Verfahren und Vorrichtung zur Partikeltrennung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Trennen von Partikelgemischen nach bestimmten Partikeleigenschaften, insbesondere ein Trennverfahren für Gemische mikroskopisch kleiner Partikel in fluidischen Mikrosystemen, und eine Trenneinrichtung zur Durchführung des Verfahrens.
Eine häufig bei biologischen oder medizinischen Untersuchungen, in der Diagnostik sowie in biotechnologischen Prozessen gestellte Aufgabe besteht in der Trennung von Suspensionsgemischen durch Verteilung oder Sortierung von Zellen oder Mik- ropartikeln aus einer großen Ausgangsmenge in bestimmte Gruppen mit jeweils den gleichen Eigenschaften. Beispielsweise kann die Transfektion einer Zellinie oft nur unvollständig durchgeführt werden, so daß vor einer weiteren Bearbeitung oder Nutzung dieser Zellinie die erfolgreich transfizierten Zellen von den nicht erfolgreich bearbeiteten Zellen getrennt werden müssen. Insbesondere das Aussortieren selten vorkommender Individuen stellt eine sehr hohe Anforderung an das Trennverfahren hinsichtlich der Reinheit und Homogenität der Zielfraktion. Ein weiteres Beispiel im medizinischen Bereich ist mit der Knochenmarktransplatation gegeben, bei der Stammzellen von einer großen Zahl anderer Zellen getrennt werden müssen. Auch bei der Analyse von fetalen Zellen im mütterlichem Blut müssen einige wenige fetale Zellen von dem Zellengemisch abgetrennt werden, das sich im mütterlichen Blut befindet. Eine wichtige Aufgabe in der Tumordiagnostik ist die Erkennung, das Aussortieren und die Analyse von metastasier- enden Krebszellen im Blut des Patienten. Es sind verschiedene Methoden zur Trennung von Zellgemischen bekannt, die die Trennaufgabe jedoch nur unvollkommen lösen. Hierzu zählen insbesondere die Affinitätschromatographie, Trennverfahren
auf der Basis von Fluoreszenzmarkierungen wie zum Beispiel die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS), auf der Basis von Markierung mit ferro agnetischen Partikeln, die Mag- net-aktivierte Zellsortierung (MACS) und mikroskopische Verfahren.
Die Affinitätschromatographie wie auch die MACS (oder: Pan- ning-Verfahren) sind auf Trennvorgänge beschränkt, bei denen die Zellen an der Zelloberfläche ein Molekül exprimieren, das eine Affinität zu einer weiteren, bekannten oder unbekannten Substanz besitzt. Bei der Affinitätschromatographie wird diese Substanz auf eine Chromatographiematrix, zum Beispiel auf der Basis von Beads, aufgebracht. Eine Suspension der zu trennenden Zellen wird über diese Matrix gegeben, so daß die ex- primierenden Zellen daran haften, während die anderen Zellen fort gespült werden. Der Nachteil dieses Verfahrens besteht neben der Beschränkung auf zelluläre Systeme mit einer Oberflächenexpression von Molekülen, in der hohen mechanischen Belastung der Zellen und der geringen Trennschärfe der Chromatographie. Die Trennschärfe ist schwach, da viele Zellen mit geringer Affinität unspezifisch an der Matrix hängenbleiben, die eigentlich nicht zu den abzutrennenden Zellen gehören. In der Praxis ist die Affinitätschromatographie auf die Trennung von mechanisch wenig empfindlichen Bakterien beschränkt.
Beim Magnet-aktivierten Trennen von Zellen wird die Zellsuspension mit mikrometergroßen Magnetpartikeln, auf die die affine Substanz aufgebracht ist, gemischt und die Magnetpartikel zusammen mit den Zielzellen mithilfe eines außerhalb des Reaktionsgefäßes befindlichen Magneten abgetrennt. Auch hier ist die Verschleppung unspezifisch anhaftender Zellen an die Magnetpartikel eine erhebliche Einschränkung des Verfahrens hinsichtlich der Reinheit der Zielfraktion.
Beim Fluoreszenz-aktivierten Trennen von Zellen (FACS) werden
diese in einem Flussigkeitsstrom durch eine dünne Kapillare transportiert, wobei in der Regel noch ein weiterer, zellfreier Hullstrom vorgesehen ist. Dieser Strom wird von einem Tropfengenerator in Einzeltropfen zerlegt, die aus der Kapillare in einen freien Meßraum emittiert werden. Die Tropfen passieren im Flug eine optische Meßstrecke, in der sie einer Streulicht- und/ oder Fluoreszenzlichtmessung unterzogen werden. Hierzu werden ein oder mehrere Laser auf die Flugbahn der Tropfen in der optischen Meßflache fokussiert. Die gemessenen Streulicht- und/oder Fluoreszenzmtensitaten erlauben die Feststellung, ob bestimmte Zelleneigenschaften gegeben sind oder nicht. In Abhängigkeit vom Meßergebnis wird eine nach der Meßstrecke angeordnete Verteilereinrichtung, zum Beispiel auf der Basis einer mechanischen Prallplatte oder einer elektrostatischen Ablenkvorrichtung, betätigt.
Der Nachteil der fluoreszenzaktivierten Zelltrennung besteht darin, daß es sich um ein serielles Verfahren handelt. Der optische Aufwand für die Meßstrecke ist so groß, daß eine Paral- lelisierung für praktische Anwendungen zu aufwendig ist. Entsprechendes gilt für die Tropfenerzeugung und die Verteilereinrichtung. Um beispielsweise 10000 Zellen pro Sekunde analysieren zu können, muß bei einer seriellen Verfahrensweise die Meßzeit auf 100 ms oder weniger beschrankt werden. In derart kurzen Zeitbereichen sind Messungen zwar möglich, aber auch mit relativ großen Fehlern behaftet, so daß die Trennschärfe des Verfahrens negativ beeinflußt wird.
Die mikroskopische Zelltrennung basiert darauf, eine zweidi- mensionale Schicht von Zellen (sogenannter Zellrasen) zu bilden und mit einem Mikroskop abzurastern. Von jeder Zelle wird ein Bild aufgenommen, das einer Bildauswertung zur Feststellung vorbestimmter Zelleigenschaften unterzogen wird. Je nach dem Auswertungsergebnis wird eine Pickvorrichtung dazu verwendet, einzelne Zellen nach der Messung aus dem Zellrasen zu lö-
sen und einem Zielort zuzuführen. Eine besonders hohe Auflo- sung bei der Bildaufnahme wird durch Einsatz der konfokalen Mikroskopie erzielt. Auch dieses Verfahren besitzt Beschrankungen vor allem in bezug auf den Durchsatz der Pickvorπch- tung. Ohne Zellen zu beschädigen, kann maximal im Rhythmus von ca. 10 s eweils ein Pickvorgang erfolgen, der darüber hinaus eine mechanische Belastung der zu trennenden Zellen darstellt.
Die genannten Probleme treten nicht nur bei der Trennung von Zeilgemischen, sondern allgemein bei der Trennung von Parti- kelgemischen natürlichen und/oder synthetischen Ursprungs auf.
In Fig. 7 ist ein aus der Mikrosystemtec nik allgemein bekanntes Prinzip der Verteilung von Partikeln illustriert. Ein flu- ldisches Mikrosystem 100' enthalt eine erste Kanalstruktur 10' und eine zweite Kanalstruktur 20', die anemandergrenzende, zum Beispiel nebeneinander oder übereinander angeordnete, Kanäle oder Kammern umfassen. Ein m einer Flüssigkeit suspendiertes Partikelgemisch 1' wird m der ersten Kammerstruktur 10' zu einem Feldkafig 30' bewegt. Sobald ein Partikel im Feldkafig 30' positioniert ist, erfolgen an dieser Beobachtungsposition eine Vermessung des Partikels mit elektrischen Mitteln und nach Freigabe des Partikels vom Feldkafig 30' in Abhängigkeit vom Meßergebnis eine Ansteuerung einer Ablenkelektrode 40' derart, daß der Partikel m die zweite Kanalstruktur 20' überfuhrt oder zur weiteren Bewegung m der ersten Kanalstruktur 10' verbleibt (siehe Pfeile). Dieses Verfahren ist wegen der seriellen Trennweise nachteilig. Soll das Trennverfahren gemäß Fig. 5 mit mehreren Feldkafigen durchgeführt werden, so mußten entsprechend mehrere Ablenkelektroden selektiv verstimmt werden. Dies ist jedoch wegen der elektrischen Wechselwirkung benachbarter Strukturen in praktisch interessierenden Zeitbereichen nicht zuverlässig durchfuhrbar und es wurde zu unerwünschten Fehltrennungen kommen. Ein weiterer Nachteil besteht m der Beschrankung auf die Messung
elektrischer Eigenschaften der Partikel im Mikrosystem.
Der Einsatz von optischen Kräften zur Trennung von Partikelgemischen ist an sich bekannt (siehe Buican et al . in "Applied Optics", Bd. 26, 1987, S. 5311 ff. und Fuhr et al. in "Topics in Current Chemistry" Springer-Verlag 1998, S. 83 ff.). Allerdings sind die herkömmlichen Techniken auf Trennungen mit einem sehr geringen Partikeldurchsatz beschränkt, da der Sortiervorgang nur an einer einzigen definierten Position durchgeführt wird und alle Partikel nacheinander diese Position durchlaufen. Außerdem ist die Reproduzierbarkeit der optischen Bewertung der Partikel vor der Trennung nur über optische Kräfte ohne eine zusätzliche Positionskontrolle der Partikel nur schwer möglich.
Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes Trennverfahren anzugeben, das sich durch einen hohen Durchsatz, eine hohe Trennschärfe und eine geringe mechanische Belastung der zu trennenden Partikel auszeichnet. Die Aufgabe der Erfindung ist es auch, eine Trennvorrichtung zur Implementierung eines derartigen Verfahrens anzugeben.
Diese Aufgaben werden durch ein Verfahren und eine Vorrichtung mit den Merkmalen gemäß den Patenansprüchen 1 bzw. 23 gelöst.
Vorteilhafte Ausführungsformen und Anwendungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.
Die Grundidee der Erfindung besteht darin, eine Partikeltrennung in einem fluidischen Mikrosystem durchzuführen, in dem die zu trennenden Partikel zunächst einzeln oder gruppenweise in mindestens einer Aufnahmestruktur an einer Vielzahl von Funktionselementen, die zum mindestens zeitweiligen Haltern der Partikel oder Partikelgruppen eingerichtet sind, insbesondere Funktionselementen auf der Basis von Feldkäfigen oder anderen geeigneten Feldbarrieren durch positive oder negative
Dielektrophorese positioniert und an dieser Beobachtungsposition (oder: m diesem Beobachtungsfeld) vermessen werden. Beim Vermessen werden vorbestimmte Eigenschaften der zu trennenden Partikel und dementsprechend die Positionen der Partikel ermittelt, die aus dem Gemisch zu trennen sind oder die Positionen der Partikel, die zum Restgemisch gehören. Im Rahmen der vorliegenden Beschreibung werden die abzutrennenden Partikel auch Zielpartikel und die zum übrigen Gemisch gehörenden Partikel Restpartikel genannt. Unter zeitweiligem Haltern wird hier eine Positionierung der Partikel an einem vorbestimmten Ort im Mikrosystem für die Dauer der jeweiligen Messung oder Manipulation verstanden.
Um die Ziel- oder Restpartikel in eine benachbarte Kanalstruktur des Mikrosystems zu übertragen, werden die Zieloder Restpartikel nach der Vermessung sukzessiv oder gleichzeitig einer Laserbestrahlung zur Bildung von optischen Käfigen unterzogen. Vorzugsweise werden die Ziel- oder Restpartikel nach der Vermessung gleichzeitig einer Laserbestrahlung zur Bildung von optischen Käfigen unterzogen. Die Laserbestrahlung kann hierbei z.B. innerhalb eines Feldkafigs, an einer Feldbamere oder m Fließrichtung unmittelbar hinter einem Feldkafig oder einer Feldbarriere erfolgen. Dementsprechend werden die Ziel- oder Restpartikel zusätzlich zu den elektrischen Feldkraften auch optischen Kräften ausgesetzt. Je nach Ausfuhrungsform der Erfindung erfolgt die Übertragung der Ziel- oder Restpartikel durch Verschiebung der optischen Käfige m die benachbarte Kanalstruktur oder durch Offnen der elektrischen Feldkafige hin zur benachbarten Kanalstruktur bei gleichzeitigem Festhalten der optischen Käfige. Diese Übertragung erfolgt vorzugsweise für mehrere Ziel- oder Restpartikel gleichzeitig. D e Zielpartikel werden entsprechend in der benachbarten oder in der ursprünglichen Kanalstruktur des Mikrosystems gesammelt und weiter bearbeitet. Es können auch Gruppen von Partikeln aus den Beobachtungsfeldern über-
tragen werden.
Gemäß einer Grundform der Erfindung erfolgt ein Verteilen der Ziel- und Restpartikel in zwei Gruppen. Die Ziel- und Restpartikel können eine oder mehrere Arten von Partikeln umfassen. Durch stufenweises Wiederholen der Trennung jeweils unter Bezug auf andere Partikeleigenschaften kann auch ein Sortieren in mehrere Ziel- und Restpartikelgruppen erfolgen. Die Zieloder Restpartikel 2, 3 werden nach der Trennung vorzugsweise m verschiedene Auffangbehalter überfuhrt.
Eine Vorrichtung zur Partikeltrennung m fluidischen Mikrosys- temen umfaßt insbesondere eine oder mehrere erste Aufnahmestruktur (en) mit Einrichtungen zum mindestens zeitweiligen Haltern der Partikel, insbesondere mit Elektrodeneinrichtungen zur Bildung einer Vielzahl von Funktionselementen (z.B. dielektrische Feldkafige) , eine oder mehrere insbesondere benachbarte, zweite Aufnahmestruktur (en) , die jeweils mit der ersten oder den ersten Aufnahmestruktur (en) über Offnungen verbunden ist oder sind, vorzugsweise an den Positionen der Funktionselemente, eine oder mehrere Lasereinrichtung (en) , die zur Bildung eines oder mehrerer optischer Käfige an jedem Funktions- element, insbesondere in jedem dielektrischen Feldkafig, ausgebildet ist oder sind, und einen oder mehrere Lichtmodulator (en), mit dem oder denen in jeder vorgegebenen Position der einzelne oder mehrere optische Käfige ein- oder ausgeschaltet werden kann oder können. Vorzugsweise können die optischen Käfige einzeln ein- oder ausgeschaltet werden. Des weiteren ist es bevorzugt, jeweils einen optischen Käfig an jedem Funktionselement zu bilden. Vorzugsweise weist die Vorrichtung eine oder mehrere Ladeeinrichtung (ein) zum Positionieren von Partikeln an den Funktionselementen auf.
Die Aufnahmestrukturen sind insbesondere Kanal- oder Kammerstrukturen des fluidischen Mikrosystems. Die Offnungen zwi-
sehen den Aufnahmestrukturen können mit Klappen zeitweilig verschließbar ausgebildet sein.
Gemäß einer ersten Ausfuhrungsform der Erfindung erfolgt die Übertragung der Zielpartikel durch Einschalten der optischen Käfige in oder hinter den Feldkäfigen oder Feldbarrieren mit den Zielpartikeln, Einfangen der Zielpartikel in den optischen Käfigen und Verschieben der optischen Käfige in die zweite Kanalstruktur, während die Restpartikel in der ersten Kanalstruktur bleiben. Die zweite Kanalstruktur liegt dabei entweder in y-Richtung parallel seitlich zu der ersten (relativ zur Fließrichtung des Partikelstroms) versetzt. In diesem Fall geschieht das Verschieben der in den optischen Käfigen gehaltenen Partikel durch Verschieben der Vorrichtung in xy-Richtung relativ zur optischen Achse des Laserstrahls. Oder die zweite Kanalstruktur liegt in z-Richtung entlang der optische Achse über der ersten Kanalstruktur. In diesem Fall geschieht das Verschieben der Partikel in die zweite Ebene durch Fokusverstellung der optischen Käfige.
Gemäß einer zweiten Ausfuhrungsform der Erfindung werden die Zielpartikel ebenfalls in den jeweiligen dielektrischen Feldkäfigen in optischen Käfigen gehalten, wahrend die Restpartikel in den übrigen dielektrischen Feldkafigen unbeleuchtet und somit frei von optischen Kräften bleiben. Zur Partikeltrennung werden sämtliche Feldkäfige derart verstimmt, daß dielektrische Abstoßungskräfte ausgebildet werden, die auf die Partikel in den Feldkäfigen hin zu der zweiten Kanalstruktur gerichtet sind. Darauf hin werden die Restpartikel in die zweite Kanalstruktur übertragen, wahrend die Zielpartikel unter Wirkung der optischen Kräfte trotz der Feldkäfigverstimmung in der ersten Kanalstruktur verbleiben.
Ein wesentliches Merkmal der Erfindung besteht in einer Kombination von parallelisierten Haltekräften, insbesondere elekt-
πschen Feldkraften, zur Positionskontrolle mit parallelisierten optischen Kräften zur Sortierung. Beliebige Positionen m der erfmdungsgemaßen Vorrichtung können durch den speziellen optischen Aufbau mit der Laserbestrahlung gleichzeitig adressiert werden, ohne die Vorrichtung zu bewegen. Die Kombination mit vervielfältigten Feldkafigen sieht die gleichzeitige Beobachtung und Bewertung einer großen Anzahl von Partikeln vor, die z.B. durch dielektrische Kräfte an vorbestimmten Positionen gehalten werden. Anschließend wird der Sortiervorgang durch die parallelisierte und adressierbare Laserbestrahlung für diese große Anzahl an Partikeln vorzugsweise in einem Schritt, d.h. gleichzeitig, vorgenommen. So wird ein hoher Durchsatz beim Sortieren ermöglicht. Das Ausbilden optischer Käfige an den Beobachtungsfeldern erfolgt über eine parallelisierte Optik zur gleichzeitigen Adressierung aller gewünschten Beobachtungsfelder .
Die Erfindung besitzt die folgenden Vorteile. Mit dem erfin- dungsgemaßen Prinzip des gleichzeitigen oder sukzessiven Ver- messens einer Vielzahl von Partikeln mit einer anschließenden gleichzeitigen oder sukzessiven Übertragung der Zielpartikel wird der Durchsatz der Partikeltrennung im Vergleich zu den herkömmlichen Techniken erheblich erhöht. Vorzugsweise erfolgt die Übertragung der Zielpartikel gleichzeitig. Die Vermessung der Partikel z. B. m den dielektrischen Feldkafigen kann schonend ohne nachteilige Auswirkungen auf die Partikel durchgeführt werden. Für die Vermessung steht genügend Zeit zur Verfugung, um die jeweils gesuchten Eigenschaften der Partikel zuverlässig zu ermitteln. Insbesondere das Aussortieren von selten vorkommenden Partikeln in einer großen Ausgangspopula- tion kann so mit hoher Zuverlässigkeit erfolgen, da alle Partikel einzeln adressierbar sind. Die dielektrischen Feldkafige oder Feldbarrieren trennen die einzelnen Partikel oder Gruppen von Partikeln wahrend der Prozedur räumlich voneinander. Die optischen Käfige ermöglichen ein Erfassen einzelner Partikel
ohne Ubersprechen auf andere Partikel. Damit wird die Trennscharfe der Partikeltrennung erheblich verbessert. Die Vermessung kann sich auf elektrische und/oder optische Eigenschaften der Partikel beziehen. Die Erfindung ist mit beliebigen Partikeln naturlichen oder synthetischen Ursprungs implementierbar, die in fluidischen Mikrosystemen manipulierbar sind. Ein weiterer Vorteil besteht in der Kompatibilität des Trennverfahrens mit der verfugbaren Mikrosystemtechnik.
Weitere Vorteile und Einzelheiten der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung der beigefugten Zeichnungen ersichtlich. Es zeigen:
Fig. 1 eine schematische Draufsicht eines Mikrosystems mit einer erflndungsge aßen Trennvorrichtung,
Fig. 2 eine schematische Seitenansicht eines Mikrosystems gemäß Fig. 1,
Fig. 3 eine schematische Draufsicht eines Mikrosystems mit einer weiteren erfmdungsgemaßen Trennvorrichtung,
Fig. 4A eine schematische Seitenansicht auf ein Mikrosystem gemäß Fig. 3 mit übereinander gelagerten Kanälen,
Fig. 4B eine schematische Draufsicht eines Mikrosystems mit nebeneinander gelagerten Kanälen,
Fig. 5 eine schematische Draufsicht eines Mikrosystems mit einer zweidimensionalen, flachigen Matrixanordnung von Feldkafigen und einem für die erfin- dungsgemaße Ausfuhrung typischen Stromungsprofll,
Fig. 6 eine schematische Draufsicht eines Mikrosystems mit einer zweidimensionalen, flächigen Matrixanordnung von Feldbarrieren, und
Fig. 7 eine schematische Draufsicht auf einen herkömmlichen Emzelpartikelverteiler (Stand der Technik) .
Eine erste Ausfuhrungsform der Erfindung, die m den Figuren 1 und 2 illustriert ist, basiert auf der Kombination von dielektrischen Feldkafigen mit verstellbaren optischen Käfigen. Eine erfmdungsgemaße Trennvorrichtung 200, die in ein fluidi- sches Mikrosystem 100 integriert ist, umfaßt eine Vielzahl dielektrischer Feldkafige 30, in denen mit der Lasereinrichtung 40 und der Optik 42 jeweils ein optischer Käfig mit verstellbarem Fokus 41 gebildet ist. Das Bezugszeichen 43 weist auf einen Lichtmodulator, mit dem die optischen Käfige in den Feldkafigen 30 selektiv ein- oder ausgeschaltet werden können.
Die Erzeugung optischer Käfige und deren Verwendung zur Manipulierung mikroskopisch kleiner Partikel ist an sich bekannt (s. z.B. A. Ashkm et al. in "Nature", Bd. 330, 1987, S. 796 ff., und G. Weber et al . in "International Review of Cytolo- gy", Bd. 133, 1992, S. 1 ff.). Einzelheiten des Laserbetriebs (z.B. Leistung, Wellenlange etc.) und der Strahlfokussierung können bei der Realisierung des erfmdungsgemaßen Systems auf der Grundlage der bekannten Techniken an die konkrete Trennaufgabe angepaßt werden.
Das Mikrosystem 100 umfaßt mindestens zwei Kanalstrukturen 10, 20. Die Kanalstrukturen 10, 20 umfassen jeweils Mikroka- nale oder Mikrokammern, z. B. offene Reservoire oder Vertiefungen wie m Nano- oder Mikrotiterplatten, mit anwendungsab- hangig gewählter Gestalt. Es sind auch Kombinationen aus Mik- rokanalen und Mikrokammern m einem Mikrosystem möglich. Vorzugsweise sind Mikrokanale vorgesehen. Beim dargestellten
Beispiel sind beispielsweise zwei in Betriebsfunktion übereinander angeordnete Kanäle vorgesehen. Sie können aber auch nebeneinander angeordnet sein (siehe Figur 4B) . Die Kanäle sind unter anderem aus Kunststoff-, Glas oder Halbleitermaterialien mit aus der Mikrosystemtechnik an sich bekannten Verfahren hergestellt und dazu ausgelegt, von Flüssigkeiten mit suspendierten Partikeln durchströmt zu werden. Vorzugsweise werden die in einer Flüssigkeit suspendierten Partikel mit einem Flussigkeitstransportsystem durch das Mikrosystem befordert. Die Kanäle besitzen charakteristische Dimensionen, die in Abhängigkeit von der Anwendung so gewählt sind, daß ein unbehinderter Suspensionsdurchsatz möglich ist. Dient das Mikrosystem beispielsweise der Manipulierung biologischer Zellen (charakteristische Große: 10 μm) , so besitzt jeder Kanal einen typischen Querschnitt, der großer als 10 μm ist und beispielsweise bis zu 50 μm betragt. Zum Trennen synthetischer Partikel (beads) , zum Beispiel bei Anwendungen in der kombinatorischen Chemie, können die Kanäle aber auch charakteristische Querschnittsdimensionen im Bereich von 100 bis 200 μm besitzen. Um eine optische Partikelvermessung in den Feldkafigen zu gewährleisten, werden die Wände des Mikrosystems 100 entsprechend mindestens teilweise transparent gestaltet .
In der ersten Kanalstruktur 10 des Mikrosystems 100 ist eine Vielzahl von Feldkafigen 30 gebildet. Jeder Feldkafig 30 umfaßt eine Gruppe von schematisch dargestellten Mikroelektroden 31, die an den Deck- und Bodenflachen der jeweiligen Kanalstruktur angebracht sind. Die Mikroelektroden 31 sind dazu ausgelegt, mit Hochfreguenzfeidern derart beaufschlagt zu werden, daß sich zwischen den Mikroelektroden 31 eine Feldverteilung ergibt, m der auf dielektrische Partikel Polarisations- krafte erzeugt werden, die die Partikel im Inneren des Feldka- figs halten. Einzelheiten des Aufbaus und der Ansteuerung von dielektrischen Feldkafigen und Feldbarrieren sind an sich be-
kannt (s. z.B. G. Fuhr et al. in "Electromanipulation of Cells", CRT Press Inc., 1996, S. 259 ff.).
Im Mikrosystem 100 ist ferner vorzugsweise eine Ladeeinrichtung 50 vorgesehen, die zur Verteilung von Partikeln auf die Feldkafige 30 der Trennvorrichtung 200 ausgelegt ist. Mit besonderem Vorteil wird eine Ladeeinrichtung 50 verwendet, deren Funktion im einzelnen unten erläutert wird. Diese Form der Ladeeinrichtung stellt jedoch kein zwingendes Merkmal der Erfindung dar und kann alternativ auch durch andere Lade- oder Aufreihglieder ersetzt werden. Es können auch mehrere Ladeeinrichtungen vorgesehen sein.
Die Beladung der Beobachtungspositionen oder -felder kann beispielsweise auch passiv durch Transport der Partikelsuspension über den laminaren Flussigkeitsstrom vorgenommen werden. Das Stromungsprofil in den Mikrokanalen der Vorrichtung ist nicht parabolisch, sondern verlauft über den größten Teil des Kanals - mit Ausnahme der äußersten Randbereiche - geradlinig (siehe Fig. 5), da der Kanal erheblich breiter ist, als hoch. So werden die Partikel über den größten Teil des Kanals gleichmaßig schnell transportiert und die Feldkäfige oder Feldbarrieren werden statistisch gleichmaßig beladen. Ablenkelektroden 63 am Rand des Kanals dienen dazu, Partikel aus den stromungsberuhigten Randzonen des Kanals in Zonen mit gleichförmiger Strömung zu befordern. Die Ablenkelektroden können dabei auch Teil von Feldkafig- oder Feldbarrierenelektroden sein. Sollte eine Beobachtungsposition einmal unbesetzt bleiben, ist dies für das weitere Verfahren unerheblich.
Die Kanalstrukturen 10, 20 sind, abgesehen von Offnungen 11 im Bereich jedes Feldkafigs 30, durch eine durchgehende Wandung voneinander getrennt. Die Aufgabe des Trennverfahrens besteht nun darin, ein in der ersten Kanalstruktur 10 entsprechend der
Pfeilrichtung A eingeströmtes Partikelgemisch 1 in Zielpartikel 2, die bei dieser Ausfuhrungsform der Erfindung in die zweite Kanalstruktur 20 übertragen werden sollen, und Restpartikel 3 zu trennen, die in der ersten Kanalstruktur 10 verbleiben sollen. So werden zunächst die Partikel einzeln oder gruppenweise, z.B. unter Verwendung der Ladeeinrichtung 50, in die in einer Reihe (siehe Fig. 1) angeordneten Beobachtungspositionen (Feldkafige oder Feldbarrieren) 30 geladen. Die Ladeeinrichtung 50 umfaßt beispielweise zwei gerade, an den oberen und unteren Kanalselten angeordnete, streifenformi- ge Mikroelektroden, die bei Beaufschlagung mit hochfrequenten elektrischen Feldern unter Wirkung negativer Dielektrophorese Abstoßungskrafte auf die anströmenden Teilchen ausüben und damit eine schräg zur Stromungsrichtung (Pfeil A) verlaufende Feldbarriere bilden. Hier werden beispielhaft einzelne Partikel betrachtet. Die Umsetzung der Erfindung mit Gruppen von Partikeln erfolgt analog. Der erste anströmende Partikel la lauft bei eingeschalteter Feldbarriere zunächst entlang der Pfeilrichtung B bis zum Ende der Ladeeinrichtung 50 und dann in den Feldkafig 30a (siehe Fig. 2) . In diesem Zustand ist der Feldkafig 30a auf der stromaufwärts gelegenen Seite offen, so daß der Partikel frei bis zum Mittelpunkt 31a des Feldkafigs 30a gelangt. Sobald das Eintreffen des Partikels zum Beispiel mit optischen oder elektrischen Mitteln erfaßt ist, wird der Feldkafig 30a auch auf der stromaufwärts gelegenen Seite geschlossen. Die übrigen Feldkafige 30b, 30c, ... werden analog durch Einstromen von Partikeln beladen. Die Ladeeinrichtung 50 wird synchron zum Beladungszustand der Feldkäfige betätigt. An der Ladeeinrichtung 50 sind ggf. weitere Aufreihglieder, Feldkafige oder Barrieren zur Anordnung der anströmenden Partikel vorgesehen .
Wenn alle Feldkafige beispielsweise mit einzelnen Partikeln beladen sind, erfolgt die Vermessung zur Bestimmung physikalischer und/oder biologisch-chemischer Parameter der Partikel.
Diese Vermessung erfolgt beispielsweise auf optischem Wege (zum Beispiel Fluoreszenz- oder Streulichtmessung) und/oder auf elektrischem Wege (zum Beispiel Elektrorotationsmessung in den Feldkafigen) . Vorzugsweise wird zu den optischen Messungen eine Lasereinrichtung verwendet, die auch zur Bildung der optischen Käfige ausgelegt ist. Es kann auch vorgesehen sein, mit der Suspensionsflussigkeit im Mikrosystem Zusatzstoffe zu den Feldkafigen zu spulen, deren Wechselwirkung mit den gehalterten Partikeln optisch und/oder elektrisch erfaßt wird. Die Feldkafige, in denen sich die Zielpartikel mit vorbestimmten Parametern befinden, werden zur Vorbereitung des folgenden Trennschrittes erfaßt.
Zur gleichzeitigen Übertragung der Zielpartikel in die zweite Kanalstruktur 20 wird der Lichtmodulator 43 derart betätigt, daß eine Laserbestrahlung in die erfaßten Feldkafige mit den Zielpartikeln freigegeben wird. Durch diese Bestrahlung wird jeweils ein optischer Käfig gebildet, dessen Fokus 41 mit dem Zentrum (z.B. 31a) des dielektrischen Feldkafigs 30 übereinstimmt. Die Zielpartikel werden in den optischen Käfigen wie mit einer Laserpinzette gefangen. Anschließend wird gleichzeitig für alle optischen Käfige der Fokus 41 durch die Öffnung 11 zwischen den Kanalstrukturen (Pfeil C) verschoben. Diese Verschiebung erfolgt beispielsweise durch Verstellung der Optik 42. Sobald die Zielpartikel mit dem verschobenen Fokus in die zweite Kanalstruktur 20 übertragen worden sind, wird mit dem Lichtmodulator 43 die Laserstrahlung abgeschaltet. Dadurch werden die Zielpartikel freigegeben, um einer weiteren Bewegung und/oder Bearbeitung der zweiten Kanalstruktur 20 unterzogen zu werden. Simultan werden die Feldkafige 30 m der ersten Kanalstruktur 10 auf der stromabwärts gelegenen Seite geöffnet, so daß die Restpartikel 3 ebenfalls freigegeben werden. Die Ziel- oder Restpartikel 2, 3 können jeweils einer oder mehreren weiteren Trennungen nach dem erläuterten Prinzip unterzogen werden, um eine Sortierung in eine Vielzahl von
Partikelgruppen vorzunehmen.
D e Trennvorrichtung 200 umfaßt insbesondere die Lasereinrichtung 40, deren Licht mit der Optik 42 zur Bildung des Fokus 41 gebündelt wird, und den Lichtmodulator 43. Die Lasereinrichtung 40 umfaßt eine Laserdiodenanordnung oder einen einzelnen Laser mit einer Strahlaufweitungsoptik. Es können auch mehrere Laserstrahlen zur Bildung jeweils eines optischen Käfigs vorgesehen sein. Bei der Laserdiodenanordnung sind eine Vielzahl von Laserdioden entsprechend der Position der Feldkafige oder Feldbameren im Mikrosystem ausgerichtet. Beim Einsatz eines einzelnen Lasers hingegen wird die gesamte Anordnung der Feldkafige mit dem einzelnen aufgeweiteten Strahl beleuchtet. Die Lasereinrichtung 40 wird vorzugsweise bei einer Wellenlange betrieben, die sich zur Ausbildung effektiver optischer Käfige bei möglichst geringer Lichtleistung besonders gut eignet. Bei den meisten Anwendungen wird die Wellenlange im infraroten oder roten Spektralbereich gewählt.
Der Lichtmodulator 43 ist ein Transmissions- oder Reflektions- Modulator. Als Transmissions-Modulator sind an sich bekannte Mikroshutteranordnungen verwendbar, bei denen eine Vielzahl von Mikroshuttern entsprechend der Position der Feldkafige ausgerichtet ist. Es werden mechanische Mikroshutter oder schaltbare Flussigkπstall-Anordnungen verwendet. Als Reflek- tions-Modulator kann eine schaltbare Matrix von Spiegelelemen- ten (sog. Digital Mirror Array) verwendet werden. Alternativ ist es bei Ausbildung der Lasereinrichtung 40 mit einer Laser- diodenanordnung auch möglich, den Lichtmodulator m die Lasereinrichtung 40 zu integrieren. In diesem Fall ist der Lichtmodulator eine Steuerschaltung, mit der die einzelnen Laserdioden individuell ein- oder ausgeschaltet werden können.
Die Optik 42 umfaßt eine Mikrolmsen-Anordnung aus einer Vielzahl von Mikrolmsen, die vorzugsweise entsprechend den Posi-
tionen der Feldkafige ausgerichtet sind. Es ist mit der erfin- dungsgemaßen Optik ferner möglich, mehrere Teilbereiche eines Feldkafigs parallel zu erfassen und Laserpinzetten auf diese Bereiche zu richten. Dies ist insbesondere von Vorteil, wenn Gruppen von Partikeln in den Feldkafigen enthalten sind und einzelne Partikel oder Untergruppen aus den Gruppen von Zieloder Restpartikeln 2, 3 den Beobachtungsfeldern übernommen werden sollen. An dieser Ausfuhrungsform besteht insbesondere für Anwendungen zur Anreicherung von Partikelarten Interesse. Die Mikrolmsenanordnung ist zur Verstellung des Fokus 41 vertikal beweglich angebracht, wie es an sich von Laserpinzetten bekannt ist.
Gemäß einer bevorzugten Ausfuhrungsform erfolgt die Vermessung der Partikel in den Feldkafigen unter Verwendung einer optischen Detektoreinrichtung, die beispielsweise durch einen Ar- ray-Detektor auf der Basis von CCD-, CID -(Charge Injection Device), CMOS-, APD - (Avalanche Photodiode) oder PD -(Photodiode) Anordnungen gebildet ist. Die Detektoreinrichtung wird vorzugsweise auf der relativ zur Lasereinrichtung 40 gegenüberliegenden Seite des Mikrosystems 100 angebracht. Die Detektorelemente der Detektoreinrichtung sind vorzugsweise für eine wellenlangenselektive Lichterfassung ausgelegt. Hierzu sind Filtereinrichtungen, die ggf. in die Detektoreinrichtung integriert sind, vorgesehen. Die wellenlangenselektive Messung dient insbesondere der Fluoreszenzmessung an den Partikeln.
Eine weitere Ausfuhrungsform der Erfindung, die ebenfalls mit der in den Figuren 1 und 2 illustrierten Anordnung implementiert werden kann, basiert auf der Kombination optischer Käfige mit verstellbaren dielektrischen Feldkafigen. Bei dieser Gestaltung werden zunächst, wie oben beschrieben wurde, die Partikel des Ausgangsgemisches 1 in den Feldkafigen 30 positioniert und vermessen. Um nun die Ziel- und Restpartikel voneinander zu trennen, wird in Abhängigkeit vom Meßergebnis für
eine Gruppe von Feldkafigen 30, die beispielsweise die Zielpartikel enthalt, mit dem Lichtmodulator 43 die Laserbestrahlung freigegeben. Dadurch wird jeder Zielpartikel in einem optischen Käfig gefangen. Zur Trennung der Partikel werden nun samtliche Feldkafige 30 derart verstimmt, daß eine resultierende dielektrische Kraft auf die Partikel durch die Öffnung 11 hin in die zweite Kanalstruktur 20 ausgeübt wird. Dieser Kraftwirkung folgen alle Partikel, die nicht zusatzlich durch den optischen Käfig gehaltert werden, so daß sich eine entsprechende Sammlung m der zweiten Kanalstruktur 20 ergibt. Die beleuchteten Partikel (z.B. Zielpartikel) bleiben in diesem Fall m der ersten Kanalstruktur 10. Nach Freigabe der optischen und dielektrischen Kräfte werden die Ziel- und Restpartikel m der ersten oder zweiten Kanalstruktur 10, 20 weiter transportiert.
Eine weitere abgewandelte Ausfuhrungsform der Erfindung, die entsprechend einem der beiden oben genannten Kombinationsprm- zipien betrieben werden kann, ist in den Figuren 3, 4A und 4B illustriert. Das Mikrosystem 100 enthalt wiederum zwei übereinander oder nebeneinander angeordnete Kanalstrukturen 10, 20 mit zumindest teilweise transparenten Kanalwanden. Auf den inneren Deck- und Bodenflachen der Kanalstrukturen s nd anwen- dungsabhangig gestaltete Mikroelektroden zur Erzeugung von Feldkafigen und/oder Barrieren ausgebildet. Im Unterschied zu der in Fig. 1 gezeigten Feldkaflgreihe umfaßt die Trennvorrichtung 200 bei dieser Ausfuhrungsform eine flachige Matrixanordnung von Feldkafigen 30 in geraden Reihen und Spalten. So sind mehrere Reihen von Beobachtungspositionen Stromungsrichtung hintereinander angeordnet. Dies hat einerseits den Vorteil, daß individuelle Partikel mehrmals hintereinander bewertet werden können, was die Zuverlässigkeit der Analyse und damit auch der Trennung betrachtlich verbessert. Auf der anderen Seite erhöht ein solches zweidimensionales Array an Beobachtungsfeldern erheblich den Durchsatz an Partikeln, die
gleichzeitig bewertet werden. Die Kanäle können übereinander oder nebeneinander angeordnet sein, wie dies in den Figuren 4A und 4B illustriert ist.
Eine weitere abgewandelte Ausfuhrungsform der Erfindung hinsichtlich der Form der Elektroden zur Ausbildung von Feldkafigen 60 zeigt die Figur 5. Hier werden die einzelnen Feldkafige durch Zinken- oder Kamm-artige Elektroden (61a, 61b, 61c...) gebildet. Die Partikel 62a, 62b, 62c... ordnen sich in einer solchen Anordnung in den Zwischenräumen der Zinken an. Diese Elektrodenform hat vor allem Vorteile hinsichtlich einer einfachen Elektrodenprozessierung mit verbundenen Zuleitungen.
Eine weitere Abwandlung der Erfindung ist m Figur 6 demonstriert. Hier werden keine vollständigen Feldkafige geformt, sondern Feldbameren 70 mithilfe von Elektroden, wie bei 70a, 70b, 70c... gezeigt. Die Partikel 71a, 71b, 71c... werden durch einen stetigen Flussigkeitsstrom 72 gegen die dielektrischen Feldbarrieren gedruckt und so an den jeweiligen Beobachtungspositionen gehalten.
Erfmdungsgemaß können verschiedene Richtungen der Bestrahlung durch die Lasereinrichtung 40 vorgesehen sein. Gemäß Fig. 4A erfolgt die Bestrahlung von der Unterseite des Mikrosystems, d.h. von der Seite der ersten Kanalstruktur 10 her. Dementsprechend besteht mindestens der Kanalboden 12 aus einem transparenten Material. Eine optische Vermessung der m den Feldkafigen 30 gefangenen Partikel kann ebenfalls von der Unterseite des Mikrosystems 100 her oder auch von der entgegengesetzten Seite her erfolgen. Das Licht von der Lasereinrichtung 40 wird wiederum über einen Lichtmodulator 43 und über eine Optik 42 m die Feldkafige 30 fokussiert.
Bei der m den Figuren 3 und 4A, B gezeigten Ausfuhrungsformen
ist als Ladeeinrichtung 50 eine Aufreihung von Feldkafigen vorgesehen. Die m der ersten Kanalstruktur 10 anströmenden Partikel 1 (zu trennendes Gemisch) werden zunächst m der Ladeeinrichtung 50 positioniert. Sobald jeder Feldkafig 51 der Ladeeinrichtung 50 einen Partikel enthalt, wird die gesamte Reihe der Feldkafige 51 und die benachbarte Reihe der Feldkafige 30a so angesteuert, daß die Partikel in die Feldkafige 30a übernommen werden. Anschließend werden die Feldkafige 51 der Ladeeinrichtung 50 erneut beschickt. Wiederum werden die Partikel an die Feldkafige 30a und von dieser zur Reihe der Feldkafige 30b weitergegeben, bis schrittweise alle Reihen der Feldkafige 30 gefüllt sind. Anschließend erfolgt die Vermessung und die Trennung der Partikel nach den oben erläuterten Prinzipien .
Ein wichtiger Vorteil der in den Figuren 1 bis 6 gezeigten Ausfuhrungsformen der Erfindung besteht darin, daß sämtliche dielektrischen Feldkafige gleichzeitig angesteuert werden. Dadurch werden Storfelder oder ein Ubersprechen zwischen den Feldkafigen vermieden, wodurch die Genauigkeit der erfmdungs- gemaßen Trennung insbesondere m Vergleich zu der unter Bezug auf Fig. 7 erläuterten herkömmlichen Technik erheblich verbessert wird.
Gemäß einer weiteren Ausfuhrungsform der Erfindung erfolgt die Partikeltrennung ausschließlich unter der Wirkung optischer Kräfte. Bei dieser (nicht dargestellten) Ausfuhrungsform werden die zu trennenden Partikel nicht dielektrischen Feldkafigen, sondern an mechanisch ausgebildeten Halterungen im Mikrosystem positioniert. Derartige Halterungen werden beispielsweise durch Locher m der Kanalwandung gebildet. Nach der Partikelvermessung wird die Gruppe der Zielpartikel m entsprechende optische Käfige aufgenommen und mit diesen von den Halterungen weg in die benachbarte Kanalstruktur gehoben.
Bei einer weiteren Abwandlung des oben erläuterten Trennprinzips ist vorgesehen, daß drei Kanalstrukturen zueinander benachbart angeordnet sind, wobei das Positionieren und Vermessen der Partikel in der mittleren Kanalstruktur und das Übertragen von Zielpartikeln in die benachbarten Kanalstrukturen erfolgt, indem zunächst eine erste Gruppe von Zielpartikeln z.B. m die obere Kanalstruktur und anschließend eine weitere Gruppe von Zielpartikeln die untere Kanalstruktur übertragen wird.
Gemäß einer weiteren Ausfuhrungsform der Erfindung werden die Partikel durch mechanische oder akustische Kräfte gehalten oder positioniert. Derartige Halterungen können z. B. mit Mik- romanipulatoren oder Ultraschalleinrichtungen gebildet werden.
Die in der vorstehenden Beschreibung, den Zeichnungen und den Ansprüchen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch m beliebiger Kombination für die Verwirklichung der Erfindung m ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein.