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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Beenden mikroskopischer Anwendungen mit einem Immersionsobjektiv, insbesondere zum Wechseln zwischen dem Immersionsobjektiv und einem Trockenobjektiv oder einem weiteren Immersionsobjektiv, wobei nach der mikroskopischen Anwendung das Immersionsobjektiv oder der eine Probe und/oder ein Probengefäß tragende Mikroskoptisch aus der Beobachtungsposition bewegt wird.
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In Mikroskopen bilden Objektive einen zentralen Bestandteil. Es gibt sie mit unterschiedlichsten Vergrößerungen und Auflösungsvermögen. Typischerweise besitzen höher vergrößernde Objektive auch ein höheres Auflösungsvermögen als gering vergrößernde Objektive. Für besonders hochauflösende Objektive wird der Raum zwischen Objektiv und Probe mit einer Flüssigkeit immergiert. Das kann beispielsweise Wasser oder Öl sein. Diese Objektive werden entsprechend auch als Immersionsobjektive bezeichnet. Im Gegensatz dazu heißen Objektive ohne Immersion Trockenobjektive.
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Im Folgenden wird ein exemplarischer Untersuchungsablauf mit einem inversen Mikroskop beschrieben. Das Objektiv befindet sich dabei unterhalb der Probe. Auch die weitere Beschreibung bezieht sich stets auf eine inverse Konfiguration.
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Exemplarischer Untersuchungsablauf:
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Es sollen lebende Zellen dahingehend untersucht werden, wie sie auf Zugabe bestimmter Substanzen reagieren. Mit einem gering vergrößernden Trockenobjektiv wird ein Übersichtsbild der Probe erzeugt. Danach werden Regionen im Übersichtsbild detektiert, die genauer untersucht werden sollen. Dies kann beispielsweise mit Hilfe einer geeigneten Bildanalyse geschehen. Für die weitere Detailbeobachtung wird ein höher vergrößerndes und höher auflösendes Immersionsobjektiv eingeschwenkt, das Immersionsmedium auf das Objektiv aufgebracht und nach Zugabe der Reagenzien werden die vorgemerkten Bereiche beispielsweise in einer Zeitserie betrachtet. Nach der Zeitserie mit dem Immersionsobjektiv soll erneut ein Übersichtsbild der Probe aufgenommen werden. Dies ist in der Regel notwendig, da sich bei Lebendzellproben die Übersichtsaufnahme mit der Zeit ändern kann. Zur Detektion der Region für die nächste Zeitserie, die mit Immersionsobjektiv aufgenommen werden soll, ist daher eine Aktualisierung des Übersichtsbildes notwendig. Dazu muss auf das Trockenobjektiv gewechselt werden.
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Wird nun erneut das Trockenobjektiv eingeschwenkt, tritt jedoch ein Problem auf:
Das Immersionsmedium bleibt sowohl auf der Frontoptik des Immersionsobjektivs als auch an der Unterseite des Probengefäßes zurück. Beim Ausschwenken des Immersionsobjektivs kann das Immersionsmedium am Objektiv entlang nach unten in das Mikroskop hineinlaufen und zu Schäden führen. Je nach Menge des Immersionsmediums lässt sich das durch einen Aqua-Stop abfangen. Alternativ kann der Tropfen auch abgesaugt werden. Der Tropfen am Probengefäß kann seinerseits beim Einschwenken des Trockenobjektivs erneut einen Immersionsfilm aufbauen. Da ein Trockenobjektiv dafür jedoch nicht ausgelegt ist, resultieren daraus gravierende Abbildungsfehler bis hin zu völlig unbrauchbaren Ergebnissen. Selbst wenn sich kein Immersionsfilm aufbaut, weil der Abstand zwischen Frontoptik des Trockenobjektivs und Probengefäß zu groß ist, um das Objektiv mit dem Resttropfen in Berührung zu bringen, verfälscht der Tropfen das Bild an der Stelle des Probengefäßes, an der er sich befindet. In manuellen Mikroskopen kann der Nutzer das Probengefäß entnehmen, das Immersionsmedium entfernen, wieder einsetzen und mit der Untersuchung fortfahren. Die Schwierigkeit besteht dann allerdings darin, die ursprüngliche Stelle wiederzufinden. Insbesondere in automatisierten Mikroskopen, bei denen vordefinierte Experimentabläufe durchgeführt werden, ist eine solche Interaktion weder gewollt noch möglich. Der Resttropfen des Immersionsmediums stellt also eine Fehlerquelle mit potenziell gravierenden Folgen dar.
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In
EP 2180363 wird ein Verfahren beschrieben, um nach der Beobachtung mit einem Immersionsobjektiv eine Position der Probe mit einem Trockenobjektiv zu betrachten. Dazu wird der Tisch an eine Position gefahren, die außerhalb des Bereichs liegt, der unmittelbar danach mit dem Trockenobjektiv betrachtet werden soll. Dort wird dann der Objektivwechsel vorgenommen. Anschließend fährt der Tisch wieder an seine ursprüngliche Position. Die erste Beobachtungsposition nach dem Wechsel ist somit nicht vom Immersionstropfen beeinträchtigt, dies gilt aber nicht für mögliche weitere Beobachtungspositionen, da diese für die Seitwärtsfahrt des Tisches keine Rolle spielen.
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Aufgabe dieser Erfindung ist somit, ein Verfahren zum Beenden mikroskopischer Anwendungen mit einem Immersionsobjektiv, insbesondere zum Wechseln zwischen dem Immersionsobjektiv und einem Trockenobjektiv oder einem weiteren Immersionsobjektiv zu beschreiben, mit dem es in einem Experimentablauf möglich ist, nach Beendigung der mikroskopischen Anwendung mit dem Immersionsobjektiv das Experiment fortzusetzen, ohne dass das am Probengefäß zurückbleibende Immersionsmedium das weitere Experiment beeinträchtigt.
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Diese Aufgabe wird durch die im Patentanspruch 1 genannten Verfahrensansprüche gelöst. Vorteilhafte Ausführungen sind in den Unteransprüchen 2 bis 10 angegeben.
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Erfindungsgemäß wird dass das an der Probe und/oder am Probengefäß verbleibende Immersionsmedium an einem Ort außerhalb der Beobachtungsposition der beendeten mikroskopischen Anwendung oder einer weiteren mikroskopischen Anwendung abgelegt.
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Beim Wechsel zwischen dem Immersionsobjektiv und einem Trockenobjektiv oder einem weiteren Immersionsobjektiv erfolgt dies über:
- – Erstellen eines Vorschaubildes der Probe und/oder des Probengefäßes und/oder der Probenauflage auf dem Mikroskoptisch,
- – Ermitteln von Koordinaten des Mikroskoptisches und/oder des Objektivs aus dem Vorschaubild,
- – Bewegung des Mikroskoptisches und/oder des Objektivs an eine Position der Probe und/oder des Probengefäßes, die keine Beobachtungsposition darstellt,
- – Ablegen des Immersionsmittelresttropfens außerhalb der Beobachtungsposition,
- – Wechseln der Objektive außerhalb der Beobachtungsposition und
- – Bewegung des Mikroskoptisches und/oder des Objektivs an die Beobachtungsposition des Trockenobjektivs.
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Das Vorschaubild kann entweder an einer besonderen Stelle im Mikroskop oder direkt im normalen Strahlengang erstellt werden, wenn beispielsweise ein schwach vergrößerndes Trockenobjektiv eingeschwenkt werden soll. Aus dem Vorschaubild werden dann die Tischkoordinaten oder die Koordinaten des Objektivs für jeden Punkt des Probengefäßes ermittelt.
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Unter Umständen liefert diese Vorschau auch Informationen darüber, welche Teile des Probengefäßes relevante Proben erhalten und welche nicht. Eine geeignete Bilderkennungsfunktion kann dies auch in automatisierter Form durchführen. Beispielsweise können bei Verwendung einer Mikrotiterplatte als Probengefäß die Bereiche zwischen den einzelnen Töpfchen automatisch erkannt und für den späteren Objektivwechsel genutzt werden.
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Beim Wechsel zwischen einem Immersionsobjektiv und einem Trockenobjektiv oder einem weiteren Immersionsobjektiv fährt der Mikroskoptisch oder das Objektiv auf Basis des Vorschaubildes an eine Position des Probengefäßes, die keine potentielle Beobachtungsposition darstellt. An dieser Stelle erfolgt der Objektivwechsel. Anschließend fährt der Mikroskoptisch oder das Objektiv an die Beobachtungspositionen, die mit dem neuen Objektiv betrachtet werden sollen.
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Es gibt viele verschiedene Arten von Probengefäßen. Beispiele sind gedeckelte Probenträger, Petrischalen und, wie bereits genannt, Mikrotiterplatten.
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Bei gedeckelten Probenträgern befindet sich die Probe zwischen Probenträger und einem Deckglas. Zum Objektivwechsel bieten sich hier die nicht gedeckelten Stellen des Probenträgers an. Alternativ können auch die Deckglasbereiche verwendet werden, unter denen sich keine Probe befindet.
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Bei Petrischalen sind die Gebiete in der Nähe des Randes geeignet, da diese für die Untersuchungen häufig nicht relevant sind. Deshalb kann dort vorteilhafterweise der Objektivwechsel durchgeführt werden.
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Mikrotiterplatten verfügen über eine Vielzahl einzelner Töpfchen, in denen sich Proben befinden können. Die Töpfchenanzahl variiert je nach Plattentyp. Es können beispielsweise 24, 96 oder 384 Töpfchen sein. Mögliche Wechselstellen sind leere Töpfchen oder, wie bereits ausgeführt, die Bereiche zwischen einzelnen Töpfchen. Diese Stellen müssen dann lediglich noch beim weiteren Experimentverlauf gespeichert werden, um zu vermeiden, dass beim Wechsel zwischen der Beobachtung zweier Töpfchen der Mikroskoptisch so verfährt, dass er den deponierten Immersionsmittelresttropfen über der Objektivfront entlang führt und versehentlich das Trockenobjektiv benetzt wird.
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Von Vorteil ist es, wenn sich die Wechselstelle außerhalb der Probengefäßfläche befindet. So kann der Mikroskoptisch oder das Objektiv so weit fahren, bis sich der Halter des Probengefäßes oberhalb des Objektivs befindet. Auch dort kann der Immersionsresttropfen deponiert werden. Allerdings liegt die Unterseite der Probengefäßhalter häufig nicht in derselben Ebene wie die Probengefäßunterseite. Damit das Probengefäß stabil aufliegt, sind die Halter in der Regel so konstruiert, dass ihre Unterseite etwas tiefer liegt als die des Probengefäßes. Beispielsweise wären dies 0,5 mm.
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Da Immersionsobjektive häufig nur sehr geringe Arbeitsabstände besitzen, also die Objektivfront sehr nahe dem Probengefäßboden liegt, besteht die Gefahr der Kollision von Halter und Tisch, wenn der Tisch weit genug gefahren wird, um den Immersionsmittelresttropfen am Halter abzulegen. Natürlich kann der Objektivrevolver entsprechend abgesenkt werden, aber dieser Vorgang erhöht die Komplexität des Objektivwechsels und darüber hinaus besteht die Gefahr eines Abreißens des Immersionsfilms beim Absenken, so dass der Immersionsmittelresttropfen nicht am Halter deponiert werden kann, sondern bereits an der Beobachtungsposition hängen bleibt. Deshalb sind Wechselstellen im Bereich des Probengefäßbodens denen am Probengefäßhalter vorzuziehen.
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Es sind auch andere Ausführungen von Probengefäßen denkbar. Die Probe muss auch nicht zwingend in einem Probengefäß liegen. Bei Materialuntersuchungen kann sie sich direkt auf dem Mikroskoptisch befinden. Welche Konfiguration auch verwendet wird, für den Nutzer ist in der Regel offensichtlich, welche Regionen untersucht werden sollen und an welchen Stellen mit Sicherheit keine Untersuchung stattfinden wird. Daraus lassen sich die Positionen beim Wechsel von einem Immersions- zu einem Trockenobjektiv ableiten.
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Die Definition der Wechselstellen kann automatisch aus einem Vorschaubild erfolgen. Soll ein Objektivwechsel stattfinden, fährt das System beispielsweise die nächstgelegene sinnvolle Wechselposition an, wechselt das Objektiv und setzt anschließend das Experiment fort. Dazu wird keine weitere Nutzerinteraktion benötigt. Alternativ kann der Nutzer auch definieren, wo ein Objektivwechsel stattfinden soll. Das kann beispielsweise bei ungewöhnlichen Probengefäßen geschehen.
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Auch bei Mikrotiterplatten mit sehr vielen Töpfchen, beispielsweise 384 oder 1536 Töpfchen, wo zwischen einzelnen Töpfchen unter Umständen nicht genügend Platz ist, um den Immersionsmittelresttropfen abzulegen, ist es sinnvoll, die genaue Wechselposition interaktiv festzulegen. Wenn beispielsweise nicht alle Töpfchen Proben enthalten, diese Unterscheidung aber nicht aus einem Vorschaubild abgeleitet werden kann, der Nutzer jedoch weiß, welche Töpfchen relevant sind und welche nicht, kann er die Positionen der probenfreien Töpfchen für den Objektivwechsel vorsehen. Nutzt der Anwender identisch aufgebaute Gefäße, ist auch eine einmalige Definition und Abspeicherung der Wechselzonen möglich, das heißt beim Einlegen der nächsten Probe kann ein automatisiertes Mikroskop diese Positionen wieder abrufen und verwenden, ohne dass interaktiv oder per Vorschaubild eine erneute Bestimmung der Wechselzonen notwendig wäre.
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Wie bereits ausgeführt, wird üblicherweise nach dem Objektivwechsel der Mikroskoptisch oder das Objektiv wieder an seine Ausgangsposition zurückgefahren, so dass derselbe Teil der Probe, der zuvor mit dem Immersionsobjektiv betrachtet wurde, danach mit dem Trockenobjektiv oder auch mit einem anderen Immersionsobjektiv beobachtet werden kann. In einem komplexen Experiment muss dies jedoch nicht so sein.
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Vor dem Objektivwechsel kann auch ein größerer Bereich der Probe oder es können mehrere nicht zusammenhängende Einzelstellen mit dem Immersionsobjektiv betrachtet worden sein. Nach dem Objektivwechsel sollen alle diese Punkte erneut betrachtet werden. Dann ist es häufig sinnvoll, die Punkte erneut in derselben Reihenfolge anzufahren. Der Beobachtungspunkt unmittelbar vor dem Objektivwechsel und derjenige direkt danach können also sehr verschieden sein.
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Das erfindungsgemäße Verfahren lässt sich auch mit einem ortsfesten Mikoskoptisch und/oder einem motorisiert verfahrbaren Objektiv umsetzen. Das Objektiv muss sich nicht zwangsläufig in einem Revolver befinden, sondern kann auch anderweitig befestigt sein. Es ist auch anwendbar, wenn von einem Immersionsobjektiv zu einem weiteren Immersionsobjektiv mit anderem Immersionsmedium gewechselt werden soll, also beispielsweise von einem Wasserimmersions- hin zu einem Ölimmersionsobjektiv. Dann bleiben alle Schritte gleich, nur dass am Ende noch das neue Immersionsmedium, also in diesem Fall Öl, auf die Frontlinse gebracht werden muss. Bei einem Wechsel zwischen zwei Immersionsobjektiven mit gleichem Immersionsmedium ist das Verfahren jedoch nicht nötig, da der Resttropfen am Probengefäßboden gleich wieder als Immersionsmedium für das neue Objektiv genutzt werden kann.
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Die Erfindung ist auch unabhängig davon, ob tatsächlich nach dem Immersionsobjektiv ein weiteres Objektiv benutzt werden soll. Ein komplexer Experimentablauf liegt häufig nicht direkt auf der Hand, sondern ergibt sich erst, nachdem die Probe betrachtet wurde und gegebenenfalls erste Voruntersuchungen stattgefunden haben. Auch dabei kann ein Immersionsobjektiv zum Einsatz kommen. Wenn beim Wechsel vom Immersionsobjektiv weg das in dieser Erfindung beschriebene Verfahren zum Einsatz kommt, ermöglicht dies dem Nutzer auch anschließend noch ein weiteres Experiment zu konfigurieren, ohne dass es durch den Immersionstropfen am Probengefäßboden in irgendeiner Weise eingeschränkt wäre, da dieser Tropfen an einer Stelle abgelegt wurde, die in jedem Fall nicht relevant für die Beobachtung ist. In einem automatisierten Mikroskop ist es sinnvoll, das beschriebene Verfahren mit dem Ende der Immersionsobjektivnutzung zu verknüpfen und weniger mit dem Wechsel von einem Immersions- zu einem anderen Objektiv. Häufig wird nach der Nutzung des Immersionsobjektivs das Experiment beendet sein. Es muss dann jedoch eine Lösung gefunden werden, um das verbleibende Immersionsmedium zu entfernen. Das kann mit einer der bekannten Lösungen des Standes der Technik an der aktuellen Tischposition geschehen, müsste dann aber extra veranlasst werden. Eleganter ist es, das erfindungsgemäße Verfahren zu nutzen, das direkt an das Ende der Immersionsobjektivnutzung gekoppelt ist. Auf diese Weise braucht sich der Nutzer nicht mehr um den Abbau der Immersion zu kümmern und es ist garantiert, dass das Gerät ausgeschaltet werden kann, ohne dass die Immersion verbleibt. Wechselposition heißt in diesem Fall also nicht, dass dort auch tatsächlich ein Objektivwechsel stattfindet, sondern dass er dort potenziell möglich wäre.
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Das erfindungsgemäße Verfahren wird nachfolgend anhand von drei Ausführungsbeispielen zur Probenaufnahme näher erläutert werden. Dazu zeigen:
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1: eine schematische Darstellung eines Probengefäßes mit einer Deckpatte,
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2: eine schematische Darstellung einer Petrischale als Probengefäß,
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3: eine schematische Darstellung einer Mikrotiterplatte als Probengefäß,
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4: eine Darstellung des Verfahrensablaufs mit einer Mikroskoptischverstellung,
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5: eine Darstellung der mikroskopischen Anwendung mit einem Immersionsobjektiv und
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6: ein Ablaufdiagramm zur Bestimmung möglicher Positionen zum Objektivwechsel.
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1 zeigt ein Probengefäß 1, auf dem sich eine Probe 2 befindet, die von einem Deckglas 3 bedeckt ist. In diesem Beispiel erfolgt das Ablegen des Immersionsresttropfens, beziehungsweise der Objektivwechsel an den Stellen 4a oder 4b, die sich außerhalb der Probe 2, also außerhalb der Beobachtungsposition befinden. In einem weiteren Ausführungsbeispiel nach 2 befinden auf einer Petrischale 5 mehrere Proben 6. Hier sind zum Ablegen des Immersionsmittelresttropfens, beziehungsweise zum Objektivwechsel die Gebiete 7 in der Nähe des Randes geeignet, da diese für Untersuchungen häufig nicht relevant sind. 3 zeigt eine Mikrotiterplatte B. Diese verfügt über eine Vielzahl einzelner Töpfchen 10, in denen sich Proben 9 befinden. Die Töpfchenanzahl variiert je nach Plattentyp. Mögliche Wechselstellen für die Objektive sind hier entweder leere Töpfchen 10 oder die Bereiche 11 zwischen einzelnen Töpfchen.
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Das erfindungsgemäße Verfahren mit der Verstellbewegung des Mikroskoptisches zum Objektivwechsel ist in 4 dargestellt, wobei zunächst die Wechselstellen für die Objektive ermittelt werden.
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5 zeigt eine mikroskopische Anwendung (Experiment) mit einem Immersionsobjektiv.
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Ein Ablaufdiagramm zur Bestimmung möglicher Positionen zum Objektivwechsel wird in 6 dargestellt. Der Zeitpunkt zum Finden der Wechselstellen ist danach variabel. Das kann direkt nach der Aufnahme des Übersichtsbildes geschehen, oder erst dann, wenn die Entscheidung zum Beginn der Nutzung eines Immersionsobjektivs oder die Entscheidung zum Beenden der Nutzung des Immersionsobjektivs gefallen ist.
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Bezugszeichenliste
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- 1, 5, 8
- Probengefäß (Glas)
- 2, 6, 9
- Probe
- 3
- Deckglas
- 4a, 4b, 7, 10, 11
- Objektivwechselstelle
- 5
- Petrischale
- 8
- Mikrotiterplatte
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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