DE202012007891U1

DE202012007891U1 - Mikroskop und Probenkammer für die SPIM Mikroskopie

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Publication number: DE202012007891U1
Application number: DE201220007891
Authority: DE
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2012-08-16
Filing date: 2012-08-16
Publication date: 2012-11-23
Anticipated expiration: 2022-08-17

Abstract

Mikroskop zur SPIM Mikroskopie, bestehend aus – einer Beleuchtungseinrichtung, umfassend eine Beleuchtungslichtquelle (3) und einen Beleuchtungsstrahlengang zur Beleuchtung der Probe (1) mit einem Lichtblatt, vorzugsweise über ein Beleuchtungsobjektiv – einer Detektierungseinrichtung zur Detektierung von Licht, das von der Probe (1) abgestrahlt wird, – einer Abbildungsoptik, die die Probe (1) über ein Abbildungsobjektiv (7) in einem Abbildungsstrahlengang mindestens teilweise auf die Detektierungseinrichtung abbildet, – einer vorzugsweise mit Flüssigkeit gefüllten Probenkammer die in Beleuchtungsrichtung und/oder in Detektionsrichtung mindestens ein lichtdurchlässiges Fenster aufweist, – wobei das Lichtblatt im Fokus des Abbildungsobjektivs (7) oder einer definierten Ebene in der Nähe des geometrischen Fokus des Abbildungsobjektivs im Wesentlichen eben ist und wobei das Abbildungsobjektiv (7) eine optische Achse aufweist, die die Ebene des Lichtblattes in einem von Null verschiedenen Winkel, bevorzugt senkrecht schneidet, dadurch gekennzeichnet dass mindestens in einem lichtdurchlässigen Fenster eine Aufnahme, vorzugsweise mit einem Gewinde...

Description

Die Erfindung betrifft ein Mikroskop, welches ein Abbildungsobjektiv zur Abbildung einer Probe auf einen Detektor sowie Mittel zur Beleuchtung der Probe mit einem Lichtblatt in der Fokusebene des Abbildungsobjektivs bzw. in einer definierten Ebene in der Nähe der dieser Fokusebene umfasst. Die Mittel zur Beleuchtung umfassen eine kohärentes Licht abstrahlende Beleuchtungsquelle.
Ein Mikroskop, bei dem Beleuchtungsstrahlengang und Detektionsstrahlengang im Wesentlichen senkrecht zueinander angeordnet sind, und bei der die Probe mit einem Lichtblatt in der Fokusebene des Abbildungsobjektivs, d. h. senkrecht zu dessen optischer Achse, beleuchtet wird, ist für die Untersuchung von Proben nach dem Verfahren der Selective-Plane-Illumination-Microscopy (SPIM) ausgelegt. Im Unterschied zur konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie (LSM), bei der eine dreidimensionale Probe in einzelnen, unterschiedlich tiefen Ebenen Punkt für Punkt abgetastet wird und die dabei gewonnenen Bildinformationen nachfolgend zu einer dreidimensionalen Abbildung der Probe zusammengesetzt werden, beruht die SPIM-Technologie auf der Weitfeldmikroskopie und ermöglicht die bildliche Darstellung der Probe auf der Grundlage von optischen Schnitten durch einzelne Ebenen der Probe.
Die Probe wird in dem überlappenden Bereich von Beleuchtung und Detektion platziert. Fluoreszenzsignale, die durch das Beleuchtungslichtblatt angeregt werden, werden über das gesamte Gesichtsfeld des Detektionsobjektivs auf eine Kamera abgebildet. Durch die rechtwinklige Beleuchtung mit einem dünnen Lichtblatt wird nur ein kleiner Teil der axialen Ausdehnung der Detektionsoptik beleuchtet und somit ein optischer Schnitt erzeugt. Um einen anderen Bereich in der Probe zu beobachten wird die Probe, unabhängig von der Optik, mit einer Probenpositioniereinheit durch das Lichtblatt gefahren.
Die Vorteile der SPIM-Technologie bestehen unter anderem in der größeren Geschwindigkeit, mit der die Erfassung der Bildinformationen erfolgt, der geringeren Gefahr des Ausbleichens von biologischen Proben sowie einer erweiterten Eindringtiefe des Fokus in die Probe.
Prinzipiell werden bei der SPIM-Technologie Fluorophore, die in der Probe enthalten sind oder in diese eingebracht werden, mit Laserlicht angeregt, welches zu einem sogenannten Lichtblatt geformt ist. Mit dem Lichtblatt wird jeweils eine ausgewählte Ebene in der Tiefe der Probe beleuchtet und mit einer Abbildungsoptik ein Bild dieser Probenebene in Form eines optischen Schnitts gewonnen. Im Wesentlichen äquivalent zu einer solchen Anregung mit einem statischen Lichtblatt ist die schnelle Hin- und Herbewegung eines dünnen, rotationssymmetrischen Laserstrahls in der Fokusebene des Abbildungsobjektivs. Effektiv, d. h. im zeitlichen Mittel über den Zeitraum der Beobachtung, ergibt sich somit die Form eines Lichtblatts.
Die SPIM-Technologie ist beispielsweise beschrieben in Stelzer et al., Optics Letters 31, 1477 (2006), in Stelzer et al., Science 305, 1007 (2004), in der DE 102 57 423 A1 und in der WO 2004/0530558 A1 .
In 1 ist zunächst der grundsätzliche Aufbau eines SPIM-Mikroskops dargestellt. Das Licht einer Beleuchtungsquelle 1 wird über eine Beleuchtungsoptik 2 zu einem Lichtblatt geformt und auf eine Probe 3 gelenkt. Probe und Lichtblatt befinden sich in der Fokusebene eines Abbildungsobjektivs 4. Die optische Achse des Abbildungsobjektivs 4 steht senkrecht zu der Richtung, aus der die Probe 3 beleuchtet wird. Die Beleuchtungsoptik 2 umfasst in der Regel mehrere optische Elemente, die das kohärente Licht der Beleuchtungsquelle 1 kollimieren und daraus ein Lichtblatt formen. Im Stand der Technik umfasst die Beleuchtungsoptik 2 in der Regel auch eine Zylinderlinse, deren flache Seite zur Probe weist und deren gewölbte Seite in Richtung der Beleuchtungsquelle weist. Im Folgenden sollen mehrere Beispiele für Beleuchtungsoptiken 2 erläutert werden, mit denen die Erzeugung eines Lichtblatts mit erhöhter Schärfentiefe und verringertem Schattenwurf gegenüber aus dem Stand der Technik bekannten Anordnungen möglich ist.
Problemstellung
Ein großer Vorteil der Lichtscheibenmikroskopie ist das Beobachten lebendiger Proben über einen längeren Zeitraum. Durch die einzigartige Geometrie der Optik, der Anforderung die Probe völlig frei bewegen zu können und die Probe unter physiologischen Bedingungen zu beobachten, hat sich ein besonderes Probenkammerdesign durchgesetzt ( ). Die Probenkammer wird mit einer Flüssigkeit gefüllt (in der Regel Puffer wie z. B. PBS), die Probe wird zur Beobachtung in diese Flüssigkeit eingetaucht ebenso wie das Detektionsobjektiv. Damit keine Flüssigkeit aus der Probenkammer austritt, muss die Schnittstelle zwischen Detektionsobjektiv und Probenkammer dicht abgeschlossen sein. Verschiedene Wassertauchobjektive haben aber ganz unterschiedliche geometrische Maße ( ), alternativ zum Tauchobjektiv sollte auch noch die Möglichkeit bestehen, mit einem Luftobjektiv durch ein Deckglas in die Probenkammer zu beobachten.
Das bedeutet, dass die Probenkammer speziell auf das Detektionsobjektiv konstruiert sein muss und ein einfacher Wechsel zwischen verschiedenen Detektionsobjektiven nicht möglich ist. Aber genau das ist notwendig. Bei verschiedenen Proben, und auch bei unterschiedlicher Probengröße, ist ein Wechsel des Objektivs unvermeidlich, da die Vergrößerung und/oder Numerische Apertur auf die Probe angepasst werden muss. Um ein universell einsetzbares Lichtscheibenmikroskop zu konstruieren, das mit ganz unterschiedlichen Proben genutzt werden kann, muss es eine einfache Möglichkeit geben die Objektive zu wechseln. Ansonsten muss für jedes Objektiv eine eigene Probenkammer konstruiert werden. Dies ist umständlich für den Anwender (er muss für jedes Objektiv immer die passende Kammer parat haben), sehr aufwendig (teilweise ist eine Neuberechnung des Optik Designs nötig) und teuer.
zeigt mögliche verwendete Objektive in einem SPIM Aufbau.
2(a) ist beispielsweise ein Luftobjektiv 5 × NA 0.16, das im Probenraum ein Deckglas benötigt. 2b)–d) sind beispielhaft Wassertauchobjektive mit einer NA 1.0 und unterschiedlicher Vergrößerung Vergrößerung: (b) 20×, (c) 40× und (d) 63×.
Lösung
Das dargestellte Problem wird durch die Merkmale der unabhängigen Patentansprüche gelöst.
Bevorzugte Weiterbildungen sind in den abhängigen Patentansprüchen aufgeführt.
Die Erfindung betrifft ein Mikroskop zur SPIM Mikroskopie, bestehend aus

– einer Beleuchtungseinrichtung, umfassend eine Beleuchtungslichtquelle (3) und einen Beleuchtungsstrahlengang zur Beleuchtung der Probe (1) mit einem Lichtblatt, vorzugsweise über ein Beleuchtungsobjektiv
– einer Detektierungseinrichtung zur Detektierung von Licht, das von der Probe (1) abgestrahlt wird,
– einer Abbildungsoptik, die die Probe (1) über ein Abbildungsobjektiv (7) in einem Abbildungsstrahlengang mindestens teilweise auf die Detektierungseinrichtung abbildet,
– einer vorzugsweise mit Flüssigkeit gefüllten Probenkammer die in Beleuchtungsrichtung und in Detektionsrichtung mindestens ein lichtdurchlässiges Fenster aufweist,
– wobei das Lichtblatt im Fokus des Abbildungsobjektivs (7) oder einer definierten Ebene in der Nähe des geometrischen Fokus des Abbildungsobjektivs im Wesentlichen eben ist und wobei das Abbildungsobjektiv (7) eine optische Achse aufweist, die die Ebene des Lichtblattes in einem von Null verschiedenen Winkel, bevorzugt senkrecht schneidet,

3 zeigt einen erfindungsgemässen Objektivadapter als Schnittstelle, in (a) als Seitenansicht des Objektivadapters, in (b) als Frontansicht des Objektivadapters. Dier Mittenteil 13 bleibt frei bzw. lichtdurchlässig. 3(c) ist eine Anwendung des Objektivadapters am Beispiel des ZEISS 6× NA 1.0 Detektionsobjektives Es ist ein Adapter 5 dargestellt, der passend zum Objektiv ausgewählt ist und in die Probenkammer eingeschraubt wird. Der jeweilige Adapter enthält einen Kunststoff- oder Gummiring 6 und schließt dadurch dicht mit dem Detektionsobjektiv, 7, hier beispielhaft das aus 2d) in ab. Mit dem Adapter erhält man die notwendige Flexibilität. So ist es möglich Wassertauchobjektive unterschiedlicher Größe mit der Probenkammer zu verwenden, es können auch Adapter mit Deckgläsern (oder auch ganz unterschiedlichen Glasdicken) eingesetzt werden.
Für die hier vorgestellten Adapter wird, im Falle des Wassertauchobjektivs, die Probenkammer gegen das Detektionsobjektiv gedrückt. Dabei übernimmt ein Kunststoffring, der auf das Objektiv gequetscht wird, die Abdichtung. Außerdem sorgt er dafür, dass das Objektiv nicht beschädigt wird. Beispielsweise gibt es vorteilhaft gibt es vier verschiedene Adapterringe, für jedes Objektiv einen eigenen, da die jeweilige Objektivgeometrie unterschiedlich ist. Einer der Adapterringe hat anstatt der Apertur (Öffnung) für das Tauchobjektiv ein Deckglas eingeschraubt (austauschbar), da er beispielsweise mit dem 5 × Luftobjektiv funktionieren muss.
In 4 ist eine SPIM Probenkammer 10 dargestellt die lichtdurchlässige Fenster 11 aufweist. Entlang der optischen Achse 12 erfolgt die hier nicht dargestellte SPIM Beleuchtung.
An einer Seite der Probenkammer 10 ist in einem mittels eines Gewindes 8 einschraubbaren Einsatz 5 (Apapter) ein Objektiv 7 vorgesehen, das mittels des Dichtringes 6 fest und flüssigkeitsdicht in den Einsatz 5 eingequetscht ist.
Da es sich beim Objektiv 7 hier beispielhaft um ein Luftobjektiv handelt, weist der Einsatz 5 ein mit ihm verbundenes Deckglas 9 auf das das O)bjekti7 7 vor der in der Probenkammer 10 befindlichen Flüssigkeit schützt.
Dieses Verfahren ist nicht allein auf das Detektionsobjektiv beschränkt, sondern kann analog auch für die Beleuchtungsobjektive verwendet werden.
Ohne Einschränkung lässt es sich auch auf Einzellinsen wie Zylinderlinsen zur Erzeugung des Lichtblatts die in einer entsprechenden Halterung- oder Fassung angebracht sind, anwenden.
Dabei könnte auch ein Aufbau mit bis zu vier Objektiven, in die Probenkammer eingetaucht, realisiert werden. Denkbar wäre auch ein Fall, dass die Probenkammer fest ist und alle Objektive (bis zu 4) in die Probenkammer gefahren werden.
Werden beispielsweise zwei Tauchobjektive in einem Winkel zu einander verwendet, muss auch mindestens eins der Objektive bewegbar sein um die Dichtigkeit zu gewährleisten.
Eine weitere Voraussetzung ist, dass die Verschraubung zwischen Adapter und Probenkammer dicht sein muss. Dies kann durch eine zusätzliche Dichtung oder andere bekannte Maßnahmen erfolgen.
Da die Lichtscheibenmikroskopie überwiegend bei lebenden Proben eingesetzt wird, ist es von Vorteil wenn die Adapter und Probenkammer sterilisiert werden können. D. h. die Materialen müssen gängigen Sterilisations und Reinigungsmitteln (z. B. 70% Ethanol) widerstehen. Außerdem wäre es von Vorteil, wenn die Materialien autoklavierbar sind.
Der Dichtungsring sollte aus diesem Grund austauschbar sein, auch da der Kunststoff mit der Zeit porös wird.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

DE 10257423 A1 [0006]
WO 2004/0530558 A1 [0006]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Stelzer et al., Optics Letters 31, 1477 (2006) [0006]
Stelzer et al., Science 305, 1007 (2004) [0006]

Claims

Mikroskop zur SPIM Mikroskopie, bestehend aus – einer Beleuchtungseinrichtung, umfassend eine Beleuchtungslichtquelle (3) und einen Beleuchtungsstrahlengang zur Beleuchtung der Probe (1) mit einem Lichtblatt, vorzugsweise über ein Beleuchtungsobjektiv – einer Detektierungseinrichtung zur Detektierung von Licht, das von der Probe (1) abgestrahlt wird, – einer Abbildungsoptik, die die Probe (1) über ein Abbildungsobjektiv (7) in einem Abbildungsstrahlengang mindestens teilweise auf die Detektierungseinrichtung abbildet, – einer vorzugsweise mit Flüssigkeit gefüllten Probenkammer die in Beleuchtungsrichtung und/oder in Detektionsrichtung mindestens ein lichtdurchlässiges Fenster aufweist, – wobei das Lichtblatt im Fokus des Abbildungsobjektivs (7) oder einer definierten Ebene in der Nähe des geometrischen Fokus des Abbildungsobjektivs im Wesentlichen eben ist und wobei das Abbildungsobjektiv (7) eine optische Achse aufweist, die die Ebene des Lichtblattes in einem von Null verschiedenen Winkel, bevorzugt senkrecht schneidet, dadurch gekennzeichnet dass mindestens in einem lichtdurchlässigen Fenster eine Aufnahme, vorzugsweise mit einem Gewinde versehen, vorgesehen ist in die mindestens ein vorzugsweise einschraubbarer Einsatz (Adapter) einpaßbar ist der eine vorzugsweise ringförmige Öffnung aufweist in der ein Dichtungsring zur Einpassung eines Dektektionsobjektives und/oder Beleuchtungsobjektives und/oder einer Linsenfassung- oder halterung eingebracht ist.
Probenkammer für die SPIM Mikroskopie, die ein lichtdurchlässiges Fenster in Detektionsrichtung und/oder Beleuchtungsrichtung aufweist, in dem mindestens in einem lichtdurchlässigen Fenster eine Aufnahme, vorzugsweise mit einem Gewinde versehen, vorgesehen ist in die mindestens ein vorzugsweise einschraubbarer Einsatz (Adapter) einpaßbar ist der eine vorzugsweise ringförmige Öffnung aufweist in der ein Dichtungsring zur Einpassung eines Dektektionsobjektives und/oder Beleuchtungsobjektives und/oder einer Linsenfassung- oder halterung eingebracht ist.
Objektivwechseladapter oder Adapter für Linsenfassungen- oder Halterungen für die SPIM Mikroskopie, der aus mindestens einer Aufnahme einer in einem lichtdurchlässigen Fenster, vorzugsweise mit einem Gewinde, besteht in die mindestens ein vorzugsweise einschraubbarer Einsatz (Adapter) einpaßbar ist der eine vorzugsweise ringförmige Öffnung aufweist in der ein Dichtungsring zur Einpassung eines Dektektionsobjektives und/oder Beleuchtungsobjektives und/oder einer Linsenfassung- oder halterung eingebracht ist.
Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei mehrere Einsätze oder Adapter vorgesehen sind die zur Anpassung an unterschiedliche Detektions- und/oder Beleuchtungsobjektive und/oder Linsenfassungen einen unterschiedlichen Innendurchmesser der Öffnung aufweisen.
Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei an dem Adapter für den Einsatz von Trockenobjektiven in Richtung der Probe ein flüssigkeitsdichtes Deckglas vorgesehen ist.
Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, mit einem austauschbaren Dichtungsring.
Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Objektive und/oder Linsenfassungen in Richtung der Probenkammer zur Erzeugung eines Anpressdrucks an der Probenkammer in Richtung der optischen Achse verschiebbar und arretierbar sind.