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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Lokalisieren wenigstens eines Emitters elektromagnetischer Emissionsstrahlung mittels eins Lokalisationsmikroskops sowie eine Vorrichtung zum Durchführen eines derartigen Verfahrens.
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Derartige Verfahren sind heute in unterschiedlichen Ausgestaltungen im Stand der Technik bekannt. Es können Emitter in Bildgebungs- und/oder Tracking-Verfahren beobachtet werden, die kleiner als die dem Abbe'schen Auflösungskriterium entsprechenden Abmessungen sind. Dies sind beispielsweise Kohlenstoff-Nano-Röhren, Quantenpunkte oder Fluorophore. Insbesondere die Fluorophore werden mit elektromagnetischer Anregungsstrahlung zum Leuchten angeregt. Die von dem Emitter ausgesandte elektromagnetische Emissionsstrahlung wird aufgefangen und über geeignete Objektive und optische Anordnungen auf einen optischen Detektor, beispielsweise einen CCD-Chip einer digitalen Kamera geleitet. Man erhält somit im Bildfeld des jeweiligen Objektivs verteilt liegende Punktbilder, die jeweils einem Emitter zugeordnet werden können. Die Zentren dieser Punktbilder korrespondieren mit der lateralen Position der Emitter im beobachteten Volumen.
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Die gattungsgemäßen Verfahren sind insbesondere dann interessant, wenn die zu beobachtenden Emitter so dicht beieinander angeordnet sind, dass sie mit einem herkömmlichen Beobachtungssystem nach Abbe wegen der optischen Auflösungsgrenze nicht aufgelöst und getrennt werden können. Für diesen Anwendungsfall sind sogenannte „super-resolution-microscopy“-Verfahren entwickelt worden. Dabei werden Fluorophore verwendet, die beispielsweise durch einen Farbstoff gebildet werden. Dieser Farbstoff kann in einem aktiven und einem passiven Zustand vorliegen.
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Der aktive Zustand unterscheidet sich von dem passiven Zustand in mindestens einem optischen Merkmal. Im passiven Zustand ist beispielsweise eine Anregung durch die elektromagnetische Anregungsstrahlung nicht möglich. Nur wenn der Fluorophor in dem aktiven Zustand vorliegt, ist er durch die elektromagnetische Anregungsstrahlung anregbar. Nur in diesem Fall kann er zum Leuchten angeregt werden.
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Es sind Fluorophore bekannt, die durch elektromagnetische Aktivierungsstrahlung aus einem passiven Zustand in einen aktiven Zustand gebracht werden können. Ebenso sind Fluorophore bekannt, die aus einem aktiven in einen passiven Zustand bringbar sind. Im Folgenden wird von Aktivierungsstrahlung gesprochen, da in der Regel Fluorophore verwendet werden, die durch die elektromagnetische Aktivierungsstrahlung in einen aktiven Zustand gebracht werden können. Dies ist jedoch auch für die hier beschriebenen Verfahren nicht zwingend nötig. Aus dem Stand der Technik sind Verfahren bekannt, bei denen durch die Aktivierungsstrahlung nur ein Teil der jeweils vorhandenen Fluorophore vom inaktiven oder passiven Zustand in den aktiven Zustand gebracht werden kann, sodass der Abstand zwischen zwei auf diese Weise aktivierten Fluorophoren größer ist, als es der optischen Auflösungsgrenze nach Abbe entspricht. Diese Verfahren können als Einzelmolekül-schalten („single-marker-switching“ SMS) bezeichnet werden und sind aus dem Stand der Technik bekannt. Je nach verwendetem Schaltmechanismus, der verwendet wird, sind sie als „photo activated localization microscopy“ (PALM), „stochastic optical reconstruction microscopy“ (STORM), „fluorescence photoactivation localization microscopy“ (FPALM), „PALM with independently running acquisition“ (PALMIRA), „ground state depletion microscopy followed by individual molecule return“ (GSDIM) oder „direct STORM“ (dSTORM) bekannt. Diese Aufzählung umfasst Verfahren, bei denen Fluorophore durch Strahlung in den aktiven Zustand gebracht werden und Verfahren, bei denen Fluorophore durch Strahlung in den passiven Zustand gebracht werden.
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Die Verfahren haben eine hohe laterale Lokalisierungsgenauigkeit von weniger als 20 - 30 Nanometern. In axialer Richtung ist das beobachtbare Volumen jedoch auf eine Schicht von ca. 1 µm begrenzt. Derartige Verfahren sind beispielsweise in der
WO 2009/146016 A1 beschrieben.
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Es sind Versuche unternommen worden, auch in axialer Richtung eine gute Lokalisierungsgenauigkeit zu erreichen. Bisher muss die Information über die Positionen in dieser Richtung jedoch indirekt ermittelt werden. Dazu werden Techniken wie Zwei-Ebenen-Detektion, Astigmatismus oder Doppelhelix verwendet, wobei die Punktspreizfunktion („point-spread-function“, PSF) modifiziert wird, um die Position entlang der optischen Achse aus der z-abhängigen Änderung dieser Funktion zu bestimmen. Dies führt jedoch nicht zu einer isotropen Auflösung in allen Raumrichtungen. Im Interferenzverfahren erreichen einander gegenüber liegende Objektive (4Pi) eine bessere axiale Auflösung. Alle diese Verfahren sind jedoch auf Schichtdicken von ca. 1 µm begrenzt.
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Die Verwendung von Farbstoffen, die als emittierende Marker verwendet werden, ist insbesondere für die Betrachtung biologischer Objekte, beispielsweise lebender oder fixierter Zellen, von Interesse. Um die gesamte Zelle betrachten zu können, ist jedoch ein beobachtbares Volumen von nur einem µm Dicke nicht ausreichend, sodass die gute axiale Auflösung nicht über den gesamten Bereich der Zelle erreicht wird.
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Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zu Grunde, ein Verfahren zum Lokalisieren wenigstens eines Emitters elektromagnetischer Emissionsstrahlung mittels eines Lokalisationsmikroskops so zu verbessern, dass eine isotrope oder zumindest nahezu isotrope Auflösung über ein großes Bildfeld, insbesondere in drei Raumrichtungen, erreicht wird. Andere mikroskopische Verfahren sind beispielsweise aus der
EP 2 818 905 A2 bekannt, bei der die Oberfläche eines transparenten Materials vermessen werden soll. Aus der
WO 93/25926 ist ein Überwachungsgerät bekannt, bei dem insbesondere mittels „Fischauge“-Weitwinkelobjektiven ein Raum überwacht werden soll. Die nachveröffentliche
WO 2015/075247 A2 befasst sich mit austauschbaren Linsenanordnungen und Objektiven, während die
DE 20 2004 021 696 U eine Abdecktuchanordnung für ein chirurgisches Mikroskop offenbart. Aus der
JP 61307034 A ist ein Detektionssystem für Halbleitergeräte und aus der
US 2011/0115895 A1 eine Vorrichtung und ein Verfahren für die Lichtscheibenmikroskopie bekannt. Die
DE 102 50 247 B4 befasst sich hingegen mit einem Mikroskop-Probenträger.
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Die Erfindung löst die gestellte Aufgabe durch ein Verfahren zum Lokalisieren wenigstens eines Emitters elektromagnetischer Emissionsstrahlung mittels eines Lokalisationsmikroskops, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist:
- a) Leiten der elektromagnetischen Emissionsstrahlung durch wenigstens zwei Objektive auf wenigstens einen optischen Detektor, wobei
- - die optischen Achsen der wenigstens zwei Objektive in voneinander linear unabhängigen Richtungen verlaufen und
- b) Detektieren der elektromagnetischen Emissionsstrahlung durch den wenigstens einen optischen Detektor, wobei der wenigstens eine optische Detektor Messwerte aufnimmt, und
- c) Ermitteln der Position des wenigstens einen Emitters aus den von dem optischen Detektor aufgenommenen Messwerten,
wobei der wenigstens eine Emitter ein Fluorophor ist, der mittels elektromagnetischer Anregungsstrahlung zum Aussenden der elektromagnetischen Emissionsstrahlung angeregt wird.
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Die Messwerte entsprechen dabei der Verteilung der auf den optischen Detektor auftreffenden Photonen, also vorzugsweise deren Menge und Auftreffpositionen. In diesen so erfassten Daten sind aufgrund der mindestens zwei linear unabhängigen Beobachtungsrichtungen Informationen über die Position des oder der jeweiligen Emitter enthalten, die mit einem geeigneten Verfahren extrahiert werden können, so dass die Position des oder der jeweiligen Emitter ermittelt werden kann. Dabei können unterschiedliche Verfahren verwendet werden, wobei unterschiedliche Situationen und Anforderungen unterschiedliche Verfahren zur Folge haben können.
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Anders als bei den Verfahren, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, wird beim erfindungsgemäßen Verfahren die elektromagnetische Emissionsstrahlung durch wenigstens zwei Objektive auf den optischen Detektor geleitet, deren optische Achsen in linear unabhängigen Richtungen voneinander verlaufen. Dies entspricht einer Beobachtung des strahlenden Emitters aus zwei unterschiedlichen, linear unabhängigen Richtungen. Die Messwerte der elektromagnetischen Emissionsstrahlung bilden für jedes Objektiv, durch das die elektromagnetische Emissionsstrahlung geleitet wird, jeweils ein Bild des Emitters auf dem optischen Detektor. Dabei wird der Begriff „Bild“ im Rahmen der vorliegenden Erfindung nur als Zusammenfassung der Messwerte verstanden, die durch die elektromagnetische Emissionsstrahlung eines oder mehrerer Emitter hervorgerufen werden, die durch eines der wenigstens zwei Objektive geleitet wurde.
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Die elektromagnetische Emissionsstrahlung mehrerer Emitter bildet in der Regel bei diesem Verständnis mehrere „Bilder“, auch wenn sie durch ein einziges der wenigstens zwei Objektive geleitet wurde. Lediglich für den Fall, dass für wenigstens eins der mehreren Objektive die mehreren Emitter dichter bei einander liegen als die dem Abbe'schen Auflösungskriterium entsprechende Abmessung kann die elektromagnetische Emissionsstrahlung mehrerer Emitter ein gemeinsames Bild bilden. Dieser Fall kann beispielsweise eintreten, wenn zwei Emitter entlang der optischen Achse des jeweiligen Objektives versetzt angeordnet sind. Die Emitter scheinen dann für das Objektiv sehr nah beieinander zu sein, obwohl der tatsächliche Abstand dem Auflösungskriterium entsprechende Abmessung überschreiten kann. Dies lässt sich in der Regel durch die „Bilder“ des zumindest eines weiteren Objektives auflösen.
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Aus der Kenntnis dieser Messwerte des optischen Detektors sowie der Parameter, die die Lage und Blickrichtung des jeweiligen Objektivs bestimmen, lassen sich beispielsweise durch Lösen eines linearen Gleichungssystems dreidimensionale Koordinaten des jeweils emittierenden Emitters ermitteln. Durch die Beobachtung des Volumens, in dem sich der Emitter befindet, aus zwei unterschiedlichen, linear unabhängigen Blickrichtungen, erhält man auf direktem Wege Informationen über die Position des Emitters in zwei zueinander verkippten Ebenen, und damit über die dreidimensionale Position im Raum.
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Jedes Objektiv leitet die Emissionsstrahlung auf wenigstens einen optischen Detektor. Die verschiedenen optischen Detektoren können Teil einer einzigen Detektoranordnung sein, die beispielsweise in Form eines CCD-Chips einer Digitalkamera vorliegen kann. In diesem Fall würden beispielsweise die unterschiedlichen Objektive die jeweils von ihnen weitergeleitete Emissionsstrahlung auf unterschiedliche Bereiche des Chips übermitteln.
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In einer vorteilhaften Ausgestaltung des Verfahrens wird die elektromagnetische Emissionsstrahlung durch wenigstens drei, bevorzugt wenigstens vier Objektive auf den wenigstens einen optischen Detektor geleitet, wobei die optischen Achsen der Objektive in paarweise linear unabhängigen Richtungen verlaufen. Durch die Verwendung von mehr als zwei Objektiven wird die Isotropie des Auflösungsvermögens und der Lokalisierungsgenauigkeit verbessert. Die optimale Positionierung von beispielsweise vier Objektiven ist die Tetraederanordnung. Zwischen jeweils zwei der Objektive ist dann der Tetraederwinkel von 109,5° eingeschlossen. In diesem Fall ist die Lokalisierungsgenauigkeit nahezu isotrop, wenn die Objektive effektiv den gleichen Aperturwinkel aufweisen.
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Die Lokalisierungsgenauigkeit, mit der die Position eines Emitters bestimmt werden kann, hängt von der Anzahl der durch die Objektive weitergeleiteten Photonen ab, die von dem jeweiligen Emitter ausgesandt werden. Vielfach verfügen beispielsweise die als Fluorophor verwendeten Farbstoffe nur über eine begrenzte Aktivitätsdauer, sodass die Anzahl der aussendbaren Photonen begrenzt ist. Da die einzelnen Fluorophore zumeist durch stochastische Prozesse von dem inaktiven oder passiven Zustand in den aktiven Zustand geschaltet werden, lässt sich ein einmal aktivierter Fluorophor nicht gesteuert erneut aktivieren, um beispielsweise die „Belichtungszeit“ für diesen Fluorophor zu erhöhen und somit die Lokalisierungsgenauigkeit zu verbessern. Es ist daher wichtig, möglichst viele der ausgesandten Photonen mit den Objektiven aufzufangen, sodass es von Vorteil ist, Objektive mit einer möglichst großen numerischen Apertur und somit einem möglichst großen Aperturwinkel zu verwenden. Für ein isotropes Bildfeld, bei dem auch die Lokalisierungsgenauigkeit in allen drei Raumrichtungen zumindest nahezu isotrop ist, ist es von Vorteil, wenn alle Objektive effektiv den gleichen Aperturwinkel aufweisen.
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Bei der Verwendung von mehr als drei Objektiven ist es nicht mehr möglich, alle Richtungen der optischen Achsen linear unabhängig voneinander auszugestalten, sodass nur die paarweise lineare Unabhängigkeit gewährleistet sein kann.
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Dadurch wird das Gleichungssystem, das zum Ermitteln der Position der Fluorophore zu lösen ist, überbestimmt. Auch dadurch wird die Lokalisierungsgenauigkeit weiter gesteigert.
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Erfindungsgemäß handelt es sich bei dem Emitter um einen Fluorophor, der mittels elektromagnetischer Anregungsstrahlung zum Aussenden der elektromagnetischen Emissionsstrahlung angeregt wird.
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Vorteilhafterweise kann der Fluorophor in einem aktiven, durch elektromagnetische Anregungsstrahlung anregbaren Zustand und in einem passiven Zustand vorliegen, in dem eine Anregung nicht möglich ist. Vorzugsweise kann er durch elektromagnetische Strahlung von dem aktiven Zustand in den passiven Zustand oder von dem passiven Zustand in den aktiven Zustand gebracht werden.
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Vorteilhafterweise wird der wenigstens eine Fluorophor vor dem Anregen durch eine elektromagnetische Aktivierungsstrahlung in einen anregbaren Zustand gebracht. Dies ist oftmals insbesondere bei den bereits beschriebenen Verfahren nötig, um zu erreichen, dass der Fluorophor überhaupt durch die elektromagnetische Anregungsstrahlung angeregt werden kann.
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Wie bereits dargelegt, bilden die Messwerte der von einem oder mehreren Emittern ausgesandten elektromagnetischen Emissionsstrahlung jeweils ein Bild der Emitters oder der Emitter, die durch eines der wenigstens zwei Objektive auf den wenigstens einen optischen Detektor geleitet wurde.
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Es hat sich als vorteilhaft herausgestellt, dass unterschiedliche Bilder beim Ermitteln der Position des wenigstens einen Emitters unterschiedlich gewichtet werden. Vorteilhafterweise werden die Bilder weniger stark gewichtet, je breiter sie auf dem optischen Detektor sind und/oder je weniger Emissionsstrahlung von dem optischen Detektor für das jeweilige Bild detektiert wurde. Je breiter ein Bild auf dem Detektor ist, desto „unschärfer“ ist das Bild des Emitters. Dies kann beispielsweise dadurch hervorgerufen werden, dass sich der Emitter relativ weit außerhalb der Fokalebene oder des Fokalvolumens des Objektivs befindet.
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Da die Lokalisierungsgenauigkeit von der Menge der aufgefangenen Photonen abhängt, nimmt sie ab, je weniger Emissionsstrahlung von dem optischen Detektor für ein Bild detektiert wird.
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Alternativ oder zusätzlich dazu kann die unterschiedliche Gewichtung auch iterativ erfolgen. So ist es beispielsweise möglich, zunächst die Position der Emitter in genannter Weise mit oder ohne zusätzliche Wichtung zu ermitteln und aus den so bestimmten Positionen zu bestimmen, welche Emitter sich am weitesten außerhalb der Fokalebenen der einzelnen Objektive befinden. Anschließend kann eine oder können iterativ mehrere erneute Positionsbestimmungen durchgeführt werden, bei denen die Bilder dieser Emitter entsprechend der im vorigen Schritt bestimmten Positionen gewichtet werden.
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Aus den vom optischen Detektor aufgenommenen Messwerten und/oder den daraus gebildeten Bildern wird die Position des Emitters in der zu dem jeweiligen Objektiv gehörigen Abbildungsebene ermittelt. Dies kann beispielsweise durch eine mathematischen Fit, beispielsweise mit einer Gauß-Funktion geschehen. Bei einem derartigen Fit werden in der Regel Abweichungen definiert, die durch die Fitparameter minimiert werden.
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Dabei ist es auch möglich, die Anzahl der Fit-Funktionen zu variieren und damit auch die Anzahl der Emitter zu variieren, deren ausgesandte elektromagnetische Emissionsstrahlung das jeweils zu fittende Bild hervorgerufen hat. Eine vom optischen Detektor aufgenommene Helligkeitsverteilung durch eine Funktion, beispielsweise eine Gauß-Funktion, oder durch mehrere, beispielsweise zwei oder drei Gauß-Funktionen, anzufitten und auf diese Weise zu ermitteln, wie viele Emitter zumindest wahrscheinlich verantwortlich sind. Auf diese Weise lässt sich eine wahrscheinliche Emitteranordnung und -Anzahl bestimmen. Dies ist insbesondere dann von Vorteil, wenn Emitter einen kleineren Abstand aufweisen als die durch das Abbe'sche Auflösungskriterium definierte Abmessung.
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In einer bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens wird aus Teilmengen der von dem wenigstens einen optischen Detektor detektierten elektromagnetischen Emissionsstrahlung eines Emitters, die durch jeweils eines der wenigstens zwei Objektive auf den optischen Detektor geleitet wird, eine Orientierung des Emitters im Raum bestimmt. Geht man davon aus, dass der Emitter ein strahlender Dipol ist, ist die Menge der abgestrahlten elektromagnetischen Strahlung nicht isotrop über alle Raumrichtungen verteilt. Die Strahlungscharakteristik des Dipols ist bekannt, sodass aus den Teilmengen der auf den optischen Detektor auftreffenden Emissionsstrahlung für die jeweils verschiedenen Objektive auf die Orientierung des Dipols und damit die Orientierung des Emitters im Raum geschlossen werden kann.
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Bei Emittern und insbesondere auch bei Fluorophoren lässt sich beispielsweise aus der Ausgeprägtheit der Intensitätsverteilung auf eine Rotation schließen. Ist die Teilmenge der elektromagnetischen Emissionsstrahlung, die durch die verschiedenen Objektive geleitet wird, beispielsweise für alle Objektive nahezu identisch, spricht dies für eine starke Rotation des strahlenden Dipols, so dass die Strahlungscharakteristik des Dipols sich nicht in der Intensitätsverteilung auf dem optischen Detektor und den jeweiligen Teilmengen der elektromagnetischen Emissionsstrahlung niederschlägt. Sind die Teilmengen hingegen deutlich unterschiedlich für verschiedene Objektive, ist dies ein Anzeichen dafür, dass der Emitter keine großen Rotationen ausführt.
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Bei Tracking-Anwendungen der hier beschriebenen Verfahren, bei denen es um die zeitaufgelöste Untersuchung von Bewegungen der jeweiligen Emitter geht, kann über eine zu verschiedenen Zeitpunkten durchgeführte Ermittlung der Position der Emitter deren Bewegung im Raum verfolgt und untersucht werden. Durch die Bestimmung und Untersuchung der Veränderung der Teilmengen der ausgesandten Emissionsstrahlung, die auf die einzelnen Objektive verteilt sind, lassen sich Aussagen über Rotationen des Emitters treffen, insbesondere wenn diese so langsam stattfinden, dass innerhalb einer Zeitspanne, die zur Detektion einer ausreichenden Menge der elektromagnetischen Emissionsstrahlung ausreichend ist, keine oder nur eine geringe Rotation stattfindet.
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Die Erfindung löst die gestellte Aufgabe zudem durch eine Vorrichtung zum Durchführen eines der hier beschriebenen Verfahren, die wenigstens zwei Objektive mit optischen Achsen, die voneinander in linear unabhängigen Richtungen verlaufen, und einen Probenhalter aufweist. Die Vorrichtung verfügt natürlich zudem über einen optischen Detektor, eine elektrische Steuerung zum Auswerten der Detektormesswerte und zumindest eine Einkoppelmöglichkeit, für elektromagnetische Strahlung und/oder über wenigstens eine Strahlungsquelle.
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Wie bereits dargelegt, verfügt die Vorrichtung über wenigstens zwei, bevorzugt mindestens drei, besonders bevorzugt wenigstens vier Objektive. Diese sollten so nah wie technisch realisierbar an der Tetraederanordnung positioniert werden, die eine nahezu isotrope Ortsauflösung bietet. Dies ist mit kommerziell erhältlichen Objektiven nur schwer, gegebenenfalls sogar gar nicht möglich. Eine von den Erfindern hergestellte Vorrichtung verfügt über vier Objektive, von denen eines senkrecht unterhalb des Probenhalters angeordnet ist, und gleichzeitig als Zuführung für die Anregungsstrahlung und gegebenenfalls die Aktivierungsstrahlung dient. Dieses Objektiv ist vorteilhafterweise senkrecht nach oben gerichtet und als Luftimmersionsobjektiv mit einer numerischen Apertur von 0,75 ausgebildet. Oberhalb des Probenhalters befinden sich drei identische Objektive, die vorteilhafterweise als Wassertauchobjektive mit einer numerischen Apertur von beispielsweise 0,8 ausgebildet sind. Die optischen Achsen der oberen Objektive schneiden die optische Achse des unteren Objektivs im genannten Ausführungsbeispiel unter einem Winkel von 125,5°. Eine Anordnung, die näher an der optimalen Tetraederanordnung ist, ist durch den für die Objektive nötigen Bauraum mit den gewählten Objektiven nicht möglich. Die Abweichung vom optimalen Tetraederwinkel von 109,5° hat zur Folge, dass über die Positionierung in x- und y-Richtungen, also einer Richtung senkrecht zur optischen Achse des unteren Objektivs, mehr Informationen gesammelt werden, als über die senkrecht dazu verlaufende z-Richtung in Blickrichtung des unteren Objektivs, sodass die Lokalisationsgenauigkeit nicht vollständig isotrop ausgebildet ist. Das Fokalvolumen, in dem die höchste Auflösung und Lokalisierungsgenauigkeit vorliegt, wird gebildet durch die vier Fokusebenen der vier Objektive, die jeweils eine Dicke der Fokaltiefe („focal depth“) aufweisen.
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Werden Objektive mit kleinerer numerischer Apertur verwendet, lassen diese sich in einem Winkel zueinander anordnen, der näher am optimalen Tetraederwinkel von 109,5° liegt. Durch die geringere numerische Apertur werden jedoch nicht so viele von dem jeweiligen Fluorophor ausgesandte Photonen aufgefangen und zum optischen Detektor geleitet, sodass die Isotropie der Lokalisationsgenauigkeit zwar zunimmt, die Lokalisationsgenauigkeit selbst jedoch abnimmt, da sie von der Anzahl der aufgefangenen Photonen abhängt. Vorzugsweise werden Objektive mit einem möglichst großen Aperturwinkel verwendet. Dieser entspricht dem halben Öffnungswinkel und beträgt vorzugsweise mindestens 17,5°.
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In einer bevorzugten Ausgestaltung ist wenigstens eines der Objektive als Immersionsobjektiv, vorzugsweise als ein Wassertauchobjektiv, ausgebildet. Der Probenhalter weist in diesem Fall ein mit Immersionsflüssigkeit, vorzugsweise mit Wasser oder wässrigem Medium, gefülltes oder füllbares Gefäß auf, in das das wenigstens ein Immersionsobjektiv eintaucht. Im zentralen Bereich des Gefäßes befindet sich im Boden des Gefäßes direkt unterhalb der zu beobachtenden Probe vorteilhafterweise eine Erhöhung, damit der Abstand zwischen dem sich darunter befindlichen Objektiv und der zu beobachtenden Probe auf die optimale Länge eingestellt werden kann. Das Gefäß weist vorteilhafterweise eine Tiefe auf, die es erlaubt, das Gefäß so hoch mit Immersionsflüssigkeit zu befüllen, dass die Eingangslinsen der Immersionsobjektive vollständig darin eintauchen.
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Als Immersionsflüssigkeit wird vorteilhafterweise Wasser oder ein wässriges Medium verwendet. Der Wasseranteil im verwendeten wässrigen Medium beträgt vorteilhafterweise 80%, besonders bevorzugt 89%. Derartige Immersionsflüssigkeiten sind vorzugsweise Flüssigkeiten, wie sie im Stand der Technik der Superauflösungsmikroskopie insbesondere im Hinblick auf die Fluoreszenzeigenschaften der Marker und/oder den Strukturerhalt der Zelle verwendet werden. Diese sind dem Fachmann bekannt, so dass auf eine weitere Beschreibung an dieser Stelle verzichtet wird.
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Vorzugsweise weist der Probenhalter ein Deckglas auf, das derart angeordnet ist, dass zumindest ein Teil einer von dem Emitter ausgesandten Emissionsstrahlung auf dem Weg zu einem der Objektive das Deckglas passiert, und das einen Brechungsindex aufweist, der dem der Immersionsflüssigkeit, insbesondere bei einer Wellenlänge der Emissionsstrahlung, entspricht. Auf diese Weise wird erreicht, dass das Deckglas den Strahlengang in die oberen Objektive insbesondere durch den Übergang an der Grenzfläche zwischen dem Deckglas und dem umgebenden Wasser, nicht beeinflusst. Vorzugsweise besteht das Deckglas aus einem Fluoropolymer und weist einen Brechungsindex von 1,34 auf. Dadurch werden Einflüsse des Deckglases auf die optische Abbildung minimiert.
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Wird ein Deckglas mit einem vom Brechungsindex der Immersionsflüssigkeit abweichenden Brechungsindex verwendet, wird vorzugsweise ein entspiegeltes Deckglas verwendet.
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In einer bevorzugten Ausgestaltung der Vorrichtung verfügt die Vorrichtung über eine die Probe umgebende Umgebungsstruktur, in die wenigstens eine Linse eingebettet ist. Dabei handelt es sich vorteilhafterweise um Linsen, die gleichzeitig die Sinus- und die Herrschel-Bedingung erfüllen. Derartige Linsen sind aus dem Stand der Technik bekannt. Sowohl die laterale als auch die axiale Vergrößerung entspricht dabei dem Verhältnis der Brechungsindexe in der Probe und im Bildraum. Dies hat eine „Auslagerung“ des Bildes zur Folge, was dazu führt, dass die einzelnen Objektive in einem größeren Abstand zueinander angeordnet werden können. Dadurch wird der für die Objektive nötige Bauraum nicht mehr zur limitierenden Größe, sodass auch Objektive mit größerer numerischer Apertur verwendet werden können.
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Dabei kann in die Umgebungsstruktur nur eine Linse oder eine Mehrzahl von Linsen eingebettet sein, so dass das Bild für ein Objektiv, für einige Objektive oder für alle Objektive „ausgelagert“ werden kann. Die tatsächlich gewählte Ausgestaltung hängt unter anderem vom benötigten Bauraum der Objektive ab. Eine besonders vorteilhafte Ausgestaltung der Umgebungsstruktur ist tetraederförmig mit vier darin eingebetteten Linsen, die in den Flächen des Tetraeders angeordnet sind.
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Eine andere vorteilhafte Ausgestaltung weist eine tetraederförmige Umgebungsstruktur auf, in die nur drei Linsen eingebettet sind. Diese befinden sich vorzugsweise in den drei Seitenflächen des Tetraeders, während die Boden- oder Grundfläche keine Linse aufweist. Eine solche Umgebungsstruktur kann einfach über eine bereits auf dem Probenhalter angeordnete Probe gesetzt werden, so dass die Montage und Demontage, beispielsweise zum Wechseln der Probe sehr einfach möglich ist.
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Natürlich kann die Umgebungsstruktur auch Teil des Probenhalters sein.
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Vorteilhafterweise verfügt wenigstens eines der verwendeten Objektive, bevorzugt jedoch alle der verwendeten Objektive, über eine Halterung, welche die Translation in unterschiedliche, vorteilhafterweise alle, Raumrichtungen ermöglicht und eine Verkippung oder Rotation des Objektivs erlaubt. Einzig eine Rotation um die optische Achse ist nicht nötig. Die unterschiedlichen optischen Detektoren sind besonders bevorzugt Teil eines einzigen optischen Chips, beispielsweise eines CCD-Chips, der Teil einer Digitalkamera ist. Wird die bereits beschriebene Ausgestaltung mit drei oberen und einem unteren Objektiv verwendet, ist es ausreichend, für eines, bevorzugt das untere Objektive, eine Bewegung nur entlang seiner optischen Achse zu erlauben. Vorzugsweise ist die Probe an einem Probenhalter befestigt, der separat auf einem Probentisch, auf dem er angeordnet ist, in möglichst allen drei Raumrichtungen verschiebbar ist. Die gesamte Vorrichtung ist vorzugsweise auf einem schwingungsgedämpften Tisch, beispielsweise einem Luftlagertisch, gelagert.
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Verwendet man die bereits beschriebene Ausgestaltung mit einem Objektiv unterhalb und einem, zwei oder drei weiteren Objektiven oberhalb des Probenhalters, wobei der Winkel zwischen der optischen Achse der oberen Objektive und der optischen Achse des unteren Objektivs 125,5° beträgt, lässt sich die Lokalisationsgenauigkeit bei der Verwendung unterschiedlicher Anzahlen von Objektiven zeigen. Dazu wurde zunächst die Position 100-mal gemessen und die Emitterposition mit zwei, drei oder vier Objektiven ermittelt. Von der Verteilung dieser so ausgerechneten Emitterpositionen lässt sich die Standardabweichung und die Halbwertsbreite („full width at half maximum“ FWHM) als Maß für die Lokalisationsgenauigkeit berechnen. Es wurde jeweils das untere Objektiv und ein, zwei oder drei der oberen Objektive einbezogen. Bei zwei verwendeten Objektiven ergibt sich eine Halbwertsbreite von 9 nm in x-Richtung, 8 nm in y-Richtung und 20 nm in z-Richtung. Daraus ergeben sich Standardabweichungen von 3,8 nm, 3,4 nm und 8,5 nm. Werden stattdessen drei Objektive, von denen zwei oberhalb des Probenhalters angeordnet sind, verwendet, ergibt sich eine Halbwertsbreite von 11 nm in x-Richtung, 9 nm in y-Richtung und 15 nm in z-Richtung, was zu Standardabweichungen von 4,7 nm, 3,8 nm und 6,4 nm führt. Bei der Verwendung aller vier Objektive ergibt sich eine Halbwertsbreite von 11 nm in x-Richtung, 8 nm in y-Richtung und 12 nm in z-Richtung, woraus sich Standardabweichungen von 4,7 nm, 3,4 nm und 5,1 nm ergeben.
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Diese Standardabweichungen ergeben sich bei der Näherung, dass es sich um Gauß-Verteilungen handelt.
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Die Erfindung löst die gestellte Aufgabe zudem durch eine Umgebungsstruktur für eine hier beschriebene Vorrichtung.
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Mit Hilfe der beiliegenden Zeichnungen wird nachfolgend ein Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung näher erläutert. Es zeigt
- 1 die schematische Darstellung eines Ausschnittes aus einer Vorrichtung gemäß einem ersten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung,
- 2 den schematischen Schnitt durch einen Teil einer Vorrichtung gemäß dem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung,
- 3 den schematischen Schnitt durch einen Probenhalter einer derartigen Vorrichtung und
- 4 die schematische Draufsicht auf die Objektivanordnung aus 1 und eine schematische Draufsicht auf eine Objektivanordnung mit einem geänderten Probenhalter.
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1 zeigt den Ausschnitt einer Vorrichtung gemäß einem ersten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Zentral befindet sich ein Probenhalter 2, der als ein mit Wasser befüllbares Gefäß ausgebildet ist. Unterhalb des Probenhalters 2 befindet sich ein erstes Objektiv 4, das im vorliegenden Ausführungsbeispiel als Luftimmersionsobjektiv mit einer numerischen Apertur von 0,75 ausgebildet ist. Das erste Objektiv 4 dient einerseits dazu, zumindest einen Teil der von dem Fluorophor ausgesandten elektromagnetischen Emissionsstrahlung auf einen nicht gezeigten optischen Detektor zu leiten und andererseits dazu, elektromagnetische Anregungsstrahlung auf eine Probe 6 zu senden, die sich in der Mitte des Probenhalters 2 befindet.
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Oberhalb des Probenhalters 2 sind in 1 drei zweite Objektive 8 dargestellt, die vorteilhafterweise identisch ausgebildet sind. Im gezeigten Ausführungsbeispiel sind sie als Wassertauchobjektive mit einer numerischen Apertur von 0,8 ausgebildet.
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Die optischen Achsen der verschiedenen Objektive 4,8 schneiden sich vorteilhafterweise in einem Punkt, der in der Probe 6 liegt.
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2 zeigt einen Schnitt durch die in 1 gezeigte Ausführungsform. Man erkennt den Probenhalter 2, das erste Objektiv 4 und eines der zweiten Objektive 8. Im zentralen Bereich des Probenhalters 2 befindet sich eine Erhöhung 10, auf der die Probe 6 angeordnet ist und die dafür sorgt, dass die Probe 6 im optimalen Abstand zu einer ersten Eingangslinse 12 des ersten Objektivs 4 angeordnet werden kann. Der Probenhalter 2 ist bis zu einem Wasserstand 14, der in 2 durch eine gestrichelte Linie dargestellt ist, mit Wasser gefüllt. Dieser Wasserstand 14 muss so hoch sein, dass eine zweite Eingangslinse 16 vollständig mit Wasser bedeckt ist.
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3 zeigt eine vergrößerte Schnittdarstellung des Probenhalters 2 mit der zentralen Erhöhung 10, auf der die Probe 6 anzuordnen ist, und dem Wasserstand 14, bis zu dem der Probenhalter 2 mit Wasser gefüllt wird.
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Im oberen Teil der 4 sind die drei zweiten Objektive 8 zu erkennen, die um die Probe 6 angeordnet sind. In gestrichelten Kreisen sind Wellenfronten 18 dargestellt, die der elektromagnetischen Emissionsstrahlung entsprechen. Aufgrund der Bauart der Objektive 8 ist der Bauraum der limitierende Faktor und die Objektive 8 stehen sehr nah beieinander.
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Im unteren Bereich der 4 sind die drei zweiten Objektive 8 um die Probe 6 herum angeordnet, wobei um die Probe 6 ein Probenhalter 2 angeordnet ist, der eine Umgebungsstruktur 20 aufweist. Das erste Objektiv 4 ist in dieser Darstellung nicht gezeigt. Es „blickt“ von unten aus der Zeichenebene auf die Probe 6. In dieser sind schematisch dargestellte Linsen 22 eingebettet, die eine laterale und eine axiale Vergrößerung aufweisen, welche dem Verhältnis der Brechungsindexe in der Probe 2 außerhalb der Umgebungsstruktur 20 liegenden Bildraum 24 entsprechen. Die perfekten reellen Zwischenbilder 28 werden durch die zweiten Objektive 8 beobachtet. Dadurch können diese in größerem Abstand zur Probe 6 angeordnet werden und der Bauraum der Objektive 8 ist nicht mehr der begrenzende Faktor.
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Bezugszeichenliste
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- 2
- Probenhalter
- 4
- erstes Objektiv
- 6
- Probe
- 8
- zweites Objektiv
- 10
- Erhöhung
- 12
- erste Eingangslinse
- 14
- Wasserstand
- 16
- zweite Eingangslinse
- 18
- Wellenfront
- 20
- Umgebungsstruktur
- 22
- Linse
- 24
- Bildraum
- 28
- reelles Zwischenbild
