DE10329674A1

DE10329674A1 - Laserverfahren und Anordnung zur Markierung und Gewinnung von Materialien, Zellbestandteilen, Zellen und Gewebebestandteilen

Info

Publication number: DE10329674A1
Application number: DE2003129674
Authority: DE
Inventors: Karsten Dr. König; Iris Dr. Riemann
Original assignee: Individual
Current assignee: Jenlab De GmbH
Priority date: 2003-06-30
Filing date: 2003-06-30
Publication date: 2005-02-03
Anticipated expiration: 2023-07-01
Also published as: DE10329674B4

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Anordnung zur optischen Markierung und Gewinnung von Materialien, Zellbestandteilen, Zellen und Gewebebestandteilen. DOLLAR A Aufgabe ist es, ein Verfahren und eine Anordnung zur Markierung und Gewinnung von Biomaterial durch Lasereinwirkung mit hoher Präzision und Schnelligkeit und ohne destruktive Nebeneffekte für das zu untersuchende Objekt, insbesondere unter Umgehung der Nachteile bisheriger UVA-Nanosekunden-Lasersysteme, bereitzustellen. DOLLAR A Erfindungsgemäß werden hierzu multiple ultrakurze Laserpulse einer hohen Intensität von mindestens 10·12· W/cm·2·, einer Laserwellenlänge größer 400 nm, einem maximalen Durchmesser des wirksamen Laserspots von weniger als 5 mum und einer Folgefrequenz von mindestens 1000 Hz eingesetzt, wobei die intensiven Laserpulse durch Multihotonen-Absorption ein Plasma generieren, das durch veränderte Strahlposition im Trägersubstrat und im biologischen Objekt eine Schneidwirkung erzeugt. Die Isolation und der Transport des bearbeiteten Materials kann durch Gravitationswirkung, hydrodynamischen Fluss und Strahlungsdruck erfolgen. DOLLAR A Das Verfahren und die Anordnung sind geeignet, mittels Multiphotonen-Schneidens bestimmte Bereiche von Chromosomen, einzelne Zellen und Zellcluster sowie Gewebebereiche aus einem Zell- und Gewebeverband sowie einer Unterlage (Substrat) herauszuschneiden und damit zu isolieren sowie dieses Material einer weiteren Analyse, z. B. Proteinanalyse, RNA-Analyse und DNA-Analyse, ...

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Anordnung zur optischen Markierung und zur Gewinnung von biologischen Materialien mittels gepulster ultrakurzer Laserstrahlung.
Das Verfahren und die Anordnung sind geeignet, bestimmte Bereiche von Chromosomen, von Metaphaseplatten, einzelne Zellen und Zellcluster sowie Gewebebereiche aus einem Biomolekülverband, Zell- und Gewebeverband sowie einer Unterlage (Substrat) herauszuschneiden und damit zu isolieren sowie dieses Material einer weiteren Analyse, z.B. Proteinanalyse, RNA-Analyse und DNA-Analyse, zuzuführen. Zudem kann das mittels Laserstrahlung isolierte Material für die Gewinnung reiner Zell- und Gewebekulturen genutzt werden. Auch ist eine Markierung von bestimmten biologischen Strukturen in einem Zell- und Gewebeverband möglich.

Es sind Applikationen von gepulsten Lasersystemen zur Gewinnung von Zell- und Gewebematerial bekannt. Üblicherweise werden dabei gepulste Laser mit Pulsbreiten im Nanosekunden-Bereich, Pulsfolgefrequenzen im Bereich von wenigen Hertz (Hz), einer Pulsenergie im μJ-Bereich und mit einer Laserwellenlänge im ultravioletten (UV) Spektralbereich eingesetzt (Meier-Ruge et al., Histochem. J. 8(1976)387–401; Kubo et al., Cancer Res. 55(1995)989–990; Schütze und Lahr, Nature Biotechnology 16(1998)737–742). Ein solches typisches Lasersystem besteht aus einem gepulsten Stickstoff-Laser bei einer Emissionswellenlänge von 337 nm in Kombination mit einem handelsüblichen Fluoreszenzmikroskop (Schütze und Lahr, Nature Biotechnology 16(1998)737–742). Die Laserstrahlung wird mittels Umlenkspiegel zum Mikroskopobjektiv geführt und dort auf das Target fokussiert. Ein solches Target kann eine einige Mikrometer dicke Polymer-Folie (z.B. ca. 1 μm dicke Polyethylenmembran) sein, auf der sich zum Beispiel fixierte Chromosomen, fixierte Zellansammlungen oder histologische Schnitte einer kryokonservierten oder chemisch fixierten Gewebebiopsie befinden (Schütze und Lahr, Nature Biotechnology 16(1998)737–742). Es können sich auch vitale Zellen oder Gewebebestandteile auf dem Substrat befinden. Üblicherweise wird der Mikroskoptisch mit der zu bearbeitenden Probe bei fixem Strahlverlauf motorisiert bewegt. Durch Absorption der UV-Strahlung durch die Folienbestandteile kann die Folie einschliesslich dem darüberliegenden biologischen Material bearbeitet werden. Der Bearbeitungsprozess basiert auf der ablativen Photodekomposition, auch kalte Ablation genannt, da keine signifikanten thermischen Destruktionsprozesse auftreten (Srinivasan und Leigh, Appl. Phys. Lett. 104(1982)6784; Srinivasan, Science 234(1986)559–561). UV-Ablation wird auch zur Bearbeitung der Cornea in der Augentherapie eingesetzt (Srinivasan, Science 234(1986)559–561).

Die UV-Ablation kann für eine Schneidwirkung eingesetzt werden, so dass ein interessierendes Areal auf dem Substrat, z.B. einer Polymerfolie, von der Umgebung getrennt werden kann. Das Verfahren wird auch kontaktfreie Mikrodissektion genannt. Mittels zum Beispiel Saugeinrichtungen und Kontakt zu Glasspitzen kann dieses isolierte Material (Probe) gewonnen und zum Beispiel einer weiteren molekularbiologischen Verfahren zur Analyse unterzogen werden. Die Probe kann auch durch UV-Laser induzierte mechanische Wirkungen nach dem Schneidvorgang gewonnen werden, auch "Laser Pressure Catapulting" genannt (Patent EP 0879 408 ). Dabei wird das mit hoher Geschwindigkeit während der UV-Ablation mit energiereichen Pulsen entstehende sich ausdehnende Plasma genutzt, das geschnittene Material wegzuschleudern. Üblicherweise werden dabei doppelt so hohe Pulsenergien wie zum Schneiden der Folie mit Target eingesetzt (Schütze und Lahr, Nature Biotechnology 16(1998)737–742).

Das zu isolierende biologische Objekt wird üblicherweise mit einem Mikroskop im Durchlichtverfahren mittels Weisslichtquelle (Halogenlampe) und Videokamera lokalisiert.

Die Auflösung ist gering und beträgt mehrere Mikrometer. Eine genaue 3D-Targetsuche ist nicht gegeben.

Die Analyse des mittels UV-Laser isolierten und chemisch bearbeiteten Zell- und Gewebematerials beinhaltet z.B. die Gen-/DNA-Analyse nach PCR (Polymer Chain Reaction)-Amplifkation von optisch isoliertem DNA-Material, die RNA-Analyse und die Proteinanalyse mittels SELDI- und MALDI-Verfahren. Die UV-Laser induzierte Gewinnung von isoliertem Zell- und Gewebematerial kann prinzipiell auch für die Kultivierung und Klonierung von Zellen genutzt werden.

Nachteile dieses bisherigen optischen Verfahrens mittels UV-Laserpulse im Nanosekundenbereich zur Gewinnung von Zell- und Gewebematerial sind die mögliche Veränderung des zu analysierenden Materials durch Absorption der UV-Laserstrahlung, deren destruktive Wirkung einschliesslich mutagener Effekte bekannt sind. Da die UV-Strahlung nicht nur im Fokusbereich sondern auch im gesamten Bestrahlungsfeld vom zu analysierenden Target absorbiert werden kann, besteht so die Gefahr, dass z.B. Laserinduzierte DNA-Strangbrüche die Gen-/DNA-Analysen behindern oder verfälschen. Auch wenn die 337 nm Strahlung des Stickstoff-Lasers nicht direkt von der DNA und den Proteinen absorbiert wird, können dennoch erhebliche Destruktionseffekte durch indirekte Wirkungen einschliesslich DNA-Strangbrüchen entstehen. So wird generell UVA-Strahlung (320 nm – 400 nm) von einer Vielzahl endogener Zellabsorber, wie die essentiellen Koenzyme NAD(P)H und Flavine, absorbiert. Dies kann zur Generation von toxisch wirkenden reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) führen. So wurde demonstriert, dass UVA-Strahlung den Zellmetabolismus beinflusst, das Reproduktionsverhalten schädigen kann, das Zytoskelett in Mitleidenschaft gezogen werden kann und DNA-Schäden induziert werden können. Allgemein ist bekannt, das UVA-Strahlung Hautkrebs auslösen kann (z.B. König et al., Biomedical Optics 1(1996),217–222; Dube et al. Radiation Environmental Biophysics 40(2001)77–82; Zamansky und Chou, J. Invest. Dermatol. 89(1987)603–606; Pourzand und Tyrrell, Sci. USA, 96(1999)6751–6756; Moyen et al. J. Photochem. Photobiol. B 29(1995) 59–63).

Ein weiterer Nachteil der bisherigen UVA-Laserablation von biologischem Material besteht in der geringen Schnittqualität. Diese Schnittqualität ist einerseits durch die geringe Strahlqualität des Stickstofflasers, welcher ein Superstrahler ist, und den damit verbundenen Bestrahlungs-Spot gegeben. Andererseits ist die Schnittqualität von Nanosekundenlasern üblicherweise geringer als die mit Femtosekundenlasern. So konnten mit Femtosekundenlasern Schnittbreiten in humanen Chromosomen von weniger als 150 Nanometern erzeugt werden (König et al., Opt. Lett. 26(2001)819–821), während die typischen Schnittbreiten mit dem Stickstofflaser im Mikrometerbereich liegen. Die Gewinnung von biologischem Material mittels Stickstofflaser ist damit auf Objekte mit einer minimalen Ausdehnung von mehreren Mikrometern begrenzt.

Nachteilig ist auch die bisherige Methode der Targeterkennung, die üblicherweise auf einem mit einer Videokammera aufgenommenen zweidimensionalen Weisslichtbild geringer Auflösung basiert. Die geringe Auflösung limitiert die Präzision der optischen Gewinnung des biologischen Objektes. Das zu isolierende biologische Objekt muss zudem genügend Kontrast aufweisen, um im Durchlicht lokalisiert zu werden.

Ein weiterer Nachteil ist die Verwendung von Pulsfolgefrequenzen im Hertz-Bereich, typischerweise kleiner 30 Hz. Es werden somit nur einzelne energiereiche Laserpulse für die Schneidwirkung verwendet. Beim Laser Pressure Catapulting wird typischerweise nur ein Einzelpuls verwendet. Dadurch können nur geringe Schnittgeschwindigkeiten erreicht werden. Auch ist die Geschwindigkeit des motorisch gesteuerten Mikroskoptisches sehr limitiert.

Nachteilig ist weiterhin, dass die Wirkung auf der UV-Absorption basiert und daher nur bestimmte UV-absorbierende Trägermaterialien (z.B. Folien mit erheblichem Anteil an aromatischen Polykondensaten), deren Absorptionsvermögen der UV-Laserwellenlänge angepasst ist, verwendet werden können ( EP 0879 408 ).

Da die Trägermaterialien üblicherweise auf Glas aufgetragen sind, muss zudem ein UV-durchlässiges Spezialglas verwendet werden.

Es sind zudem Verfahren zur Lasermikrodissektion zur Gewinnung von Zell- und Gewebematerial bekannt, die auf der Wärmewirkung sichtbarer und infraroter Laser in Kombination mit einem wärmeempfindlichen Substratmaterial basieren (Schindler et al. Methods Cell Biol. 32(1989)423–446; Emmert-Buck et al. Science 274(1996)998–1001). Jedoch ist der Einsatzbereich dieser laserthermischen Verfahren typischerweise auf Targets grösser 30 μm limitiert.

In dem Patent JP-A-05076342 ist eine Apparates zur Gewinnung von mikroskopischen Objekten beschrieben worden, die auf der Applikation multipler kontinuierlich emittierender Laserquellen beruht.

Es sind zudem ein Verfahren und eine Anordnung für die Bearbeitung von vitalen Einzelzellen und einzelner Zellbestandteile bekannt, die auf der Wirkung von Femtosekundenpulsen im Nahen Infraroten (NIR) Spektralbereich basieren. Eine Gewinnung von Zell- und Gewebematerial, insbesondere von fixiertem Material, zur weiteren DNA- und Proteinanalyse oder zum Anlegen von reinen Zell- und Gewebekulturen ist in diesen Patentanmeldungen ( DE 19719345 A1 ; DE 19719344 A1 ; DE 10223921.5 ; DE 10223922.3 ) nicht vorgesehen.

Aufgabe ist es, ein Verfahren und eine Anordnung zur Markierung und Gewinnung von Biomaterial durch Lasereinwirkung mit hoher Präzision und Schnelligkeit und ohne destruktive Nebeneffekte für das zu untersuchende Objekt unter Umgehung genannter Nachteile bisheriger UVA-Nanosekunden-Lasersysteme bereitzustellen.

Die Aufgabe wird dadurch gelöst, dass erfindungsgemäss ein Verfahren und eine Anordnung zur Markierung und Gewinnung von biologischem Material auf der Basis von Multiphotoneneffekten multipler intensiver ultrakurzer Laserpulse im Pikosekunden- und Femtosekundenbereich mit einer Folgefrequenz im kHz-Bereich und höheren Folgefrequenzen zur präzisen Materialablation in Form von Bohrungen und Schnitten mit typischen Bohr- und Schnittbreiten kleiner 5 μm eingesetzt wird. Die bevorzugte Laserwellenlänge liegt im nahen infraroten Bereich. Es können jedoch insbesondere durch den Einsatz eines Frequenzverdopplers auch Laserpulse im sichtbaren Bereich eingesetzt werden. Eine Einphotonen-Absorption des Substratmoleküls bei der Laserwellenlänge ist nicht erforderlich. Das verwendete Substrat kann transparent sein und muss keine Absorptionsbanden im UVA-Bereich aufweisen. Wird das Substrat, z.B. eine dünne Folie, auf einen weiteren Träger, zum Beispiel ein dünnes Glas aufgebracht, sind keine besonderen Anforderungen an die UV-Durchlässigkeit des Glasses notwendig. Es können somit auch gewöhnliche kostengünstige 170 μm dicke Deckgläser verwendet werden. Durch die Verwendung von ultrakurzen Pulsen im Femtosekunden- und Pikosekundenbereich kann eine hohe Präzision im Submikrometerbereich gewährleistet werden. Die Wirkung basiert dabei auf sogenannten nicht-resonanten Multiphotonen-Absorptionen, wobei mehrere Laserphotonen simultan absorbiert und damit hohe Energien bereitgestellt werden, die ausreichen, einen optischen Durchbruch und eine Ionisierung des Trägermaterials und des biologischen Objektes zu induzieren. Dabei entsteht Plasma, welches für eine Schneidwirkung und eine Materialentfernung genutzt werden kann. Da dieses Plasma nur bei hohen Intensitäten von typischerweise TW/cm² im NIR-Spektralbereich entsteht, kann durch die Verwendung von Laserpulsen geringer Energie im Nanojoule-Bereich oder Subnanojoule-Bereich bei gleichzeitiger Fokussierung auf einen Bearbeitungsspot im Sub-Mikrometerbereich mittels Mikroskopobjektive hoher numerischer Apertur, erreicht werden, dass diese hohen erforderlichen Intensitäten nur in einem geringen Sub-Femtolitervolumen entstehen. Ausserhalb dieses Volumens (Entfernung von weniger als zwei Mikrometer Kantenlänge) ist die Licht-Intensität zu gering, um Multiphotoneneffekte zu bewirken. Damit können geringe Sub-Mikrometer-Schneidbreiten im Substratmaterial (z.B. transparente dünne Trägerfolie) und im biologischen Objekt (Zellbestandteile, Zellen, Gewebe) und somit eine hohe Präzision erreicht werden.

Wird Laserstrahlung im nahen infraroten Bereich, z.B. im Spektralbereich von 750 nm bis 1200 nm, verwendet, können aufgrund fehlender signifikanter Absorption destruktive Wirkungen benachbarter Targetbereiche ausgeschlossen werden. So weist der Absorptionskoeffizient des hauptsächlichen NIR-Absorbers Wasser lediglich Werte kleiner 0,1 cm^–1 (1000 nm) auf. Er ist damit wesentlich geringer als die Absorptionskoeffizienten bei 337 nm von einer Vielzahl endogener UVA-Absorber, wie z.B. die Koenzyme NAD(P)H und Flavine.

Erfindungsgemäss kommen multiple Laserpulse mit typischen Folgefrequenzen im MHz-Bereich zum Einsatz. Mittlere Leistungen im Bereich kleiner 1000 mW sind ausreichend für die optische Gewinnung der biologischen Objekte. Ein typischer Wert ist 200 mW.

Erfindungsgemäss wird bevorzugt ein Beamscanner eingesetzt, der hohe Schneidgeschwindigkeiten ermöglicht. Ein derartiger Beamscanner kann aus zwei Galvanospiegeln bestehen, deren Position und Geschwindigkeit der Targetmorphologie angepasst werden können. Typische Strahlverweilzeiten pro Targetausdehung sind μs/μm.

Der Scanner kann sowohl Bohrungen (Punktbestrahlung bei veränderlicher z-Position), Linienscans, kreisförmige und spiralförmige sowie rechteckige Scans für lineare und gekrümmte Schneidprofile realisieren.

Zudem ermöglicht der Scanner, bei Verwendung geringer Laserleistungen (typischerweise < 10 mW) in Kombination mit geeigneten Photonendetektoren, wie Photomultiplier und CCD-Kameras, hochauflösende nicht-destruktive Aufnahmen mittels der ultrakurzen Laserpulse im Durchlichtmodus, Reflexionsmodus und im Fluoreszenzmodus zu erstellen. So kann durch eine Zwei- und Dreiphotonen- angeregte Fluoreszenz ein 3D-Bild des Targets mit Submikrometerauflösung erstellt werden. Die Bildaufnahme mittels Beamscanner kann nicht nur für die genaue Targetsuche und die genaue Einstellung der Schneidposition genutzt werden, sondern auch zur Beurteilung des Schneidprozesses.

Das durch Multiphotonen-Schneiden isolierte biologische Objekt kann bei Verwendung eines aufrechten Mikroskops infolge Gravitation auf einem darunterliegenden Träger, z.B. ein Lysin-beschichtetes Deckglas oder in einen Probenbehälter (z.B. Eppendorf-Röhrchen), aufgefangen und einer weiteren Analyse oder einer Kultivierung/Klonierung zugeführt werden. Die Gewinnung kann auch in Kombination mit Saugvorrichtungen oder anderen mechanischen Anordnungen durchgeführt werden.

Zudem kann das herausgeschnittene biologische Objekt auch durch Ausnutzung des Strahlungsdrucks des Laserstrahls optisch transportiert werden. Günstigerweise sollte die Laserquelle dafür durch Ausschalten des Mode-Locking-Modus in den kontinuierlich emittierenden (cw) Modus überführt werden. Durch diese Massnahme stehen bei Laserleistungen Kräfte im Pikonewton-Bereich zur Verfügung, die einen optischen Transport ermöglichen und so das herausgeschnittene Material von dem umgebenden Zell- und Gewebematerial isolieren können.

Die Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.
In 1 ist schematisch eine erfindungsgemässe Anordnung dargestellt. Die gepulste Strahlung eines moden-synchronisierten 80 MHz Titan:Saphirlasers (1) mit typischen Pulsbreiten um 80 fs und einer Wellenlänge um 800 nm wird nach Transmission durch einen Galvanoscanner (2), Scanoptik (3) und Leistungsregler (4) in ein aufrechtes Fluoreszenzmikroskop (5) eingekoppelt und nach Reflexion an einem dichroitischen Spiegel (6) mittels Objektiv hoher numerischer Apertur mit motorisch verstellbarer Fokusebene (7) nach Transmission durch ein Deckglas (8) auf die sich auf dem Deckglas befindliche Folie mit Target (9) fokussiert. Als Auffangsubstrat dient ein Lysin-beschichtetes Deckglas (10) welches sich in einem Abstand von einigen Millimetern unter dem Deckglas (8) mit Target (9) befindet. Transmissionsstrahlung und Fluoreszenzstrahlung der Probe (9) kann nach Transmission durch das Auffangsubstrat (10) und den Kondensor (11) mittels Detektor (12) mit Filter (13) erfasst werden. Reflektierte Strahlung und Fluoreszenzstrahlung kann nach Transmission durch den dichroitischen Spiegel (6) und einem Detektor (14) detektiert werden. Aus der Scanposition und dem jeweiligen Detektorsignal kann mittels Rechner (15) und Bildverarbeitungssoftware eine Abbildung des biologischen Objektes erstellt werden. Ein Joystick (16) ermöglicht zudem durch Veränderung der Spiegelposition des Scanners eine schnelle Veränderung der Strahlposition und kann bei cw Laserbetrieb für den optischen Transport des herausgeschnittenen Materials genutzt werden.
In der 2 ist eine erfindungsgemässe Anordnung dargestellt, die für ein steriles Arbeiten zur optischen Gewinnung von biologischem Material geeignet ist. Ein Grundkörper (17) beinhaltet zwei 170 μm dicke Glasfenster (18 und 19), wobei Glas (18) mit einer 1 μm dicken Folie (20) und einem biologischen Objekt (21) versehen ist. Glas (19) ist mit einer 1% Poly-L-Lysinschicht (22) versehen. Beide Gläser sind mittels gasdurchlässigem Silikonring variabler Dicke (23) separiert. Zwischen den Glasfenstern kann sich innerhalb des Silikonrings Luft oder Medium befinden. Durch die Wirkung des Lasers (24) kann das herausgeschnittene biologische Material infolge Gravitation auf das Glas (19) fallen und dort anhaften. Es kann auch der Strahlungsdruck des Lasers für einen Transport zum Glas (19) genutzt werden. Befinden sich auf dem so isolierten Material vitale Zellen, können diese auf dem Glas (19) bei geeignetem Medium und geeigneten Umgebungsbedingungen innerhalb der Anordnung kultiviert werden. Durch Einführung von zwei Kanülen (25 und 26) in den Silikonring kann das herausgeschnittene Material auch abgesaugt oder mittels hydrodynamischem Fluss (Durchflussbetrieb) aus der Anordnung herausgespült werden. Dieses Material kann z.B. mittels steriler Filter aufgefangen werden. Die Kraftwirkung des hydrodynamischen Flusses kann die Abtrennung des bearbeiteten Materials vom umgebenden Material unterstützen.
Die (3) demonstriert die Verwendung des erfindungsgemässen Verfahrens zur Markierung von bestimmten biologischen Arealen innerhalb eines histologischen Schnittes. Anhand vier Linescans wurde mittels 80 MHz NIR-Femtosekunden-Laserpulse einer mittleren Leistung von 200 mW vier ca. 320 μm lange Schnitte als Begrenzung eines interessierenden Mikrobereiches innerhalb des ca. 10 μm dicken Kryoschnittes einer Herzklappe gesetzt. Die Markierung wurde anschliessend genutzt, um nach der Durchführung bestimmter histologischer und molekularbiologischer Färbetechniken das interessierende Material aufzufinden und mikroskopisch zu analysieren.
Die (4) zeigt Resultate von Schneidexperimenten mittels 80 MHz Femtosekundenlaser bei 800 nm zur Gewinnung von auf 1,35 μm dicken Folien aufgebrachtem gefärbtem Gewebematerial der Darm-Muskulatur. Das optisch gewonnene Probenmaterial wurde einer Proteinanalyse mittels SELDI unterzogen.

1: Laser
2: Galvanoscanner
3: Scanoptic
4: Leistungsregler
5: aufrechtes Fluoreszenzmikroskop
6: dichroitischer Spiegel
7: Objektiv
8: Deckglas
9: Target
10: Auffangsubstrat
11: Kondensor
12: Detektor
13: Filter
14: Detektor
15: Rechner
16: Joystick
17: Grundkörper
18: Glasfenster
19: Glasfenster
20: Folie
21: biologisches Objekt
22: Lysinschicht
23: Silikonring
24: Laserstrahl
25: Kanüle 1
26: Kanüle 2

Claims

Verfahren und Anordnung zur Markierung, Isolation und Gewinnung von biologischem Material aus einem Verband biologischer und synthetischer Materialien dadurch gekennzeichnet, dass multiple ultrakurze Laserpulse einer hohen Intensität von mindestens 10¹² W/cm², einer Laserwellenlänge grösser 400 nm, einem maximalen Durchmesser des wirksamen Laserspots von weniger als 5 μm und einer Folgefrequenz von mindestens 1000 Hz eingesetzt werden, wobei die intensiven Laserpulse durch Multiphotonen-Absorption ein Plasma generieren, das durch veränderte Strahlposition im Trägersubstrat und im biologischen Objekt eine Schneidwirkung erzeugt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur Markierung, Isolation und Gewinnung von biologischem Material eine Laserpulsenergie im Bereich 10^–10 J bis 10^–3 J, bevorzugt im Bereich um 3 × 10^–9 J, eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur Markierung, Isolation und Gewinnung von biologischem Material eine Pulsfolgefrequenz bevorzugt im MHz-Bereich zur Anwendung kommt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur Markierung, Isolation und Gewinnung von biologischem Material Laserwellenlängen bevorzugt im Bereich 700 nm bis 1200 nm verwendet werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur Markierung, Isolation und Gewinnung von biologischem Material die veränderte Strahlposition im zu bearbeitenden Objekt durch Beam-Scanning erzielt wird, wobei der Scanner Punktbestrahlungen, Line-Scans und gekrümmte Bestrahlungslinien ermöglichen soll.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur Markierung, Isolation und Gewinnung von biologischem Material die veränderte Strahlposition durch Verschiebung eines motorisierten Mikroskoptisches erzielt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur Markierung, Isolation und Gewinnung von biologischem Material die Scananordnung und Photonendetektoren in Kombination mit den ultrakurzen aber weniger intensiven Laserpulsen einer Intensität kleiner 10^–12 W/cm² für eine Bildgewinnung des zu bearbeitenden Objekts genutzt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur Markierung von biologischem Material präzise Schnitte und Bohrungen innerhalb von Zell- und Gewebematerial durchgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das zu isolierende und gewinnende biologische Material, sich auf einem Substrat, bevorzugt eine dünne Folie, einer maximalen Dicke von 5 μm, bevorzugt kleiner 2 μm, befindet.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat sich durch Adhäsion an Deckgläser binden lässt.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat transparent ist und UV-durchlässig sein kann.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur Isolation und Gewinnung von biologischem Material Schneidwirkungen entlang von geraden oder gekrümmten Linien derart durchgeführt werden, dass das Target komplett von dem umgebenden Material getrennt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur Gewinnung von biologischem Material ein aufrechtes Laserschneid-Mikroskop genutzt wird und das das bearbeitete Material durch Gravitation auf ein Auffangsubstrat fällt.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Auffangsubstrat bevorzugt mit Poly-L-Lysin beschichtet ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur Isolation und Gewinnung von biologischem Material eine geschlossene sterile Kammer verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur Isolation und Gewinnung von biologischem Material mittels Saugwirkung das bearbeitete Material aufgefangen wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur Isolation und Gewinnung von biologischem Material mittels mechanischem Kontakt eines geeigneten Instrumentes, bevorzugt einer Glasnadel, das Material gezielt entfernt und transportiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur Isolation und Gewinnung von biologischem Material das bearbeitete Material mittels eines hydrodynamischen Flusses, z.B. einer laminaren Strömung, entfernt und transportiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur Isolation und Gewinnung von biologischem Material das bearbeitete Material mittels Strahlungsdruck des Laserstrahls optisch bewegt wird, wobei der Laser im kontinuierlich emittierenden Modus arbeitet.
Anordnung nach einem oder mehreren der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur Markierung, Isolation und Gewinnung von biologischem Material, dass ein modensynchronisierter Laser mit einer Emission im Wellenlängenbereich 400 nm bis 1200 nm, einer Pulsdauer im Bereich 10^–15 s bis 10^–10 s, einer Intensität von mindestens 10¹² W/cm², einer Pulsfolgefrequenz von mindestens 1000 Hz mit einer mikroskopischen Scanning-Anordnung mit Photonendetektoren für eine Bildgewinnung gekoppelt ist.
Anordnung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Kammer zwei Glasfenster (18 und 19) enthält, wobei Glas (18) mit einem Substrat (20) und einem biologischen Objekt (21) versehen ist. Glas (19) ist bevorzugt mit einer Poly-L-Lysinschicht (22) versehen. Beide Gläser sind bevorzugt mittels gasdurchlässigem Silikonring variabler Dicke (23) separiert. Zwischen den Glasfenstern kann sich innerhalb des Silikonrings Luft oder Medium befinden. Durch die Wirkung des Lasers (24) kann das herausgeschnittene biologische Material infolge Gravitation auf das Glas (19) fallen und dort anhaften.
Anordnung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Kammer einen Abfluss und einen Zufluss enthält, durch die ein hydrodynamischer Fluss erzeugt wird, der zur Isolierung und Gewinnung des isolierten Materials genutzt werden kann.