DE102015221850A1

DE102015221850A1 - Verfahren zur Präparation von Referenzmarkierungen auf einem Probenträger

Info

Publication number: DE102015221850A1
Application number: DE102015221850.3A
Authority: DE
Inventors: Christian Dietrich; Wibke Hellmich
Original assignee: Carl Zeiss AG
Current assignee: Carl Zeiss AG
Priority date: 2015-11-06
Filing date: 2015-11-06
Publication date: 2017-05-11

Abstract

Verfahren zur Präparation von Referenzmarkierungen auf einem Probenträger (1), bei dem einzelne Partikel (2.1) als Referenzmarkierungen auf einer Grenzfläche (1.1) des Probenträgers (1) aufgebracht werden, die eine Oberflächenladung aufweisen und in einer Flüssigkeit (2) gelöst in ein elektrisches Feld eingebracht werden, in dem der Probenträger (1) angeordnet ist, und die Partikel (2.1) mit einer steuerbaren Partikeldichte in einem oder mehreren zeitlich aufeinanderfolgenden Abscheidungsprozessen an der Grenzfläche (1.1) abgeschieden werden.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren, wie es gattungsgemäß aus der Publikation „Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision", Kukulski et al., JCB 2011, Vol. 192 No. 1, p. 111–119 bekannt ist.
In der korrelativen Mikroskopie, bei der unterschiedliche Mikroskopieverfahren, wie die Licht-/Fluoreszenzmikroskopie (FM) und die Elektronenstrahlmikroskopie (EM), miteinander kombiniert werden, besteht eine große Herausforderung in der exakten korrelativen Überlagerung der Aufnahmen (Bilder) einer Probenstelle, um die komplementären Informationen ein und derselben Stelle einer Probe korrekt einander zuordnen zu können.
Die Ursachen hierfür liegen zum einen in der unterschiedlichen Natur der gewonnenen Bildinformationen und zum anderen im Transfer zwischen den jeweils verwendeten Mikroskopiesystemen, begründet durch eine begrenzte Anfahrgenauigkeit der zugehörigen Tischsysteme im Bereich von einigen m.
Um die Bildinformationen der Bilder einander eineindeutig zuordnen zu können, ist es bekannt, Referenzmarkierungen (fiducial marks) auf den Probenträger aufzubringen. Über die Bestimmung der Position dieser Referenzmarkierungen in den mit einer Kamera aufgenommenen Bildern des Probenträgers und damit einer darauf sich befindenden Probe über das eine und das andere Mikroskopieverfahren können die Bilder mit einer Genauigkeit bis zu wenigen nm in Deckung gebracht werden.
Für die Präparation von Referenzmarkierungen existieren für die hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie bzw. korrelative Mikroskopie sowohl wissenschaftliche als auch kommerzielle Lösungsansätze.
Die einfachste und schnellste Methode basiert auf der unspezifischen Adhäsion von Partikeln auf der Grenzfläche des Probenträgers. Als Grenzfläche des Probenträgers soll sowohl die Oberfläche des Probenträgers in einem von einer Probe nicht bedeckten Bereich oder aber die Oberfläche einer darauf sich befindenden Probe verstanden werden. Dabei wird entweder ein Tropfen einer Partikellösung auf die Grenzfläche gegeben oder die Grenzfläche auf den Tropfen gelegt und dann anschließend inkubiert („Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision", Kukulski et al., JCB 2011, Vol. 192 No. 1, p. 111–119). Durch die Steuerung der Partikelkonzentration und der Inkubationszeit können somit verschiedene Partikeldichten erzielt werden, wobei die Parameter auf Erfahrungswerten beruhen und vorab in separat iterierten Messschritten evaluiert werden. Sowohl Adhäsions- als auch Ablösevorgänge spielen hier eine Rolle, die sehr sensitiv von den Oberflächeneigenschaften der Partikel und Grenzfläche des Probenträgers abhängen und schwierig zu kontrollieren sind. Weiterhin kommt es bei langen Inkubationszeiten oder hohen Partikeldichten zur Zusammenlagerung der Partikel bereits in der Lösung, sodass sich teilweise die Partikel nicht vereinzelt an der Grenzfläche anlagern. Um die Anlagerung von Partikeln an die Grenzfläche zu unterstützen, werden oft Reagenzien, wie z. B. Poly-Lysine, der Lösung beigemengt, wodurch eine Gefahr von Verklumpungen der Partikel und einer Kontamination der Grenzfläche mit diesen Reagenzien hervorgerufen wird.
In der vorgenannten Publikation „Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision", Kukulski et al., JCB 2011, Vol. 192 No. 1, p. 111–119 wird speziell die Verwendung von fluoreszierenden Mikropartikeln als Referenzmarkierungen vorgeschlagen.
In der Publikation „Correlative Photoactivated Localization and Scanning Electron Microscopy", Kopek et al., PLOS ONE 2013, vol. 8 Issue 10 wird die Verwendung von Goldkolloiden als Referenzmarkierungen offenbart (Kopek et al., PLoS 2013, 8, p. e77209). Für den Einsatz dieser Methode ist es in allen Fällen wichtig, die Dichte der Referenzmarkierungen bestimmen zu können, um in jedem Bildfeld Referenzpartikel zu haben, ohne dass aber die Probe als solche verdeckt wird oder Störungen durch Verklumpungen entstehen.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu finden, mit dem Referenzmarkierungen auf der Grenzfläche eines Probenträgers kontrolliert und vorteilhaft partiell oder differenziert unterschiedlich abgeschieden werden können.
Diese Aufgabe wird für ein Verfahren zur Präparation von Referenzmarkierungen auf einem Probenträger, bei dem einzelne Partikel als Referenzmarkierungen auf einer Grenzfläche des Probenträgers aufgebracht werden, dadurch gelöst, dass die Partikel eine gleiche positive oder negative Oberflächenladung aufweisen und in einer Flüssigkeit gelöst in ein elektrisches Feld eingebracht werden, in dem der Probenträger angeordnet ist. Dabei werden die Partikel in Abhängigkeit von der gewählten Flüssigkeit, der Partikelkonzentration in der Flüssigkeit, der angelegten, das elektrische Feld verursachenden Spannung und der Zeitdauer der Aufrechterhaltung des elektrischen Feldes an der Grenzfläche des Probenträgers vereinzelt und mit einer steuerbaren Partikeldichte, die zu einer Flächenbelegung FB von maximal 1 % führt, in einem oder mehreren zeitlich aufeinanderfolgenden Abscheidungsprozessen abgeschieden.
Vorteilhaft wird nach Beendigung jeweils eines Abscheidungsprozesses die Polarität des elektrischen Feldes geändert, sodass noch nicht abgeschiedene, noch freie Partikel aus der Nähe des Probenträgers abtransportiert werden.
Das elektrische Feld kann durch eine erste und eine zweite Elektrode gebildet werden. Alternativ wird es vorteilhaft durch den Probenträger, der eine elektrisch leitfähige, kontaktierte Beschichtung aufweist, und eine zweite Elektrode gebildet.
Das Verfahren ermöglichst, dass die Partikel örtlich differenziert an der Grenzfläche abgeschieden werden.
Dazu kann vorteilhaft eine elektrisch isolierende Abstandsschicht mit einem oder mehreren Durchbrüchen in das elektrische Feld, den Probenträger und die zweite Elektrode in Kontakt bringend, eingebracht werden, sodass das elektrische Feld nur innerhalb der Durchbrüche zwischen dem Probenträger und der zweiten Elektrode zur Wirkung kommt und die Partikel abgeschieden werden.
Selbiges kann erreicht werden, indem die Flüssigkeit in Form einzelner Tropfen zwischen den Probenträger und die zweite Elektrode eingebracht wird, sodass nur im Bereich der Tropfen Partikel abgeschieden werden.
Auch kann das elektrische Feld nur partiell oder örtlich differenziert zwischen der zweiten Elektrode und dem Probenträger gebildet werden, indem der Probenträger nur partiell oder strukturiert beschichtet ist, sodass nur im Bereich der Beschichtung Partikel abgeschieden werden.
Der eine oder die mehreren zeitlich aufeinanderfolgenden Abscheidungsprozesse können automatisiert beendet werden, oder aber vorteilhaft visuell beobachtet und bei Erreichen einer ausreichenden Partikeldichte beendet werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird nachfolgend unter Zuhilfenahme von Zeichnungen näher erläutert. Hierzu zeigen:
1 einen Prinzipaufbau für eine erste Anordnung zur Durchführung des Verfahrens,
2 einen Prinzipaufbau für eine zweite Anordnung zu einem bevorzugten Ausführungsbeispiel des Verfahrens,
3 einen Prinzipaufbau für eine dritte Anordnung zu einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel des Verfahrens und
4a–4d schematische Darstellung von Aufnahmen des Probenträgers zu verschiedenen Zeitpunkten während des Verfahrens.
Allen Ausführungsbeispielen eines erfindungsgemäßen Verfahrens ist gemeinsam, dass ein Probenträger 1, auf dessen Grenzfläche 1.1 Referenzmarkierungen präpariert werden sollen, in ein elektrisches Feld gebracht wird und dass die Referenzmarkierungen elektrisch geladene Partikel 2.1 sind, die in einer Flüssigkeit 2 gelöst in das elektrische Feld eingebracht werden, wodurch die Partikel 2.1 in Abhängigkeit von der gewählten Flüssigkeit 2 und der gewählten Partikelkonzentration in der Flüssigkeit 2 über die angelegte, das elektrische Feld verursachende Spannung und die Zeitdauer der Aufrechterhaltung des elektrischen Feldes gesteuert an der Grenzfläche 1.1 des Probenträgers 1 vereinzelt und mit einer steuerbaren Partikeldichte abgeschieden werden.
Die Partikel 2.1 besitzen entweder alle eine positive oder eine negative Oberflächenladung, so dass die elektrostatische Abstoßung eine Verklumpung der Partikel 2.1 untereinander verhindert und eine vereinzelte Abscheidung der Partikel 2.1 an der Grenzfläche 1.1 ermöglicht wird.
Die Wahl der Flüssigkeit 2, z. B. in Abhängigkeit vom ph-Wert, der die Ladungseigenschaften der Partikel 2.1 beeinflusst, und der Partikelkonzentration der Flüssigkeit 2, wird so getroffen, dass die abgeschiedenen Partikel 2.1 in Summe die Grenzfläche 1.1 des Probenträgers 1 mit einer Flächenbelegung FB von weniger als 1 % bedecken und die Abscheidung in einer angemessenen Zeitdauer gut steuerbar ist. Eine Flächenbelegung FB von größer 1 % ist zwar möglich, führt aber unvorteilhaft zu einer prozentual größeren Abdeckung der Bildaufnahme. Eine geeignete Anzahl der abgeschiedenen Partikel 2.1 ergibt sich mit ca. 10 Referenzmarkierungen, die sich im Bildfeld einer Mikroskopieaufnahme befinden sollen, um eine eindeutige Indizierung und Zuordnung der Partikel 2.1 sicherzustellen.
Nachfolgendes Beispiel soll die Wahl der Verfahrensparameter für die Ablage von Partikeln 2.1 mit einem Durchmesser von 100 nm für eine elektronenmikroskopische Bildaufnahme mit einer Kantenlänge von 5 µm (25 µm²) des Bildfeldes illustrieren. Mit einer angestrebten Ablage von ca. 10 Partikeln pro Bildfeld ergibt sich eine mittlere Flächenbelegung FB von: FB = 10 × Pi × 0,1²/4/25 = 0,31 %.
Eine geeignete Zeitdauer der Aufrechterhaltung des elektrischen Feldes und damit der Abscheidungszeit liegt vorteilhaft im Bereich von 10–200 Sekunden. Die Spannung sollte so gewählt werden, dass die induzierte elektrophoretische Partikelverschiebung während der Abscheidung die mittlere Translation durch thermische Diffusionsbewegung der Partikel 2.1 dominiert, vorteilhaft ist sie wenigstens um das Zehnfache größer. Bei einer Partikelgeschwindigkeit von 1 µm/s werden während einer Abscheidungszeit von 20 Sekunden im Durchschnitt 10 Partikel pro 25 µm² Bildfeld an der Grenzfläche 1.1 abgelagert, wenn eine Partikeldichte von 10 Partikeln pro 25µm² × 20 µm vorliegt. Dies entspricht einer Partikelkonzentration von 2 × 10¹⁰ Partikel in einem Milliliter. Die Partikelgeschwindigkeit hängt von der Ladung ab, die sie tragen, der Feldstärke zwischen den Elektroden und der Reibung in der Flüssigkeit 2. Bei Polystyrol-Partikeln mit einem Durchmesser von ca. 100 nm, einem Elektrodenabstand von wenigen Millimetern, vorteilhaft zwischen 2 bis 6 mm, und Reinstwasser als Flüssigkeit 2 und Dielektrikum sind wenige Volt notwendig, um die gerichtete Transportgeschwindigkeit von einigen Mikrometern/Sekunde zu erreichen (vergleiche 4a–d).
Geeignete Werte für die Verfahrensparameter Partikelkonzentration, Spannung und Zeitdauer eines Abscheidungsprozesses werden entweder vorab über die Durchführung von iterativen Messreihen bestimmt und / oder bei vorgegebener Partikelkonzentration und Spannung, basierend auf Erfahrungen, wird die Zeitdauer in Verbindung mit einer visuellen Beobachtung des Probenträgers 1 bei Erreichen einer ausreichenden Partikeldichte beendet.
Es können ein oder auch mehrere Abscheidungsprozesse mit unterschiedlichen Verfahrensparametern und / oder unterschiedlichen Partikeln 2.1 nacheinander durchgeführt werden.
Grundsätzlich kann der Probenträger 1 in ein elektrisches Feld gebracht werden, indem er zwischen einer ersten Elektrode 3.1 und einer zweiten Elektrode 3.2 angeordnet wird oder indem er selbst, hergestellt aus einem Substrat und einer elektrisch leitfähigen Beschichtung, die Wirkung einer der Elektroden 3.1, 3.2 übernimmt.
In 1 ist ein Prinzipaufbau für eine Anordnung dargestellt, bei welchem der Probenträger 1 zwischen der ersten Elektrode 3.1 und der zweiten Elektrode 3.2 angeordnet wird. Die beiden Elektroden 3.1, 3.2 befinden sich entweder in einem Behälter 4 bzw. sie selbst begrenzen auf sich gegenüberliegenden Seiten einen Behälter 4. Der Behälter 4 ist mit einer Flüssigkeit 2, z. B. Wasser, befüllt, in der die Partikel 2.1 in einer geeigneten Partikelkonzentration vorliegen.
Die beiden Elektroden 3.1, 3.2, die sich dazwischen befindende Flüssigkeit 2 und die elektrischen Verbindungen der Elektroden 3.1, 3.2 untereinander über ein Netzgerät 5 und einen Schalter 6 bilden einen Stromkreis. Mit dem Anlegen eines elektrischen Feldes, was durch das Einschalten des Netzgerätes 5 erfolgt, werden die Partikel 2.1 zwischen den beiden Elektroden 3.1, 3.2 transportiert und mit dem Probenträger 1, der z. B. ein Mikroskopiedeckglas sein kann, in Kontakt gebracht. Die stabile Anlagerung der Partikel 2.1 an den Probenträger 1 wird über van der Waals Wechselwirkungen erreicht, die nach Überwindung der elektrostatischen Abstoßung zwischen dem Probenträger 1 und den Partikeln 2.1 im Nahfeld dominiert. In Abhängigkeit von der Polung der Elektroden 3.1, 3.2 und der Polarität der Partikel 2.1 wird der Probenträger 1 so zwischen die beiden Elektroden 3.1, 3.2 gebracht, dass die Abscheidung der Partikel 2.1 auf der Seite des Probenträgers 1 erfolgt, auf welcher sich gegebenenfalls eine Probe befindet. Dabei kann die Abscheidung auf der Probe oder aber in probenfreien Oberflächenbereichen des Probenträgers 1 erfolgen, beides wird nachfolgend als die Grenzfläche 1.1 des Probenträgers 1 bezeichnet.
Vorteilhaft kann nach der Abscheidung einer hinreichenden Menge von Partikeln 2.1 an der Grenzfläche 1.1 die Polarität der Elektroden 3.1, 3.2 geändert werden, sodass noch nicht abgeschiedene, noch freie Partikel 2.1 aus der Nähe des Probenträgers 1 abtransportiert werden.
Mit der Verwendung eines programmierbaren Netzgeräts 5 kann das Verfahren automatisiert werden und mittels des Schalters 6 kann der Vorgang durch den Benutzer gestartet und individuell unterbrochen werden.
Indem auf den Probenträger 1, der grundsätzlich durch ein Substrat gebildet wird, vor Beginn des Verfahrens eine elektrisch leitfähige Schicht aufgebracht wurde, dies kann bevorzugt vor aber auch nach dem Aufbringen einer Probe erfolgen, und diese elektrisch kontaktiert wird, kann der Probenträger 1 die erste Elektrode 3.1 ersetzen. Dies gilt insbesondere für Präparate für die Elektronenmikroskopie, für die eine elektrische Kontaktierung notwendig ist, um Aufladungseffekte zu vermeiden. Dabei muss das Substrat nicht mit einer geschlossenen gleichen Schicht beschichtet sein, sondern es kann je nachdem, ob eine örtlich differenzierte Abscheidung von gleichen oder auch unterschiedlichen Partikeln 2.1 von Interesse ist, differenziert unterschiedlich oder auch nur partiell oder strukturiert beschichtet sein. Der jetzt die Funktion der ersten Elektrode 3.1 übernehmende Probenträger 1 und die zweite Elektrode 3.2 können gleich der vorher beschriebenen Ausführung des Verfahrens in einen mit der Flüssigkeit 2 befüllten Behälter 4 eingebracht werden.
Vorteilhaft wird jedoch die Flüssigkeit 2, wie in 2 dargestellt, auf die zweite Elektrode 3.2, die aus einem Substrat mit einem bevorzugt gleichen Material wie der Probenträger 1, mit einer ebenfalls leitfähigen und elektrisch kontaktierten Schicht, besteht, aufgebracht und der Probenträger 1 wird oberhalb, gegenüberliegend der zweiten Elektrode 3.2 angeordnet, sodass die Flüssigkeit 2 mit dem Probenträger 1 in Kontakt kommt.
Das Material der Substrate sowie der leitfähigen Schichten ist transparent, so dass mittels einer Beobachtungsoptik, insbesondere eines Lichtmikroskops 9, der Abscheidungsprozess der Partikel 2.1 auf der Grenzfläche 1.1 beobachtet und infolge dessen gesteuert werden kann. Individuell kann somit die Dichte der abgeschiedenen Partikel 2.1 gesteuert werden. Die gewählte Partikelkonzentration, die Spannung und die Zeitdauer der Abscheidung stellen in diesem Fall eine Grobeinstellung dar und müssen nicht mehr vorab in Messreihen ermittelt werden. Die Feinabstimmung in Form einer Anpassung der Verfahrensparameter Spannung und Zeitdauer erfolgt durch die visuelle Kontrolle. Zusätzlich kann durch Abschalten und wieder Einschalten des elektrischen Feldes mit geänderter Spannung oder auch geänderter Polarität der Vorgang der Abscheidung beendet und wieder begonnen werden, um z. B. die Abscheidung an Bereichen der Grenzfläche 1.1 unterschiedlicher Grenzflächenpolarität zu ermöglichen und zu beeinflussen.
Nachfolgend soll das Verfahren anhand eines vorteilhaften Ausführungsbeispiels mithilfe von 2 beschrieben werden.
Das Verfahren wird an einem Probenträger 1 durchgeführt, der aus einem transparenten Substrat besteht und mit einer transparenten leitfähigen Schicht beschichtet ist. Vorteilhaft wurde hierfür, für die Elektronenstrahlmikroskopie besonders geeignet, eine Indiumzinnoxidschicht verwendet.
Um in einem oder mehreren definierten Bereich(en) auf der Grenzfläche 1.1 des Probenträgers 1 Partikel 2.1 abzuscheiden, wird vorgeschlagen, zwischen der zweiten Elektrode 3.2, die hier ebenfalls aus einem transparenten Substrat und einer transparenten elektrisch leitenden Schicht besteht, und der mittelbar über die Flüssigkeit 2 in Kontakt stehenden Grenzfläche 1.1 des Probenträgers 1 eine elektrisch isolierende Abstandsschicht 7, mit einer Dicke bevorzugt von 1–2 mm und mit einem oder mehreren Durchbrüchen 7.1, einzubringen. Die Durchbrüche 7.1 bilden mit der zweiten Elektrode 3.2 und der angrenzenden Grenzfläche 1.1 des später aufgesetzten Probenträgers 1 jeweils eine geschlossene Kammer. Weist die Abstandsschicht 7 genau einen Durchbruch 7.1 auf, kann über die Wahl dessen Querschnitts der Bereich der Grenzfläche 1.1 genau definiert werden, in dem Partikel 2.1 abgeschieden werden, da nur in einem Bereich Partikel 2.1 abgeschieden werden können, der innerhalb des Durchbruches 7.1 liegt.
Um eine örtlich differenzierte Abscheidung von Partikeln 2.1 auf der Grenzfläche 1.1 des Probenträgers 1 zu bewirken, weist die Abstandsschicht 7 mehrere Durchbrüche 7.1 auf. Es können die durch die anliegende zweite Elektrode 3.2 einseitig geschlossenen Durchbrüche 7.1 mit einer Flüssigkeit 2 gleicher Partikel 2.1 oder aber mit Flüssigkeiten 2 unterschiedlicher Partikel 2.1 oder Partikelkonzentrationen befüllt werden. Durch die Befüllung der Durchbrüche 7.1 mit Flüssigkeiten 2 unterschiedlicher Partikel 2.1, z. B. unterschiedlicher Fluoreszenzeigenschaften, kann eine Abscheidung unterschiedlicher Partikel 2.1 auf einem gleichen Probenträger 1 erreicht werden. Die Partikelkonzentration, Partikelgröße sowie die spektralen Fluoreszenz- bzw. Adsorptionseigenschaften der sich in der Flüssigkeit 2 befindenden Partikel 2.1 sind bekannt und die Durchbrüche 7.1 werden mit einem Flüssigkeitsvolumen befüllt, so dass die jeweils gebildeten Kammern vollständig befüllt sind und die Grenzfläche 1.1 des Probenträges 1 und die zweite Elektrode 3.2 innerhalb der Durchbrüche 7.1 mittelbar über die Flüssigkeit 2 verbunden sind. Über die Größe und Anordnung der Durchbrüche 7.1 zueinander kann exakt beeinflusst werden, wo und wo nicht auf der Grenzfläche 1.1 Partikel 2.1 abgeschieden werden.
Nach dem Befüllen der Durchbrüche 7.1 und dem Verschließen durch die Auflage des Probenträgers 1 wird die Polung der leitenden Schichten des Probenträgers 1 und der zweiten Elektrode 3.2 gewählt und das elektrische Feld angelegt, z. B. über eine Zeitdauer von 20 s.
Eine auf den Probenträger 1 gerichtete Beobachtungsoptik, insbesondere ein Lichtmikroskop 9, wird auf die Grenzfläche 1.1 eingestellt, auf die die Partikel 2.1 abgeschieden werden.
Wie bereits erläutert können nicht nur die Dichte der abgeschiedenen Partikel 2.1 auf der Grenzfläche 1.1 durch die Wahl der Verfahrensparameter, sondern auch Bereiche der Grenzfläche 1.1, in denen Partikel 2.1 abgeschieden werden, mit Ort und Größe festgelegt werden. Vorteilhaft können, wie dargelegt, der Ort und die Größe der Bereiche über den Ort und die Größe von Durchbrüchen 7.1 einer Abstandsschicht 7 festgelegt werden.
Gleiches, aber nur weniger definiert, ist erreichbar, wenn anstelle der ausgeführten Abstandsschicht 7 mit Durchbrüchen 7.1 ein Abstandsrahmen 8, wie in 3 gezeigt, zwischen den Probenträger 1 und die zweite Elektrode 3.2 gefügt wird, der einen Mindestabstand zwischen der zweiten Elektrode 3.2 und dem Probenträger 1 gewährleistet, sodass ein oder mehrere einzeln auf die zweite Elektrode 3.2 aufgebrachte Tropfen von Flüssigkeiten 2 nur begrenzt breit gedrückt werden, wenn der Probenträger 1 auf den Abstandsrahmen 8 aufgelegt wird. Nach Beendigung eines Abscheidungsprozesses können weitere Tropfen an gleicher oder anderer Stelle auf die zweite Elektrode 3.2 aufgetragen werden und ein zweiter oder weiterer Abscheidungsprozess kann gestartet werden. So können unterschiedliche Partikel 2.1 abgeschieden oder Partikel 2.1 in unterschiedlicher Partikeldichte abgeschieden werden.
Anstelle eines diskreten Abstandsrahmens 8 kann auch ein am Probenträger 1 ausgebildeter erhöhter Rand als Rahmen dienen.
Auch kann durch eine Strukturierung der elektrisch leitfähigen Schicht des Probenträgers 1 die örtliche Abscheidung der Partikel 2.1 gezielt beeinflusst werden, sodass unterschiedliche Partikel 2.1 örtlich unterschiedlich oder gleiche Partikel 2.1 örtlich unterschiedlich dicht abgeschieden werden.
Darüber hinaus ist es durch Verwendung inhomogener elektrischer Felder möglich, die Bedeckung der Grenzfläche 1.1 mit Partikeln 2.1 differenziert zu variieren. Dies schafft unter anderem die Möglichkeit, auf Unterschiede in der Grenzflächenpolarität einzugehen.
In den 4a bis 4d sind exemplarisch einzelne zu unterschiedlichen Zeitpunkten erstellte Aufnahmen (Bilder) der Grenzfläche 1.1 des Probenträgers 1 innerhalb der Zeitdauer des anliegenden elektrischen Feldes schematisch dargestellt, innerhalb der eine Abscheidung von Fluoreszenzpartikeln mit einer Größe von ca. 100 nm auf der Grenzfläche 1.1 erfolgt ist. Aufgrund der begrenzten Möglichkeiten der zeichnerischen Darstellung konnten Partikel die sich unmittelbar vor der Grenzfläche bereits in einem Unschärfebereich befinden und unscharf in den Aufnahmen erscheinen, nicht dargestellt werden.
In 4a ist die Grenzfläche 1.1 zu einem Zeitpunkt dargestellt zu noch keine Spannung und somit kein elektrisches Feld anliegt, sodass noch keine Partikel 2.1 an der Grenzfläche 1.1 abgeschieden wurden. Sobald eine Spannung anliegt, beginnt die definierte Abscheidung der Partikel 2.1 auf der Grenzfläche 1.1, wie in 4b gezeigt. Mittels der Beobachtungsoptik kann die weitere Abscheidung der Partikel 2.1 verfolgt werden (4c) und bei gewünschter homogener Dichte, gezeigt in 4d, gestoppt werden.
Durch die verfahrensbegleitende visuelle Beobachtung kann entsprechend auf den Abscheidungsprozess Einfluss genommen werden und das Verfahren kann bei gewünschter erreichter Dichte der Partikel 2.1 auf der Grenzfläche 1.1 abgebrochen oder mittels eines weiteren Abscheidungsprozesses fortgesetzt werden. Im Anschluss an das Verfahren wird der Probenträger 1 mit den abgeschiedenen Partikeln 2.1 auf der Grenzfläche 1.1 aus der Vorrichtung genommen und mit Wasser abgespült, um noch in der überstehenden Flüssigkeit 2 befindliche Partikel 2.1 zu entfernen.
Bezugszeichenliste

1: Probenträger
1.1: Grenzfläche
2: Flüssigkeit
2.1: Partikel
3.1: erste Elektrode
3.2: zweite Elektrode
4: Behälter
5: Netzgerät
6: Schalter
7: Abstandsschicht
7.1: Durchbruch
8: Abstandsrahmen
9: Lichtmikroskop

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

„Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision“, Kukulski et al., JCB 2011, Vol. 192 No. 1, p. 111–119 [0001]
„Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision“, Kukulski et al., JCB 2011, Vol. 192 No. 1, p. 111–119 [0006]
„Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision“, Kukulski et al., JCB 2011, Vol. 192 No. 1, p. 111–119 [0007]
„Correlative Photoactivated Localization and Scanning Electron Microscopy“, Kopek et al., PLOS ONE 2013, vol. 8 Issue 10 [0008]
Kopek et al., PLoS 2013, 8, p. e77209 [0008]

Claims

Verfahren zur Präparation von Referenzmarkierungen auf einem Probenträger (1), bei dem einzelne Partikel (2.1) als Referenzmarkierungen auf einer Grenzfläche (1.1) des Probenträgers (1) aufgebracht werden, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel (2.1) eine gleiche positive oder negative Oberflächenladung aufweisen und in einer Flüssigkeit (2) gelöst in ein elektrisches Feld eingebracht werden, in dem der Probenträger (1) angeordnet ist, wobei die Partikel (2.1) in Abhängigkeit von der gewählten Flüssigkeit (2), der Partikelkonzentration in der Flüssigkeit (2), der angelegten, das elektrische Feld verursachenden Spannung und der Zeitdauer der Aufrechterhaltung des elektrischen Feldes an der Grenzfläche (1.1) des Probenträgers (1) vereinzelt und mit einer steuerbaren Partikeldichte, die zu einer Flächenbelegung FB von maximal 1 % führt, in einem oder mehreren zeitlich aufeinanderfolgenden Abscheidungsprozessen abgeschieden werden.
Verfahren zur Präparation von Referenzmarkierungen auf einem Probenträger (1) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass nach Beendigung jeweils eines Abscheidungsprozesses die Polarität des elektrischen Feldes geändert wird, sodass noch nicht abgeschiedene, noch freie Partikel (2.1) aus der Nähe des Probenträgers (1) abtransportiert werden.
Verfahren zur Präparation von Referenzmarkierungen auf einem Probenträger (1) nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das elektrische Feld durch eine erste und eine zweite Elektrode (3.1, 3.2) gebildet wird.
Verfahren zur Präparation von Referenzmarkierungen auf einem Probenträger (1) nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das elektrische Feld durch den Probenträger (1), der eine elektrisch leitfähige, kontaktierte Beschichtung aufweist, und eine zweite Elektrode (3.2) gebildet wird.
Verfahren zur Präparation von Referenzmarkierungen auf einem Probenträger (1) nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel (2.1) örtlich differenziert an der Grenzfläche (1.1) abgeschieden werden, indem eine elektrisch isolierende Abstandsschicht (7) mit einem oder mehreren Durchbrüchen (7.1) in das elektrische Feld, den Probenträger (1) und die zweite Elektrode (3.2) in Kontakt bringend, eingebracht wird, sodass das elektrische Feld nur innerhalb der Durchbrüche (7.1) zwischen dem Probenträger (1) und der zweiten Elektrode (3.2) zur Wirkung kommt und die Partikel (2.1) abgeschieden werden.
Verfahren zur Präparation von Referenzmarkierungen auf einem Probenträger (1) nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit (2) in Form einzelner Tropfen zwischen den Probenträger (1) und die zweite Elektrode (3.2) eingebracht wird, sodass nur im Bereich der Tropfen Partikel (2.1) abgeschieden werden.
Verfahren zur Präparation von Referenzmarkierungen auf einem Probenträger (1) nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das elektrische Feld nur partiell oder örtlich differenziert zwischen der zweiten Elektrode (3.2) und dem Probenträger (1) gebildet ist, da der Probenträger (1) nur partiell oder strukturiert beschichtet ist, sodass nur im Bereich der Beschichtung Partikel (2.1) abgeschieden werden.
Verfahren zur Präparation von Referenzmarkierungen auf einem Probenträger (1) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der eine oder die mehreren zeitlich aufeinanderfolgenden Abscheidungsprozesse visuell beobachtet werden und bei Erreichen einer ausreichenden Partikeldichte beendet werden.