DE102013209455B4 - Probenfänger zum Auffangen eines Laser-Mikrodissektats - Google Patents

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Abstract

Laser-Mikrodissektat-Probenfänger (1) für eine Laser-Mikrodissektionseinrichtung, wobei der Probenfänger eine Auffangkammer (10) zur Aufnahme eines Dissektats (111) umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass
die Auffangkammer (10) probenseitig eine zur Umgebung offene Öffnung zur Aufnahme des Dissektats (111) aufweist, die Auffangkammer (10) ein erstes Ventil (102, 122) aufweist, das im geschlossenen Zustand einen probenabgewandten Abschluss der Auffangkammer (10) zur Rückhaltung des Dissektats (111) bildet, und
dass stromabwärts des ersten Ventils (102, 122) eine Kapillarleitung (107) angeordnet ist, die zum Transport des Dissektats (111) aus der Auffangkammer (10) mit letzterer in Verbindung steht,
wobei der Laser-Mikrodissektat-Probenfänger (1) derart eingerichtet ist, dass er probenseitig eines Objektträgers (103) eines Mikroskoptisches (205) einer Laser-Mikrodissektionseinrichtung (200) angeordnet werden kann.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen Laser-Mikrodissektat-Probenfänger für eine Laser-Mikrodissektionseinrichtung und eine solche Laser-Mikrodissektionseinrichtung.
  • Stand der Technik
  • Bei der Laser-Mikrodissektion werden mit Hilfe eines fokussierten Laserstrahls ausgewählte Gewebebereiche oder Zellen aus mikroskopierten Gewebeproben für die weitere Analyse herausgetrennt bzw. herausgeschnitten („dissektiert“).
  • Die DE 100 18 253 C2 , die DE 10 2005 028 062 B4 und die DE 10 2005 008 925 A1 der Anmelderin beschreiben mögliche Verfahren und Systeme zur Laser-Mikrodissektion unter Einsatz eines Mikroskops.
  • Kapillarbasierte Analysegeräte sind so weit fortgeschritten, dass aus Gewebe herausgelöste Einzelzellen oder sogar Chromosomen in Tröpfchen oder Lösung durch Kapillarsysteme transportiert, sortiert, analysiert und auch nach Analysen weiter verwertet werden können. Die kapillarbasierten Analysetechniken werden beispielsweise von den Firmen Fluidigm (http://www.fluidigm.com/) und RainDance Technologies (http://www.raindancetechnologies.com/) angewandt und vorangetrieben.
  • Um mit diesen Techniken analysiert werden zu können, müssen die Proben und Einzelzellen zunächst separiert werden; dies kann durch fluoreszenzbasierte Durchflusszytometrie, Laser-Mikrodissektion und Umpipettieren in ein entsprechendes Zuführmedium für die Kapillarsysteme erfolgen.
  • Für bei der Laser-Mikrodissektion ausgeschnittene sogenannte „Dissektate“ stehen verschiedene Auffänger zur Verfügung, beispielsweise sogenannte „tube-caps“, 8er-Streifen, 8er-Streifen-Deckel oder sogenannte „Westentaschenlabors“ (englisch auch „Lab on a Chip“), z.B. AmpliGrid-Vorrichtungen. Nach dem Laser-Mikrodissektionsprozess werden diese Auffänger der Dissektionsmaschine physisch entnommen und separat weiterverarbeitet. Dazu sind in der Regel Zentrifugations- und Pipettierschritte notwendig, bis das Dissektat in entsprechender Lösung einem Analyseverfahren, wie der Polymerase-Kettenreaktion (engl.: Polymerase Chain Reaction, PCR), der Reverse-Transkriptions-PCR (RT-PCR) oder Echtzeit- bzw. quantitativen PCR (rt-/qPCR) oder der Massenspektrometrie (MS), zugeführt werden kann.
  • Diese Vorgehensweise hat den Nachteil, dass die Möglichkeiten für eine automatisierte Probenweiterverarbeitung direkt nach Isolation mittels Laser-Mikrodissektion stark eingeschränkt sind. Zudem beinhalten die nötigen aufwendigen Zentrifugations- und Pipettierschritte ein hohes Kontaminations- und Probenverlustrisiko.
  • Aus der EP 2 083 257 A1 sind ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Übertragen einer mikroskopischen, isolierten Probe bekannt. Dabei wird ein Nanosauger über einer Probe positioniert, die aus einem Probenkörper auf einem Objekttisch ausgeschnitten wurde. Der Nanosauger saugt aktiv die Probe vom Objekttisch an, ehe er verschwenkt wird und die Probe anschließend an anderer Stelle wieder abbläst. So kann die Probe beispielsweise in ein Reaktionsgefäß überführt werden. Vor dem Ansaugen kann die Probe jedoch nicht oder zumindest nur unzureichend visuell inspiziert werden, weil sie noch von dem verbliebenen Probenkörper, aus dem sie ausgeschnitten wurde, umgeben ist.
  • Die DE 10 2009 016 512 B4 offenbart eine Laserablationskammer bestehend aus einem Behälter, der von oben gasdicht mit einem Deckglas verschlossen werden kann, auf dessen Unterseite sich die zu untersuchende Probe befindet. Der Behälter weist eine Zuführleitung und eine Abführleitung für ein Transportgas (beispielsweise Argon) auf. Zunächst erfolgt eine Untersuchung der Probe mit einer Bestimmung der mittels Laserablation zu entfernenden Bereiche. Diese Untersuchung wird mit einem Lasermikrodissektionsgerät unter Ausnutzung der hochauflösenden Optik eines solchen Geräts vorgenommen. Nach Bestimmung entsprechender Bereiche werden diese mittels Laserablation aus der Probe gelöst und durch Zufuhr des Transportgases aus dem gasdichten Behälter beispielsweise in eine Analytikeinrichtung, wie ein Massenspektrometer, transportiert. Je nach Analyseergebnis können weitere Probenbereiche analysiert werden. Hierzu kann die bekannte Lasermikrodissektion eingesetzt werden, die es ermöglicht, mit hoher Präzision Probenausschnitte im Submikrometerbereich zu dissektieren. Die beschriebene Laserablationskammer wird für die Lasermikrodissektion durch herkömmliche Probenbehälter für die Lasermikrodissektion ersetzt.
  • Die DE 103 29 674 A1 stellt sich zur Aufgabe, Nachteile der UV-Ablation, wie die Absorption von UV-Strahlung in biologischem Gewebe oder die geringe Schnittqualität, zu überwinden. Zum Schneiden von biologischem Material wird hier der Einsatz ultrakurzer Laserpulse im Piko- oder Femtosekundenbereich mit Folgefrequenzen von mindestens 1000 Hz bei einer Laserwellenlänge größer 400 nm (nahes Infrarot) vorgeschlagen, wobei der Laser auf die Probe fokussiert wird, um dort hohe Intensitäten von mindestens 1012 W/cm2 zu erzeugen. Hierdurch wird eine sogenannte nicht-resonante Multiphotonen-Absorption erzielt, die zur Schneidwirkung ein Plasma erzeugt. In einem Ausführungsbeispiel wird das herausgeschnittene biologische Material durch Gravitationswirkung von der umgebenden Probe getrennt und fällt auf ein mit Lysin beschichtetes Deckglas. Hierbei ist beispielsweise die Probe mit der sie tragenden Folie auf die Unterseite eines Glasfensters aufgebracht. Ein Silikonring verbindet das Glasfenster mit dem Lysin beschichteten Deckglas. Das herausgeschnittene biologische Material kann beispielsweise durch Einführung von zwei Kanülen durch den Silikonring entweder abgesaugt oder mittels hydrodynamischem Fluss herausgespült und mittels steriler Filter aufgefangen werden. Das obere Glasfenster, der Silikonring und das untere Deckglas zum Auffangen des herausgeschnittenen Materials bilden insgesamt eine geschlossene sterile Kammer.
  • Die DE 100 57 292 C2 betrifft eine Vorrichtung zum Aufnehmen von Mikrodissektaten mit mehreren Behältnissen, wobei zwischen der Öffnung eines Behältnisses und der Probe eine Kontaminationsschutzplatte vorhanden ist, so dass jeweils immer nur ein Behältnis zum Auffangen eines Mikrodissektats aus der Probe offen ist, während die übrigen Behältnisse von der Kontaminationsschutzplatte abgedeckt sind.
  • Ein kapillarbasiertes Analysegerät offenbart die US 2007/0095669 A1 . Hier sollen Mikro- oder Nanopartikel, wie einzelne Zellen, manipuliert werden. Die Manipulation erfolgt hier optoelektronisch über dielektrophoretische Kräfte, die auf die Mikro-Partikel wirken. Eine optoelektronische Manipulationseinrichtung zum Identifizieren und Sortieren von Mikro-Partikel weist eine abgeschlossene Kammer mit einem Einlassventil und einem Auslassventil auf. Auszusortierende Zielzellen werden über eine Leitung aus der Kammer aussortiert und in einem Reservoir gesammelt, das seinerseits mit einem Auslassventil versehen ist. Das Vorgehen der Identifikation von Ziel-Partikel mittels eines Lichtstrahls, der die Kammer abscannt und des anschließenden Aussortierens der Ziel-Partikel aus den übrigen Partikeln ist anhand der 9A bis 9H dieser Druckschrift beschrieben. Nachdem die Ziel-Partikel in dem Reservoir angesammelt sind, werden die übrigen Partikel, die in der Kammer verblieben sind, herausgespült. Die Ziel-Partikel können dann einer weiteren Analyse zugeführt werden.
  • Die DE 10 2009 016 512 B4 offenbart eine gasdicht abgeschlossene Laserablationskammer, deren obere Seite von dem Objektträger gebildet ist, auf dessen Unterseite sich die Probe befindet. Zu- und Abführungsleitungen für ein Transportgas, das die Kammer senkrecht zur Gravitationsrichtung durchströmt, sind vorgesehen.
  • Der vorliegenden Erfindung stellt sich daher die Aufgabe, eine automatisierte Probenverarbeitung nach erfolgter Laser-Mikrodissektion, insbesondere mit der Möglichkeit einer Visualisierung bzw. Detektion des Dissektats, zu ermöglichen.
  • Offenbarung der Erfindung
  • Die Aufgabe wird gelöst durch einen Laser-Mikrodissektat-Probenfänger für eine Laser-Mikrodissektionseinrichtung und durch eine solche Einrichtung gemäß den unabhängigen Patentansprüchen. Bevorzugte Ausführungsformen werden in den jeweiligen Unteransprüchen und der nachfolgenden Beschreibung offenbart.
  • Der erfindungsgemäße Laser-Mikrodissektat-Probenfänger weist eine inspektionsfähige Auffangkammer zum Aufnehmen eines Dissektats auf, wobei diese Auffangkammer probenseitig eine zur Umgebung im Wesentlichen offene Öffnung zur Aufnahme des Dissektats umfasst. Weiterhin weist die Auffangkammer ein erstes Ventil auf, das im geschlossenen Zustand einen probenabgewandten Abschluss (oder Boden) der Auffangkammer zur insbesondere temporären Rückhaltung des Dissektats bildet. Stromabwärts des ersten Ventils ist eine Kapillarleitung angeordnet, die zum Transport des Dissektats (bei geöffnetem Ventil) aus der Auffangkammer mit dieser Auffangkammer in Verbindung steht.
  • Im folgenden sollen die Begriffe „stromabwärts“ und „stromaufwärts“ sich auf eine Strömungsrichtung beziehen, die von der probenseitigen Öffnung der Auffangkammer über das erste Ventil in Richtung Kapillarleitung gerichtet ist, so dass die Strömungsrichtung folglich den Transportweg des Dissektats beschreibt.
  • Unter „einer zur Umgebung im Wesentlichen offenen Öffnung“ der Auffangkammer sei verstanden, dass die Auffangkammer nicht gas- oder flüssigkeitsisoliert abgedichtet ist.
  • Die vorliegende Erfindung hat den Vorteil, dass der erfindungsgemäße Probenfänger eine ausgeschnittene Probe (ein Dissektat) auffangen, auf dem durch das geschlossene erste Ventil gebildeten Boden zunächst zurückhalten und anschließend weiter zur und durch die Kapillarleitung lenken kann, ohne dass ein manueller Arbeitsschritt erforderlich ist. Zwischen dem Auffangen und dem Weiterlenken des Dissektats kann dieses gegebenenfalls visuell inspiziert oder detektiert werden. Nach seinem Weiterleiten kann das Dissektat der Analyse zugeführt werden. Insbesondere muss der Probenfänger für das Weiterleiten nicht manuell entnommen und/oder geneigt werden. Auf diese Weise wird eine Automatisierung der Probenverarbeitung ermöglicht, was den Arbeitskomfort verbessert und Arbeitszeiten verringert. Zudem können durch manuelle Arbeitsschritte begünstigte Kontamination und/oder Materialverlust vermieden oder zumindest reduziert werden. Insbesondere kann die Probe durch Verwendung geeigneter Puffer oder Lösungsmittel zum Spülen direkt nach dem Dissektionsprozess geschützt und der Analyse zugeführt werden.
  • Die Auffangkammer kann ein Teil der inneren Oberfläche des Probenfängers sein. Die Verbindung der Auffangkammer mit der Kapillarleitung kann in Form eines direkten Anschlusses, der das erste Ventil umfasst, vorliegen. Auffangkammer und Kapillarleitung können dabei als Segmente eines gemeinsamen, einzelnen Bauteils gefertigt sein, beispielsweise aus Glas oder Kunststoff. Solche Segmente können aneinander anschließen, oder das Bauteil kann einen (Ventil-) Abschnitt aufweisen, der zwischen den beiden genannten Segmenten angeordnet ist. Alternativ können die Auffangkammer und die Kapillarleitung als separate Bauteile oder Teilstücke separater Bauteile vorliegen, die direkt oder über ein oder mehrere Verbindungsteil(e) (erstes Ventil) miteinander verbunden sind. Die separaten Bauteile können aus demselben Material oder denselben Materialien bestehen. Alternativ kann mindestens eines der Bauteile mindestens ein Material enthalten, das im anderen Bauteil nicht enthalten ist.
  • Die Kapillarleitung kann eine Kapillare oder ein Röhrchen sein.
  • Die Auffangkammer kann beispielsweise dazu dienen, mehrere Dissektate zu sammeln, um sie dann gemeinsam über das erste Ventil durch die Kapillarleitung zu leiten und von dort weiteren Reaktionsprozessen verfügbar zu machen. Eine derartige Auffangkammer erlaubt oder erleichtert darüber hinaus ein Hinzufügen einer Transport-/Trägersubstanz, wie einer Flüssigkeit, beispielsweise zum Ausspülen des Dissektats durch die Ablaufleitung.
  • Dabei kann beispielsweise ein zweites Ventil vorgesehen sein, das die Auffangkammer wahlweise so verschließt oder öffnet, dass nur bei geöffnetem Ventil ein Dissektat oder anderes Material in die Auffangkammer fallen kann. Insbesondere kann damit nach dem Auffangen des Dissektats durch Schließen des zweiten Ventils ein Eindringen von Fremdmaterial, wie Schmutzpartikeln in die Auffangkammer verhindert werden. Das zweite Ventil bildet dann im geschlossenen Zustand einen probenseitigen Abschluss („Deckel“) der Auffangkammer.
  • Mit dem ersten Ventil kann der Transport des Dissektats aus der Auffangkammer und durch die Kapillarleitung kontrolliert werden. So kann der Zeitpunkt kontrolliert werden, zu dem ein Dissektat durch die Kapillarleitung gelenkt und der weiteren Probenverarbeitung bzw. -analyse zugeführt wird. Beispielsweise kann das Dissektat nach seinem Ausschneiden und vor seinem Transport aus der Auffangkammer zunächst visuell durch einen Verwender inspiziert werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform können bzw. kann die Auffangkammer und/oder die Kapillarleitung mindestens einen Injektor aufweisen, mit dem eine Flüssigkeit oder sonstige Transportsubstanz zugeführt werden kann. Dadurch ist es beispielsweise möglich, eine Flüssigkeit zum Transport des Dissektats durch die Kapillarleitung zuzugeben. Alternativ oder zusätzlich kann eine für die weitere Probenverarbeitung geeignete Stoffzugabe erfolgen, beispielsweise ein geeigneter Puffer, ein Lösungsmittel, eine mizellenbildende Flüssigkeit oder Ähnliches. Beide Arten von zugeführten Substanzen sollen im Folgenden unter dem Begriff „Trägersubstanz“ zusammengefasst werden.
  • Sofern der Probenfänger eine Auffangkammer mit zwei Ventilen wie oben beschrieben umfasst, ist es vorteilhaft, wenn ein Injektor zwischen den Ventilen angeordnet ist. Dies erlaubt es, die Auffangkammer vor der Zugabe einer Substanz zu verschließen, so dass beispielsweise keine Gerüche oder Dämpfe der Substanz austreten können oder die Substanz nicht verunreinigt wird.
  • Der Probenfänger kann einen Dispenser umfassen, der vorzugsweise zwischen der Auffangkammer und der Kapillarleitung angeordnet ist.Der Dispenser ist vorzugsweise stromabwärts der Auffangkammer angeordnet.
  • Ein derartiger Dispenser ermöglicht es, das Dissektat in einen Flüssigkeitstropfen einzuschließen. Einzelne Tropfen können dann vorzugsweise in der Ablaufleitung sortiert werden. Beispielsweise können Tropfen, die ein Dissektat enthalten, von anderen Tropfen getrennt werden. Tropfen ohne Dissektat können dann beispielsweise einer Wieder- oder Weiterverwertung (beispielsweise durch neues Injizieren mit einem Injektor des Probenfängers) zugeführt werden, wohingegen Tropfen mit Dissektat Analyseoperationen zugeleitet werden können.
  • Mit einer Kapillarleitung können kleinste Volumina von Flüssigkeiten transportiert werden. Die Kapillarleitung kann eine Verzweigung aufweisen. Die Verzweigung kann als Sortierkreuzung ausgebildet sein, an der Tropfen mit Dissektat automatisch (beispielsweise mittels eines elektrischen Feldgradienten) von Tropfen ohne Dissektat getrennt werden können. Dadurch kann die Konzentration von Dissektaten in einer Analyselösung erhöht und damit die Analyse etwa mittels DNA-Anreicherung verbessert werden. Bei Verwendung einer Sortierkreuzung kann eine abgehende Kapillarleitung zum Transport von Dissektat dienen, während eine andere abgehende Kapillarleitung Trägersubstanz zu einem Reservoir zurückleitet, das dann mittels einer Pumpe beispielsweise über einen Injektor der Auffangkammer zugeführt werden kann.
  • In einer zweckmäßigen Ausführungsform kann stromaufwärts der Öffnung der Auffangkammer eine inspektionsfähige Abflusseinrichtung angeordnet sein, deren Abfluss mit der Öffnung der Auffangkammer in Verbindung steht. In diesem Fall fällt das Dissektat nicht unmittelbar in die Auffangkammer, sondern zunächst in die Abflusseinrichtung, in der es beispielsweise visuell oder mit einer Kamera inspiziert werden kann. Über den Abfluss der Abflusseinrichtung gelangt das Dissektat anschließend durch die Öffnung der Auffangkammer in die selbige.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Abflusseinrichtung eine Spül- und/oder Ablauf- bzw. Absaugeinrichtung. Die Spül- und/oder Ablauf- bzw. Absaugeinrichtung kann dazu dienen, das Dissektat zuverlässig aus der Abflusseinrichtung in die Kapillarleitung zu befördern. Auch kann damit der Zeitpunkt des Transports des Dissektats aus der Auffangkammer kontrolliert werden.
  • Im Falle einer Spülvorrichtung kann diese dazu eingerichtet sein, die Abflusseinrichtung bereits vor dem Einfallen des Dissektats und/oder kontinuierlich zu befeuchten und so den Transport des eingefallenen Dissektats zu erleichtern. Alternativ kann die Spülvorrichtung eingerichtet sein, erst nach dem Auffangen des Dissektats Flüssigkeit in die Auffangeinrichtung einzuspeisen, was eine vorangehende Visualisierung des Dissektats ermöglicht. Die Einspeisung kann dabei automatisch nach einer vorbestimmten Zeitspanne oder manuell durch einen Verwender aktiviert werden. Auf diese Weise kann einerseits dem Verwender Zeit gegeben werden, das Dissektat visuell zu inspizieren, bevor es in die Kapillarleitung gespült wird, andererseits können zunächst mehrere Dissektate in der Auffangeinrichtung gesammelt werden, ehe sie gemeinsam in die Kapillarleitung gespült werden.
  • In einer insbesondere eine Spülvorrichtung aufweisenden Ausführungsform ist die Abflusseinrichtung vorzugsweise als eine mit erhöhten Seitenrändern begrenzte Auffangfläche ausgestaltet. Dadurch kann zugeführte Flüssigkeit gesammelt und durch Neigung der Auffangfläche gegen die Horizontale die Flussrichtung der Flüssigkeit gesteuert werden. Insbesondere kann das Dissektat gezielt in die Öffnung der Auffangkammer gespült werden.
  • In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform ist stromabwärts des ersten Ventils ein Filter diesem Ventil nachgeordnet, wobei das Filter derart beschaffen ist, dass es das Dissektat passieren lässt. Das Filter ist insbesondere entweder unmittelbar nach dem ersten Ventil vor der Kapillarleitung angeordnet oder in der Kapillarleitung selbst. Durch das Filter tretendes Dissektat wird durch die Kapillarleitung weiter transportiert.
  • Das Filter kann insbesondere für die oben genannte Trägersubstanz durchlässig sein, während andere insbesondere feste dissektatfremde Stoffe zurückgehalten werden. Zu solchen dissektatfremden Stoffen gehören insbesondere Membranfragmente. Bei der Lasermikrodissektion werden in der Regel sogenannte Membranobjektträger verwendet. Das zu dissektierende Material ist auf einer geeigneten (in der Regel UVlaserabsorbierenden) Membran aufgebracht, wobei der Laser des Laser-Mikrodissektionssystems zusammen mit der Probe auch die Membran schneidet. Das Dissektat wird folglich physikalisch aus dem Gesamtverband von Membran und umgebender Probe vollständig abgetrennt. Dies hat zur Folge, dass die extrahierte Probe (Dissektat) weiterhin mit der ebenfalls extrahierten Membran (Membranfragment) verbunden ist. Membranfragmente können die Kapillarleitungen des Probenfängers verstopfen und/oder nachfolgende Reaktionen beeinflussen.
  • Im Folgenden sei angenommen, dass ein solches beschriebenes Filter unmittelbar hinter dem ersten Ventil der Auffangkammer vor der Kapillarleitung angeordnet ist. Zur Trennung des Dissektats von dem Membranfragment kann folgendes Verfahren eingesetzt werden: Die dissektierte Probe wird in der Auffangkammer aufgefangen, wo das Dissektat gegebenenfalls inspiziert werden kann. Über einen Injektor wird der Auffangkammer Lysepuffer zugegeben, welcher das Dissektat von dem Membranfragment trennt. Die Probe kann durch Lysepuffer oder Verdauungsenzyme im Lysepuffer auch komplett lysiert/verdaut werden, so dass sich die Bestandteile der vormals festen Probe in Lösung (Lysat) befinden, während die Membran ihre ursprünglich feste Form behält. Durch Öffnen des ersten Ventils gelangt das (lysierte) Dissektat durch das Filter in das Kapillarsystem, während das mitdissektierte Membranfragment vom Filter zurückgehalten wird.
  • Zur Reinigung des Filters von Membranfragmenten gibt es verschiedene Möglichkeiten: Zunächst kann die komplette Auffangkammer mit Ventil(en) und Filter ausgetauscht und durch eine neue ersetzt werden. Alternativ kann nur das Filter ausgetauscht und durch ein neues ersetzt werden. Zusätzlich oder alternativ ist es vor einem Austausch von Filter bzw. kompletter Auffangkammer (oder auch zur Vermeidung eines solchen Austauschs) möglich, das Filter zu spülen. Hierzu kann beispielsweise das Filter bei geöffnetem ersten Ventil in Gegenrichtung aufgespült werden, wodurch Membranfragmente in die Auffangkammer gelangen. Die Membranfragmente können dann beispielsweise mittels eines Injektors (oder mittels des dort bereits angeordneten Injektors) abgesaugt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist der erfindungsgemäße Probenfänger in eine Laser-Mikrodissektionseinrichtung eingebunden. Diese Einrichtung umfasst weiterhin eine Laserlichtquelle zum Erzeugen eines Laserstrahls, eine Ablenkeinrichtung zur Ablenkung des Laserstrahls, ein Mikroskopobjektiv als Fokussierlinse und einen Mikroskoptisch zur Aufnahme eines Objektträgers. Der Laserstrahl wird mittels des Mikroskopobjektivs auf die auf dem Objektträger befindliche Probe fokussiert. Mittels der Ablenkvorrichtung wird der Laserstrahl entlang einer Schnittlinie innerhalb der Probe geführt. Der Probenfänger ist vorzugsweise unter dem Objektträger befestigt und so ausgerichtet, dass ein vom Laserstrahl ausgeschnittenes Dissektat in die Auffangkammer (oder eine vorgeschaltete Abflusseinrichtung) des Probenfängers fällt.
  • Eine solche Laser-Mikrodissektionseinrichtung umfasst ein Mikroskop, wobei Mittel zum Einkoppeln des Laserstrahls in den Mikroskopstrahlengang vorgesehen sind. Hierbei kann es sich um einen Strahlteiler handeln, der für die Laserwellenlängen reflektierend ist, während er für die Beobachtungswellenlängen des Mikroskops durchlässig ist. Weiterhin können optische Komponenten (Linsen etc.) zum Einkoppeln des Laserstrahls vorgesehen sein. Insgesamt ist es zweckmäßig, eine Auflichteinrichtung zum Einkoppeln und Fokussieren des Laserstrahls durch das Mikroskopobjektiv auf die Probe zu verwenden. Der Laserstrahl durchläuft dann die in der Auflichteinrichtung angeordnete Ablenkvorrichtung und trifft auf das Mikroskopobjektiv, das dann als Fokussierlinse dient. Der Laserstrahl wird auf die Probe fokussiert und beschreibt mittels entsprechender Ablenkung durch die Ablenkungsvorrichtung eine Schnittlinie auf der Probe. Entlang dieser Schnittlinie wird die Probe geschnitten, wodurch das Dissektat entsteht. Eine solche Anordnung ist besonders vorteilhaft, da die Probe mikroskopisch (beispielsweise mittels Fluoreszenzmikroskopie) untersucht und zu dissektierende Bereiche der Probe identifiziert werden können. Weiterhin kann visuell oder mittels einer Kamera auch der Vorgang des Laserschneidens beobachtet und gegebenenfalls kontrolliert werden, da der Mikroskoptisch während des Laserschneidens nicht bewegt werden muss.
  • Bezüglich des prinzipiellen Aufbaus und der Funktionsweise des genannten Laser-Mikrodissektionssystems, das ein Mikroskop umfasst, sei ausdrücklich auf die Patentschrift DE 100 18 253 C2 hingewiesen. Ein solches System ist insbesondere in Kombination mit dem erfindungsgemäßen Probenfänger von Vorteil. Bezüglich Einzelheiten des Systems sei zur Vermeidung von Wiederholungen die entsprechende Offenbarung der genannten Patentschrift in die vorliegende Beschreibung aufgenommen.
  • Im Rahmen der Dissektatverarbeitung kann festgestellt werden, dass eine vorgegebene Anzahl von Dissektaten in der Auffangkammer aufgefangen wurde. Dies kann ein Erfassen einer Anzahl an vorgenommenen Dissektionsschritten und ein Vergleichen der erfassten Anzahl mit der vorgegebenen Anzahl umfassen. Auf diese Weise kann beispielsweise eine für eine Analyseoperation erforderliche Konzentration an Dissektaten in einer Lösung erreicht werden.
  • Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
  • Die Erfindung wird anhand von Ausführungsbeispielen in den Zeichnungen schematisch dargestellt und wird im Folgenden unter Bezugnahme auf die Zeichnungen ausführlich beschrieben.
  • Figurenliste
    • 1 zeigt beispielhaft eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Probenfängers und verschiedene Verfahrensschritte bei seiner Verwendung.
    • 2A zeigt eine alternative Ausführungsform des erfindungsgemäßen Probenfängers und dessen Verwendung.
    • 2B zeigt eine Weiterleitung eines Dissektats in Fortsetzung des Verfahrens aus 2A.
    • 3A zeigt eine weitere alternative Ausführungsform des erfindungsgemäßen Probenfängers und erste Schritte von dessen Verwendung.
    • 3B zeigt weitere Verfahrensschritte bei der in 3A dargestellten Verwendung eines Probenfängers.
    • 4 zeigt einen Probenfänger mit Filtersystem in verschiedenen Stufen der Verwendung (4A bis 4C).
    • 5 zeigt eine mögliche Filtersystemreinigung.
    • 6 zeigt ein Laser-Mikrodissektionssystem mit integriertem Probenfänger.
  • 1 zeigt fünf Schritte eines Verfahrens, in dem eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Probenfängers 1 verwendet wird.
  • Der Probenfänger 1 umfasst eine Auffangkammer 10, die im dargestellten Fall zwei Ventile 101 und 102 aufweist. Das erste Ventil 102 bildet im geschlossenen Zustand einen von der Probe 106 abgewandten Abschluss (Boden) der Auffangkammer 10. Im ersten dargestellten Schritt S11 ist das zweite Ventil 101 (Deckel) geöffnet, der Auffangbereich ist daher bereit für die Aufnahme eines einfallenden Dissektats 111. An seiner unteren Seite stromabwärts des ersten Ventils 102 ist die Auffangkammer 10 mit einer Kapillarleitung als Ablaufleitung 107 zum Transport eines Dissektats aus dem Auffangbereich verbunden. Die Weiterleitung des Dissektats vom Auffangbereich der Auffangkammer 10 in die Ablaufleitung 107 wird über das Ventil 102 kontrolliert. Im dargestellten Schritt S11 ist das Ventil 102 geschlossen.
  • Der Probenfänger 1 ist unterhalb eines Objektträgers 103 angeordnet, der eine Probe 106 hält. Mittels eines Laserstrahls 9, der durch ein Objektiv 105 eines Mikroskops fokussiert wird, wird im Schritt S11 ein Dissektat 111 aus der Probe 106 geschnitten. Das ausgeschnittene Dissektat fällt in den Auffangbereich (also in die Auffangkammer) 10 des Probenfängers 1. 6 erläutert eine mögliche Laser-Mikrodissektionseinrichtung näher.
  • Ist das Dissektat in die Auffangkammer gefallen (Schritt S12), kann das obere Ventil 101 geschlossen werden (Schritt S13). Durch Wiederholung des Schritts S11 können zuvor weitere Dissektate ausgeschnitten und in der Auffangkammer 10 aufgenommen werden, bis eine gewünschte Dissektatanzahl erreicht ist. Das untere Ventil 102 kann dann geöffnet werden, um das Dissektat direkt der Ablaufleitung 107, die beispielsweise in ein mikrofluides Kapillarsystem eingebettet sein kann, zugänglich zu machen (Schritt S14); vorzugsweise ist das obere Ventil 101 dabei geschlossen. In Schritt S15 gelangt das beispielhaft dargestellte Dissektat 111 an eine Sortierkreuzung 108, von der es - wie weiter unten erläutert - seinem Bestimmungsort zugeführt werden kann. Während bzw. vor oder nach allen Schritten kann durch den optionalen Injektor 104 eine Trägersubstanz, wie geeigneter Puffer, Lösungsmittel, mizellenbildende Flüssigkeit oder Ähnliches, zugegeben werden. Zudem kann der Injektor 104 in Schritt S14 zum Ausspülen des Dissektats verwendet werden.
  • Zusätzlich zu der eben skizzierten Ausführungsform eines Probenfängers besteht die Möglichkeit, die Auffangkammer 10 mit einem Dispenser 109 zu kombinieren. Eine derartige Ausführungsform ist in den 2A und 2B gezeigt: Neben den analog in 1 dargestellten Merkmalen umfasst der in den 2A und 2B dargestellte Probenfänger 1 einen Dispenser 109.
  • Der erste dargestellte Schritt S21 entspricht dem Schritt S11 aus 1: Ein Dissektat 111 wird dabei aus einer Probe 106 geschnitten und fällt in den Probenfänger 1, der eine Auffangkammer 10 aufweist. Das untere Ventil 102 kann nun entweder (wie für Schritt S22a gezeigt) geschlossen oder (wie für den Schritt S22b dargestellt) geöffnet sein. Das Dissektat 111 wird somit entweder auf dem unteren Ventil 102 (Schritt S22a) gehalten oder direkt im Kopf des Dispensers 109 mit Flüssigkeit 113 vermengt (Schritt S22b). Bei beiden Schritten S22a und S22b ist eine optionale Zugabe einer Trägersubstanz vor, nach und/oder während des Auffangvorgangs optional durch den Injektor 104 möglich (nicht dargestellt). Wird das Dissektat entsprechend Schritt S22a auf dem oder oberhalb des unteren Ventil(s) 102 gehalten, so wird das Ventil 102 anschließend geöffnet, so dass das Dissektat (wie in Schritt S22b gezeigt) in den Dispenser 109 gelangt.
  • Anschließend an Schritt S22b kann das untere Ventil 102 (wie in Schritt S23a gezeigt) gleich wieder geschlossen werden. Alternativ kann zunächst (wie in Schritt S23b dargestellt) eine Substanzzugabe 114 durch den Injektor 104 erfolgen.
  • Gemäß 2B verlässt im nächsten Schritt S24 das Dissektat 111 den Dispenser 109, wodurch es in einen Tropfen 115 eingeschlossen ist. In der Darstellung ist das untere Ventil 102 dabei (wieder) geschlossen, es könnte alternativ aber auch geöffnet sein, insbesondere, wenn der vorangehende Schritt dem Schritt S23b entspricht. Der Tropfen 115 gelangt in die Kapillarleitung 107.
  • In Schritt S25 nähert sich der Tropfen 115 mit dem darin eingeschlossenen Dissektat 111 einer Sortierkreuzung 108. Dort werden mittels eines angelegten elektrischen Feldgradienten in Schritt S26 Tropfen mit Dissektaten 111 aussortiert und in einer gesonderten Kapillare 117 erwünschten Analysen zugeführt, während Tropfen ohne Dissektate in eine andere Kapillare 118 sortiert und recycelt werden können. Ein Recycling ist ggf. das erneute Injizieren durch den Injektor. Vor Wiederholung des Prozesses muss der Dispenser 109 ggf. nachgefüllt werden (nicht dargestellt), beispielsweise durch den Injektor 104. Das untere Ventil 102 ist dabei geöffnet, das obere Ventil 101 kann ebenfalls geöffnet oder auch geschlossen sein.
  • Die 3A und 3B zeigen eine alternative Ausführungsform, bei der der oberen Öffnung der Auffangkammer 10 des Probenfängers 1 stromaufwärts eine mit erhöhten Seitenrändern 125 begrenzte Auffangfläche 124 als Abflusseinrichtung 11 vorgeschaltet ist. Letztere umfasst vorzugsweise eine Spül- oder eine Ablauf- bzw. Absaugeinrichtung, mit deren Hilfe ein aufgefangenes Dissektat zur Ablaufleitung 107 geschwemmt werden kann.
  • In einem ersten Schritt S31 wird dabei ein Dissektat 111 per Laser-Mikrodissektion aus einer Probe 106 gelöst. Das Dissektat fällt durch Schwerkraft nach unten. In Schritt S32 wird das Dissektat auf der Auffangfläche 124 der Abflusseinrichtung 11 des Probenfängers 1 aufgefangen. Die Auffangfläche 124 ist gegenüber der Horizontalen geneigt. In der dargestellten Ausführungsform umfasst die Abflusseinrichtung 11 einen Injektor oder eine Spülvorrichtung 119, mit dem/der eine Spülflüssigkeit oder eine sonstige Substanz, allgemein Trägersubstanz, zugegeben werden kann. Die Seitenränder 125 der Auffangfläche 124 sind erhöht, um (Spül-)Flüssigkeit am Überlaufen zu hindern und zum Abfluss 126 zu leiten.
  • Im dargestellten Fall wird in Schritt S32 noch keine Flüssigkeit oder sonstige Substanz in die Auffangfläche 124 geleitet. Daher kann eine Inspektion der Auffangfläche 124 und des Dissektats erfolgen. Alternativ könnte die Auffangfläche 124 durchgehend mittels der Spülung oder dem Injektor 119 benässt werden.
  • Durch Spülen mit einer geeigneten Spüllösung wird das Dissektat 111 in Schritt S33 durch den Abfluss 126 und in Schritt S34 durch eine Verbindung zu der Auffangkammer 10, die im dargestellten Fall in eine Kapillarkammer 120 integriert ist, gespült. Alternativ zum Spülen ist ein Ansaugen des Dissektats denkbar.
  • Die dargestellte Kapillarkammer 120 weist die eigentliche Auffangkammer 10, ein Eingangsventil 121, ein Ausgangsventil 122 sowie einen optionalen Injektor 123 auf. Durch das geöffnete Eingangsventil 121 gelangt das Dissektat 111 in Schritt S35 in die Auffangkammer 10, deren Ausgangsventil 122 geschlossen ist, wie in 3B dargestellt.
  • Die Auffangkammer 10 kann (wie in Schritt S36a dargestellt) direkt oder (wie in Schritt S36b gezeigt) über einen Dispenser 109 an eine Ablaufleitung 107 angeschlossen sein. Ist ein Injektor 123 vorhanden, kann durch ihn in beiden Fällen bei geschlossenem Ausgangsventil 122 eine Zugabe einer oder mehrerer Substanz/en erfolgen.
  • Ausgehend von Schritt S36a (also in dem Fall, dass die Auffangkammer 10 nicht an einen Dispenser angeschlossen ist), wird in Schritt S37a das Ausgangsventil 122 geöffnet und das Dissektat in die Ablaufleitung 107, die hier eine Kapillare ist, überführt. In Schritt S38a wird das Dissektat in umgebender Flüssigkeit durch die Kapillare 107 - wie beispielsweise in 1 gezeigt - seiner weiteren Analyse zugeführt. Bezüglich der weiteren Vorgehensweise sei auf die 1 bzw. die 2A und 2B verwiesen.
  • Im Fall, dass die Auffangkammer 10 an einen Dispenser 109 angeschlossen ist (S36b), wird das Dissektat in den Schritten S37b und S38b analog zu den für 2B beschriebenen Schritten S23b - S25 in einen Tropfen eingefasst, der von Tropfen ohne Dissektat getrennt und zu einem Reaktionsort für die Analyse des Dissektats geleitet wird.
  • 4 zeigt die Funktionsweise einer Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Probenfängers 1, wie er im Wesentlichen bereits in 1 dargestellt ist, mit einem Filtersystem zur Trennung des Dissektats 111 von dissektatfremden Stoffen 112, wie einer Membran. Hierzu ist in 4 dem ersten Ventil 102 ein Filter 116 nachgeordnet, wobei das Filter 116 noch vor der Kapillarleitung 107 angeordnet ist.
  • 4A zeigt eine Fokussierlinse 105 für einen Laserstrahl 9, der auf eine von einem Objektträger 103 gehaltene Probe 106 fokussiert wird. Ein ausgeschnittenes Dissektat fällt bei geöffnetem zweiten Ventil 101 in die Auffangkammer 10 des Probenfängers 1. Insofern sei auf die Erläuterungen zur 1 hingewiesen.
  • Eine Laser-Mikrodissektion wird in der Regel mit sogenannten Membranobjektträgern durchgeführt. Die Probe 106 wird hierzu auf einer geeigneten Membran (i.d.R. aus UVlaserabsorbierendem Material) aufgebracht. Der Laser 9 des Laser-Mikrodissektionssystems schneidet aus der Probe 106 ein Dissektat 111, wobei gleichzeitig die Membran, die das Dissektat 111 hält, mit geschnitten wird. Dies hat zur Folge, dass die extrahierte Probe, also das Dissektat 111, weiterhin mit der ebenfalls extrahierten Membran 112 verbunden ist. Diese Membran 112 kann die Kapillaren der Kapillarleitung 107 verstopfen oder nachfolgende Reaktionen beeinflussen.
  • 4B zeigt die Situation im Probenfänger 1, nachdem das zweite Ventil 101 geschlossen wurde, nachdem das Dissektat 111 in die Auffangkammer 10 gefallen war. Über den Injektor 104 wurde bereits eine Trägersubstanz 113 in das Innere der Auffangkammer 10 gegeben. Das Dissektat 111 befindet sich somit zusammen mit der Membran 112 in der Trägerflüssigkeit bei geschlossenem ersten Ventil 102. In der Situation gemäß 4B kann die dissektierte Probe inspiziert werden. Als Trägersubstanz 113 kann Lysepuffer zugegeben werden, weleher zumindest das Dissektat 111 von dem Membranfragment 112 trennt oder aber die Probe komplett unter Zurückbleiben des Membranfragments 112 auflöst/lysiert.
  • 4C zeigt die Situation nach Öffnen des ersten (unteren) Ventils 102. Da das Filter 116 für die Trägersubstanz (Lysepuffer) 113 sowie für das Dissektat 111 bzw. die aufgelöste Probe durchlässig ist, für die Membran 112 hingegen undurchlässig ist, wird das Dissektat 111 in das Kapillarsystem 107 übergeführt, während das mitdissektierte Membranfragment 112 im Filter 116 verbleibt.
  • 5 zeigt eine Möglichkeit der Filtersystemreinigung in schematischer Form.
  • Prinzipiell gibt es drei Möglichkeiten zur Filtersystemreinigung. Entweder kann die komplette Auffangkammer 10 mit Ventilen 101 und 102 sowie Filter 116 ausgetauscht werden oder aber nur das Filter 116, je nach Konstruktionsweise. Um einen solchen Austausch ganz zu vermeiden oder zumindest nur in größeren Zeitabständen erforderlich zu machen, kann vorteilhafterweise das Filter 116 aufgespült werden. Dieser Vorgang ist in den 5A bis 5C schematisch dargestellt. Zunächst wird mit der Trägersubstanz oder einer anderen Filterreinigungsflüssigkeit das Filter 116 aufgespült, so dass bei geöffnetem Ventil 102 das gefilterte Membran 112 oder mehrere dort befindliche Membranfragmente in das Innere der Auffangkammer 10 gespült werden. Anschließend wird das untere Filter 102 wieder geschlossen (siehe 5B). Das Innere der Auffangkammer 10 wird nun entleert, wobei dies durch einen dort angeordneten Injektor, beispielsweise auch den Injektor 104 erfolgen kann. Es ist auch möglich, nur die Membranfragmente 112 abzusaugen, ohne die Auffangkammer 10 vollständig zu entleeren. 5C zeigt den Zustand nach Filtersystemreinigung. Durch Öffnen des oberen Ventils 101 steht der Probenfänger wieder zur Aufnahme eines Dissektats bereit.
  • 6 zeigt schematisch eine Laser-Mikrodissektionseinrichtung, wie sie für die vorliegende Erfindung Einsatz finden kann. Ein für die vorliegende Erfindung besonders geeignetes Laser-Mikrodissektionssystem ist in der deutschen Patentschrift DE 10 2005 028 062 B4 ausführlich beschrieben. Hinsichtlich bestimmter im Folgenden erwähnter Details dieses Systems sei daher ausdrücklich auf diese Schrift hingewiesen, deren Offenbarung insoweit in vorliegender Anmeldung aufgenommen sei.
  • Die Laser-Mikrodissektionseinrichtung 200 umfasst ein Mikroskop 204 mit einem motorisch verfahrbaren x-y-Tisch, dem Mikroskoptisch 205, der zur Aufnahme eines Objektträgers 103 dient, auf dem ein zu untersuchendes und/oder zu schneidendes Präparat (Probe) 106 aufgebracht ist. Mit 209 ist eine Durchlichtbeleuchtungseinrichtung bezeichnet. Die Probe 106 kann in Durchlicht und/oder in Auflicht beleuchtet werden. Mit 203 ist eine entsprechende Auflichteinrichtung bezeichnet. Eine entsprechende Lichtquelle dieser Auflichteinrichtung 203 kann zusammen mit der Laserlichtquelle 201 untergebracht sein. Auch eine getrennte Anordnung, auch mit getrennten Lichtwegen, ist einsetzbar. 206 bezeichnet eine Lichtquelle, wie eine Halogenlampe oder eine Weißlicht-LED, mit nachgeschalteter (nicht im Einzelnen dargestellter) Beleuchtungsoptik zur Erzeugung eines Durchlichtbeleuchtungsstrahlengangs. Dieser Beleuchtungsstrahlengang wird mittels eines Umlenkspiegels 207 und eines Kondensors 211 von unten auf die Probe 106 gerichtet. Das Mikroskop 204 umfasst weiterhin ein Objektiv 105 sowie im Einzelnen nicht weiter dargestellte Mikroskopelemente, wie Zoomsystem, Tubuslinsen und Okularlinsen. Das Okular selbst ist mit 212 bezeichnet.
  • Das durch den Probenfänger 1 und die Probe 106 hindurchtretende Licht des Durchlichtbeleuchtungsstrahlengangs gelangt zum Objektiv 105, das einen Ausschnitt der Probe 106 erfasst, der von einem Betrachter in Form eines mikroskopischen Bildes durch das Okular 212 betrachtet werden kann. Zusätzlich ist das Mikroskop 204 mit einer Kamera 217 verbunden, die beispielsweise über einen CCD-Chip ein digitales Bild des Präparatausschnitts erfassen kann. Die von der Kamera 217 aufgenommenen Bilddaten werden an einen Rechner 220 weitergegeben, der seinerseits mit einer Anzeigefläche 218 (hier Monitor) verbunden ist, auf der ein Bild des aufgenommenen Präparatausschnitts dargestellt werden kann. Rechner 220 und Kamera 217 können ganz oder teilweise auch eine integrale Einheit bilden.
  • Die dargestellte Laser-Mikrodissektionseinrichtung 200 umfasst weiterhin eine Lasereinrichtung (hier Auflichteinrichtung 203) zur Dissektion eines Laser-Mikrodissektionsbereichs der Probe 106 durch Laserschneiden. Hierzu ist eine Laserlichtquelle 201 mit dem Mikroskop 204 etwa durch Verbindung der Laserlichtquelle 201 am Mikroskopstativ 208 gekoppelt. Der von der Laserlichtquelle 201 erzeugte Laserstrahl 9 wird über noch zu erläuternde Elemente 216, 219, 214, 202 und 213 in die optische Achse 210 des Mikroskops 204 eingekoppelt und über das Mikroskopobjektiv 105 auf die Probe 106 zum Schneiden fokussiert. Durch eine Relativbewegung zwischen Laserstrahl 9 und Probe 106 wird dann der entsprechende Dissektionsbereich aus dem Präparat entlang einer vorgegebenen Markierung (Schnittlinie) ausgeschnitten. Während diese Relativbewegung durch entsprechende Bewegung des Mikroskoptisches 205 und somit des Objektträgers 103 bei feststehendem Laserstrahl 9 realisiert werden könnte, ist es bevorzugt und in diesem Ausführungsbeispiel umgesetzt, den Laserstrahl 9 bei feststehendem Mikroskoptisch 205 bzw. feststehendem Objektträger 103 während des Laserschneidens zu bewegen. Dies hat den großen Vorteil, dass die Probe 106 während der Laser-Mikrodissektion unmittelbar beobachtet werden kann.
  • Zu diesem Zweck wird der Laserstrahl 9 über eine (optionale) Abschwächereinheit 216 (Attenuator), eine Fokussieroptik 219 sowie eine Apertureinheit 214 geführt. Mittels dieser Elemente wird in bekannter Weise (siehe explizit die bereits erwähnte DE 10 2005 028 062 B4 ) ein Laserstrahlfokus an der gewünschten Stelle in der Probe 106 mit der gewünschten Intensität und Geometrie erzeugt. Ein Umlenkelement 213 dient zur Einkopplung des Laserstrahls 9 in die optische Achse 210 des Mikroskops 204. Als Laser eignet sich beispielsweise ein UV-Laser.
  • Eine Steuerungseinrichtung ist in 6 mit 215 bezeichnet. Sie kann voneinander getrennte Einheiten umfassen, wie in 6 illustrierend dargestellt, in der Praxis stellt die Steuerungseinrichtung in der Regel jedoch eine Einheit dar, die insbesondere auch in dem Rechner 220 integriert sein kann. In diesem Ausführungsbeispiel ist die Steuerungseinrichtung 215 mit der Laserlichtquelle 201, der Abschwächereinheit 216, der Fokussieroptik 219, der Apertureinheit 214 sowie mit der noch zu erläuternden Ablenkvorrichtung 202 verbunden, um diese Elemente geeignet ansteuern zu können. Auch eine Verbindung (hier nicht dargestellt) mit dem Mikroskoptisch 205 ist sinnvoll, um verschiedene Bereiche der Probe 106 durchfahren bzw. anfahren zu können. Eine Verbindung mit der Kamera 217 ist ebenfalls zweckmäßig, um Aufnahmeparameter einstellen zu können. Bezüglich weiterer Details sei nochmals auf die DE 10 2005 028 062 B4 verwiesen.
  • Zur Bewegung des Laserstrahlfokus entlang einer vorgegebenen Markierung bzw. Schnittlinie zur Dissektion eines Probenbereichs (Dissektat) ist eine Ablenkeinheit 202 vorhanden, die ein Keilplattenpaar, dessen einzelne Keilplatten zueinander in veränderlicher Weise orientiert werden können, umfasst. Auf diese Weise kann in bekannter Weise der Laserstrahl aus der optischen Achse um einen Versatz abgelenkt werden, so dass er entsprechend versetzt auf die Probe 106 auftrifft, wobei der Laserstrahl für alle Ablenkwinkel die Mitte der Objektivpupille des Objektivs 105 durchläuft. Zu Einzelheiten bezüglich Aufbau und Funktionsweise der Ablenkvorrichtung 202 sei ausdrücklich auf die deutsche Patentschrift DE 100 18 253 C2 verwiesen. Durch geeignete Ansteuerung der Ablenkvorrichtung 202 ist es möglich, den Laserstrahlfokus entlang einer beliebig vorgegebenen Schnittlinie zu führen.
  • Die hier behandelte Laser-Mikrodissektionseinrichtung 200 erlaubt die Erfassung eines Probenausschnitts, insbesondere bei fixierter Haltposition des Objektträgers 103, unter verschiedenen Mikroskopiermethoden. Die mögliche Durchlichtbeleuchtung wurde bereits oben erläutert. Die Auflichteinrichtung 203, hier nur erläutert für die Lasereinrichtung steht stellvertretend für andere Auflichtbeleuchtungsverfahren, wie Kontrastierverfahren oder Auflicht-Fluoreszenzverfahren. Es kann zweckmäßig sein, einen Präparatausschnitt mit (mindestens) zwei unterschiedlichen Mikroskopiermethoden darzustellen, die Mikroskopbilder zu überlagern und im Überlagerungsbild eine Schnittlinie (automatisch oder manuell) zu definieren. Der Rechner 220 steuert über die Steuereinrichtung 215 dann die Ablenkvorrichtung 202 zur Erzeugung eines Dissektats 111 aus der Probe 106 in entsprechender Weise an. Das Dissektat 111 gelangt in den erfindungsgemäßen Probenfänger 1, insbesondere in das Innere der Auffangkammer 10.
  • Das im Inneren der Auffangkammer 10 befindliche Dissektat 111 wird - wie bereits ausführlich anhand der 1 und 2 erläutert - in eine Kapillarleitung 107 übergeführt. Hierzu kann auch ein Dispenser 109 (vgl. 2) vorgesehen sein. Weiterhin kann, wie in 3 erläutert, eine Abflusseinrichtung 11 zum Einsatz kommen. Über eine Sortierkreuzung 108 (vgl. 1) kann das Dissektat 111 aussortiert und einer Analyseeinrichtung (hier nicht dargestellt) zugeführt werden. Überschüssige Trägersubstanz kann über eine andere Leitung des Kapillarsystems wieder ihrem Ursprung zurückgeführt werden (also bspw. einem Reservoir, von wo aus die Trägersubstanz mittels einer Pumpe wieder an ihren ursprünglichen Einsatzort zurückgeführt werden kann).
  • Um den Vorgang der Dissektion mikroskopisch betrachten zu können, ist darauf zu achten, dass die im Durchlichtbeleuchtungsstrahlengang befindlichen Elemente des Probenfängers 1 weitgehend lichtdurchlässig sind. Andernfalls kann eine Betrachtung im Auflicht gewählt werden. Auch eine wahlweise Durchlicht- und Auflichtbeleuchtung ist vorstellbar.
  • Bezugszeichenliste
    • 1
    Probenfänger
    9
    Laserstrahl
    10
    Auffangkammer
    11
    Abflusseinrichtung
    101
    erstes Ventil
    102
    zweites Ventil
    103
    Objektträger
    104
    Injektor
    105
    Fokussierlinse, Miktroksopobjektiv
    106
    Probe
    107
    Ablaufleitung, Kapillarleitung
    108
    Sortierkreuzung, Verzweigung
    109
    Dispenser
    111
    Dissektat
    112
    Membran
    113
    Trägersubstanz
    114
    Substanzzugabe
    115
    Tropfen
    116
    Filter
    117
    Kapillare
    118
    Kapillare
    119
    Spüleinrichtung
    120
    Kapillarkammer
    121
    zweites Ventil, Eingangsventil
    122
    erstes Ventil, Ausgangsventil
    123
    Injektor
    124
    Auffangfläche
    125
    Seitenränder
    126
    Abfluss
    200
    Laser-Mikrodissektionseinrichtung
    201
    Laserlichtquelle
    202
    Ablenkvorrichtung
    203
    Auflichteinrichtung
    204
    Mikroskop
    205
    Mikroskoptisch
    206
    Lichtquelle
    207
    Umlenkspiegel
    208
    Mikroskopstativ
    209
    Durchlichtbeleuchtungseinrichtung
    210
    optische Achse
    211
    Kondensor
    212
    Okular
    213
    Umlenkelement
    214
    Apertureinheit
    215
    Steuerungseinrichtung
    216
    Abschwächereinheit
    217
    Kamera
    218
    Anzeigefläche
    219
    Fokussieroptik
    220
    Rechner
    S11-S15
    Verfahrensschritte
    S21-S26
    Verfahrensschritte
    S31-S38b
    Verfahrensschritte

Claims (14)

  1. Laser-Mikrodissektat-Probenfänger (1) für eine Laser-Mikrodissektionseinrichtung, wobei der Probenfänger eine Auffangkammer (10) zur Aufnahme eines Dissektats (111) umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass die Auffangkammer (10) probenseitig eine zur Umgebung offene Öffnung zur Aufnahme des Dissektats (111) aufweist, die Auffangkammer (10) ein erstes Ventil (102, 122) aufweist, das im geschlossenen Zustand einen probenabgewandten Abschluss der Auffangkammer (10) zur Rückhaltung des Dissektats (111) bildet, und dass stromabwärts des ersten Ventils (102, 122) eine Kapillarleitung (107) angeordnet ist, die zum Transport des Dissektats (111) aus der Auffangkammer (10) mit letzterer in Verbindung steht, wobei der Laser-Mikrodissektat-Probenfänger (1) derart eingerichtet ist, dass er probenseitig eines Objektträgers (103) eines Mikroskoptisches (205) einer Laser-Mikrodissektionseinrichtung (200) angeordnet werden kann.
  2. Probenfänger nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Auffangkammer (10) ein zweites Ventil (101, 121) aufweist, das in geschlossenem Zustand einen probenseitigen Abschluss der Auffangkammer (10) bildet.
  3. Probenfänger nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Auffangkammer (10) und/oder die Kapillarleitung (107) mindestens einen Injektor (104) zur Zuführung einer Trägersubstanz (113) aufweisen.
  4. Probenfänger nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen den zwei Ventilen (102, 122; 101, 121) der Auffangkammer (10) ein Injektor (104) zur Zuführung einer Trägersubstanz angeordnet ist.
  5. Probenfänger nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Kapillarleitung (107) eine Verzweigung (108) aufweist.
  6. Probenfänger nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen der Auffangkammer (10) und der Kapillarleitung (107) ein Dispenser (109) angeordnet ist.
  7. Probenfänger nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass stromaufwärts der Öffnung der Auffangkammer (10) eine Abflusseinrichtung (11) angeordnet ist, deren Abfluss (126) mit der probenseitigen Öffnung der Auffangkammer (10) in Verbindung steht.
  8. Probenfänger nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Abflusseinrichtung (11) eine Spüleinrichtung (119) und/oder eine Ablauf- oder Absaugeeinrichtung umfasst.
  9. Probenfänger gemäß Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Abflusseinrichtung (11) als mit erhöhten Seitenrändern (125) begrenzte Auffangfläche (124) ausgestaltet ist.
  10. Probenfänger nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass stromabwärts des ersten Ventils (102, 122) ein Filter (116) diesem Ventil nachgeordnet ist, wobei das Filter derart beschaffen ist, dass es das Dissektat passieren (111) lässt.
  11. Probenfänger nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Filter (116) in Strömungsrichtung vor der Kapillarleitung (107) angeordnet ist.
  12. Probenfänger nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Filter (116) derart beschaffen ist, dass dissektatfremde Stoffe (112) zurückgehalten werden.
  13. Probenfänger nach einem der Ansprüche 10 bis 12 und nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Filter (116) für die Trägersubstanz (113) durchlässig ist.
  14. Laser-Mikrodissektionseinrichtung (200), die eine Laserlichtquelle (201) zur Erzeugung eines Laserstrahls (9), eine Ablenkvorrichtung (202) zur Ablenkung des Laserstrahls (9), eine Auflichteinrichtung (203) zum Fokussieren des Laserstrahls durch ein Mikroskopobjektiv (105) auf eine Probe (106), einen Mikroskoptisch (205) zur Aufnahme eines Objektträgers (103) zur Halterung der zu dissektierenden Probe (106) und einen probenseitig des Objektträgers (103) angeordneten Laser-Mikrodissektat-Probenfänger (1) gemäß einem der voranstehenden Ansprüche umfasst.
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