DE10346130B4

DE10346130B4 - Vorrichtung und Verfahren zum Isolieren eines Teils einer Schicht biologischen Materials oder eines Präparats

Info

Publication number: DE10346130B4
Application number: DE2003146130
Authority: DE
Inventors: Norbert Leclerc; Kay Haupt
Original assignee: LECLERC NORBERT DR
Current assignee: LECLERC NORBERT DR
Priority date: 2003-10-01
Filing date: 2003-10-01
Publication date: 2006-10-05
Anticipated expiration: 2023-10-02
Also published as: DE10346130A1

Abstract

Vorrichtung zum Isolieren eines Teils einer Schicht biologischen Materials oder eines Präparats mit:
a) einem Greifer (28), der an den zu isolierenden Teil (22) der Schicht biologischen Materials herangeführt werden kann,
b) wobei der Greifer (28) derart ausgebildet ist, dass er einen durchgängigen Hohlkanal (34) mit einer präparatseitigen Öffnung (32) hat, die kleiner ist als der zu isolierende Teil (22) des Präparats,
c) Mitteln zum Fixieren des zu isolierenden Teils (22) durch eine Druckdifferenz vor der präparatseitigen Öffnung (32) des Greifers (28),
d) Mittel zum Ausschneiden des zu isolierenden Teils (22) aus der Schicht (10) biologischen Materials, wodurch ein Dissektat gebildet werden kann, und mit
e) Mittel zum Entfernen des Greifers (28) vom Rest der Schicht (10) biologischen Materials,
dadurch gekennzeichnet,
dass der Greifer (28) eine Mehrzahl von präparatseitigen Öffnungen (32) aufweist, die kleiner sind als zu isolierende Teile (22) des Präparats...

Description

Zur Aufklärung der molekularen Ursachen von Krankheiten werden sogenannte Genexpressionsstudien durchgeführt. Dabei wird versucht, die tatsächlich in einer Zelle exprimierten Gene zu bestimmen, da die zugehörigen Proteine für die krankhafte Entwicklung der Zellen verantwortlich sind. Eine Möglichkeit, die tatsächlich vorhandenen Proteine zu bestimmen, besteht darin, die in der Zelle synthetisierten m-RNA zu bestimmen, da aus ihnen die Proteine gebildet werden.
Die m-RNA ist jedoch ein sehr kurzlebiges Produkt der Zellen, weshalb die Konzentration an m-RNA in den Zellen sehr gering ist. Will man die m-RNA z. B. einer Tumorzelle bestimmen, so muss daher eine möglichst große Zahl von Tumorzellen gesammelt werden. Die Tumorzellen müssen dazu aus krankem Gewebe isoliert werden. Dazu können die Tumorzellen beispielsweise aus Gewebeschnitten ausgeschnitten (dissektiert) und isoliert gesammelt werden. Anschließend werden die isolierten Tumorzellen aufgeschlossen. Durch geeignete Aufreinigungsschritte wird die m-RNA aus den Zellen isoliert. Danach wird sie mittels der Reversen Transkriptase in c-DNA übersetzt. Diese wird mit i. d. R. linearer PCR amplifiziert. Die so gewonnene c-DNA wird z. B. mit Hilfe von geeigneten DNA-Chips qualitativ bzw. quantitativ analysiert.
In diesem Zusammenhang befasst sich die vorliegende Erfindung mit dem Isolieren bzw. Ausschneiden von zu untersuchenden Zellen, mit der sogenannten Dissektion. Werden dabei einzelne Zellen – mit Durchmessern im Bereich einiger Mikrometer – aus Gewebe ausgeschnitten, spricht man auch von Mikrodissektion.
Bei der Mikrodissektion kommt es u. a. darauf an, äußerst sauber zu arbeiten, d.h. insbesondere RNAsen-frei zu arbeiten, da diese die m-RNA abbauen. Schon eine Berührung mit der bloßen Hand ist zu vermeiden.

Bei bekannten Verfahren zum Schneiden von Gewebe wird der Gewebeschnitt (Präparat) beispielsweise auf einem Objektträger an Luft präpariert. Mit Hilfe eines Lasers wird eine geschlossene Kurve um das zu untersuchende Gewebe (Dissektat) beschrieben. Auf der Kurve wird das Gewebe ablatiert, wodurch das zu isolierende Gewebe vom restlichen Gewebe getrennt ist. Das ausgeschnittene Dissektat kann beispielsweise in eine Pipette eingesaugt werden, sofern es in Flüssigkeit vorliegt ( DE 196 29 143 A1 ). Nachteilig an dem bekannten Verfahren ist, dass es sehr zeitaufwendig ist. Um die für eine Analyse benötigte Menge an m-RNA zu sammeln ist eine Person mehrere Tage mit dem Schneiden von Gewebe beschäftigt.

Ein verbessertes Verfahren ist in der DE 196 16 216 A1 beschrieben. Ein auf einem Objektträger präparierter Gewebeschnitt wird auf ein inverses Mikroskop gelegt. Über dem Gewebeschnitt wird ein Deckel eines verschließbaren Röhrchens (Tube) angeordnet. Die Unter- bzw. Innenseite des Deckels ist mit Öl beschichtet. Mittels Laserablation werden Teile des Gewebes ausgeschnitten. Die ausgeschnittenen Teile des Gewebes werden mittels eines Lichtpulses von unten nach oben katapultiert. Dabei treffen sie auf den mit Öl beschichteten Deckel und haften am Öl. Nachteilig an diesem Verfahren ist die schlecht kontrollierbare Bewegung des gelösten Gewebestücks. Dieses erreicht nicht immer den Deckel.

Ein weiteres Verfahren ist in der DE 100 03 588 C2 beschrieben. Dabei wird eine Folie mit einem Gewebeschnitt mit dem Gewebeschnitt nach unten auf einen Mikroskop-Objektträger gelegt. Anschließend wird der Mikroskop-Objektträger in die Objektebene eines inversen Mikroskops gelegt. Ein Klebeband wird mit einem Haftmittel nach unten über der Folie und damit über dem Gewebeschnitt angeordnet. Anschließend wird zu isolierendes Gewebe durch einen fokussierten Laserstrahl ausgeschnitten. Dabei wird auch die Folie durchtrennt. Danach wird das Klebeband aus dem Mikroskop entfernt. Die Dissektate haften am Klebeband. Der Rest der Folie und des Gewebeschnitts bleibt am Mikroskop-Objektträger haften. Ein Ablösen des Dissektats vom Klebeband ist anschließend nicht mehr möglich, so dass dem nachfolgenden biochemischen Prozess das Klebeband mit zugeführt werden muss. Damit verbunden ist ein hoher Bedarf an teuren Verbrauchsmaterialien.

Weiterhin ist in der DE 198 04 800 A1 ein pneumatisches Bergewerkzeug beschrieben, das ein einzelnes Dissektat aus dem Präparat bergen soll. Die Positionierung des Bergewerkzeugs stellt allerdings sehr hohe Anforderungen an die Präzision der verwendeten Appartur. Die Fixierung des Präparats ist nicht erwähnt.

In der WO 03/008934 A1 wird im Wesentlichen der Transport der schon ausgeschnittenen Dissektate über elektrostatische und elektromagnetische Kräfte beschrieben. Eine notwendige Fixierung des Präparats wird ebenfalls nicht beschrieben.

Ein weiterer Nachteil der bisher bekannten Verfahren ist die unzureichende Automatisierbarkeit, da die Dissektate nicht kontrolliert aufgenommen, transportiert und wieder abgegeben werden können. Dies spielt insbesondere dann eine Rolle, wenn mehrere verschiedene Dissektat-Typen in verschiedene Auffanggefäße transportiert werden müssen.

Aufgabe der Erfindung ist es, eine Vorrichtung und ein Mikrodissektionsverfahren anzugeben, die sich zur Automatisierung eignen.

Ein geeignetes Mikrodissektionsverfahren muss das Präparat beim Schneiden fixieren, damit sich letzteres nicht durch die Einwirkung z. B. des Lasers bewegt. Nach dem Schneiden muss das Dissektat sicher aus dem restlichen Gewebe isoliert werden. Ein zuverlässiger Transport des Dissektats mittels eines Greifers in verschiedene Auffanggefäße und das sichere Loslösen vom Greifer zum Absetzten des Dissektats in den verschiedenen Auffanggefäßen muss gewährleistet sein. Ein hoher Automatisierungsgrad sollte mit vergleichbar geringem Aufwand erreichbar sein.

Diese Aufgabe wird durch eine Vorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 1 und ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 5 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindungen sind in den Unteransprüchen gekennzeichnet.

Bei der Mikrodissektion wird typischerweise mit Hilfe eines Lasers eine geschlossene Kurve um das kranke Gewebe beschrieben. Auf der Kurve wird das Gewebe ablatiert. Bevor die Kurve ganz geschlossen ist, kommt es häufig dazu, dass sich das Dissektat aufrollt oder aufstellt und in manchen Fällen den letzten noch zu schneidenden Kurvenabschnitt verschattet, weshalb es nicht mehr möglich ist, den Schnitt zu vollenden und das Dissektat tatsächlich zu isolieren.

Wichtig ist also eine gute Fixierung des gesamten Gewebes während des Schneidens zu gewährleisten.

Dabei wird zunächst das Präparat auf einen dielektrischen Objektträger aufgebracht.

Häufig wird dazu zunächst die Schicht biologischen Materials auf einer Seite einer Stabilisierungsschicht aufgebracht. Die Stabilisierungsschicht kann entfallen, sofern die mechanischen Eigenschaften der Schicht biologischen Materials dies zulassen. Die Schicht biologischen Materials eventuell zusammen mit der Stabilisierungsschicht wird im Folgenden als Präparat bezeichnet.

Die Schicht biologischen Materials kann z. B. ein Gewebeschnitt, ein Zellenausstrich, ausgesäte Zellen oder eine Zellkultur sein.

Als Objektträger kommen insbesondere Objektträger aus Glas für die Mikroskopie in Betracht. Es können aber auch sonstige feste Unterlagen verwendet werden, sofern sie dielektrisch sind. Sie müssen auch nicht zwingend transparent sein.

Danach wird ein elektrisches Feld ausreichender Stärke (beispielsweise zwischen ca. 100 kV/m und 10 MV/m, vorzugsweise 1 MV/m) zwischen der vom Präparat abgewandten Seite des Objektträgers und der vom Objektträger abgewandten Seite des Präparats angelegt. Dabei kommt es zu einer dielektrischen Polarisation sowohl des Objektträgers als auch des Präparats.

Werden die auf der dem Objektträger abgewandten Seite des Präparates sich sammelnden Ladungsträger durch eine geeignete erste Elektrode (z. B. ein gegenüber dem Präparat nicht isolierter Draht mit Nullpotential/Erdung) entfernt, verbleibt im Präparat eine Restladung. Diese bewirkt eine verstärkte flächige Anziehung zwischen dem dielektrisch polarisierten Objektträger und dem elektrisch geladenen Präparat, die deutlich über die natürlich vorhandene Adhäsion hinausgeht. Damit ist das Präparat für die auszuführende Dissektion sicher fixiert.

Nach dem elektrostatischen Fixieren wird der zu isolierende Teil (Dissektat) des Präparats aus dem Präparat z. B. mittels Laser-Mikrodissektion, ausgeschnitten.

Bei der Laser-Mikrodissektion beschreibt der Fokus eines Laserstrahls eine geschlossene oder annähernd geschlossene Kurve um das Dissektat. Auf dieser Kurve wird das Präparat ablatiert, d. h. im Wesentlichen verdampft. Dadurch ist das Dissektat vom Rest des Präparats getrennt.

Es genügt, wenn das Präparat nicht auf einer vollständig geschlossenen Kurve sondern nur auf einer annähernd geschlossenen Kurve abgetragen wird, sofern der verbleibende Abschnitt so klein ist, dass er beim anschließenden Entfernen des Dissektats aus dem Präparat durchgerissen wird und das Entfernen nicht hindert.

Das Dissektat verbleibt zunächst zusammen mit dem Präparat an seiner ursprünglichen Stelle auf dem Objektträger, zumal es elektrostatisch am Objektträger haftet. Es ist aber vom restlichen Präparat – zumindest im Wesentlichen – mechanisch getrennt.

Um das Dissektat vom Objektträger abzuheben und damit vom Rest des Präparats zu trennen, wird ein Greifer an den zu isolierenden Teil der Schicht biologischen Materials oder des Präparats herangeführt. Der Greifer wird dazu entweder in Kontakt mit dem Präparat oder in dessen unmittelbare Nähe gebracht.

Der Greifer hat mehrere durchgängige Hohlkanäle mit präparatseitigen Öffnungen, die kleiner sind als der zu isolierende Teil des Präparats.

Die Öffnungen können rund oder schlitzförmig ausgebildet sein. Entscheidend ist, dass zumindest eine Dimension der Öffnungen kleiner als das Dissektat ist. Somit wird das Eintreten der Dissektate in die Öffnungen verhindert.

Unmittelbar um die präparatseitigen Öffnungen des Greifers herum sind vorzugsweise weitgehend ebene Kontaktflächen ausgebildet, mit der der Greifer das Präparat berühren kann. Die Kontaktflächen des Greifers können auch aus einem porösen Material mit unregelmäßigen Öffnungen bestehen.

Der zu isolierende Teil des Präparats wird durch eine Druckdifferenz an den Greifer angesaugt. In der Regel erfolgt dies durch eine Druckerniedrigung in den Hohlkänalen bzw. in den Öffnungen des Greifers und einer damit einhergehenden Druckerniedrigung auf einer Seite des Präparats. Der zu isolierende Teil wird dann durch den relativen Überdruck des Umgebungsmediums an die Kontaktfläche des Greifers gepresst. Bei Aufrechterhaltung der Druckdifferenz bleibt die Anpresskraft dauerhaft erhalten. Damit ist das Präparat am Greifer fixiert. Das Fixieren lässt sich z. B. ohne Schwierigkeiten an Luft oder in Flüssigkeit durchführen.

Das Fixieren erfolget, bevor der zu isolierende Teil der Schicht biologischen Materials aus dem Präparat ausgeschnitten wurde. Dadurch wird der zu isolierende Teil während des Schnitts vom Greifer fixiert und ein Aufwölben oder Verschieben verhindert.

Anschließend wird das Dissektat aus dem Präparat ausgeschnitten. Dies erfolgt vorzugsweise mit Hilfe von Laser-Mikrodissektion.

Vorteilhafterweise ist der Greifer in diesem Fall transparent, um störende Reflexionen und Streuung zu vermeiden. Auch ansonsten bietet es sich an, den Greifer aus einem transparenten Material zu fertigen, damit die Beleuchtung des Präparates nicht beeinträchtigt wird.

Es kann auch zunächst das Dissektat ausgeschnitten werden und erst danach der Greifer das Dissektat aufnehmen. Dabei wird das Präparat vorher elektrostatisch am Objektträger fixiert.

Da die präparatseitigen Öffnungen des Greifers kleiner sind als die Dissektate, bleiben letztere vor der Öffnung des Greifers haften.

Nach erfolgter Dissektion bleiben die Dissektate am Greifer haften, auch wenn der Greifer vom Präparat entfernt wird. Dafür muss mindestens eine Öffnung des Greifers von einem Dissektat zumindest teilweise bedeckt sein. Das kann durch die Positionierung des Greifers vor der Dissektion erreicht werden. Dadurch wird das Dissektat von der übrigen Schicht isoliert.

Mit Hilfe des Greifers wird somit das Dissektat angesaugt, aber nicht eingesaugt. Dies erlaubt es, die Dissektate zu transportieren und in einem Auffanggefäß wieder abzulegen. Dazu genügt es, die Druckdifferenz derart zu verändern, dass die Dissektate vom Greifer nicht mehr gehalten werden und von diesem abfallen. Dazu kann die Druckdifferenz aufgehoben oder umgekehrt werden.

Mit Auffanggefäß wird ein Ort bezeichnet, an dem das Dissektat für eine weitere Prozessierung aufbewahrt oder einer weiteren Prozessierung zugeführt wird.

Das beschriebene Verfahren ist relativ einfach durchzuführen. Es fixiert das Präparat während des Schneidens und es erlaubt einen zuverlässigen Transport des Dissektats in ein Auffanggefäß, wo es abgelegt werden kann. Damit eignet sich das beschriebene Verfahren in besonderer Weise zur Automatisierung.

Zum Fixieren einer Mehrzahl von Dissektaten auf einem Greifer an unterschiedlichen Positionen weist der Greifer eine Mehrzahl von präparatseitigen Öffnungen auf, die kleiner sind als die Dissektate und das Fixieren von einer entsprechenden Mehrzahl von Dissektaten vor den jeweiligen präparatseitigen Öffnungen ermöglichen. Dazu wird der Greifer nach Aufnahme des ersten Dissektats erneut auf dem Präparat aufgesetzt. Damit lassen sich mehrere Dissektate einfach auf einem Greifer sammeln.

Es können auch mehrere Greifer in einer gemeinsamen Halterung angebracht sein und nacheinander unterschiedliche Phasen des Verfahrens durchlaufen.

Die unterschiedlichen Öffnungen eines solchen Greifers lassen sich entweder einzeln oder gemeinsam mit einer Druckdifferenz beaufschlagen. Um sie einzeln zu beaufschlagen ist ein Kanalsystem innerhalb des Greifers denkbar, bei dem jede Öffnung an einen eigenen Hohlkanal angeschlossen ist.

Zwischen dem Greifer und dem Präparat kann sich eine ebenfalls mit Öffnungen versehene Schicht befinden. Diese wird im Folgenden als Zwischenschicht bezeichnet. Eine der Öffnungen dieser Zwischenschicht wird vor dem Absenken des Greifers auf das Präparat mit einer Öffnung des Greifers in Deckung gebracht. Die Durchmesser der Öffnungen müssen dabei nicht übereinstimmen. Wichtig ist nur, dass eine der Öffnungen – vorzugsweise die Öffnung in der Zwischenschicht – kleiner ist als das aufzunehmende Dissektat.

Nach erfolgter Dissektion und dem Abheben des Greifers und der Zwischenschicht vom Präparat kann die Zwischenschicht so bewegt werden, dass:

a) erneut eine freie Öffnung mit einer Öffnung des Greifers zur Deckung kommt;
b) die mit einem Dissektat belegte Öffnung zu einer dem Greifer äquivalenten Vorrichtung gelangt, an der die Ablösung des Dissektats durch Veränderung der Druckdifferenz erfolgt.

Da der Greifer nur mit der kontaminationsfreien Zwischenschicht in Berührung kommt, besteht keine Kontaminations- oder Verschleppungsgefahr, so dass das Verfahren unbegrenzt wiederholt werden kann.

Durch die Wahl eines geeigneten Materials der Zwischenschicht kann erreicht werden, dass die Dissektate nach der Isolation an der Zwischenschicht adhäsiv haften und sich auch dann nicht von der Zwischenschicht lösen, wenn der Greifer und/oder die Druckdifferenz nicht mehr unmittelbar anliegen. Dazu kann die Zwischenschicht beispielsweise aus Polycarbonat bestehen.

Der Vorteil des beschriebenen Verfahrens liegt in der sicheren Probenaufnahme und in der Möglichkeit der einfachen Automatisierung. Da die Proben einfach in verschiedenen Auffanggefäßen abgelegt werden können, ist das Verfahren sehr flexibel. Des weiteren können die isolierten Dissektate einfach auf dem Greifer kontrolliert werden, da der Greifer mit dem vorhandenen Mikroskop untersucht werden kann.

Im Folgenden wird die Vorrichtung und das Verfahren anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert, die in den Figuren schematisch dargestellt sind. Gleiche Bezugsziffern in den einzelnen Figuren bezeichnen dabei gleiche oder funktionsgleiche bzw. hinsichtlich ihrer Funktionen einander entsprechende Elemente. Im Einzelnen zeigt:
1 eine schematische Darstellung des Polarisationsschrittes des elektrostatischen Fixierens eines Präparats auf einem Objektträger;
2 eine schematische Darstellung des Aufladungsschrittes des elektrostatischen Fixierens eines Präparats auf einem Objektträger;
3A eine schematische Darstellung der Annäherung eines pneumatischen Greifers an ein Präparat;
3B das Ansaugen des Präparats bzw. Dissektats an den Greifer;
3C das Abheben des Dissektats mit Hilfe des Greifers;
3D das Absetzen des Dissektats in einem Auffanggefäß; und
4 eine schematische Darstellung des Einsatzes einer Zwischenschicht zwischen Greifer und Präparat.
In Paraffin eingebettetes oder gefrorenes Gewebe wird durch einen Hobel in dünne Gewebeschnitte 10 zerlegt. Diese rollen sich in der Regel auf (siehe 1).
Ein dielektrischer Mikroskop-Objektträger 12 wird mit Alkohol besprüht. Ein wenige Quadratzentimeter großes Stück einer Folie 14, welches auf einer Papierschicht aufgetragen ist, wird auf die mit Alkohol besprühte Fläche des Mikroskop-Objektträgers 12 aufgebracht. Die Folie 14 besteht z. B. aus 2 μm dickem, UV absorbierendem PET oder PEN. Sie dient als Stabilisierungsschicht. Das Papier wird anschließend entfernt.
Anschließend wird der aufgerollte Gewebeschnitt 10 auf die Folie 14 gebracht. Der Mikroskop-Objektträger 12 mit Folie 14 und Gewebeschnitt 10 wird auf 60° erhitzt, wodurch das Paraffin schmilzt und sich der Gewebeschnitt 10 ausrollt.
Danach kann der Aufbau aus Folie 14 und Gewebeschnitt 10 – der gemeinsam als Präparat bezeichnet wird – umgedreht werden, wodurch der Gewebeschnitt 10 auf dem Objektträger 12 zu liegen kommt. Der Gewebeschnitt 10 liegt dann zwischen Objektträger und Stabilisierungsschicht bzw. Folie 14.
Das Präparat wird zusammen mit dem dielektrischen Objektträger 12 in die Objektebene eines inversen Mikroskops so eingelegt, dass der Objektträger unten liegt und die Schicht biologischen Materials von oben zugänglich ist.
Das Mikroskop besitzt einen motorischen x-y-Tisch, der das Präparat verfahren kann. Ebenfalls am Tisch angebracht sind Auffanggefäße, in die die zu isolierenden Teile nach der Dissektion verbracht werden sollen.
Danach wird ein elektrisches Feld 18 (siehe 1) ausreichender Stärke (vorzugsweise 1 MV/m) zwischen der vom Präparat abgewandten Seite des Objektträgers 12 und der vom Objektträger abgewandten Seite des Präparates, also der Folie 14, angelegt. Dazu werden zwei Elektroden, eine präparatseitige Elektrode 15 und eine objektträgerseitige Elektrode 16 eingesetzt. Letztere weißt eine Aussparung 17 auf, um das Objektiv des inversen Mikroskops nicht zu behindern.
Durch Anlegen des elektrischen Feldes 18 kommt es zu einer dielektrischen Polarisation sowohl des Objektträgers 12 als auch des Präparates.
Bei dem in 1 gezeigten Beispiel sammeln sich an der vom Präparat abgewandten Seite des Objektträgers 12 negative Ladungen. An der dem Präparat zugewandten Seite des Objektträgers 12 sammeln sich positive Ladungen. Entsprechend sammeln sich an der auf dem Objektträger 12 liegenden Seite des Gewebeschnitts 10 negative Ladungen und an der vom Objektträger abgewandten Seite der Folie 14 wiederum positive Ladungen.
Werden die auf der dem Objektträger 12 abgewandten Seite des Präparates sich sammelnden Ladungsträger durch eine geeignete Elektrode 20 (z. B. durch einen gegenüber dem Präparat nicht isolierter Draht mit Nullpotential/Erdung) entfernt, verbleibt im Präparat eine Restladung (2). Bei dem in 1 gezeigten Beispiel werden die positiven Ladungen an der vom Objektträger 12 abgewandten Seite der Folie 14 abgezogen. Das Präparat bleibt negativ geladen zurück.
Dies bewirkt eine verstärkte flächige Anziehung zwischen dem dielektrisch polarisierten Objektträger mit seinen positiven Ladungen auf der Seite des Präparats und dem elektrisch negativ geladenen Präparat. Diese elektrostatische Anziehungskraft geht deutlich über die natürlich vorhandene Adhäsion hinaus. Damit ist das Präparat sicher fixiert.
Anschließend wird das Präparat mittels Laser-Mikrodissektion geschnitten. Erfolgt die Mikrodissektion auf einer geschlossenen Kontur, verbleibt das Dissektat 22 zusammen mit dem Präparat an ursprünglicher Stelle auf dem Objektträger 12. Es ist jetzt vom restlichen Präparat mechanisch getrennt.
Ein transparenter Greifer 28 ist über dem Präparat angebracht (3A). Er kann auf das Präparat abgesenkt werden und im abgesenkten Zustand mit dem Präparat auf dem Mikroskoptisch mitbewegt werden, wenn sich der Mikroskoptisch für die Ablation bzw. Mikrodissektion relativ zum Laserfokus bewegt.
Der Greifer 28 besitzt an seinem unteren Ende eine weitgehend ebene Kontaktfläche 30, die mehrere kleine Öffnungen 32 aufweist. Zweckmäßigerweise ist die Kontaktfläche 30 so groß, dass mehrere Dissektate darauf Platz finden können. Vorzugsweise hat die Kontaktfläche 30 einen Durchmesser von 500 μm. Die Öffnungen 32 haben einen Durchmesser von ca. 8 μm und sind in Form einer 10 × 10 Matrix angeordnet.
Diese Öffnungen 32 sind über Hohlkanäle 34 mit einer (nicht gezeigten) pneumatischen Vorrichtung verbunden, die Unter- und Überdruck erzeugen kann.
Der zu isolierende Teil 22 des Präparats wird ausgewählt und der transparente Greifer 28 von oben mit dem Präparat so in Kontakt gebracht, dass eine Öffnung 32 der Kontaktfläche 30 innerhalb der zu schneidenden Kontur liegt. Die Bewegungsrichtung des Greifers 28 ist in 3A durch eine fett gedruckten Pfeil angedeutet.
Dann wird ein Unterdruck im Hohlkanal 34 des Greifers 28 erzeugt und dadurch das Präparat an den Greifer angesaugt und damit fixiert. Die unterschiedlichen Drücke sind in 3B durch dünne Pfeile angedeutet.
Der Unterdruck kann sowohl über alle Öffnungen bzw. Kanäle gleich verteilt sein, als auch für jeden Kanal individuell ausgebildet werden.
Nun wird die Kontur geschnitten, um den zu isolierenden Teil 22 zu dissektieren. Danach wird der Greifer 28 mit dem anhaftenden Dissektat 22 nach oben herausgehoben. Die Bewegungsrichtung ist in 3C durch einen fett gedruckten Pfeil angedeutet.
Um weitere Dissektate 22 auf dem Greifer 28 zu sammeln, wird dieser Vorgang mit den jeweils noch freien Öffnungen 32 des Greifers wiederholt.
3D deutet schematisch an, wie das Dissektat 22 nach Abheben vom Objektträger 12 mit Hilfe des Greifers 28 zu einem Auffanggefäß 36 transportiert wird. Über dem Auffanggefäß 36 wird der Hohlkanal 34 mit einem (durch einen dünnen Pfeil angedeuteten) Überdruck beaufschlagt. Dies löst das Dissektat 22 von der Öffnung 32. Daraufhin fällt (angedeutet durch den fett gedruckten Pfeil) das Dissektat 22 in das Auffanggefäß 36.
Wird – wie im bevorzugten Beispiel – der Gewebeschnitt 10 unmittelbar auf den Objektträger 12 gelegt und durch die Stabilisierungsschicht 14 bedeckt, so wird der Greifer 28 stets auf der vom Präparat abgewandten Seite mit der Stabilisierungsschicht 14 in Kontakt gebracht. Eine Kontamination und Verschleppung von biologischem Material wird auf diese Weise wirkungsvoll verhindert, da der Greifer 28 nie direkt mit der biologischen Schicht 10 in Kontakt kommt.
Zwischen dem Greifer 28 und dem Präparat kann sich eine ebenfalls mit Öffnungen 40 versehene Schicht 38 befinden (4). Diese wird im Folgenden als Zwischenschicht 38 bezeichnet. Eine der Öffnungen 40 dieser Zwischenschicht 38 wird vor dem Absenken des Greifers 28 auf das Präparat mit einer Öffnung 32 des Greifers 28 in Deckung gebracht. Die Durchmesser der Öffnungen müssen dabei nicht übereinstimmen. Wichtig ist nur, dass eine der Öffnungen – vorzugsweise die Öffnung 40 in der Zwischenschicht 38 – kleiner ist als das aufzunehmende Dissektat 22.
Nach erfolgter Dissektion und dem Abheben des Greifers 28 und der Zwischenschicht 38 vom Präparat kann die Zwischenschicht so bewegt werden (angedeutet durch den fett gedruckten Pfeil in 4), dass:

a) erneut eine freie Öffnung 40 mit einer Öffnung 32 des Greifers 28 zur Deckung kommt; oder
b) die mit einem Dissektat 22 belegte Öffnung 40 zu einer dem Greifer 28 äquivalenten Vorrichtung gelangt, an der die Ablösung des Dissektats 22 wie oben beschrieben erfolgt.

Zum Abschluss des Verfahrens wird – entsprechend 3D – der Greifer 28 abgehoben und das Auffanggefäß 36 zum Greifer 28 transportiert oder aber der Greifer 28 zum Auffanggefäß 36 transportiert. In dieser Stellung können durch eine Druckerhöhung im Hohlkanal 34 die am Greifer 28 fixierten Dissektate 22 abgelöst werden. Sie fallen dann in das Auffanggefäß 36. Die Druckerhöhung kann z. B. durch einen oder mehrere kurze Druckstöße oder durch Schallwellen erfolgen.
Da der Greifer 28 nur mit der kontaminationsfreien Zwischenschicht 38 in Berührung kommt, besteht keine Kontaminations- oder Verschleppungsgefahr für den Greifer. Dieser kann unbegrenzt wiederholt eingesetzt werden.
Im Rahmen des Verfahrens kann auch ein aufrechtes Mikroskop verwendet werden. Dabei ordnen sich alle Komponenten entsprechend an.

Claims

Vorrichtung zum Isolieren eines Teils einer Schicht biologischen Materials oder eines Präparats mit: a) einem Greifer (28), der an den zu isolierenden Teil (22) der Schicht biologischen Materials herangeführt werden kann, b) wobei der Greifer (28) derart ausgebildet ist, dass er einen durchgängigen Hohlkanal (34) mit einer präparatseitigen Öffnung (32) hat, die kleiner ist als der zu isolierende Teil (22) des Präparats, c) Mitteln zum Fixieren des zu isolierenden Teils (22) durch eine Druckdifferenz vor der präparatseitigen Öffnung (32) des Greifers (28), d) Mittel zum Ausschneiden des zu isolierenden Teils (22) aus der Schicht (10) biologischen Materials, wodurch ein Dissektat gebildet werden kann, und mit e) Mittel zum Entfernen des Greifers (28) vom Rest der Schicht (10) biologischen Materials, dadurch gekennzeichnet, dass der Greifer (28) eine Mehrzahl von präparatseitigen Öffnungen (32) aufweist, die kleiner sind als zu isolierende Teile (22) des Präparats (10, 14) und das Fixieren von einer Mehrzahl von Dissektaten (22) vor den jeweiligen präparatseitigen Öffnungen (32) ermöglichen.
Vorrichtung nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch Mittel zum Transportieren des Dissektats (22) mit Hilfe des Greifers (28) an einen Zielort (36) und mit Mitteln zum Umkehren der Druckdifferenz vor der präparatseitigen Öffnung (32) des Greifers (28).
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch eine Zwischenschicht (38) zwischen dem Greifer (28) und dem Präparat (10, 14), wobei die Zwischenschicht (38) eine Mehrzahl von Öffnungen (40) aufweist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, gekennzeichnet durch Mittel (15, 16) zum Anlegen eines elektrischen Felds (18) zwischen der vom Präparat (10, 14) abgewandten Seite des Objektträgers (12) und der vom Objektträger abgewandten Seite des Präparats, und mit einer ersten Elektrode (20) zum Entfernen der auf der dem Objektträger (12) abgewandten Seite des Präparats (10, 14) sich sammelnden Ladungsträger.
Verfahren zum Isolieren eines Teils einer Schicht biologischen Materials oder eines Präparats mit folgenden Schritten: a) ein Greifer (28) wird an den zu isolierenden Teil (22) der Schicht biologischen Materials herangeführt, b) der Greifer (28) wird derart ausgebildet, dass er einen durchgängigen Hohlkanal (34) mit einer präparatseitigen Öffnung (32) hat, die kleiner ist als der zu isolierende Teil (22) des Präparats, c) durch eine Druckdifferenz wird der zu isolierende Teil (22) vor der präparatseitigen Öffnung (32) des Greifers (28) fixiert, d) der zu isolierende Teil (22) wird aus der Schicht (10) biologischen Materials ausgeschnitten, wodurch ein Dissektat gebildet wird, und e) das Dissektat (22) wird vom Rest der Schicht (10) biologischen Materials durch Entfernen des Greifers (28) von der Schicht biologischen Materials getrennt, dadurch gekennzeichnet dass der Greifer (28) derart ausgebildet wird, dass er eine Mehrzahl von präparatseitigen Öffnungen (32) aufweist, die kleiner sind als zu isolierende Teile (22) des Präparats (10, 14) und das Fixieren von einer Mehrzahl von Dissektaten vor den jeweiligen präparatseitigen Öffnungen ermöglichen.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Dissektat (22) mit Hilfe des Greifers (28) an einen Zielort (36) transportiert wird und dort durch Umkehren der Druckdifferenz abgelegt wird.
Verfahren nach einem der Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen dem Greifer (28) und dem Präparat (10, 14) eine mit Öffnungen (40) versehene Zwischenschicht (38) angeordnet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Präparat (10, 14) auf einen dielektrischen Objektträger (12) aufgebracht wird, ein elektrisches Feld (18) zwischen der vom Präparat (10, 14) abgewandten Seite des Objektträgers (12) und der vom Objektträger abgewandten Seite des Präparats angelegt wird, und die auf der dem Objektträger (12) abgewandten Seite des Präparats (10, 14) sich sammelnden Ladungsträger durch eine Elektrode (20) entfernt werden.