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Die
Erfindung betrifft eine Probenhalterung für ein Mikroskop.
Eine solche Probenhalterung umfaßt eine mit einer Immersionsflüssigkeit
gefüllte Probenkammer, in der sich eine in ein transparentes
Einbettmedium eingebettete Probe in einem Halter befindet, wobei
die Probenkammer eine obere Öffnung aufweist. Die Probenhalterung
umfaßt außerdem Mittel zur Translation der Probe
relativ zu einem Detektionsobjektiv des Mikroskops, sowie Mittel
zur Rotation der Probe um eine im wesentlichen vertikale Rotationsachse,
die in einer Ebene liegt, die mit der optischen Achse des Detektionsobjektives
einen von Null verschiedenen Winkel einschließt, d. h.
nicht parallel zur optischen Achse liegt, bevorzugt in einer zur optischen
Achse im wesentlichen senkrechten Ebene.
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Die
erfindungsgemäße Probenhalterung ist insbesondere
im Zusammenhang mit der Single-Plane-Illumination-Mikroskopie (SPIM),
auch als Selective-Plane-Illumination-Mikroskopie bezeichnet, anwendbar.
Während mit der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie die
Probe in mehreren unterschiedlich tiefen Ebenen Punkt für
Punkt abgetastet wird und daraus dreidimensionale Bildinformationen
der Probe gewonnen werden, so beruht die SPIM-Technologie auf der
Weitfeldmikroskopie und ermöglicht die dreidimensionale
bildliche Darstellung von Proben auf der Grundlage von optischen
Schnitten durch verschiedene Ebenen der Probe.
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Dabei
bestehen die Vorteile der SPIM-Technologie u. a. in der größeren
Geschwindigkeit, mit der die Bilderfassung erfolgt, einem geringeren
Ausbleichen von biologischen Proben sowie einer erweiterten Eindringtiefe
des Fokus in die Probe.
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Prinzipiell
werden bei der SPIM-Technologie Fluorophore, die in der Probe enthalten
oder in die Probe eingebracht sind, mit Laserlicht angeregt, das zu
einem sogenannten Lichtblatt geformt ist bzw. auf eine Weise über
die Probe geführt wird, daß sich effektiv, d.
h. über den Zeitraum der Beobachtung, die Form eines Lichtblatts
ergibt. Dabei wird mit jeweils einem Lichtblatt eine Ebene in der
Tiefe der Probe beleuchtet. Mittels dieser Beleuchtung wird ein
Bild der Probe in dieser Ebene gewonnen. Wesentlicher Bestandteil
dieses Verfahrens ist dabei, daß die Richtung, in der Licht
detektiert wird, senkrecht oder zumindest in einem von Null Grad
abweichenden Winkel zu der Ebene, in der beleuchtet wird, steht.
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Die
SPIM-Technologie ist beispielsweise beschrieben in
Stelzer
et al., Optics Letter 31,1477 (2006), in
Stelzer
et al., Science 305, 1007 (2004), in der
DE 102 57 423 A1 und in
der
WO 2004/0530558 A1 .
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Aus
diesen Veröffentlichungen ist u. a. ein Probenhalter bekannt,
der ein optimales Ausrichten der Probe im Hinblick auf die Gewinnung
von dreidimensionalen Bilddaten aus verschiedenen Blickrichtungen
ermöglicht. Dazu wird die Probe in ein Gel, welches zu
einem Kreiszylinder geformt wurde, eingebettet und dieser Gelzylinder
in eine mit einem Immersionsmedium, beispielsweise Wasser, gefüllte Probenkammer
eingebracht. Dabei soll sich der Brechungsindex des Gels nicht wesentlich
vom Brechungsindex des umgebenden Immersionsmediums unterscheiden.
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Der
Gelzylinder, der die Probe umschließt, wird gemäß des
Standes der Technik so in der Probenkammer positioniert, daß seine
Rotationsachse in der Schwerkraftrichtung verläuft, was
im Hinblick auf die Verformbarkeit des Gels Vorteile bei der Positionierung
der Probe hat. Er wird so gelagert, daß er für die
Bildaufnahmen innerhalb der Probenkammer translatorisch verschoben
und optional auch um seine Rotationsachse gedreht werden kann.
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Die
optische Achse des Detektionsobjektivs, welches das von der Probe
kommende Detektionslicht aufsammelt, ist dabei im Stand der Technik
annähernd senkrecht zur Rotationsachse des Gelzylinders
ausgerichtet und verläuft dadurch nicht wie beim klassischen
Mikroskopaufbau vertikal, sondern horizontal, d. h. senkrecht zur
Richtung der Schwerkraft.
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Für
Bildaufnahmen, die mit großem Abbildungsmaßstab
und großer numerischer Apertur gewonnen werden sollen,
ist in der Regel die Verwendung von Detektionsobjektiven vorgesehen,
die als Tauch- bzw. Immersionsobjektive ausgeführt sind. Dabei
ragen die Tauchobjektive durch eine Wand der Probenkammer in die
Probenkammer hinein und sind, um das Auslaufen des Immersionsmediums
an der Stelle der Objektivdurchführung zu verhindern an ihrem äußeren
Umfang gegen die Probenkammerwand abgedichtet.
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Translation
und Rotation der Probe können dabei auf zweierlei Weisen
erreicht werden. Zum einen kann in aufwendiger Weise die umgebende
Optik bewegt werden, zum anderen kann die Probe auch direkt bewegt
werden. Dies wird zumindest für die Rotation im Stand der
Technik erreicht, indem ein Antrieb direkt mit einem Halter, der
die Probe hält, gekoppelt ist. Zwischen Antrieb und Probenhalter
besteht also eine direkte Verbindung durch eine Wand der Probenkammer,
die dafür eine Öffnung aufweist. Um Dichtungsprobleme
zu vermeiden, wird hierzu in der Regel die obere Öffnung
gewählt, wo keine Gefahr des Auslaufens von Immersionsflüssigkeit
aus der Kammer besteht. Aufgrund der Antriebshalterung und -ausführung
wird dabei allerdings der direkte Zugang zur Probe bzw. zum Kammerinneren über
die obere Öffnung erschwert bzw. behindert, das Einsetzen
und Herausnehmen der Probe ist daher sehr umständlich.
Auch das Anbringen zusätzlicher Instrumente zur Manipulation
der Probe ist schwierig, eine Kontrolle der Umgebung, in der sich
die Probe befindet, wie beispielsweise Temperaturmessungen, pH-Wert-Messungen,
Messungen der atmosphärischen Zusammensetzung, etc. ist
ebenfalls äußerst umständlich.
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Eine
Möglichkeit um dieses Problem zu vermeiden besteht darin,
die Motoraufhängung durch eine seitliche oder die untere
Kammerwand zu führen. Zur Vermeidung des Auslaufens von
Immersionsflüssigkeit aus der Kammer ist hierzu allerdings eine
entsprechende Dichtung vorzusehen. Insbesondere im Falle eines längeren
Gebrauchs besteht jedoch hier das Risiko des Auftretens von Lecks
aufgrund von Abnutzungserscheinungen und Materialermüdungserscheinungen.
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Aufgabe
der Erfindung ist es daher, eine Probenhalterung zu schaffen, die
eine einfache Rotation und Translation der Probe ermöglicht,
dabei jedoch den Zugang zur Probe von oben durch die obere Öffnung
nicht durch eine diesen Zugang ebenfalls nutzende Motoraufhängung
behindert. Gleichzeitig soll das mögliche Auftreten von
Dichtungsproblemen vermieden werden.
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Diese
Aufgabe wird bei einer Probenhalterung der eingangs beschriebenen
Art dadurch gelöst, daß die Mittel zur Rotation
der Probe einen Rotationsantrieb aufweisen, mit einer Magnetkupplung,
die die Rotationsbewegung auf den Halter durch eine Wandung der
Probenkammer hindurch überträgt. Die Übertragung
durch eine Wandung der Kammer impliziert, daß dies nicht
durch die obere Öffnung geschieht, sondern bei einer kastenförmigen
Kammer beispielsweise durch eine seitliche oder die untere Wand.
Auf diese Weise kann auf eine Öffnung der Probenkammer
auf der Seite oder unten mit anschließender Abdichtung
verzichtet werden, außerdem wird die obere Öffnung
nicht blockiert. Da die Kupplung nicht von oben erfolgt, blockiert
keine Motoraufhängung die obere Öffnung, die Probe
ist daher weiterhin frei zugänglich. Eine aufwendige Mechanik wird
nicht benötigt.
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Der
Antrieb auf der Außenseite der Probenkammer ist dabei mit
einem Magneten versehen, ein entsprechend ausgerichteter Magnet
ist am Halter der Probe in der Kammer befestigt. Beide Magnete liegen
sich also gegenüber, nur getrennt durch die Wandung der
Probenkammer und ggf. Immersionsflüssigkeit. Die Magnetkupplung
befindet sich dabei bevorzugt an der Unterseite der Probenkammer,
die beispielsweise quaderförmig oder zylinderförmig ausgestaltet
sein kann. Auch andere Formen in Abhängigkeit von der Untersuchungseinrichtung
oder der Probengestaltung sind denkbar. Bei jeder Drehung des Motors
und des Antriebs dreht sich der Halter, an dem der Magnet in der
Probenkammer befestigt ist, entsprechend mit. Dieser Aufbau ermöglicht ein
besonders einfaches manuelles Austauschen verschiedener Probenexemplare.
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In
einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung weisen die Mittel
zur Translation einen Translationsantrieb auf, der die Translationsbewegung über
die Magnetkupplung auf den Halter überträgt. Dies
kann beispielsweise erreicht werden, indem ein Motorblock, der den
Rotationsantrieb enthält durch einen Translationsantrieb
unter der Probenkammer verschoben wird. Der magnetische Gegenpol
mit dem Halter auf der anderen Seite wird dann mitbewegt. Alternativ
kann auch ein einziger Motorblock vorgesehen sein, wobei auf mechanische
Weise nur der Magnet unterhalb der Probenkammer translatiert oder
rotiert wird. Eine Bewegung in Z-Richtung, d. h. entlang der Rotationsachse,
ist dabei jedoch nur in eingeschränktem Maße möglich.
Hierzu kann beispielsweise die gesamte Probenkammer mit dem Translationsantrieb
relativ zum Detektionsobjektiv bzw. der Detektionsachse bewegt werden.
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Die
Aufgabe wird für eine Probenhalterung der eingangs beschriebenen
Art auch dadurch gelöst, daß die Mittel zur Rotation
der Probe einen Riemen- und/oder Zahnrad-Rotationsantrieb aufweisen, der
die Rotationsbewegung auf den Halter überträgt. Der
Antrieb ist dabei oberhalb der Kammer angeordnet, über
Riemen und/oder Zahnräder wird die Rotation durch die obere Öffnung
der Kammer hindurch auf den Halter der Probe übertragen.
Die Probe ist auf einem Ausleger befestigt, so daß der
Zugang zur Probe gewährleistet bleibt. Es muß darauf
geachtet werden, daß die Mechanik nicht von der Flüssigkeit
in irgendeiner Weise beeinträchtigt wird. Da auch bei dieser
Ausführung auf Dichtungen verzichtet werden kann, tritt
das Problem von Lecks nicht auf. Gegenüber der indirekten
Variante mit magnetischer Kupplung bietet dieser Antrieb den Vorteil
einer noch besseren Positionierung der Probe insbesondere auch in Z-Richtung,
d. h. nach oben oder unten.
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In
einer bevorzugten Ausgestaltung dieser Ausführung umfassen
die Mittel zur Translation der Probe einen an einen Translationsantrieb
gekoppelten mechanischen Arm, wobei Riemen- und/oder Zahnrad-Rotationsantrieb
sowie der Halter am mechanischen Arm befestigt sind. Auf diese Weise
kann die Probe unabhängig von der Probenkammer in dieser
bewegt werden, und zwar in allen drei Richtungen, wobei auch in
Z-Richtung entlang der Rotationsachse gegenüber der magnetischen
Variante ein erheblicher Spielraum zur Verfügung steht.
So kann dieser Antrieb auch dazu verwendet werden, die Probe aus
der Probenkammer zu entfernen, beispielsweise zum Wechseln. Rotations-
und Translationsantrieb können dabei auch in einen Motorblock
integriert sein, über eine entsprechende Mechanik werden
Translation und Rotation dann auf den Probenhalter übertragen.
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Dabei
kann es zweckmäßig sein, daß die Mittel
zur Translation sowohl beim magnetischen Antrieb als auch beim Zahnrad-Antrieb
einen im Raum verfahrbaren Probentisch umfassen, auf dem die Probenkammer
angeordnet ist. Die Probenkammer kann beispielsweise fest auf dem
Probentisch montiert sein. Eine Translation der Probe wird also
erreicht, indem die ganze Probenkammer bewegt wird, wobei die Probe
in der Probenkammer sich relativ zu dieser nicht bewegt. Dies ist
bei Bewegung in Z-Richtung und insbesondere dann von Vorteil, wenn
ein Bildstapel aufgenommen werden muß, da gegenüber einer
Translation der Probe in der Probenkammer eine höhere Stabilität
erreicht wird. Vibrationen, die beim Positionieren der Probe auftreten
können, werden vermieden. Äquivalent und mit der
gleichen Wirkung kann anstelle des Tisches auch das Detektionsobjektiv
bewegt werden. Zum Ausgleich der optischen Weglängen bzgl.
Beleuchtung und Detektion ist es je nach verwendeter numerischer
Apertur vor teilhaft, dabei adaptive optische Elemente vorzusehen.
Dies ist insbesondere bei der Erzeugung eines Lichtblattes wichtig,
da dieses dort, wo es die Probe trifft, am dünnsten sein
muß.
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In
einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung, die insbesondere für
die Verwendung von Luftobjektiven bei der Detektion geeignet ist,
ist die Probenkammer zylinderförmig ausgestaltet, wobei
die Probe im Halter relativ zur Probenkammer fixiert ist. Die Probenkammer
ist auf einem im Raum verfahrbaren Probentisch montiert, wobei die
Mittel zur Rotation einen Rotationsantrieb umfassen, der die Probenkammer
auf dem Probentisch um die Rotationsachse der Probenkammer rotiert.
Der Halter mit der Probe ist also im Zentrum des Zylinders positioniert.
Auf diese Weise kann erreicht werden, daß die Rotation durch
eine Bewegung der gesamten Kammer erreicht wird, ohne hierbei auf
die Geometrie der Kammer Rücksicht nehmen zu müssen.
Auch anders geformte Probenkammern, beispielsweise quader- oder würfelförmige
Probenkammern können rotierbar gelagert sein, jedoch wird
man in einem solchen Fall auf gewisse Rotationswinkel eingeschränkt
sein bzw. wird man bevorzugt adaptive optische Elemente verwenden,
um optische Weglängenunterschiede bei unterschiedlichen
Rotationswinkeln auszugleichen. Auch andere polygonale Formen sind
für die Probenkammer verwendbar.
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Besonders
geeignet läßt sich die erfindungsgemäße
Probenhalterung in einem Mikroskop mit lichtblattförmiger
Beleuchtung in einer Ebene, die mit der Rotationsachse und der optischen
Achse des Detektionsobjektivs einen von Null verschiedenen Winkel
einschließt, bevorzugt in einem Single-Plane-Illumination-Mikroskop
(SPIM), wo die Winkel in einer besonders bevorzugten Ausgestaltung
jeweils 90 Grad betragen.
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Die
Erfindung soll im Folgenden anhand von Ausführungsbeispielen
näher erläutert werden. In den dazugehörigen
Zeichnungen zeigt
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1 den
generellen Aufbau einer Probenhalterung mit den Strahlengängen
in einem SPIM,
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2 einen
Antrieb mittels Magnetkupplung, und
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3 einen
Antrieb mittels mechanischem Arm, sowie
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4 einen
Antrieb über Bewegung des Probentischs mit zylinderförmiger
Probenkammer.
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In 1 ist
zunächst der allgemeine Aufbau einer Probenkammer (1),
dargestellt. Die Probenkammer 1 ist mit Immersionsflüssigkeit
gefüllt und weist eine obere Öffnung auf, die
in keiner Weise beispielsweise durch eine Motoraufhängung
blockiert ist. In der Probenkammer 1 befindet sich eine
in ein transparentes Einbettmedium, beispielsweise einen Gelzylinder 2 eingebettete
Probe 3. Die Probe 3 befindet sich in oder auf
einem Halter, der hier nicht dargestellt ist. Der Gelzylinder 2 kann
um seine Symmetrieachse rotieren. Durch die obere, frei zugängliche Öffnung
der Probenkammer 1 ist diese für einen Benutzer
leicht zugänglich, die Probe 3 kann auf diese Weise
leicht gewechselt werden, auch die Eigenschaften der Immersionsflüssigkeit
können auf diese Weise leicht – beispielsweise
durch Zugabe von pH-Wert – veränderenden Zusätzen – beeinflußt
werden. Der von rechts kommende Pfeil deutet die Richtung an, aus
der die Probe 3 mit einem Lichtblatt beleuchtet wird. Die
Rotationsachse des Gelzylinders 2 liegt dabei vorteilhaft
in der Ebene, die das Lichtblatt im Fokus bildet. Die Detektion, angedeutet
durch den anderen Pfeil aus der Blattebene heraus, findet senkrecht
zur Beleuchtungsrichtung statt. Eine Probenhalterung, zu der die
Probenkammer 1 gehört, weist darüber
hinaus auch Mittel zur Translation der Probe 3 relativ
zu einem Detektionsobjektiv und Mittel zur Rotation der Probe 3 um
die Rotationsachse des Gelzylinders 2 auf.
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In 2 ist
eine Probenhalterung gezeigt, bei der die Mittel zur Rotation der
Probe 3 einen Rotationsantrieb 4 aufweisen, der
eine Magnetkupplung, die die Rotationsbewegung auf den Halter durch
eine Wandung der Probenkammer 1, hier die Unterseite, hindurch überträgt.
Unterhalb der Probenkammer 1 ist ein Rotationsantrieb 4 mit
einem Magneten 5 dargestellt. Der Rotationsantrieb 4 umfaßt
dabei einen Motor, der die Rotationsbewegung erzeugt und auf den
Magneten 5 überträgt.
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Durch
die Drehung des Magneten 5 wird ein entsprechender, gegenpoliger
Magnet 6 in der Probenkammer 1, an dem der nichtgezeigte
Halter für den Gelzylinder 2 befestigt ist, ebenfalls
in Rotation versetzt, so daß sich der Halter mit der Probe 3 dreht. Der
Magnet 6 kann dabei auch direkt in den Gelzylinder 2 eingebracht
sein. Dabei ist die Probenkammer 1 auf einem Probentisch 7 angeordnet.
Die Probe 3 kann in den drei Raumrichtungen verfahren werden, indem
beispielsweise der Probentisch 7 mit der Probenkammer und
dem Rotationsantrieb 4 verfahren wird. Alternativ oder
zur Ergänzung kann der Probentisch 7 an der Stelle,
wo die Probenkammer 1 angeordnet bzw. montiert ist, eine
Aussparung aufweisen, so daß der Rotationsantrieb 4 mittels
eines – hier nicht gezeigten – Translationsantriebes
im Bereich der Unterseite der Probenkammer 1 verschoben
werden kann und so die Probe mittels der magnetischen Kupplung in
der Ebene des Probentisches verschoben wird. Rotationsantrieb 4 und
Translationsantrieb können dabei auch in eine gemeinsame
Einheit integriert sein, so daß nur der Magnet 5 bewegt
wird.
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Bei
der in 3 gezeigten Probenhalterung umfassen die Mittel
zur Rotation der Probe 3 einen oberhalb der Probenkammer 1 angeordneten
Riemen- und/oder Zahnrad-Rotationsantrieb 8, der die Rotationsbewegung
auf einen Halter 9 überträgt. Der Halter 9 wird
auf einem Ausleger 10 eines mechanischen Arms 11 gehalten.
Riemen- und/oder Zahnrad-Rotationsantrieb 8 sowie der Halter 9 sind
auf diesem mechanischen Arm 11 mit seinem Ausleger 10 befestigt.
Der mechanische Arm 11 ist außerdem an einen Translationsantrieb 12 gekoppelt.
Die Rotationsbewegung wird im vorliegenden Beispiel über Zahnräder 13 auf
den Halter 9 übertragen. Ein entsprechendes Zahnrad
befindet sich daher auch am Halter 9. Alternativ kann auch
ein Riemenantrieb verwendet werden. Auf diese Weise läßt
sich der gesamte Probenarm mit der Probe 3 unabhängig
von der Probenkammer 1 in dieser bewegen. Die optische
Weglänge beispielsweise kann auf diese Weise konstant gehalten
werden. Der mechanische Arm 11 kann dabei mit seinen Antrieben 8 und 12 so
ausgestaltet sein, daß auf er auf den Boden der Probenkammer 1 aufsetzen
kann, so daß das Auftreten von Schwingungen bei ausschließlicher
Rotation der Probe 3 möglichst unterdrückt
werden kann. Auch hier kann die Probenkammer 1 auf einem
zusätzlich verfahrbaren Probentisch angeordnet sein.
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In 4 schließlich
ist eine zylinderförmige Probenkammer 1 dargestellt,
die auf einem in allen drei Raumrichtungen verfahrbaren Probentisch 7 angeordnet
bzw. montiert ist. Die Rotation der Probe 3 wird in diesem
Fall erreicht, in dem die gesamte Probenkammer 1 mit der
Probe 3 rotiert wird, wofür ein entsprechender
Rotationsantrieb vorgesehen ist. Die Kammer 1 muß nicht
notwendigerweise zylinderförmig sein, auch andere Formen
mit beispielsweise polygonalem Querschnitt sind denkbar. Die Zylinderform
bietet jedoch bei der Beleuchtung und Detektion den Vorteil, daß sich
die geometrischen Strahlverhältnisse bei einer Drehung
nicht ändern. Indem nicht die Probe 3 selbst in
der Kammer 1, sondern die Kammer 1 bzw. der Tisch 7 bewegt
werden, kann die Stabilität der Probe 3 insgesamt
erhöht werden. Insbesondere Vibrationsbewegungen durch
das Verändern der Position der Probe 3 können
vermieden werden.
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- 1
- Probenkammer
- 2
- Gelzylinder
- 3
- Probe
- 4
- Rotationsantrieb
- 5,
6
- Magnet
- 7
- Probentisch
- 8
- Rotationsantriebe
- 9
- Halter
- 10
- Ausleger
- 11
- Arm
- 12
- Translationsantrieb
- 13
- Zahnrad
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- - DE 10257423
A1 [0005]
- - WO 2004/0530558 A1 [0005]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- - Stelzer et
al., Optics Letter 31,1477 (2006) [0005]
- - Stelzer et al., Science 305, 1007 (2004) [0005]