DE102004041941A1

DE102004041941A1 - Aufnahmeeinheit für biologische Objekte sowie Verfahren und Vorrichtung zur Verarbeitung in der Aufnahmeeinheit aufgenommener biologischer Objekte

Info

Publication number: DE102004041941A1
Application number: DE200410041941
Authority: DE
Inventors: Karin Dr. Schütze; Yilmaz Dr. Niyaz
Original assignee: PALM Microlaser Technologies GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2004-08-30
Filing date: 2004-08-30
Publication date: 2006-03-02
Anticipated expiration: 2024-08-31
Also published as: EP1805495A2; WO2006024392A3; WO2006024392A2; DE102004041941B4

Abstract

Es wird eine Aufnahmeeinheit für biologische Objekte bereitgestellt, welche ein plattenförmiges Element (1) mit einer Vielzahl von Öffnungen (2) umfasst. Diese Öffnungen sind insbesondere entsprechend den Öffnungen einer Mikrotiter- oder Multiwellplatte angeordnet. Hierdurch ist ein einfaches Einbringen von biologischen Objekten beispielsweise mittels Laser-Catapulting in das Aufnahmeelement und von dort in die Mikrotiter- oder Multiwellplatte möglich. Zudem wird eine Vorrichtung zur Wärmebehandlung von in der Aufnahmeeinheit befindlichen biologischen Objekten bereitgestellt.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Aufnahmeeinheit für biologische Objekte, welche insbesondere zur Aufnahme von mittels Laser-Mikrodissektion mit nachfolgendem Laser-Catapulting gewonnenen biologischen Objekten dienen kann. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren und Vorrichtungen zur Verarbeitung von in der Aufnahmeeinheit aufgenommenen biologischen Objekten, insbesondere zur Durchführung einer zyklischen Wärmebehandlung beispielsweise für eine Polymerase-Kettenreaktion („Polymerase Chain Reaction", PCR).

Das in der WO 97/29355 A der Anmelderin beschriebene so genannte „Laser Pressure Catapulting" (LPC) ist ein effizientes Verfahren zur Sortierung und zur Gewinnung von einzelnen biologischen Objekten, welche auf einem planaren Träger angeordnet sind. Insbesondere wird dabei ein selektiertes biologisches Objekt von einer umgebenden weiteren biologischen Masse durch einen Laserstrahl abgetrennt und das somit freipräparierte biologische Objekt anschließend mit Hilfe eines Laserimpulses von dem Träger zu einer Auffangvorrichtung katapultiert.

Zur Gewinnung einer größeren Anzahl von biologischen Objekten wird in der WO 01/73397 A1 der Anmelderin eine Vorrichtung vorgeschlagen, bei welcher biologische Objekte automatisch in eine Vielzahl von Behältern beispielsweise einer so genannten Mikrotiterplatte katapultiert werden. Eine derartige Vorrichtung ist in 8 vereinfacht dargestellt.

Bei der in 8 gezeigten Anordnung ist eine biologische Masse 35, beispielsweise eine Zellkultur, auf einem lichtdurchlässigen Objektträger 34 angeordnet. Über dem Objektträger 34 ist eine (als Ausschnitt im Querschnitt gezeigte) Mikrotiterplatte 30 derart angebracht, dass ihre Öffnungen zum Objektträger 34 hinweisen. Wie durch Pfeile B angedeutet, kann die Mikrotiterplatte 30 parallel zum Objektträger 34 verfahren werden.

Des Weiteren umfasst die Vorrichtung einen Laser 32, beispielsweise einen Stickstofflaser, dessen Laserstrahl 33 über eine (nicht dargestellte) Mikroskopoptik auf die biologische Masse 35 gerichtet und fokussiert werden kann. Die Mikroskopoptik dient dabei gleichzeitig zur optischen Kontrolle und zum Selektieren ausgewählter Abschnitte der biologischen Masse 35.

Die ausgewählten Abschnitte werden mit dem Laserstrahl 33 ausgeschnitten und dann durch einen gezielten Laserimpuls aus der biologischen Masse 35 hinauskatapultiert. Dieses Katapultierten kann derart gezielt erfolgen, dass das so herausgelöste biologische Objekt 36 in einer ausgewählten Vertiefung der Mikrotiterplatte 30 landet. Da der Abstand, über welchen ein gezieltes Katapultieren der biologischen Objekte 36 möglich ist (optimal bis zu 5 mm), begrenzt ist, ist es nötig, die Mikrotiterplatte bis zu einer entsprechenden Höhe mit einem Aufnahmemedium 31 zu befüllen, an welchem die biologischen Objekte 36 haften bleiben. Das durch das Aufnahmemedium 31 belegte Volumen steht für nachfolgende Prozesse nicht ohne weiteres zur Verfügung bzw. das Aufnahmemedium muss hierzu zuerst aufgelöst werden. Zudem sind für verschiedene Geometrien der Mikrotiterplatte 30 oder anderer Aufnahmeeinheiten mit einer Vielzahl von Vertiefungen wie so genannte Multiwellplatten eine jeweils unterschiedliche Füllhöhe des Aufnahmemediums 31 nötig. Des Weiteren hängt das für eine weitere Verarbeitung bzw. Analyse der biologischen Objekte 36 nötige Volumen von dem nachfolgenden Verarbeitungsverfahren ab. Daher müssen Mikrotiterplatten 30 individuell nach Dimensionen und späterem Verwendungszweck der biologischen Objekte mit dem Aufnahmemedium 31 befällt werden, was aufwändig ist.

Als Alternative können die biologischen Objekte 36 in einzelnen Auffangbehältern wie beispielsweise Reaktionsgefäßen aufgefangen werden und von dort beispielsweise mittels manuellem Pipetieren in entsprechende Mikrotiterplatten zur weiteren Probenverarbeitung bzw. -analyse überführt werden. Ein derartiges manuelles Pipetieren ist zeitaufwändig und birgt die Gefahr einer Kontamination der Probe.

Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Aufnahmeeinheit bereitzustellen, welche einen optimalen Abstand für das beschriebene Laser-Catapulting und eine einfache Weiterverarbeitung der entsprechend gewonnenen biologischen Objekte in handelsüblichen Mikrotiter- und Mikrowellplatte ermöglicht.

Zudem ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren und Vorrichtungen zur einfachen und effizienten Verarbeitung bzw. Analyse der in einer derartigen Aufnahmeeinheit aufgenommenen biologischen Objekte bereitzustellen. Insbesondere soll eine Vorrichtung zum insbesondere zyklischen Erwärmen von biologischen Objekten, welche in der Aufnahmeeinheit aufgenommen sind, bereitgestellt werden. Ein derartiges zyklisches Erwärmen wird beispielsweise zur Durchführung der Polymerase-Kettenreaktion („Polymerase Chain Reaction", PCR), einem Verfahren zum Vervielfältigen von DNA-Strängen, benötigt.

Diese Aufgaben werden gelöst durch eine Aufnahmeeinheit gemäß Anspruch 1, Anspruch 4 oder Anspruch 11, eine Vorrichtung gemäß Anspruch 22 bzw. ein Verfahren gemäß Anspruch 33. Die abhängigen Ansprüche definieren jeweils bevorzugte oder vorteilhafte Ausführungsbeispiele.

Erfindungsgemäß wird eine Aufnahmeeinheit für biologische Objekte vorgeschlagen, welche ein plattenförmiges Element mit einer Mehrzahl von von einer ersten Seite des plattenförmigen Elements zu einer zweiten Seite des plattenförmigen Elements hindurchgehenden Öffnungen zur Aufnahme der biologischen Objekte umfasst. Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung ist die Aufnahmeeinheit zum Zusammenwirken mit einem zugeordneten Vielbehälterelement, welches eine Mehrzahl von Behältern umfasst, ausgelegt, wobei die Öffnungen der Aufnahmeeinheit hierzu entsprechend Öffnungen der Behälter des Behälterelements angeordnet sind. Derartige Vielbehälterelemente können beispielsweise handelsübliche Mikrotiter- oder Multiwellplatten sein.

Gemäß einem vorteilhaften und bevorzugten zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung enthalten die Öffnungen ein Aufnahmemedium für biologische Objekte, beispielsweise ein Hydrogel oder eine Flüssigkeit. Das Aufnahmemedium kann dabei Mittel zur weiteren Verarbeitung oder Analyse eines aufgenommenen biologischen Objekts, beispielsweise Mittel zur Durchführung eines PCR-Verfahrens, enthalten.

Gemäß einem vorteilhaften und bevorzugten dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist auf einer Seite der Platte eine Folie aufgespannt, welche bevorzugt derart ausgestaltet ist, dass biologische Objekte auf der den Öffnungen zugewandten Seite der Folie haften bleiben. Die Folie kann gegebenenfalls chemisch oder physikalisch vorbehandelt werden. Für die Folie wird bevorzugt ein Material verwendet, dessen Festigkeit durch eine Behandlung, beispielsweise durch Bestrahlung mit ultravioletter Strahlung, verringert werden kann. Die Folie kann aber auch so dünn gewählt sein, dass sie ohne eine derartige Behandlung beispielsweise mittels einer Stanze abreißbar ist.

Die vorstehenden Aspekte der vorliegenden Erfindung sind selbstverständlich miteinander frei kombinierbar.

Allgemein ist das plattenförmige Element bevorzugt zwischen 1 und 3 mm dick und aus einem Kunststoff wie beispielsweise Polycarbonat gefertigt.

Eine derartige Aufnahmeeinheit mit einem plattenförmigen Element bietet den Vorteil, dass biologische Objekte beispielsweise mittels Laser Pressure Catapulting auf einfache Weise in die Öffnungen befördert werden können. Die Aufnahmeeinheit kann dann auf ein entsprechendes Vielbehälterelement platziert werden, und die biologischen Objekte können – beispielsweise durch Zentrifugieren oder durch Behandlung mit einer Stanze, welche auf die Öffnungen des plattenförmigen Elements abgestimmt ist – in Behälter des Vielbehälterelements befördert werden, um dort weiterverarbeitet zu werden. Es ist jedoch auch möglich, in dem plattenförmigen Element selbst zumindest eine erste Verarbeitung der biologischen Objekte durchzuführen. Dabei ist es besonders vorteilhaft, wenn das plattenförmige Element gemäß dem dritten Aspekt der Erfindung mit einer Folie bespannt ist, da so kleine Behälter gebildet werden.

Eine bevorzugte Anwendung hierbei ist die Durchführung der Polymerase-Kettenreaktion. Hierzu werden die benötigten Stoffe entweder in die Öffnungen gegeben, oder sie sind in einem gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung vorhandenen Aufnahmemedium bereits vorhanden. Bevorzugt wird dann das plattenförmige Element auch auf der anderen Seite mit einer Folie bespannt, um Verdunstungen zu verhindern. Diese Folie kann insbesondere eine Heizfolie zur Durchführung von Wärmezyklen oder eine wärmedurchlässige Folie sein. Im zweiten Fall wird die Aufnahmeeinheit dann in eine erfindungsgemäße Vorrichtung mit einem flächigen Heizelement gelegt, um zur Durchführung der Polymerase-Kettenreaktion nötige Wärmezyklen durchzuführen. Der Einsatzbereich der Vorrichtung ist dabei nicht auf erfindungsgemäße Aufnahmeeinheiten beschränkt, sondern die Vorrichtung kann prinzipiell zusammen mit beliebigen flächigen Aufnahmeeinheiten verwendet werden.

Die Erfindung wird im Folgenden unter Bezugnahem auf die beigefügte Zeichnung anhand bevorzugter Ausführungsbeispiele näher erläutert. Es zeigen:
1 eine Draufsicht auf ein erstes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßem Aufnahmeeinheit,
2 eine Querschnittsansicht entlang einer Linie A-A aus 1,
3 eine Querschnittsansicht eines zweiten Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Aufnahmeeinheit entsprechend der Querschnittsansicht von 2,
4A bis 4C Verfahrensschritte zur Gewinnung von biologischen Objekten unter Verwendung einer erfindungsgemäßen Aufnahmeeinheit,
5A und 5B Verfahrensschritte zum Verarbeiten von in der erfindungsgemäßen Aufnahmeeinheit befindlichen biologischen Objekten,
6 schematisch eine Vorrichtung zum Bespannen einer erfindungsgemäßen Aufnahmeeinrichtung mit einer Folie,
7 ein Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zum zyklischen Erwärmen der erfindungsgemäßen Aufnahmeeinheit und darin befindlicher biologischer Objekte, und
8 eine Vorrichtung zur Gewinnung von biologischen Objekten gemäß dem Stand der Technik.
In 1 ist eine Draufsicht auf ein erstes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Aufnahmeeinheit für biologische Objekte dargestellt. Die Aufnahmeeinheit besteht im Wesentlichen aus einer Platte 1, welche aus einem Kunststoff wie Polycarbonat gefertigt sein kann und bevorzugt eine Dicke zwischen 1 und 3 mm aufweist. Prinzipiell sind jedoch auch andere Materialien und Dicken der Platte 1 denkbar. Die Platte 1 weist eine Vielzahl von Öffnungen 2 auf, welche beim vorliegenden Ausführungsbeispiel in einer rechteckigen Matrix angeordnet sind und von einer Oberseite der Platte zu einer Unterseite der Platte hindurchgehen. Die Öffnungen 2 sind in Größe, Anzahl und Form derart gewählt, dass sie zu Behälteröffnungen eines Vielbehälterelements wie einer Mikrotiterplatte oder einer Multiwellplatte passen. Im Falle einer handelsüblichen Mikrotiterplatte mit 96 Behältern mit runden Behälteröffnungen, welche in acht Reihen à 12 Behältern angeordnet sind, würde die Platte 1 ebenso 96 Öffnungen 2 in acht Reihen à 12 Öffnungen umfassen, wobei Größe, Form und Position der Öffnungen der Größe, Position und Form der Öffnungen der Behälter der Mikrotiterplatte entsprechen würden. Gleiches gilt für so genannte Multiwellplatten oder andere Vielbehälterelemente. Die Platte kann zusätzlich eine Positionierhilfe bzw. -markierung, beispielsweise in Form einer Abschrägung 22, aufweisen. Mittels einer derartigen Positioniermarkierung kann die erfindungsgemäße Aufnahmeeinheit an einer ihr zugeordneten Vielbehältereinheit ausgerichtet werden. Zudem ist eine derartige Positioniermarkierung hilfreich, um Verwechslungen zwischen Öffnungen, welche sich in einander entsprechenden Positionen befinden, zu vermeiden.
Die Öffnungen 2 enthalten jeweils ein Aufnahmemedium 3. Wie insbesondere in der Querschnittsansicht aus 2 entlang einer Linie A-A aus 1 ersichtlich, kann das Aufnahmemedium 3 insbesondere die gesamte Fläche der Öffnungen 2, welche in 1 erkennbar ist, ausfüllen. Es ist aber auch denkbar, dass die Öffnungen 2 nur teilweise durch das Aufnahmemedium 3 gefüllt sind, oder dass das Aufnahmemedium 3 die Öffnungen 2 vollständig füllt.
Als Aufnahmemedium 3 eignet sich beispielsweise ein Hydrogel, wobei unter Hydrogel in diesem Zusammenhang jedwede Substand zu verstehen ist, welche mit Wasser kolloidale Dispersionen bilden kann und sich verfestigen kann, beispielsweise durch Gelieren. Ein Beispiel hierfür ist Agarose. Falls die Öffnungen 2 nicht zu groß sind, ist als Aufnahmemedium auch eine Flüssigkeit denkbar, welche durch Adhäsionskräfte an den Rändern der Öffnungen 2 haftet. Als Aufnahmemedium 3 kann beispielsweise auch jedwede chemisch inerte Substanz mit Haftvermögen verwendet werden.
Da, wie später beschrieben werden wird, das Aufnahmemedium 3 zur Aufnahme biologischer Objekte dient, welche anschließend weiterverarbeitet werden, ist es vorzuziehen, dass das Aufnahmemedium 3 bezüglich der geplanten Weiterverarbeitung des biologischen Objekts inert ist, also nachfolgende Analysereaktionen und dergleichen nicht beeinflusst. Alternativ kann das Aufnahmemedium auch Substanzen enthalten, welche der nachfolgenden Verarbeitung dienen. Beispielsweise können in einem Hydrogel als Aufnahmemedium Puffer oder Voransätze eingelagert sein.
Es ist noch darauf hinzuweisen, dass das Aufnahmemedium 3 je nach Haltbarkeit schon bei der Herstellung der Platten 1 oder erst kurz vor der Benutzung der Aufnahmeeinheit in die Öffnungen 2 gefüllt wird.
In 3 ist eine Querschnittsansicht eines zweiten Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Aufnahmeeinheit dargestellt, wobei die Ansicht derjenigen von 2 entspricht. Das zweite Ausführungsbeispiel aus 3 ist im Wesentlichen wie die Aufnahmeeinheit gemäß dem ersten Ausführungsbeispiel aufgebaut, das heißt sie umfasst eine Platte 1 mit Öffnungen 2 entsprechend dem ersten Ausführungsbeispiel. Im Unterschied zu diesem enthalten die Öffnungen der Platte 1 gemäß dem zweiten Ausführungsbeispiel kein Aufnahmemedium. Bei dem Ausführungsbeispiel von 3 ist weiterhin auf einer Seite (in 3 der Unterseite) der Platte 1 eine gegebenenfalls vorbehandelte Folie 4 über die Öffnungen 2 gespannt, um diese zu verschließen. Bevorzugt ist die Folie 4 dabei auf der den Öffnungen zugewandten Seite 2 haftend, so dass in die Öffnungen 2 beförderte biologische Objekte an der Folie 4 haften bleiben. Der Begriff „Folie" ist in diesem Zusammenhang breit auszulegen, es kann sich hier um eine einfache oder doppelte Membran oder auch um ein Material mit einer Dicke im Millimeterbereich handeln. Selbstverständlich sind das erste und das zweite Ausführungsbeispiel auch kombinierbar, das heißt es kann sowohl die Folie 4 als auch das Aufnahmemedium 3 vorgesehen sein. In diesem Fall muss die Folie 4 keine besonderen Hafteigenschaften aufweisen.
Die Folie 4 kann beispielsweise auf die Platte 1 auflaminiert sein.
Im Folgenden soll nun anhand der 4A bis 4C dargestellt werden, wie die erfindungsgemäße Aufnahmeeinheit zur Gewinnung und anschließenden Verarbeitung von biologischen Objekten einsetzbar ist.
In 4A ist dabei ein erster Schritt eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Gewinnung von biologischen Objekten dargestellt. Hierzu wird eine Vorrichtung entsprechend der bereits in der Beschreibungseinleitung unter Bezugnahme auf 8 beschriebenen verwendet, bei welcher eine biologische Masse 6 auf einem transparenten Objektträger 7 angeordnet ist. Mittels eines von einem Laser 8 erzeugten Laserstrahl 9 können Teile der biologischen Masse 6 ausgeschnitten werden und dann mit einem gezielten Laserimpuls in eine mit dem Aufnahmemedium 3 gefüllte Öffnung 2 der Aufnahmeeinheit aus 1 und 2 katapultiert werden. Die erfindungsgemäße Aufnahmeeinheit kann entsprechend Pfeilen B über dem Objektträger 7 verfahren werden, um eine Öffnung 2 auszuwählen, in welche ein jeweiliges biologisches Objekt 5 katapultiert werden soll. Das Verfahren des Laser Pressure Catapulting selbst ist in den in der Beschreibungseinleitung zitierten Druckschriften ausführlich erläutert und wird daher hier nicht näher beschrieben.
Gegenüber dem in der Beschreibungseinleitung unter Bezugnahme auf 8 beschriebenen Verfahren bietet der Einsatz der erfindungsgemäßen Aufnahmeeinheit den Vorteil einer optimalen Distanz für den Katapultvorgang. Zudem ist eine optische Kontrolle der in den Öffnungen 2 befindlichen biologischen Objekte 5 auf einfache Weise möglich, da sich die biologischen Objekte 5 nah genug an einem auch zur Fokussierung des Laserstrahls 9 benutzten (nicht gezeigten) Objektivs befinden, um auf diese scharfstellen zu können und sie somit durch das Objektiv beobachten zu können.
Generell können die biologischen Objekte jedoch auch auf andere Art und Weise in die Öffnungen 2 der Aufnahmeeinheit eingebracht werden, beispielsweise durch Pipettieren.
In einem nächsten Schritt, welcher in 4B dargestellt ist, wird die Aufnahmeeinheit dann auf eine zugeordnete Vielbehältereinheit, beispielsweise eine Mikrotiterplatte 10 mit einer Vielzahl von Behältern bzw. Vertiefungen 10A gesetzt. Dabei wird die Aufnahmeeinheit derart positioniert, dass jeweils eine Öffnung 2 über einer Vertiefung 10A angeordnet ist. Das Aufsetzen der Aufnahmeeinheit kann dabei sowohl wie dargestellte derart erfolgen, dass die biologischen Objekte 5 von der Mikrotiterplatte 10 abgewandt als auch ihr zugewandt sind. Prinzipiell ist es auch möglich, die in 4B dargestellte Kombination aus Aufnahmeeinheit und Mikrotiterplatte 10 in bereits verbundener Weise in eine Vorrichtung zum Laser Pressure Catapulting wie der in 4A gezeigten einzusetzen.
Daraufhin wird die in 4B gezeigte Anordnung in eine herkömmliche Mikrotiterzentrifuge eingesetzt. Beim Zentrifugieren werden die biologischen Objekte 5 zusammen mit dem jeweiligen Aufnahmemedium 3 in die jeweils zugeordneten Behälter 10A zentrifugiert, was zu dem in 4C gezeigten Ergebnis führt. Da das Aufnahmemedium 3 nur ein kleines Volumen aufweist, steht für nachfolgende Verarbeitungsschritte der biologischen Objekte 5 in der Mikrotiterplatte 10 im Wesentlichen das gesamte Volumen der Behälter 10A zur Verfügung. Da, wie bereits angesprochen, das Aufnahmemedium bevorzugt inert ist, stört es bei der folgenden Verarbeitung auch nicht. Die Platte 1 kann dann entweder – im Fall einer Einwegplatte – entsorgt werden oder nach einer entsprechenden Reinigung wieder mit Aufnahmemedium befällt werden, um wiederverwendet zu werden.
Alternativ zum Zentrifugieren ist es auch denkbar, das Aufnahmemedium 3 beispielsweise durch Erwärmen aufzulösen, so dass die biologischen Objekte 5 unter Einwirkung der Schwerkraft in die Behälter 10A fallen. Eine weitere Alternative stellt die Verwendung einer Stanze dar, welche die biologischen Objekte 5 zusammen mit dem jeweiligen Aufnahmemedium 3 in die zugeordneten Behälter 10A drückt. Eine derartige Stanze kann beispielsweise in Form einer Rolle mit entsprechenden Noppen vorliegen, welche den Öffnungen 2 angepasst sind, wobei die Rolle über die Platte 1 gerollt wird.
Falls nicht, wie in den 4A bis 4C gezeigt, das erste Ausführungsbeispiel aus 1 und 2, sondern das zweite Ausführungsbeispiel der Auffangeinheit aus 3 verwendet wird, ist es bei einer entsprechend dünn gewählten Folie 4 möglich, diese ebenfalls durch Zentrifugieren zusammen mit dem jeweiligen biologischen Objekt 5 in die Vertiefungen 10A überzuführen. Gegebenenfalls reißt die Folie 4 dabei nur teilweise und bleibt so an der Platte 1 hängen. Es ist auch denkbar, Folien zu verwenden, welche beispielsweise durch Bestrahlung mit ultravioletter Strahlung derart verändert werden können, dass sie brüchig werden, um das anschließende Zentrifugieren zu erleichtern. Schließlich ist auch bei Folien die Verwendung einer Stanze wie oben beschrieben möglich.
Es ist zu bemerken, dass anstelle der Mikrotiterplatte 10 auch ein einzelner Behälter, dessen Behälteröffnung mehrere Öffnungen 2 überdeckt, verwendet werden kann, falls mehrere biologische Objekte 5 in einem einzigen Behälter weiterverarbeitet werden sollen.
Im Falle des Ausführungsbeispiels von 3 ist es möglich, zumindest einen Teil der zur Verarbeitung der biologischen Objekte notwendigen Reaktionen direkt in der erfindungsgemäßen Aufnahmeeinheit durchzuführen. Ein Beispiel hierfür ist schematisch in 5A und 5B dargestellt. 5A zeigt dabei einen Ausschnitt aus der erfindungsgemäßen Aufnahmeeinheit von 3, nachdem sie mit biologischen Objekten 5 beladen wurden. In die einzelnen Öffnungen wird nun eine Verdauungslösung 11 gegeben, was dazu führt, dass die biologischen Objekte 5 „verdaut" werden, was dazu führt, dass beispielsweise einzelne DNA-Stränge 12 in der Lösung 11 vorliegen. Diese DNA-Stränge 12 können dann zusammen mit der Lösung 11 wie oben beschrieben in eine Mikrotiterplatte überführt werden.
Es kann auch zusätzlich oder alternativ zu dem in 5A und 5B gezeigten „Verdauen" der biologischen Objekte direkt in der erfindungsgemäßen Aufnahmeeinrichtung eine Polymerase-Kettenreaktion durchgeführt werden. Hierzu wird eine erfindungsgemäße Vorrichtung zum zyklischen Erwärmen von in der Aufnahmeeinheit aufgenommenen biologischen Objekten bereitgestellt.
Dabei wird vorteilhafterweise die erfindungsgemäße Aufnahmeeinheit aus 2 beidseitig bzw. die erfindungsgemäße Aufnahmeeinheit aus 3 auch auf der Oberseite mit einer Folie 4 bespannt, um Verdunstungseffekte während dem Erwärmen zu vermeiden. Eine geeignete Vorrichtung ist schematisch in 6 dargestellt. Hier wird eine Folie 4 von einer Rolle 13 abgewickelt und auf die Platte 1 der Aufnahmeeinheit gedrückt. Die Folie kann entweder Haftmittel umfassen, so dass sie selbsttätig an der Platte 1 haftet, oder es kann ein zusätzliches Haftmittel verwendet werden. Das Bespannen mit der Folie 4 kann automatisch in einer entsprechenden Vorrichtung oder auch manuell erfolgen.
Anstatt einer flexiblen Folie, welche von der Rolle 13 abgewickelt werden kann, ist auch eine dickere, starre Folie denkbar, welche auf die Platte 1 gelegt und an ihr z.B. durch Laminieren befestigt wird.
In 7 ist ein Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zum zyklischen Erwärmen einer erfindungsgemäßen Aufnahmeeinheit dargestellt. Die in 7 dargestellte Vorrichtung umfasst ein flächiges Heizelement 16 mit Öffnungen 17, welche den Öffnungen 2 der Platte 1 der erfindungsgemäßen Aufnahmeeinheit entsprechend angeordnet sind. Das flächige Heizelement 16 kann beispielsweise aus Peltier-Heizelementen aufgebaut sein. Es ist aber auch die Verwendung einer Heizfolie denkbar. Ist diese transparent, sind die Öffnungen 17 entbehrlich. Eine Steuereinheit 20 steuert bzw. regelt eine Temperatur des flächigen Heizelements 16. Hierzu kann beispielsweise ein gewünschter Temperaturverlauf vorgegeben werden. Beispielsweise werden für die Polymerase-Kettenreaktion typischerweise eine Mehrzahl von Heizzyklen mit Temperaturen zwischen ca. 96°C zum Auftrennen von doppelsträngiger DNA, 37°C bis 65°C zum Anlagern von so genannten Primern und DNA-Polymerase an die einzelnen DNA-Stränge und 65°C bis 80°C zur so genannten Elongation, bei welcher der jeweils fehlende zweite DNA-Strang erzeugt wird, durchlaufen.
Die bevorzugt mit zwei Folien 4 als Verdunstungsschutz bespannte Platte 1 wird direkt auf das flächige Heizelement 16 gelegt. In den Öffnungen 2 der Platte 1 befinden sich biologische Objekte 5 – gegebenenfalls nach einer „Verdauung" wie in 5A und 5B gezeigt –, das Auffangmittel 3 und/oder zusätzlich hinzugegebene Substanzen 21. Wird als Aufnahmemedium ein geeignetes Hydrogel verwendet, verflüssigt sich dieses während der beschriebenen Heizzyklen. Dabei ist es besonders vorteilhaft, wenn die für die durchzuführende Reaktion nötigen Substanzen, im Falle der Polymerase-Kettenreaktion insbesondere die DNA-Polymerase, in dem Hydrogel eingelagert ist. In diesem Fall werden diese Substanzen bei der Verflüssigung des Hydrogels freigesetzt. Hierdurch wird ein zusätzlicher Schritt, in welchem die Substanzen 21 in die Öffnungen 2 gegeben werden müssten, eingespart, was ein Kontaminationsrisiko verringert. Es ist aber auch möglich, zusätzlich oder alternativ benötigte Substanzen 21 in einem separaten Schritt vor dem in 6 gezeigten Bespannen mit Folie in die Öffnungen 2 zu pipetieren.
Zur Kontrolle der in den Öffnungen 2 der Platte 1 ablaufenden Reaktion ist eine Beleuchtungseinrichtung mit einer Lichtquelle 14 und einer Optik 15 vorgesehen, welche die Platte 1 bevorzugt über ihre gesamte Breite ausleuchtet. Des Weiteren ist eine Detektionseinrichtung 18 mit einer Auswerteeinheit 19 vorgesehen.
Im Falle der Polymerase-Kettenreaktion wird zur Echtzeitkontrolle der Detektion beispielsweise ein Fluoreszenzfarbstoff in die Öffnungen gegeben (entweder in das Aufnahmemedium eingelagert oder separat), beispielsweise SYBR-Green, welches während der Reaktion in die entstehenden DNA eingelagert wird. Dieser Farbstoff wird dann durch die Beleuchtungseinrichtung 14, 15 zur Fluoreszenz angeregt, welche durch die Öffnungen 17 in dem flächigen Heizelement 16 von der Detektionseinrichtung 18 detektiert werden. Die Intensität der Fluoreszenz ist dabei ein Maß für die Anzahl der erzeugten DNA-Stränge.
Dabei sind verschiedene Ausgestaltungen der Detektionseinrichtung 18 denkbar. Zum einen kann die Detektionseinrichtung 18 als einzelner flächiger Detektor ausgelegt sein, welcher die gesamte Fluoreszenz, welche in den Öffnungen 2 entsteht, misst. In diesem Fall kann durch die Auswerteeinheit 19 für jede der Öffnungen 2 der entsprechende Reaktionsverlauf bestimmt werden. Es ist jedoch auch denkbar, dass die Detektionseinrichtung 18 eine Vielzahl von Detektionsfeldern umfasst, wobei jedes Detektionsfeld einer Öffnung 2 der Platte 1 zugeordnet ist. Hiermit ist eine individuelle Erfassung des Reaktionsverlaufs in den einzelnen Öffnungen 2 möglich. Als Detektor kann hierbei beispielsweise eine CCD-Kamera zum Einsatz kommen. Bei dieser Variante ist es auch denkbar, dass das Fluoreszenzsignal mittels Glasfasern zu entsprechenden Detektoren geleitet wird. Schließlich ist es auch denkbar, dass die Detektionseinrichtung 18 als Scanner ausgestaltet ist, welche die einzelnen Öffnungen 2 z.B. mittels eines Objektivs sequenziell abrastert. Auch in diesem Fall kann die Auswerteeinheit 19 den Reaktionsverlauf für jede Kammer separat bestimmen.
Anstelle der gezeigten Durchlichtmessung der Fluoreszenz ist auch eine Reflektionsfluoreszenzmessung denkbar. In diesem Fall wäre die Beleuchtungseinrichtung 14, 15 auf derselben Seite der Platte 1 wie die Detektionseinrichtung 18 angeordnet.
Die dargestellte Vorrichtung zum zyklischen Heizen hat insbesondere den Vorteil, dass sie durch den Einsatz der erfindungsgemäßen Aufnahmeeinheit sehr kompakt und insbesondere flach ausgeführt werden kann, wobei eine gewünschte Reaktion in einer Vielzahl von Öffnungen 2 simultan stattfinden kann, was eine beträchtliche Zeitersparnis bedeutet.
Wird anstelle von Peltier-Elementen als flächiges Heizelement 16 eine Heizfolie verwendet, kann diese auch direkt als Ersatz für eine der Folien 4 auf die Platte 1 gespannt werden.
Um eine möglichst gute Verteilung der von dem flächigen Heizelement 16 erzeugten Wärme auf die Öffnungen 2 zu gewährleisten, ist es vorteilhaft, dass die Platte 1 sowie die Folien 4 aus einem hinreichend wärmeleitenden Material gefertigt sind. Für die Fluoreszenzmessungen sollten die Folien 4 zudem lichtdurchlässig sein.
Es ist zu bemerken, dass für die Verwendung in der Vorrichtung zum zyklischen Heizen aus 7 die Öffnungen 2 der Aufnahmeeinheit auch auf andere Weise als durch das beschriebene Laser-Catapulting mit biologischen Objekten 5 beladen werden können, beispielsweise durch Pipetieren.
Durch die Platz sparende Bauweise ist es möglich, die Vorrichtung aus 7 in einen Mikroskopaufbau zur Durchführung einer Laser-Mikrodissektion bzw. eines Laser-Catapultings zu integrieren, so dass sowohl die Gewinnung als auch die weitere Verarbeitung der biologischen Objekte in einer kompakten Vorrichtung durchgeführt werden kann. Hierzu kann beispielsweise das flächige Heizelement 16 in einer Halterung für die erfindungsgemäße Aufnahmeeinheit integriert sein.
Zudem kann die Vorrichtung die in 6 schematisch gezeigte Vorrichtung zum Bespannen der Platte 1 mit der Folie 4 umfassen.
Nach der Durchführung der Reaktion in der Vorrichtung aus 7 kann das Reaktionsprodukt, im Fall der Polymerase-Kettenreaktion auch als Amplifikat bezeichnet, entsprechend dem in 4A bis 4C gezeigten Verfahren in eine Mikrotiter- oder Multiwellplatte überführt werden und dort weiterverarbeitet bzw. analysiert werden.

Claims

Aufnahmeeinheit für biologische Objekte (5), mit einem plattenförmigen Element (1) mit einer Mehrzahl von von einer ersten Seite des plattenförmigen Elements (1) zu einer zweiten Seite des plattenförmiges Elements (1) hindurchgehenden Öffnungen (2) zur Aufnahme der biologischen Objekte, wobei die Öffnungen (2) entsprechend Behälteröffnungen von Behältern (10A) eines zugeordneten Vielbehälterelements (10) angeordnet sind.
Aufnahmeeinheit nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Form eines Querschnitts der Öffnungen (2) und/oder eine Anzahl der Öffnungen (2) einer Form bzw. einer Anzahl von Behälteröffnungen des zugeordneten Vielbehälterelements (10) entspricht.
Aufnahmeeinheit nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das zugeordnete Vielbehälterelement eine Mikrotiterplatte oder eine Multiwellplatte ist.
Aufnahmeeinheit für biologische Objekte, mit einem plattenförmigen Element (1) mit einer Mehrzahl von von einer ersten Seite des plattenförmigen Elements (1) zu einer zweiten Seite des plattenförmigen Elements (1) hindurchgehenden Öffnungen (2), und mit einem in den Öffnungen (2) angeordneten Aufnahmemedium (3) zur Aufnahme der biologischen Objekte.
Aufnahmeeinheit nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Aufnahmemedium (3) ein Haftmittel, insbesondere ein Hydrogel, umfasst.
Aufnahmeeinheit nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Aufnahmemedium (3) eine Flüssigkeit umfasst.
Aufnahmeeinheit nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Aufnahmemedium (3) eine Querschnittsfläche der Öffnungen (2) vollständig ausfüllt.
Aufnahmeeinheit nach einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Aufnahmemedium (3) Mittel zur Verarbeitung der aufgenommenen biologischen Objekte (5) umfasst.
Aufnahmeeinheit nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zur Verarbeitung der biologischen Objekten (5) Mittel zur Durchführung einer Polymerase-Kettenreaktion umfassen.
Aufnahmeeinheit nach einem der Ansprüche 4 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Aufnahmeeinheit nach einem der Ansprüche 1 bis 3 ausgestaltet ist.
Aufnahmeeinheit für biologische Objekte, mit einem plattenförmigen Element (1) mit einer Mehrzahl von von einer ersten Seite des plattenförmigen Elements (1) zu einer zweiten Seite des plattenförmigen Elements (1) hindurchgehenden Öffnungen (2) zur Aufnahme der biologischen Objekte, und mit einem auf der ersten Seite des plattenförmigen Elements (1) aufgebrachten Abdeckungsmittel (4), wobei das Abdeckungsmittel (4) derart aufgebracht ist, dass es die Öffnungen (2) abdeckt.
Aufnahmeeinheit nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Abdeckungsmittel (4) auf einer der zweiten Seite des plattenförmigen Elements (1) zugewandten Seite ein Haftmittel aufweist.
Aufnahmeeinheit nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Abdeckungsmittel (4) derart ausgestaltet ist, dass die Festigkeit des Abdeckungsmittels (4) durch Bestrahlung verringerbar ist.
Aufnahmeeinheit nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Abdeckungsmittel (4) lichtdurchlässig ist.
Aufnahmeeinheit nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Abdeckungsmittel (4) Heizmittel umfasst.
Aufnahmeeinheit nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Abdeckungsmittel eine vorzugsweise chemisch oder physikalisch behandelte Folie (4) umfasst.
Aufnahmeeinheit nach einem der Ansprüche 11 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Aufnahmeeinheit nach einem der Ansprüche 1 bis 10 ausgestaltet ist.
Aufnahmeeinheit nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass das plattenförmige Element (1) eine Dicke zwischen 1 und 3 mm aufweist.
Aufnahmeeinheit nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass das plattenförmige Element (1) aus einem Kunststoffmaterial gefertigt ist.
Aufnahmeeinheit nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass das Kunststoffmaterial Polycarbonat umfasst.
Aufnahmeeinheit nach einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Aufnahmeeinheit Positioniermittel (22) zur Positionierung der Aufnahmeeinheit auf einem zugeordneten Vielbehälterelement (10) aufweist.
Vorrichtung zur thermischen Behandlung von in Öffnungen einer Aufnahmeeinheit nach einem der Ansprüche 1 bis 21 befindlichen biologischen Objekten (5), mit Heizmitteln (16) mit einer Heizoberfläche, welche mindestens die Fläche der ersten Seite oder der zweiten Seite der Aufnahmeeinheit aufweist, wobei die Aufnahmeeinheit mit ihrer ersten bzw. zweiten Seite flächig an der Heizoberfläche anlegbar ist, und mit Steuermitteln (20) zur Steuerung eines vorgegebenen Temperaturverlaufs der Heizmittel (16).
Vorrichtung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Heizmittel (16) Peltier-Elemente umfassen.
Vorrichtung nach Anspruch 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Heizmittel (16) eine Heizfolie umfassen.
Vorrichtung nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Heizfolie derart ausgestaltet ist, dass sie zur Abdeckung der Öffnungen (2) der Aufnahmeeinheit an der Aufnahmeeinheit befestigbar ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 22 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Heizmittel (16) zumindest an Orten, an welchen beim flächigen Anlegen der Aufnahmeeinheit an den Heizmitteln Öffnungen (2) der Aufnahmeeinheit positioniert sind, lichtdurchlässig ist.
Vorrichtung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Heizmittel (16) transparent sind.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 22 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung Beleuchtungsmittel (14, 15) zum Beleuchten der biologischen Objekte (5) in der Aufnahmeeinheit umfasst.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 22 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung Detektionsmittel (18) zur Detektion einer Leuchtemission in der Aufnahmeeinheit umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionsmittel eine Mehrzahl von Detektionseinheiten umfassen, wobei jeweils eine Detektionseinheit einer Öffnung (2) der Aufnahmeeinheit zugeordnet ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 22 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung Mittel (13) zur Bedeckung von Öffnungen (2) der Aufnahmeeinheit mit einem Abdeckungsmittel (4) umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass das Abdeckungsmittel eine Folie (4) umfasst.
Verfahren zur Gewinnung von biologischen Objekten (5), wobei ein biologisches Objekt (5) in eine Öffnung (2) einer Aufnahmeeinheit nach einem der Ansprüche 1 bis 21 eingebracht wird, wobei die Aufnahmeeinheit mit einem Behälterelement derart gekoppelt wird, dass die das biologische Objekt (5) enthaltende Öffnung (2) der Aufnahmeeinheit mit einer Behälteröffnung des Behälterelements (10) korrespondiert, und wobei das biologische Objekt (5) von der Öffnung (2) in das Behälterelement überführt wird.
Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass das Behälterelement (10) eine Vielzahl von Behältern (10A) mit jeweiligen Behälteröffnungen umfasst, wobei jede Öffnung (2) der Aufnahmeeinheit mit jeweils einer Behälteröffnung korrespondiert.
Verfahren nach Anspruch 33 oder 34, dadurch gekennzeichnet, dass das biologische Objekt (5) durch Zentrifugieren in das Behälterelement (10) überführt wird.
Verfahren nach Anspruch 33 oder 34, dadurch gekennzeichnet, dass das biologische Objekt (5) durch mechanische Einwirkung in das Behälterelement (10) überführt wird.
Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass die mechanische Einwirkung durch eine Stanze ausgeübt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 33 bis 37, dadurch gekennzeichnet, dass das biologische Objekt (5) durch einen gezielten Laserimpuls in die Öffnung (2) eingebracht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 33 bis 38, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Koppeln der Aufnahmeeinheit mit dem Behälterelement (10) eine Reaktion unter Beteiligung des mindestens einen biologischen Objekts (5) in der Aufnahmeeinheit durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion eine Verdauungsreaktion umfasst.
Verfahren nach Anspruch 39 oder 40, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion eine Polymerase-Kettenreaktion umfasst.
Verfahren nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerase-Kettenreaktion in einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 22 bis 32 durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 33 bis 42, dadurch gekennzeichnet, dass das Behälterelement (10) eine Mikrotiterplatte oder eine Multiwellplatte ist.