektiv
5 Beobachtungslicht
6 Linse
7 Blende
8 Detektor
9 Strahlteiler
10-14 Spiegel
15, 16 Interferenzveränderungsmittel (Kompensationsvorrichtungen)
17 Beleuchtungsobjektiv

Claims

1. Konfokales Mikroskop,

- mit einer Beleuchtungsobjektivanordnung (2; 17) zur punktförmigen, beugungsbegrenzten Beleuchtung eines zu beobachtenden Objektpunktes (3)
- und mit einem punktförmig registrierenden Detektor (7, 8) mit zugehöriger Detektorobjektivanordnung (4), der das von dem Objektpunkt (3) herkommende Objektlicht konfokal detektiert, - wobei das Beleuchtungsvolumen (18), unter dem die Beleuchtungsobjektivanordnung (2; 17) den Objektpunkt (3) punktförmig beleuchtet, am Ort des Objektpunktes (3) ellipsoidförmig ausgebildet und in Beleuchtungsrichtung elongiert ist,
- wobei das Detektionsvolumen (19), unter dem der Detektor (7, 8) das von dem beleuchteten Objektpunkt (3) herkommende Objektlicht detektiert, ebenfalls ellipsoidförmig ausgebildet und in Detektionsrichtung elongiert ist,
- und wobei das den beobachteten Objektpunkt (3) wiedergebende Signal gegeben ist durch die Überlagerung des Beleuchtungsvolumens (18) mit dem Detektionsvolumen (19),
dadurch gekennzeichnet,
- daß die Detektionsrichtung des Detektors (7, 8) relativ zu der Beleuchtungsrichtung der Beleuchtungsobjektivanordnung (2; 17) so weit geneigt ist,
- daß der Überlagerungsbereich (21) des Beleuchtungsvolumens (18) mit dem Detektionsvolumen (19) gegenüber einem konventionellen konfokalen Mikroskop mit paralleler Beleuchtungs- und Detektionsrichtung deutlich verringert ist.

2. Konfokales Mikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Beleuchtungsobjektivanordnung (2; 17) zwei gegeneinander ausgerichtete Beleuchtungsobjektive umfaßt, die eine konstruktive Interferenz des Beleuchtungslichtes am Ort des Objektpunktes (3) ermöglichen, wobei eine Kompensationsvorrichtung (15, 16) eine Einstellung der Phasendifferenz gewährleistet.

3. Konfokales Mikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektorobjektivanordnung (4) zwei gegeneinander ausgerichtete Detektionsobjektive umfaßt, die eine konstruktive Interferenz des Detektionslichtes am Ort des Detektors (7, 8) ermöglichen, wobei eine Kompensationsvorrichtung eine Einstellung der Phasendifferenz gewährleistet.

4. Konfokales Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Beleuchtungslicht (1) und/oder das Beobachtungslicht (5) durch optische Fasern verläuft.

5. Konfokales Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Mikroskop zur Beobachtung von Fluoreszenzlicht wahlweise in Verbindung mit einer Mehrphotonenabsorption des Objektes ausgebildet ist.