DE10329674B4

DE10329674B4 - Laserverfahren und Anordnung zur Markierung und Gewinnung von Materialien, Zellbestandteilen, Zellen und Gewebebestandteilen

Info

Publication number: DE10329674B4
Application number: DE2003129674
Authority: DE
Inventors: Prof. Dr. König Karsten; Dr. Riemann Iris
Original assignee: Individual
Current assignee: Jenlab De GmbH
Priority date: 2003-06-30
Filing date: 2003-06-30
Publication date: 2014-08-14
Anticipated expiration: 2023-07-01
Also published as: DE10329674A1

Abstract

Verfahren zur Markierung und Isolation von biologischem Material ausgehend von einem auf einem Trägersubstrat aus synthetischem Material aufgebrachten biologischem Material, dadurch gekennzeichnet, dass multiple ultrakurze Laserpulse einer Intensität von mindestens 1012 W/cm2, einer Laserwellenlänge größer als 400 nm, einem maximalen Durchmesser des wirksamen Laserstrahls von weniger als 5 µm und einer Pulsfolgefrequenz im MHz Bereich eingesetzt werden, wobei das entstehende Plasma genutzt wird, um durch eine Veränderung der Strahlposition im Trägersubstrat sowie im biologischen Material eine Schneidwirkung zu erzeugen.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Anordnung zur optischen Markierung und zur Gewinnung von biologischen Materialien mittels gepulster ultrakurzer Laserstrahlung. Das Verfahren und die Anordnung sind geeignet, bestimmte Bereiche von Chromosomen, von Metaphaseplatten, einzelne Zellen und Zellcluster sowie Gewebebereiche aus einem Biomolekülverband, Zell- und Gewebeverband sowie einer Unterlage (Substrat) herauszuschneiden und damit zu isolieren sowie dieses Material einer weiteren Analyse, z. B. Proteinanalyse, RNA-Analyse und DNA-Analyse, zuzuführen. Zudem kann das mittels Laserstrahlung isolierte Material für die Gewinnung reiner Zell- und Gewebekulturen genutzt werden. Auch ist eine Markierung von bestimmten biologischen Strukturen in einem Zell- und Gewebeverband möglich.
Es sind Applikationen von gepulsten Lasersystemen zur Gewinnung von Zell- und Gewebematerial bekannt. Üblicherweise werden dabei gepulste Laser mit Pulsbreiten im Nanosekunden-Bereich, Pulsfolgefrequenzen im Bereich von wenigen Hertz (Hz), einer Pulsenergie im µJ-Bereich und mit einer Laserwellenlänge im ultravioletten (UV) Spektralbereich eingesetzt (Meier-Ruge et al., Histochem. J. 8(1976)387–401; Kubo et al., Cancer Res. 55(1995)989–990; Schütze und Lahr, Nature Biotechnology 16(1998)737–742). Ein solches typisches Lasersystem besteht aus einem gepulsten Stickstoff Laser bei einer Emissionswellenlänge von 337 nm in Kombination mit einem handelsüblichen Fluoreszenzmikroskop (Schütze und Lahr, Nature Biotechnology 16(1998)737–742). Die Laserstrahlung wird mittels Umlenkspiegel zum Mikroskopobjektiv geführt und dort auf das Target fokussiert. Ein solches Target kann eine einige Mikrometer dicke Polymer-Folie (z. B. ca. 1 µm dicke Polyethylenmembran) sein, auf der sich zum Beispiel fixierte Chromosomen, fixierte Zellansammlungen oder histologische Schnitte einer kryokonservierten oder chemisch fixierten Gewebebiopsie befinden (Schütze und Lahr, Nature Biotechnology 16(1998)737–742). Es können sich auch vitale Zellen oder Gewebebestandteile auf dem Substrat befinden. Üblicherweise wird der Mikroskoptisch mit der zu bearbeitenden Probe bei fixem Strahlverlauf motorisiert bewegt. Durch Absorption der UV-Strahlung durch die Folienbestandteile kann die Folie einschließlich des darüber liegenden biologischen Materials bearbeitet werden. Der Bearbeitungsprozess basiert auf der ablativen Photodekomposition, auch kalte Ablation genannt, da keine signifikanten thermischen Destruktionsprozesse auftreten (Srinivasan und Leigh, Appl. Phys. Lett. 104(1982)6784; Srinivasan, Science 234(1986)559–561). UV-Ablation wird auch zur Bearbeitung der Cornea in der Augentherapie eingesetzt (Srinivasan, Science 234(1986)559–561). Die UV-Ablation kann für eine Schneidwirkung eingesetzt werden, so dass ein interessierendes Areal auf dem Substrat, z. B. einer Polymerfolie, von der Umgebung getrennt werden kann. Das Verfahren wird auch kontaktfreie Mikrodissektion genannt. Mittels zum Beispiel Saugeinrichtungen und Kontakt zu Glasspitzen kann dieses isolierte Material (Probe) gewonnen und zum Beispiel einer weiteren molekularbiologischen Verfahren zur Analyse unterzogen werden. Die Probe kann auch durch UV-Laser induzierte mechanische Wirkungen nach dem Schneidvorgang gewonnen werden, auch "Laser Pressure Catapulting" genannt (Patent EP 879 408 B1 ). Dabei wird das mit hoher Geschwindigkeit während der UV-Ablation mit energiereichen Pulsen entstehende sich ausdehnende Plasma genutzt, das geschnittene Material wegzuschleudern. Üblicherweise werden dabei doppelt so hohe Pulsenergien wie zum Schneiden der Folie mit Target eingesetzt (Schütze und Lahr, Nature Biotechnology 16(1998)737–742).
Das zu isolierende biologische Objekt wird üblicherweise mit einem Mikroskop im Durchlichtverfahren mittels Weißlichtquelle (Halogenlampe) und Videokamera lokalisiert.
Die Auflösung ist gering und beträgt mehrere Mikrometer. Eine genaue 3D-Targetsuche ist nicht gegeben.
Die Analyse des mittels UV-Laser isolierten und chemisch bearbeiteten Zell- und Gewebematerials beinhaltet z. B. die Gen-/DNA-Analyse nach PCR (Polymer Chain Reaction)-Amplifkation von optisch isoliertem DNA-Material, die RNA-Analyse und die Proteinanalyse mittels SELDI- und MALDI-Verfahren. Die UV-Laser induzierte Gewinnung von isoliertem Zell- und Gewebematerial kann prinzipiell auch für die Kultivierung und Klonierung von Zellen genutzt werden.
Nachteile dieses bisherigen optischen Verfahrens mittels UV-Laserpulse im Nanosekundenbereich zur Gewinnung von Zell- und Gewebematerial sind die mögliche Veränderung des zu analysierenden Materials durch Absorption der UV-Laserstrahlung, deren destruktive Wirkung einschließlich mutagener Effekte bekannt sind. Da die UV-Strahlung nicht nur im Fokusbereich sondern auch im gesamten Bestrahlungsfeld vom zu analysierenden Target absorbiert werden kann, besteht so die Gefahr, dass z. B. Laser-induzierte DNA-Strangbrüche die Gen-/DNA-Analysen behindern oder verfälschen. Auch wenn die 337 nm Strahlung des Stickstoff-Lasers nicht direkt von der DNA und den Proteinen absorbiert wird, können dennoch erhebliche Destruktionseffekte durch indirekte Wirkungen einschließlich DNA-Strangbrüchen entstehen. So wird generell UVA-Strahlung (320 nm–400 nm) von einer Vielzahl endogener Zellabsorber, wie die essentiellen Koenzyme NAD(P)H und Flavine, absorbiert. Dies kann zur Generation von toxisch wirkenden reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) führen. So wurde demonstriert, dass UVA-Strahlung den Zellmetabolismus beeinflusst, das Reproduktionsverhalten schädigen kann, das Zytoskelett in Mitleidenschaft gezogen werden kann und DNA-Schäden induziert werden können. Allgemein ist bekannt, das UVA-Strahlung Hautkrebs auslösen kann (z. B. König et al., Biomedical Optics 1(1996),217–222; Dube et al. Radiation Environmental Biophysics 40(2001)77–82; Zamansky und Chou, J. Invest. Dermatol. 89(1987) 603–606; Pourzand und Tyrrell, Sci. USA, 96 (1999)6751–6756; Moyen et al. J. Photochem. Photobiol. B 29 (1995) 59–63).
Ein weiterer Nachteil der bisherigen UVA-Laserablation von biologischem Material besteht in der geringen Schnittqualität. Diese Schnittqualität ist einerseits durch die geringe Strahlqualität des Stickstofflasers, welcher ein Superstrahler ist, und den damit verbundenen Bestrahlungs-Spot gegeben. Andererseits ist die Schnittqualität von Nanosekundenlasern üblicherweise geringer als die mit Femtosekundenlasern. So konnten mit Femtosekundenlasern Schnittbreiten in humanen Chromosomen von weniger als 150 Nanometern erzeugt werden (König et al., Opt. Lett. 26(2001)819–821), während die typischen Schnittbreiten mit dem Stickstofflaser im Mikrometerbereich liegen. Die Gewinnung von biologischem Material mittels Stickstofflaser ist damit auf Objekte mit einer minimalen Ausdehnung von mehreren Mikrometern begrenzt.
Aus der US-PS 5,720,894 A ist es bekannt, eine Trennung von biologischem Material mittels Plasmabildung eines Lasers vorzunehmen. Bei der dort beschriebenen Vorrichtung wird das Signal des gepulsten Lasers verstärkt. Damit kann systembedingt nur eine Pulsfolgefrequenz erreicht werden, die nicht höher sein als im einstelligen kHz-Bereich. Dadurch muss das Plasma eine entsprechend hohe Energie haben, um das biologische Gewebe auch bei dieser Pulsfolgefrequenz schneiden zu können.
Nachteilig ist auch die bisherige Methode der Targeterkennung, die üblicherweise auf einem mit einer Videokamera aufgenommenen zweidimensionalen Weißlichtbild geringer Auflösung basiert. Die geringe Auflösung limitiert die Präzision der optischen Gewinnung des biologischen Objektes. Das zu isolierende biologische Objekt muss zudem genügend Kontrast aufweisen, um im Durchlicht lokalisiert zu werden.
Ein weiterer Nachteil ist die Verwendung von Pulsfolgefrequenzen im Hertz-Bereich, typischerweise kleiner 30 Hz. Es werden somit nur einzelne energiereiche Laserpulse für die Schneidwirkung verwendet. Beim Laser Pressure Catapulting wird typischerweise nur ein Einzelpuls verwendet. Dadurch können nur geringe Schnittgeschwindigkeiten erreicht werden. Auch ist die Geschwindigkeit des motorisch gesteuerten Mikroskoptisches sehr limitiert.
Nachteilig ist weiterhin, dass die Wirkung auf der UV-Absorption basiert und daher nur bestimmte UV-absorbierende Trägermaterialien (z. B. Folien mit erheblichem Anteil an aromatischen Polykondensaten), deren Absorptionsvermögen der UV-Laserwellenlänge angepasst ist, verwendet werden können ( EP 879 408 B1 ).
Da die Trägermaterialien üblicherweise auf Glas aufgetragen sind, muss zudem ein UV-durchlässiges Spezialglas verwendet werden.
Es sind zudem Verfahren zur Lasermikrodissektion zur Gewinnung von Zell- und Gewebematerial bekannt, die auf der Wärmewirkung sichtbarer und infraroter Laser in Kombination mit einem wärmeempfindlichen Substratmaterial basieren (Schindler et al. Methods Cell Biol. 32(1989)423–446; Emmert-Buck et al. Science 274(1996)998–1001). Jedoch ist der Einsatzbereich dieser laserthermischen Verfahren typischerweise auf Targets größer 30 µm limitiert.
In der japanischen Offenlegungsschrift JP H05-76342 A (Veröffentlichungsdatum: 30.3.1993) ist eine Apparatur zur Gewinnung von mikroskopischen Objekten beschrieben worden, die auf der Applikation multipler kontinuierlich emittierender Laserquellen beruht.
Es sind zudem ein Verfahren und eine Anordnung für die Bearbeitung von vitalen Einzelzellen und einzelner Zellbestandteile bekannt, die auf der Wirkung von Femtosekundenpulsen im Nahen Infraroten (NIR) Spektralbereich basieren. Eine Gewinnung von Zell- und Gewebematerial, insbesondere von fixiertem Material, zur weiteren DNA- und Proteinanalyse oder zum Anlegen von reinen Zell- und Gewebekulturen ist in diesen Patentanmeldungen ( DE 197 19 345 A1 ; DE 197 19 344 A1 ; DE 102 23 921 A1 ; DE 102 23 922 A1 ) nicht vorgesehen.
Aus der DE 100 39 979 A1 ist eine Vorgehensweise bekannt, bei der biologisches Material auf ein synthetisches Trägermaterial gebracht wird. Es ist beschrieben, dass das biologische Material mit einem Laser geschnitten wird. Nähere Angaben zum Laser sowie zu dessen Betriebsweise sind in diesem Stand der Technik nicht genannt.
Aufgabe ist es, ein Verfahren und eine Anordnung zur Markierung und Gewinnung von Biomaterial durch Lasereinwirkung mit hoher Präzision und Schnelligkeit und ohne destruktive Nebeneffekte für das zu untersuchende Objekt unter Umgehung genannter Nachteile bisheriger UVA-Nanosekunden-Lasersysteme bereitzustellen.
Die Aufgabe wird dadurch gelöst, dass erfindungsgemäß nach Anspruch 1 ein Verfahren zur Markierung und Isolierung von biologischem Material auf der Basis von Multiphotoneneffekten multipler intensiver ultrakurzer Laserpulse mit einer Folgefrequenz im MHz-Bereich zur präzisen Materialablation in Form von Bohrungen und Schnitten mit typischen Bohr- und Schnittbreiten kleiner 5 µm eingesetzt wird.
Es hat sich gezeigt, dass durch die intensiven Laserpulse durch Multiphotonen-Absorption ein Plasma generiert wird, das nach der vorliegenden Erfindung genutzt werden kann.
Die Pulsdauer der Laserpulse kann in der Größenordnung von 10^–15 s bis 10^–10 s liegen.
Die bevorzugte Laserwellenlänge liegt im nahen infraroten Bereich. Es können jedoch insbesondere durch den Einsatz eines Frequenzverdopplers auch Laserpulse im sichtbaren Bereich eingesetzt werden.
Eine Einphotonen-Absorption des Substratmoleküls bei der Laserwellenlänge ist nicht erforderlich. Das verwendete Substrat kann transparent sein und muss keine Absorptionsbanden im UVA-Bereich aufweisen.
Wird das Substrat, z. B. eine dünne Folie, auf einen weiteren Träger, zum Beispiel ein dünnes Glas aufgebracht, sind keine besonderen Anforderungen an die UV-Durchlässigkeit des Glases notwendig. Es können somit auch gewöhnliche kostengünstige 170 µm dicke Deckgläser verwendet werden.
Durch die Verwendung von ultrakurzen Pulsen im Femtosekunden- und Pikosekundenbereich kann eine hohe Präzision im Submikrometerbereich gewährleistet werden. Die Wirkung basiert dabei auf sogenannten nicht-resonanten Multiphotonen-Absorptionen, wobei mehrere Laserphotonen simultan absorbiert und damit hohe Energien bereitgestellt werden, die ausreichen, einen optischen Durchbruch und eine Ionisierung des Trägermaterials und des biologischen Objektes zu induzieren. Dabei entsteht Plasma, welches für eine Schneidwirkung und eine Materialentfernung genutzt werden kann. Da dieses Plasma nur bei hohen Intensitäten von typischerweise TW/cm² im NIR-Spektralbereich entsteht, kann durch die Verwendung von Laserpulsen geringer Energie im Nanojoule-Bereich oder Subnanojoule-Bereich bei gleichzeitiger Fokussierung auf einen Bearbeitungsspot im Sub-Mikrometerbereich mittels Mikroskopobjektive hoher numerischer Apertur, erreicht werden, dass diese hohen erforderlichen Intensitäten nur in einem geringen Sub-Femtolitervolumen entstehen. Außerhalb dieses Volumens (Entfernung von weniger als zwei Mikrometer Kantenlänge) ist die Licht-Intensität zu gering, um Multiphotoneneffekte zu bewirken. Damit können geringe Sub-Mikrometer-Schneidbreiten im Substratmaterial (z. B. transparente dünne Trägerfolie) und im biologischen Objekt (Zellbestandteile, Zellen, Gewebe) und somit eine hohe Präzision erreicht werden.
Wird Laserstrahlung im nahen infraroten Bereich, z. B. im Spektralbereich von 750 nm bis 1200 nm, verwendet, können aufgrund fehlender signifikanter Absorption destruktive Wirkungen benachbarter Targetbereiche ausgeschlossen werden. So weist der Absorptionskoeffizient des hauptsächlichen NIR-Absorbers Wasser lediglich Werte kleiner 0,1 cm^–1 (1000 nm) auf. Er ist damit wesentlich geringer als die Absorptionskoeffizienten bei 337 nm von einer Vielzahl endogener UVA-Absorber, wie z. B. die Koenzyme NAD(P)H und Flavine.
Erfindungsgemäß kommen multiple Laserpulse mit typischen Folgefrequenzen im MHz-Bereich zum Einsatz. Mittlere Leistungen im Bereich kleiner 1000 mW sind ausreichend für die optische Gewinnung der biologischen Objekte. Ein typischer Wert ist 200 mW.
Erfindungsgemäß wird bevorzugt ein Strahlscanner eingesetzt, der hohe Schneidgeschwindigkeiten ermöglicht. Ein derartiger Strahlscanner kann aus zwei Galvanospiegeln bestehen, deren Position und Geschwindigkeit der Targetmorphologie angepasst werden können. Typische Strahlverweilzeiten pro Targetausdehung sind µs/µm.
Der Scanner kann sowohl Bohrungen (Punktbestrahlung bei veränderlicher z-Position), Linienscans, kreisförmige und spiralförmige sowie rechteckige Scans für lineare und gekrümmte Schneidprofile realisieren.
Zudem ermöglicht der Scanner, bei Verwendung geringer Laserleistungen (typischerweise < 10 mW) in Kombination mit geeigneten Photonendetektoren, wie Photomultiplier und CCD-Kameras, hochauflösende nicht-destruktive Aufnahmen mittels der ultrakurzen Laserpulse im Durchlichtmodus, Reflexionsmodus und im Fluoreszenzmodus zu erstellen. So kann durch eine Zwei- und Dreiphotonen – angeregte Fluoreszenz ein 3D-Bild des Targets mit Submikrometerauflösung erstellt werden. Die Bildaufnahme mittels Strahlscanner kann nicht nur für die genaue Targetsuche und die genaue Einstellung der Schneidposition genutzt werden, sondern auch zur Beurteilung des Schneidprozesses.
Das durch Multiphotonen-Schneiden isolierte biologische Objekt kann bei Verwendung eines aufrechten Mikroskops infolge Gravitation auf einem darunter liegenden Träger, z. B. ein Lysin-beschichtetes Deckglas oder in einen Probenbehälter (z. B. Eppendorf-Röhrchen), aufgefangen und einer weiteren Analyse oder einer Kultivierung/Klonierung zugeführt werden. Die Gewinnung kann auch in Kombination mit Saugvorrichtungen oder anderen mechanischen Anordnungen durchgeführt werden. Dies kann ein hydrodynamischer Fluss sein, wie beispielsweise eine laminare Strömung.
Zudem kann das herausgeschnittene biologische Objekt auch durch Ausnutzung des Strahlungsdrucks des Laserstrahls optisch transportiert werden. Günstigerweise sollte die Laserquelle dafür durch Ausschalten des Mode-Locking-Modus in den kontinuierlich emittierenden (cw) Modus überführt werden. Durch diese Maßnahmen stehen bei Laserleistungen Kräfte im Pikonewton-Bereich zur Verfügung, die einen optischen Transport ermöglichen und so das herausgeschnittene Material von dem umgebenden Zell- und Gewebematerial isolieren können.
Die Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.
In ist schematisch eine erfindungsgemäße Anordnung dargestellt. Die gepulste Strahlung eines moden-synchronisierten 80 MHz Titan: Saphirlasers (1) mit typischen Pulsbreiten um 80 fs und einer Wellenlänge um 800 nm wird nach Transmission durch einen Galvanoscanner (2), Scanoptik (3) und Leistungsregler (4) in ein aufrechtes Fluoreszenzmikroskop (5) eingekoppelt und nach Reflexion an einem dichroitischen Spiegel (6) mittels Objektiv hoher numerischer Apertur mit motorisch verstellbarer Fokusebene (7) nach Transmission durch ein Deckglas (8) auf die sich auf dem Deckglas befindliche Folie mit Target (9) fokussiert. Als Auffangsubstrat dient ein Lysin-beschichtetes Deckglas (10) welches sich in einem Abstand von einigen Millimetern unter dem Deckglas (8) mit Target (9) befindet. Transmissionsstrahlung und Fluoreszenzstrahlung der Probe (9) kann nach Transmission durch das Auffangsubstrat (10) und den Kondensor (11) mittels Detektor (12) mit Filter (13) erfasst werden. Reflektierte Strahlung und Fluoreszenzstrahlung kann nach Transmission durch den dichroitischen Spiegel (6) und einem Detektor (14) detektiert werden. Aus der Scanposition und dem jeweiligen Detektorsignal kann mittels Rechner (15) und Bildverarbeitungssoftware eine Abbildung des biologischen Objektes erstellt werden. Ein Joystick (16) ermöglicht zudem durch Veränderung der Spiegelposition des Scanners eine schnelle Veränderung der Strahlposition und kann bei cw Laserbetrieb für den optischen Transport des herausgeschnittenen Materials genutzt werden.
In der ist eine erfindungsgemäße Anordnung dargestellt, die für ein steriles Arbeiten zur optischen Gewinnung von biologischem Material geeignet ist. Ein Grundkörper (17) beinhaltet zwei 170 µm dicke Glasfenster (18 und 19), wobei Glas (18) mit einer 1 µm dicken Folie (20) und einem biologischen Objekt (21) versehen ist. Glas (19) ist mit einer 1% Poly-L-Lysinschicht (22) versehen. Beide Gläser sind mittels gasdurchlässigem Silikonring variabler Dicke (23) separiert. Zwischen den Glasfenstern kann sich innerhalb des Silikonrings Luft oder Medium befinden. Durch die Wirkung des Lasers (24) kann das herausgeschnittene biologische Material infolge Gravitation auf das Glas (19) fallen und dort anhaften. Es kann auch der Strahlungsdruck des Lasers für einen Transport zum Glas (19) genutzt werden. Befinden sich auf dem so isolierten Material vitale Zellen, können diese auf dem Glas (19) bei geeignetem Medium und geeigneten Umgebungsbedingungen innerhalb der Anordnung kultiviert werden. Durch Einführung von zwei Kanülen (25 und 26) in den Silikonring kann das herausgeschnittene Material auch abgesaugt oder mittels hydrodynamischem Fluss (Durchflussbetrieb) aus der Anordnung herausgespült werden. Dieses Material kann z. B. mittels steriler Filter aufgefangen werden. Die Kraftwirkung des hydrodynamischen Flusses kann die Abtrennung des bearbeiteten Materials vom umgebenden Material unterstützen.
Die ( ) demonstriert die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Markierung von bestimmten biologischen Arealen innerhalb eines histologischen Schnittes. Anhand vier Linescans wurde mittels 80 MHz NIR-Femtosekunden-Laserpulse einer mittleren Leistung von 200 mW vier ca. 320 µm lange Schnitte als Begrenzung eines interessierenden Mikrobereiches innerhalb des ca. 10 µm dicken Kryoschnittes einer Herzklappe gesetzt. Die Markierung wurde anschließend genutzt, um nach der Durchführung bestimmter histologischer und molekularbiologischer Färbetechniken das interessierende Material aufzufinden und mikroskopisch zu analysieren.
Die (4) zeigt Resultate von Schneidexperimenten mittels 80 MHz Femtosekundenlaser bei 800 nm zur Gewinnung von auf 1,35 µm dicken Folien aufgebrachtem gefärbtem Gewebematerial der Darm-Muskulatur. Das optisch gewonnene Probenmaterial wurde einer Proteinanalyse mittels SELDI unterzogen.
Bezugszeichenliste

1: Laser
2: Galvanoscanner
3: Scanoptic
4: Leistungsregler
5: aufrechtes Fluoreszenzmikroskop
6: dichroitischer Spiegel
7: Objektiv
8: Deckglas
9: Target
10: Auffangsubstrat
11: Kondensor
12: Detektor
13: Filter
14: Detektor
15: Rechner
16: Joystick
17: Grundkörper
18: Glasfenster
19: Glasfenster
20: Folie
21: biologisches Objekt
22: Lysinschicht
23: Silikonring
24: Laserstrahl
25: Kanüle 1
26: Kanüle 2

Claims

Verfahren zur Markierung und Isolation von biologischem Material ausgehend von einem auf einem Trägersubstrat aus synthetischem Material aufgebrachten biologischem Material, dadurch gekennzeichnet, dass multiple ultrakurze Laserpulse einer Intensität von mindestens 10¹² W/cm², einer Laserwellenlänge größer als 400 nm, einem maximalen Durchmesser des wirksamen Laserstrahls von weniger als 5 µm und einer Pulsfolgefrequenz im MHz Bereich eingesetzt werden, wobei das entstehende Plasma genutzt wird, um durch eine Veränderung der Strahlposition im Trägersubstrat sowie im biologischen Material eine Schneidwirkung zu erzeugen.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Laserpulsenergie von 10^–10 J bis 10^–3 J, bevorzugt 3 × 10^–9 J, eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass Laserwellenlängen im Bereich 700 nm bis 1200 nm verwendet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Veränderung der Strahlposition im zu bearbeitenden Objekt durch Strahl-Scanning erzielt wird, wobei der Scanner Punktbestrahlungen, Linienscans und gekrümmte Bestrahlungslinien ermöglicht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Veränderung der Strahlposition durch eine Verschiebung eines motorisierten Mikroskoptisches erzielt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Scananordnung und Photonendetektoren in Kombination mit ultrakurzen Laserpulsen mit einer Intensität kleiner als 10¹² W/cm² für eine Bildgewinnung des zu bearbeitenden Objekts genutzt werden.
Verfahren nach einem der vorher gehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur Markierung von biologischem Material Schnitte und Bohrungen mit einer Dicke von 5 µm innerhalb von Zell- und Gewebematerial durchgeführt werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sich das zu isolierende biologische Material auf einem Substrat, bevorzugt einer dünnen Folie mit einer maximalen Dicke von 5 µm, bevorzugt kleiner 2 µm, befindet.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat durch Adhäsion an Deckgläser gebunden wird.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat transparent ist.
Verfahren nach einem der vorher gehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur Isolation von biologischem Material Schneidwirkungen entlang von geraden oder gekrümmten Linien derart durchgeführt werden, dass das Target komplett von dem umgebenden Material getrennt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur Isolation von biologischem Material ein aufrechtes Laserschneid-Mikroskop genutzt wird und dass das bearbeitete Material durch Gravitation auf ein Auffangsubstrat fällt.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Auffangsubstrat mit Poly-L-Lysin beschichtet ist.
Verfahren nach einem der vorher gehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur Isolation von biologischem Material eine geschlossene sterile Kammer verwendet wird.
Verfahren nach einem der vorher gehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur Isolation von biologischem Material mittels Saugwirkung das bearbeitete Material aufgefangen wird.
Verfahren nach einem der vorher gehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur Isolation von biologischem Material mittels mechanischem Kontakt eines geeigneten Instrumentes, bevorzugt einer Glasnadel, das Material gezielt entfernt und transportiert wird.
Verfahren nach einem der vorher gehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur Isolation von biologischem Material das bearbeitete Material mittels eines hydrodynamischen Flusses entfernt und transportiert wird.
Verfahren nach einem der vorher gehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur Isolation von biologischem Material das bearbeitete Material mittels Strahlungsdruck des Laserstrahls optisch bewegt wird, wobei der Laser im kontinuierlich emittierenden Modus arbeitet.
Vorrichtung zur Durchführung eines der vorgenannten Verfahren, dadurch gekennzeichnet, dass zur Markierung und Isolation von biologischem Material ein modensynchronisierter Laser mit einer Emission im Wellenlängenbereich von 400 nm bis 1200 nm, einer Pulsdauer von 10^–15 s bis 10^–10 s, einer Intensität von mindestens 10¹² W/cm², einer Pulsfolgefrequenz von mindestens 1000 Hz mit einer mikroskopischen Scanning-Anordnung mit Photonendetektoren für eine Bildbewegung gekoppelt ist.
Vorrichtung nach Anspruch 19 zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Kammer zwei Glasfenster (18 und 19) enthält, wobei das eine Glas (18) mit einem Substrat (20) und einem biologischen Objekt (21) versehen ist, wobei das andere Glas (19) bevorzugt mit einer Poly-L-Lysinschicht (22) versehen sind, wobei beide Gläser mittels einem gasdurchlässigem Silikonring variabler Dicke (23) separiert sind, wobei sich zwischen den Glasfenstern innerhalb des Silikonrings Luft oder ein anderes gasförmiges Medium befindet und wobei durch die Wirkung des Lasers (24) das herausgeschnittene biologische Material infolge Gravitation auf das Glas (19) fällt und dort anhaftet.
Vorrichtung nach Anspruch 19 zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Kammer einen Abfluss und einen Zufluss enthält, durch die ein hydrodynamischer Fluss zur Isolierung und Gewinnung des isolierten Materials erzeugbar ist.