WO2005033669A1 - Verfahren zur laser-mikrodissektion - Google Patents

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WO2005033669A1
WO2005033669A1 PCT/EP2004/052406 EP2004052406W WO2005033669A1 WO 2005033669 A1 WO2005033669 A1 WO 2005033669A1 EP 2004052406 W EP2004052406 W EP 2004052406W WO 2005033669 A1 WO2005033669 A1 WO 2005033669A1
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WO
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laser
cut
cutting
sample
last
Prior art date
Application number
PCT/EP2004/052406
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English (en)
French (fr)
Inventor
Dieter BÄUERLE
Lucius Remer
Dagmar Elvers
Original Assignee
Leica Microsystems Cms Gmbh
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Publication date
Application filed by Leica Microsystems Cms Gmbh filed Critical Leica Microsystems Cms Gmbh
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    • G01N1/2813—Producing thin layers of samples on a substrate, e.g. smearing, spinning-on
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    • G01N1/04—Devices for withdrawing samples in the solid state, e.g. by cutting
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    • G01N2001/2833—Collecting samples on a sticky, tacky, adhesive surface
    • G01N2001/284—Collecting samples on a sticky, tacky, adhesive surface using local activation of adhesive, i.e. Laser Capture Microdissection
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    • G01N2001/2873—Cutting or cleaving
    • G01N2001/2886—Laser cutting, e.g. tissue catapult

Definitions

  • the invention relates to a method for laser microdissection with the features of the preamble of claim 1.
  • microdissection refers to a process with which a small piece, a so-called dissectate, is cut out of a generally flat sample (for example cells or a tissue section) with a fine, focused laser beam. The cut piece is then available for further biological or medical (e.g. histological) examinations.
  • the samples to be examined, from which sample areas of interest are to be cut out, are prepared on very thin plastic films.
  • the thickness of these plastic films is on the order of 1 to 2 ⁇ m.
  • PET and PEN films are suitable as materials.
  • a method for laser microdissection is described in which the cutting line is not completely closed towards the end of the cut, but at the end a narrow and at the same time stable web remains. This prevents the film with the sample area of interest from folding away and twisting outside the focal plane.
  • the remaining bridge is cut with an extended laser aperture with a last, focused, cutting laser pulse. After completion of the cut, the sample falls under the influence of gravity and is collected in a collecting vessel.
  • the aperture value of the laser beam is referred to as the laser aperture.
  • This collecting device can be, for example, a sample tube, commonly referred to as a PCR tube.
  • a sample tube commonly referred to as a PCR tube.
  • the result is that the dissectates stick to the inside of the PCR tube instead of falling to the bottom of the tube. They are then difficult to inspect, which is useful for the user, for example a pathologist represents the essential work step before further processing of the cut dissectate.
  • This object is achieved by a method for laser microdissection of a sample area of interest of a sample, in which the laser pulses of a pulsed laser beam are focused on the sample, and in which the sample area of interest is cut out by lining up cut holes produced by the laser pulses along a closed cutting line , which according to the invention is characterized in that the mass ablated during the last laser pulse that completes the cut is adapted and optimized to the cutting width of the last cutting laser pulse.
  • the invention is based on considerations that were made after examining the laser cutting process and the flight phase of the cut-out sample areas (also referred to as dissectates). For this purpose, the cutting process and the flight phase of the cut-out sample area after the end of the cutting process were examined with a high-speed camera for a large number of cutting processes.
  • this cutting process is based on local photothermal ablation (“evaporation”) under the action of the focused laser beam.
  • the material which is ablated locally under the action of the laser beam and which propagates in the opposite direction to the direction of incidence of the laser radiation naturally has a mass and a speed and thus an impulse.
  • an impulse of the same size but in the opposite direction is applied to the cut-out sample area. This gives the cut out sample area already due to the laser cutting process an initial speed v 0 .
  • Sample areas with a larger diameter are less strong than those with a smaller diameter. From the image sequences recorded with the high-speed camera, it was also possible to see that for large cut-out sample areas, depending on the initial speed, the flight time between sample and collecting device is significantly reduced over a distance. With a flight distance of, for example, 5 mm, a reduction in the flight time was reduced by a factor of 2-5, depending on the values of the initial speed between minimum and maximum.
  • the idea of the invention is now to maximize this initial speed while maintaining the laser cutting process so that the cut-out sample areas always fall, ie during all cutting processes, to the bottom of the collecting vessel. This also means that for all cut-out sample areas, regardless of their size, the highest possible initial speed should be achieved after completion of the cut in all cutting processes.
  • the initial speeds are different for each laser cut due to the pulse transmission of the cut-out sample areas when cutting according to the previously known methods.
  • the initial speeds are referred to below as v 0 .
  • a lot of material is ablated with the last laser pulse as a result of the plasma formation during the cutting process (sometimes also referred to as "evaporated” for the sake of simplicity).
  • evaporated for the sake of simplicity.
  • the size of the initial speed in the cutting process therefore depends on whether in the laser cutting process
  • the diameter of the laser focus or the cutting width of the laser pulses randomly fits into the circumference of the cutting line as an integer or non-integer.
  • the initial speed of the cut, falling sample area at the beginning of the flight phase thus varies arbitrarily between zero and a maximum value.
  • the mass ablated during the last laser pulse that completes the cut is adapted and optimized to the cutting width of the last cutting laser pulse. This ensures that the largest possible mass is ablated with the last laser pulse of the cut and therefore the pulse transmission from the plasma to the cut-out sample area is optimized, namely as far as possible. This means that the cut-out sample area has the maximum possible initial speed after the cut.
  • the laser beam is directed onto the sample from above, as in the prior art by Isenberg et al. described. This ensures that the cut-out sample area has a high initial speed after the cut and falls safely down into the collecting vessel under the influence of gravity.
  • the cutting laser beam is directed from below through the lens onto the sample.
  • the dissectate is always thrown up reliably and can be collected using a collecting device arranged above the sample.
  • the end of the cutting line that is cut with the last laser pulse that completes the cut can be set equal to the cutting width of the last cutting laser pulse.
  • the cutting width of the laser beam can be constant during the entire cut.
  • this is the simplest version, since means for switching the laser aperture can be dispensed with.
  • the execution of the method is not tied to keeping the cutting width of the laser beam constant during the cutting process.
  • a change in the cutting width of the laser beam during the cutting process, for example also before the last pulse, is in principle conceivable.
  • the cutting width of the laser beam can be kept constant throughout the cut by controlling various device parameters. A possibility of keeping the laser beam aperture and / or the laser energy of the laser beam constant during the entire cut.
  • the sample to be cut is usually applied to a laser-cut plastic film.
  • the plastic film is stretched over a glass slide, for example, and only fixed, for example glued, to the edge of the glass slide.
  • the plastic film is stretched over a frame-shaped holder and fixed to it, so that the plastic film is released in the middle of the frame.
  • the mass of this plastic film ablated during the last laser pulse that completes the cut is adapted and optimized to the cutting width of the last cutting laser pulse.
  • Plastic films which are suitable for laser microdisection such as films made of PEN, PET and POL, are suitable.
  • plastic films made of PEN material have a thickness of 2.0 ⁇ m or more.
  • Plastic films made of PET material have a thickness of 1.3 ⁇ m or preferably more.
  • Plastic films made of polyethylene material have a thickness of 0.9 ⁇ m or preferably more.
  • the plastic film can consist of a layer composite of at least two laser-cut plastic films made of the same or different material. This has the advantage of greater stability of this composite film, so that handling during sample preparation is made easier. In addition, the greater layer thickness achieved also makes it easier to adapt the mass of this composite film ablated during the last laser pulse.
  • a practical implementation of the method is that the end section of the cutting line that can be cut with the last laser pulse is determined.
  • the laser aperture of the laser beam can be used to determine the cutting width of the laser beam.
  • the value of the laser aperture preselected by the user can be recorded and converted into the corresponding cutting width.
  • the cutting width determined in this way corresponds to the maximum end piece of the cutting line that can be cut with the last laser pulse. This end piece is then subtracted from the entire cutting line. The one to be cut before the last laser pulse The cutting line is then cut with possibly overlapping cutting holes of the laser pulses in order to leave the maximum cut end piece of the cutting line free for the last laser pulse.
  • a device for carrying out the method consists of a microscope which has at least one objective defining an optical axis and which is used for viewing a sample with a sample area of interest. It also includes a laser that generates a pulsed laser beam with laser pulses and at least one optical system that couples the laser beam into the lens. It also has a cutting line control unit that generates a relative movement between the laser beam and the sample.
  • the device is additionally characterized in that it has means for adapting and optimizing the mass ablated during the last laser pulse that completes the cut to the cutting width of the last cutting laser pulse.
  • These means can include, for example, means for determining the cutting width of the laser beam and / or a computer for controlling the cutting line control unit in order to keep the end of the cutting line, which represents the mass ablated during the laser pulse, in accordance with the method for the last laser pulse.
  • a sample holder which carries the sample, lies on an xy table, with which different sample areas can be viewed and selected.
  • the device usually has a collecting device with at least one container for collecting a cut-out sample area of interest in the vicinity above or below the sample.
  • the cutting line control unit comprises a movable xy table, which moves the sample relative to the fixed laser beam during cutting. This places very high demands on the positioning accuracy of the xy table in order to achieve a to produce an exact cutting line.
  • the xy table is preferably moved by a motor.
  • the cutting line control unit comprises a laser scanning device which moves the laser beam relative to a fixed sample during cutting. For this, the xy table with the sample holder and the sample lying on it is not moved. The cutting line is created exclusively by deflecting the laser beam over the sample.
  • An embodiment of the device is particularly advantageous in which the laser is assigned a laser control unit which controls the operating parameters of the laser.
  • These operating parameters are, for example, the laser power and the laser aperture, which determine the laser cutting width. It must be taken into account that the cutting width of the laser beam in the sample depends on the absorption behavior of the plastic film used for the preparation and also on that
  • the result of this is that the initial speed of the cut-out sample area assumes maximum values as a result of the plasma generated during the last laser pulse.
  • an autofocus device can be provided for the laser, which ensures safe focusing even with samples of different thicknesses for a clean cut.
  • the microscope is assigned a computer which is used to control the cutting line control unit and the laser control unit. This makes it possible to automate the entire process.
  • means for selecting the cutting line by a user are provided.
  • the user can select the correct sample area of interest before cutting and at the same time protect important areas of the sample from damage, for example by the user being able to place the cutting line on uncritical cell structures of the sample, critical, interesting cell structures become within the sample area of interest when cutting protected. Automation of the method and the device enables use in routine laboratory operation.
  • Fig. 1 a device for laser cutting with a fixed laser beam
  • Fig.2 a device for laser cutting with a movable laser beam
  • 3 a sample with an inventive cut around a sample area of interest
  • 1 shows a device for laser cutting, which works with a fixed laser beam and a sample moved relative to it. It has a microscope 1 with a motor-driven xy table 2.
  • the xy table 2 serves to hold a sample holder 3, on the underside of which a sample 4 to be examined or cut is applied.
  • the sample holder can consist, for example, of a plastic film stretched onto a frame.
  • an illumination system 5 is arranged below the xy table 2.
  • a laser 6 generates a pulsed laser beam 7, which is focused on the sample 4 in order to cut it.
  • the xy-table 2 serves as a cutting line control unit and generates a relative movement between the laser beam 7 and the sample 4 during the cutting process.
  • the individual laser pulses of the laser beam 7 produce cut holes lined up in the sample which are caused by the relative movement between the laser beam 7 and the sample 4 result in a cutting line.
  • the microscope 1 shown is a transmitted light microscope, in which the illumination system 5 is arranged on a microscope stand 8 below the xy table 2 and the sample 4. At least one objective 9 of the microscope 1 is arranged above the xy table 2 and the sample 4. The objective 9 defines an optical axis 10 which is aligned with the optical axis of the lighting system 5.
  • sample 4 is viewed with transmitted light illumination.
  • the laser cutting could also be carried out with an inverted microscope, in which the illumination system 5 is arranged above the xy table 2 and the at least one objective 9 below the xy table 2.
  • the light emitted by the illumination system 5 is directed by a condenser 11 from below onto the sample holder 3 with the sample 4 arranged on the xy table 2.
  • the light penetrating the sample 4 reaches the objective 9 of the microscope 1.
  • the microscope 1 the light is transmitted via lenses and mirrors (not shown) to at least one Eyepiece 12 of the microscope 1 is fed through which an operator can view the sample 4 arranged on the xy table 2.
  • An optical system 13 is provided in the microscope stand 8 of the microscope 1 in the optical axis 10 of the objective 9.
  • the optical system 13 can be a dichroic splitter, for example.
  • the optical system 13 consists of several optical components. This is the case when the laser beam 7 has to be deflected several times.
  • an aperture 14 is provided in the laser beam 7, with which the diameter of the laser beam 7 can be limited in order to set a defined, constant cutting width for the laser cutting process.
  • the aperture 14 can e.g. be designed as a fixed aperture.
  • a plurality of fixed diaphragms 14 can be arranged on a turret disk or a linear slide in order to introduce one of these fixed diaphragms into the beam path as the respectively required diaphragm 14.
  • the introduction into the laser beam 7 can be done manually by the user, but is preferably performed by a motor.
  • the diaphragm 14 is designed as a variable diaphragm, for example as an iris diaphragm, the diameter of which is controlled by a diaphragm motor 15.
  • the aperture motor 15 receives the necessary control signals from a computer 16 for setting the required aperture diameter, which defines the cutting width of the laser beam.
  • the microscope 1 is also provided with a camera 17 which takes an image of the sample 4 to be cut. This image is displayed on a monitor 18 which is connected to the computer 16.
  • the computer 16 can output trigger signals to the laser 6 for triggering laser pulses and for controlling the laser power, control the diaphragm motor 15 and control an auto-focus device (not shown) for the laser 6.
  • the sample area of sample 12 of interest to be cut out is bypassed on the monitor 18 by means of a mouse pointer, thereby defining a desired cutting line.
  • the cutting process is then carried out by means of the laser 4 along the cutting line marked in this way.
  • the xy table 2 When cutting, the xy table 2 is then moved step by step in such a way that the laser beam 7 hits the sample 4 one after the other at the calculated desired position, the remaining cutting line being omitted.
  • the computer 16 In each setpoint position, the computer 16 generates a trigger signal, sends it to the laser 6 and, accordingly, emits a laser pulse which generates a single cut hole in the sample 4. In this way, a closed cutting line 25 is generated with the laser 6 around the sample area 23 of interest.
  • a collecting device with at least one collecting container 19 is arranged below the sample 4. After the cut, the cut-out sample area, which has a high initial speed due to the plasma from the last cutting laser pulse, falls down into this collecting container 19 under the influence of gravity and is collected there.
  • FIG. 2 shows a laser micro-dissection device according to the invention for carrying out the method according to the invention, which moves a laser beam over a held sample during cutting.
  • the laser micro dissection device comprises a microscope 1 with a movable xy table 2 on which a sample holder 3 is arranged.
  • a sample 4 to be cut is located on the underside of the sample holder 3.
  • An illumination system 5 and a condenser 11 which illuminates the sample 4 are arranged under the xy table 2.
  • the xy table 2 is not moved horizontally during the cutting process, that is to say in the x direction and in the y direction.
  • At least one collecting container 19 is arranged below the sample 4 for collecting the cut-out sample area of interest.
  • a laser 6, which is coupled into an illumination beam path 20, emanates from a laser 6, in this example a pulsed UV laser.
  • a laser scan device 21 is arranged in the illumination beam path 20.
  • the laser beam 7 passes through the laser scan device 21 and, via an optical system 13, arrives at a lens 9 which focuses the laser beam 7 on the sample 4.
  • the optical system 13 is preferably designed as a dichromatic splitter, through which an imaging beam path 22 emanating from the sample 4 through the objective 9 reaches at least one eyepiece 12.
  • the setting of the laser scan device 21 and thus the adjustment of the laser beam 7 on the sample 4 is carried out in this embodiment with a motor 23 assigned to the laser scan device 21, a control unit 24 and a computer 16.
  • the motor 23 is included connected to the control unit 24, which supplies the control signals for controlling the motor 23.
  • the control unit 24 is connected to the computer 16, to which a monitor 18 is connected.
  • the image of the sample 4 recorded by a camera 17 is displayed on the monitor 18.
  • a desired target cutting line can be defined on the monitor 18 in the camera image.
  • the computer 16 is also connected to the laser light source 6 and only supplies it with trigger signals for triggering laser pulses when a cut hole is produced.
  • the laser scan device 21 itself serves as a cutting line control unit, which generates a relative movement between the laser beam 7 and the sample 4 during the cutting process.
  • the laser beam 7 can be focused in height by manually moving the xy table 2 with simultaneous visual control of the camera image by a user.
  • an embodiment of the device which comprises an autofocus device (not shown) for the laser beam 7 is more user-friendly.
  • the laser scan device 21 By actuating the laser scan device 21, the laser beam 7 appears at the output of the laser scan device 21 at different deflection angles. By varying the deflection angle, the laser beam 7 can be guided to any positions on the sample 4 that lie within the field of view of the objective 10.
  • suitable control of the laser scanning device 21 a large number of cut holes are generated with the individual laser pulses of the laser beam 7 on the sample 4, which are arranged contiguously and thus produce a cutting line.
  • the cutting width of a laser in a sample depends on the
  • Laser parameters e.g. Laser power and aperture of the laser beam 7, and the nature of the sample (thickness, staining, type of sample material, etc.).
  • This cutting width is determined beforehand or is stored in a table in the computer 16 as a function of the laser parameters and the sample material.
  • a number of target positions of the individual cutting holes of the laser pulses on the sample 4 are calculated, the target positions of the cutting holes arranged in a row yielding the desired target cutting line.
  • the target positions on the sample 4 are approached with the laser scanning device 21. Every time the target position of the laser beam 7 on the sample 4 has been prepared or set by means of the laser scanning device 21, the computer 16 supplies trigger signals for triggering laser pulses to the laser light source 6. In this way, the cutting line is generated step by step.
  • an end piece is released at the end of the cutting line, which is matched to the cutting width of the laser beam 7 to the cutting width of the last laser pulse.
  • This end of the cutting line is cut with a last laser pulse.
  • the sample area of interest is completely separated from sample 4 and falls under the action of gravity into the receptacle 19 arranged below.
  • a schematic camera image of a sample 4 with a plurality of cells 25 is shown.
  • a sample area 26 of interest Approximately in the middle of the sample 4 is a sample area 26 of interest in which a different cell structure 27, e.g. a cancer cell or a cell with a genetic code of interest. This sample area 26 of interest is to be cut out of sample 4 for further investigations.
  • a user uses a computer mouse to mark a desired target cutting line for the sole cutting process to be carried out in the camera image.
  • the desired spot width and thus the cutting width of the laser beam 7 is then set. This can be done by the user, for example menu-driven.
  • the cutting width of the laser beam 7 is controlled by a control software of the device
  • an end piece 28 of the desired target cutting line is kept free, which is to be cut with the last laser pulse.
  • This end piece 28 of the cutting line 30 corresponds to a mass to be cut at the end of the cutting process, which has to be ablated with the last laser pulse.
  • the mass ablated during the last laser pulse that completes the cut is adapted to the cutting width of the last cutting laser pulse.
  • This end piece 28 is the cutting line 30 for example depending on the absorption behavior of the plastic film and the sample and the film thickness.
  • the computer 16 becomes a defined target cutting line, which, however, has been reduced by the free end piece 28 of the cutting line 30, a number of target positions for the individual Laser pulses of the laser beam 7 calculated on the sample 4.
  • a cut hole 29 is then created at each target position of a laser pulse.
  • the target positions of the laser beam 7 which are lined up in succession result in the desired target cutting line.
  • the cutting widths of the individual laser pulses are positioned more or less overlapping on the target cutting line in order to keep the end piece 28 of the cutting line 30 free.
  • the cut holes 29 strung together in this way result in the actual cut line 30.
  • the free end piece 28 of the cut line 30 is cut with the last laser pulse and thus the cut line 30 is completed.
  • the initial speed of the cut-out sample region 26 after the cut is optimized for each cutting process carried out in this way. Optimized means that the initial speed is at its maximum in the best case or as optimally large as can be set after knowledge of the respective current cutting width of the laser beam.

Abstract

Es wird ein Verfahren zur Laser-Mikrodissektion eines interessierenden Probenbereiches (26) einer Probe (4) angegeben, bei dem die Laserpulse eines gepulsten Laserstrahls (7) auf die Probe (4) fokussiert werden, und bei dem der interessierende Probenbereich (26) durch Aneinanderreihen von durch die Laserpulse erzeugten Schnittlöchern entlang einer geschlossenen Schnittlinie (30) ausgeschnitten wird. Edindungsgemäss wird die beim letzten, den Schnitt vollendenden Laserpuls ablatierte Masse an die Schnittbreite des letzten schneidenden Laserpulses angepasst und optimiert. Vorzugsweise wird das Endstück (28) der Schnittlinie (30), das mit dem letzten Laserpuls geschnitten wird, gleich der Schnittbreite des letzten schneidenden Laserpulses eingestellt. Eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens wird angegeben.

Description

Verfahren zur Laser-Mikrodissektion
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Laser-Mikrodissektion mit den Merkmalen des Oberbegriffs des Anspruchs 1.
Mit Mikrodissektion wird im Bereich der Biologie und der Medizin ein Verfahren bezeichnet, mit dem aus einer im allgemeinen flachen Probe (beispielsweise Zellen oder ein Gewebeschnitt) ein kleines Stück, ein sogenanntes Dissektat, mit einem feinen, fokussierten Laserstrahl ausgeschnitten wird. Das ausgeschnittene Stück steht damit für weitere biologische oder medizinische (z.B. histologische) Untersuchungen zur Verfügung.
Ein solches Verfahren zur Laser-Mikrodissektion ist beschrieben in dem Artikel "Cell surgery by laser micro-dissection: a preparative method" von G. Isenberg, W. Bilser, W. Meier-Ruge, E. Remy, Journal of Microscopy, Vol. 107, May 1976, pp. 19-24. Dort wird ein gepulster Laser auf eine biologische Probe fokussiert und mit dem fokussierten Laserstrahl eine geschlossene Schnittlinie um einen interessierenden Probenbereich gelegt. Dadurch wird der interessierende Probenbereich ausgeschnitten und fällt anschließend unter Einwirkung der Schwerkraft herab und wird in einem Sammelgefäß aufgefangen. Bei der biologischen Probe handelt es sich um Zellkulturen, die auf einem Objektträger angezogen wurden. Um eine feste Haftung dieser Zellen an dem Substrat zu verhindern, wurden silikonbeschichtete Objektträger verwendet. Dadurch können die ausgeschnittenen interessierende Probenbereiche unmittelbar nach dem Schnitt herabfallen.
Die DE 100 43 506 C1 beschreibt eine neuere Weiterentwicklung dieses Verfahrens. Dabei werden die zu untersuchenden Proben, aus denen interessierende Probenbereiche herausgeschnitten werden sollen, auf sehr dünne Kunststoff-Folien präpariert. Die Dicke dieser Kunststoff-Folien liegt in der Größenordnung zwischen 1 -2 μm. Als Material kommen PET-Folien und PEN-Folien in Frage. Es wird ein Verfahren zur Laser-Mikrodissektion beschrieben, bei dem die Schnittlinie gegen Ende des Schnitts nicht vollständig geschlossen wird, sondern am Ende ein schmaler und zugleich stabiler Steg stehen bleibt. Dieser verhindert ein Wegklappen und Verdrehen der Folie mit dem interessierenden Probenbereich außerhalb der Fokusebene. Der verbliebene Steg wird mit erweiterter Laserapartur mit einem letzten, fokussierten, schneidenden Laserpuls durchtrennt. Nach Beendigung des Schnitts fällt die Probe unter Einwirkung der Schwerkraft herab und wird in einem Auffanggefäß gesammelt. Insgesamt hat es sich jedoch als gerätetechnisch aufwendig erwiesen, für den letzten Puls die Laserapertur umzuschalten. Dabei wird als Laserapertur der Aperturwert des Laserstrahls bezeichnet.
Zwar werden mit beiden Schneidverfahren gute Ergebnisse erzielt, jedoch wurde bei beiden Verfahren beobachtet, dass bei unveränderter Geräteeinstellung (Optik, Laserparameter, Fokuslage usw.) nacheinander ausgeschnittene Dissektate unterschiedlich weit seitlich wegdriften, wenn sie in die Auffangvorrichtung fallen. Diese Auffangvorrichtung kann beispielsweise ein Probenröhrchen sein, marktüblich als PCR-Tube bezeichnet. Die Folge ist dann, dass die Dissektate seitlich an der Innenwand des PCR-Tubes haften anstatt bis zum Boden des Tubes zu fallen. Sie sind dann schlecht zu inspizieren, was für den Anwender, beispielsweise einen Pathologen, einen wesentlichen Arbeitsschritt vor der weiteren Bearbeitung der ausgeschnittenen Dissektate darstellt.
Es ist daher Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Laser-Mikrodissektion anzugeben, welches auf das Umschalten der Laserapertur verzichtet und einen verbesserten Transport des ausgeschnittenen Dissektats in ein Sammelgefäß bewirkt, so dass eine komfortable optische Inspektion des Dissektats möglich ist.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Laser-Mikrodissektion eines interessierenden Probenbereiche einer Probe, bei dem die Laserpulse eines gepulsten Laserstrahls auf die Probe fokussiert werden, und bei dem der interessierende Probenbereich durch Aneinanderreihen von durch die Laserpulse erzeugten Schnittlöchern entlang einer geschlossenen Schnittlinie ausgeschnitten wird, welches erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet ist, dass die beim letzten, den Schnitt vollendenden Laserpuls ablatierte Masse an die Schnittbreite des letzten schneidenden Laserpulses angepasst und optimiert wird.
Die Erfindung beruht auf Überlegungen, die nach Untersuchung des Laser- Schneidevorgangs und der Flugphase der ausgeschnittenen Probenbereiche (auch als Dissektate bezeichnet) angestellt wurden. Dazu wurden für eine Vielzahl von Schneidvorgängen der Schneidvorgang und die Flugphase des ausgeschnittenen Probenbereichs nach dem Ende des Schneidvorgangs mit einer Hochgeschwindigkeitskamera untersucht.
Dem Fachmann ist bekannt, dass dieser Schneidevorgang auf einer lokalen photothermischen Ablation ("Verdampfung") unter der Einwirkung des fokussierten Laserstrahls beruht. Das unter Einwirkung des Laserstrahls lokal ablatierte Material, das sich entgegengesetzt zur Einfallsrichtung der Laserstrahlung ausbreitet, besitzt natürlich eine Masse und eine Geschwindigkeit und damit einen Impuls. Nach dem Satz von der Erhaltung des Impulses wird ein gleich großer, aber entgegengesetzt gerichteter Impuls auf den ausgeschnittenen Probenbereich ausgeübt. Dadurch erhält der ausgeschnittene Probenbereich bereits aufgrund des Laserschneideprozesses eine Anfangsgeschwindigkeit v0 .
In den mit der Hochgeschwindigkeitskamera aufgenommenen Bildsequenzen war der Laserschneidevorgang und die Flugphase des ausgeschnittenen Probenbereichs deutlich sichtbar. Es zeigte sich, dass auch bei gleichbleibenden, also unveränderten Geräteeinstellungen (Optik, Laserparameter, Fokuslage usw.) die nacheinander ausgeschnittenen Dissektate ganz unterschiedliche Anfangsgeschwindigkeiten aufweisen. Dadurch driften sie durch Thermik und Strömung der Umgebungsluft unterschiedlich weit seitlich weg, wenn sie in die Auffangvorrichtung fallen. Daher fallen einige der ausgeschnittenen Probenbereiche auf den Boden des Auffanggefäßes; andere bleiben an der Wand des Auffanggefäßes hängen und können schlecht inspiziert werden.
Darüber hinaus wurde beobachtet, dass der Einfluss der Anfangsgeschwindigkeit auf die Dynamik der ausgeschnittenen
Probenbereiche mit größerem Durchmesser weniger stark ist als auf solche mit kleinerem Durchmesser. Aus den mit der Hochgeschwindigkeitskamera aufgenommenen Bildsequenzen konnte man weiterhin erkennen, dass für große ausgeschnittenene Probenbereiche je nach Anfangsgeschwindigkeit die Flugzeit zwischen Probe und Auffangvorrichtung über eine Distanz deutlich verringert wird. Bei einer Flugstrecke von beispielsweise 5 mm wurde eine Verringerung der Flugzeit, je nach Werten der Anfangsgeschwindigkeit zwischen minimal und maximal, bis um einen Faktor 2-5 verringert.
Die Idee der Erfindung besteht nun darin, diese Anfangsgeschwindigkeit unter Beibehaltung des Laserschneideprozesses zu maximieren, damit die ausgeschnittenen Probenbereiche immer, d.h. bei allen Schneidvorgängen, bis zum Boden des Auffanggefäßes fallen. Das heißt weiterhin, dass für alle ausgeschnittenen Probenbereiche, unabhängig von ihrer Größe, bei allen Schneidvorgängen eine möglichst große Anfangsgeschwindigkeit nach Beendigung des Schnitts erzielt werden soll. Wie bereits erläutert, sind die Anfangsgeschwindigkeiten aufgrund des Impulsübertrags der ausgeschnittenen Probenbereiche, wenn gemäß der vorbekannten Verfahren geschnitten wird, bei jedem Laserschnitt unterschiedlich. Die Anfangsgeschwindigkeiten werden nachfolgend als v0 bezeichnet. Dies gilt sowohl dann, wenn bei den bekannten Schneidverfahren mit konstanten Laserparametern gearbeitet wird, d.h. der Laser während des gesamten Schneidvorgangs mit konstanter Schnittbreite betrieben wird (wie im zitierten Stand der Technik bei Isenberg et al. beschrieben) als auch, wenn der letzte Laserpuls mit erweiterter Schnittbreite schneidet (wie in der DE 100 43 506 C1 beschrieben).
Hierzu gilt nachfolgende Überlegung: Beträgt der Umfang der Schnittlinie ( = Länge des gesamten geschlossenen Schnitts) ein ganzzahliges Vielfaches der Schnittbreite des Laserfokus der einzelnen Laserpulse, so ist das noch ungeschnittene Endstück der Schnittlinie vor dem letzten Laserpuls gleich groß wie der Durchmesser des Laserspots bzw. dessen Schnittbreite. In diesem Fall wird also mit dem letzten Laserpuls infolge der Plasma-Bildung beim Schneideprozess sehr viel Material ablatiert (manchmal stark vereinfachend auch als „verdampft" bezeichnet). Damit ist die Impulsübertragung durch das Plasma auf den ausgeschnittenen Probenbereich maximal. Die Anfangsgeschwindigkeit des ausgeschnittenen, herabfallenden Probenbereichs zu Beginn der Flugphase nimmt dann einen Maximalwert ι 0 max an, ist dann also v0 = VQ Ά .
Ist aber vor dem letzten, die Schnittlinie schließenden Laserpuls die restliche Strecke der Schnittlinie klein im Vergleich zum Durchmesser des Laserfokus bzw. dessen effektiver Schnittbreite in der Probe, so wird beim letzten Laserpuls wenig Material ablatiert. Daher ist dann die Impulsübertragung durch das Plasma auf den ausgeschnittenen Probenbereich klein. Im Extremfall ist daher die Anfangsgeschwindigkeit des ausgeschnittenen Probenbereichs zu Beginn der Flugphase nahezu gleich Null.
Die Größe der Anfangsgeschwindigkeit hängt bei dem Schneidverfahren nach dem Stand der Technik also davon ab, ob beim Laserschneideprozess der Durchmesser des Laserfokus bzw. die Schnittbreite der Laserpulse zufällig ganzzahlig oder nicht-ganzzahlig in den Umfang der Schnittlinie hineinpasst. Die Anfangsgeschwindigkeit des ausgeschnittenen, herabfallenden Probenbereichs zu Beginn der Flugphase variiert also willkürlich zwischen Null und einem Maximalwert.
Erfindungsgemäß wird die beim letzten, den Schnitt vollendenden Laserpuls ablatierte Masse an die Schnittbreite des letzten schneidenden Laserpulses angepasst und optimiert. Damit wird erzielt, dass mit dem letzten Laserpuls des Schnitts eine möglichst große Masse ablatiert wird und daher die Impulsübertragung von dem Plasma auf den ausgeschnittenen Probenbereich optimiert, nämlich möglichst maximal, wird. Dies führt dazu, dass der ausgeschnittene Probenbereich nach dem Schnitt eine möglichst maximale Anfangsgeschwindigkeit aufweist.
Bei Anwendung des Verfahrens mit einem aufrechten Mikroskop wird der Laserstrahl von oben auf die Probe gerichtet, wie im Stand der Technik von Isenberg et al. beschrieben. Dadurch wird sichergestellt, dass der ausgeschnittene Probenbereich nach dem Schnitt eine hohe Anfangsgeschwindigkeit aufeist und unter Einwirkung der Schwerkraft sicher bis in das Auffanggefäß herabfällt.
Eine Anwendung an einem inversen Mikroskop ist jedoch auch möglich. In diesem Fall wird der schneidende Laserstrahl von unten durch das Objektiv auf die Probe gerichtet. Durch die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erzielte hohe Anfangsgeschwindigkeit, die allein aufgrund der Ablation beim Laserschnitt als solchem erzielt wird, wird das Dissektat stets zuverlässig hochgeschleudert und kann mit einer oberhalb der Probe angeordneten Auffangvorrichtung gesammelt werden.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren erweist es sich als vorteilhaft, dass eine Änderung der Lasereinstellungen, speziell der Laserapertur und der Laserenergie und damit der Spotbreite, für den gesamten Schnitt nicht erforderlich ist und dass zugleich die Anfangsgeschwindigkeit des ausgeschnittenen Probenbereichs zu Beginn der Flugphase für alle Laserschneid-Vorgänge maximiert wird.
Es sind verschiedene Ausgestaltungen des Verfahrens möglich. So kann beispielsweise das Endstück der Schnittlinie, das mit dem letzten, den Schnitt vollendenden Laserpuls geschnitten wird, gleich der Schnittbreite des letzten schneidenden Laserpulses eingestellt werden.
Dabei erweist es sich als besonderer Vorteil des Verfahrens, dass die Schnittbreite des Laserstrahls während des gesamten Schnitts konstant werden kann. Dies ist gerätetechnisch die einfachste Ausführung, da auf Mittel zum Umschalten der Laserapertur verzichtet werden kann. Selbstverständlich ist die Ausführung des Verfahrens aber nicht daran gebunden, die Schnittbreite des Laserstrahls während des Schneidvorgangs konstant zu halten. Eine Änderung der Schnittbreite des Laserstrahls während des Schneidprozesses, beispielsweise auch vor dem letzten Puls, ist prinzipiell denkbar.
Die Schnittbreite des Laserstrahls kann durch Steuerung verschiedener Geräteparameter während des gesamten Schnitts konstant gehalten werden. Eine Möglichkeit, die Laserstrahl-Apertur und/oder die Laser-Energie des Laserstrahls während des gesamten Schnitts konstant zu halten.
Es ist zwar möglich, die zu schneidende Probe auf einem Silikonbeschichteteten Glasobjektträger, der wegen der Beschichtung nur eine sehr geringe Oberflächenadhäsion aufweist, aufzubringen. Üblicherweise wird die zu schneidende Probe jedoch auf einer laserschneidbaren Kunststoff-Folie aufgebracht. Dabei wird die Kunststoff-Folie beispielsweise über einen Glasobjektträger gespannt und lediglich am Rand des Glasobjektträgers fixiert, zum Beispiel geklebt. Alternativ wird die Kunststoff-Folie über einen rahmenförmigen Halter gespannt und an diesem fixiert, so dass die Kunststoff-Folie in der Mitte des Rahmens freigespannt ist. Erfindungsgemäß wird die beim letzten, den Schnitt vollendenden Laserpuls ablatierte Masse dieser Kunststoff-Folie an die Schnittbreite des letzten schneidenden Laserpulses angepasst und optimiert. Geeignet sind solche Kunststoff-Folien, die für Laser-Mikrodisektion geeignet sind, wie Folien aus PEN, PET und POL.
Zur Anpassung der beim letzten Laserpuls ablatierten Masse dieser Kunststoff-Folie ist es nicht nur möglich, das Endstück der Schnittlinie an die Schnittbreite des Laserstrahls anzupassen. Auch die Verwendung möglichst dicker Kunststoff-Folien, so dass diese gerade noch gut mit dem Laser schneidbar sind, ist denkbar. So besitzen für das neue Verfahren die Kunststoff-Folien aus PEN-Material eine Dicke von 2,0 μm oder mehr. Kunststoff-Folien aus PET-Material besitzen eine Dicke von 1,3 μm oder vorzugsweise mehr. Kunststoff-Folien aus Polyethylen-Material haben eine Dicke von 0,9 μm oder vorzugsweise mehr.
Es ist weiterhin möglich, dass die, Kunststoff-Folie aus einem Schichtverbund aus mindestens zwei laserschneidbaren Kunststoff-Folien aus gleichem oder unterschiedlichem Material besteht. Dies hat den Vorteil größerer Stabilität dieser Verbund-Folie, so dass das Handling bei der Probenpräparation erleichtert wird. Außerdem ist durch die erzielte größere Schichtdicke auch eine Anpassung der beim letzten Laserpuls ablatierten Masse dieser Verbund- Folie besser möglich.
Eine praktische Umsetzung des Verfahrens besteht darin, dass das mit dem letzten Laserpuls maximal schneidbare Endstück der Schnittlinie bestimmt wird. Zur Bestimmung der Schnittbreite des Laserstrahls kann beispielsweise die Laserapertur des Laserstrahls dienen. So kann der vom Benutzer vorgewählte Wert der Laserapertur erfasst werden und in die entsprechende Schnittbreite umgerechnet werden. Die so ermittelte Schnittbreite entspricht dem maximal mit dem letzten Laserpuls schneidbaren Endstück der Schnittlinie. Dieses Endstück wird dann von der gesamten Schnittlinie subtrahiert. Die so ermittelte vor dem letzten Laserpuls zu schneidende Schnittlinie wird dann mit gegebenenfalls überlappenden Schnittlöchern der Laserpulse geschnitten, um auf diese Weise das maximal schneidbare Endstück der Schnittlinie für den letzten Laserpuls freizulassen.
Eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens besteht aus einem Mikroskop, das mindestens ein eine optische Achse definierendes Objektiv aufweist, das zur Betrachtung einer Probe mit einem interessierenden Probenbereich dient. Außerdem umfasst sie einen Laser, der einen gepulsten Laserstrahl mit Laserpulsen erzeugt, und mindestens ein optisches System, das den Laserstrahl in das Objektiv einkoppelt. Weiterhin weist sie eine Schnittlinien-Steuerungseinheit auf, die eine Relativbewegung zwischen dem Laserstrahl und der Probe erzeugt.
Zur Durchführung des Verfahrens ist die Vorrichtung zusätzlich dadurch gekennzeichnet, dass sie Mittel zur Anpassung und Optimierung der beim letzten, den Schnitt vollendenden Laserpuls ablatierten Masse an die Schnittbreite des letzten schneidenden Laserpulses aufweist. Diese Mittel können beispielsweise Mittel zur Bestimmung der Schnittbreite des Laserstrahls und/oder einen Rechner zur Steuerung der Schnittlinien- Steuerungseinheit umfassen, um damit das Endstück der Schnittlinie, welches die beim Laserpuls ablatierte Masse repräsentiert, erntsprechend dem Verfahren für den letzten Laserpuls freizuhalten.
Ein Probenhalter, der die Probe trägt, liegt auf einem xy-Tisch auf, mit dem unterschiedliche Probenbereiche betrachtet und ausgewählt werden können. Die Vorrichtung weist üblicherweise eine Auffangvorrichtung mit mindestens einem Behältnis zum Auffangen eines ausgeschnittenen, interessierenden Probenbereichs in der Nähe oberhalb bzw. unterhalb der Probe auf.
Eine Ausführungsform der verwendeten Vorrichtung weist einen feststehenden Laserstrahl auf. Die Schnittlinien-Steuerungseinheit umfasst dabei einen verfahrbaren xy-Tisch, welcher beim Schneiden die Probe relativ zu dem feststehenden Laserstrahl bewegt. Dabei werden sehr hohe Anforderungen an die Positioniergenauigkeit des xy-Tisches gestellt, um eine exakte Schnittlinie zu erzeugen. Der xy-Tisch wird vorzugsweise motorisch verfahren.
In einer anderen Ausführungsform der Vorrichtung umfasst die Schnittlinien- Steuerungseinheit eine Laser-Scan-Einrichtung, welche beim Schneiden den Laserstrahl relativ zu einer feststehenden Probe bewegt. Dazu wird beim Schneiden der xy-Tisch mit dem aufliegenden Probenhalter und der Probe nicht verfahren. Die Schnittlinie entsteht ausschließlich durch Ablenken des Laserstrahls über die Probe.
Besonders vorteilhaft ist eine Ausführungsform der Vorrichtung, in welcher dem Laser eine Laser-Steuerungseinheit zugeordnet ist, welche die Betriebsparameter des Lasers steuert. Diese Betriebsparameter sind beispielsweise die Laser-Leistung und die Laser- Apertur, welche die Laser- Schnittbreite bestimmen. Dabei muss berücksichtigt werden, dass die Schnittbreite des Laserstrahls in der Probe von dem Absorptionsverhalten der zur Präparation verwendeten Kunststoff-Folie und ebenso von dem
Absorptionsverhaltender Probe selbst abhängt. Dabei ist die Bestimmung der Schnittbreite nicht immer ganz exakt möglich, da sie von beispielsweise auch von der Art und Intensität der Einfärbung der Probe mit Farbstoffen, dem Feuchtigkeitsgehalt usw. abhängt. Daher muss bei der Bestimmung der Schnittbreite mit einem von den Umständen abhängigen Fehler ausgegangen werden. Es hat sich aber gezeigt, dass es im Sinne der vorliegenden Erfindung ausreichend ist, wenn die beim letzten, den Schnitt vollendenden Laserpuls ablatierte Masse im Rahmen des technisch Machbaren zumindest optimiert wird. Dadurch treten nach Beendigung des Laserschneidvorgangs nur noch sehr große Anfangsgeschwindigkeiten auf, während zugleich die sehr kleinen Anfangsgeschwindigkeiten durch das neue Verfahren unterdrückt werden. Bereits dies führt zu einer deutlichen Verbesserung der Ausbeute bei der Probengewinnung und Inspektion.
Je nach Probenbeschaffenheit ist es insbesondere bei sehr homogenen Probeflächen möglich, dass die beim letzten, den Schnitt vollendenden
Laserpuls ablatierte Masse im Rahmen des technisch Machbaren maximiert wird. Dies hat dann zur Folge, dass die Anfangsgeschwindigkeit des ausgeschnittenen Probenbereichs infolge des beim letzten Laserpuls erzeugten Plasmas maximale Werte annimmt. Zusätzlich kann eine Autofokusvorrichtung für den Laser vorgesehen sein, die für einen sauberen Schnitt eine sichere Fokussierung auch bei unterschiedlich dicken Proben sicherstellt.
In einer anderen vorteilhaften Ausführungsform ist dem Mikroskop ein Rechner zugeordnet, der zur Steuerung der Schnittlinien-Steuerungseinheit und der Laser-Steuerungseinheit eingesetzt wird. Dadurch ist eine Automatisierung des gesamten Verfahrens möglich.
In anderen Ausführungsformen der Vorrichtung sind Mittel zur Auswahl der Schnittlinie durch einen Benutzer vorgesehen. Durch diese Auswahlmöglichkeit kann der Benutzer vor dem Schneiden den richtigen interessierenden Probenbereich gezielt auswählen und zugleich wichtige Stellen der Probe vor Beschädigungen schützen, indem der Benutzer beispielsweise die Schnittlinie auf unkritische Zellstrukturen der Probe legen kann, werden kritische, interessierende Zellstrukturen innerhalb des interessierenden Probenbereichs beim Schneiden geschützt. Eine Automatisierung des Verfahrens und der Vorrichtung ermöglicht einen Einsatz im routinemäßigen Laborbetrieb.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand der schematischen Zeichnung genauer beschrieben. Es zeigen:
Fig. 1: eine Vorrichtung zum Laserschneiden mit einem feststehenden Laserstrahl; Fig.2: eine Vorrichtung zum Laserschneiden mit einem beweglichen Laserstrahl. Fig. 3: eine Probe mit einer erfindungsgemäßen Schnittführung um einen interessierenden Probenbereich;
In den Figuren sind gleiche Vorrichtungselemente mit denselben Bezugsziffern bezeichnet. In Fig. 1 ist eine Vorrichtung zum Laserschneiden dargestellt, welche mit einem feststehenden Laserstrahl und einer relativ dazu bewegten Probe arbeitet. Sie weist ein Mikroskop 1 mit einem motorisch verfahrbaren xy-Tisch 2 auf. Der xy-Tisch 2 dient zur Aufnahme eines Probenhalters 3, an dessen Unterseite eine zu untersuchende bzw. zu schneidende Probe 4 aufgebracht ist. Der Probenhalter kann beispielsweise aus einer auf einen Rahmen freigespannten Kunststoff-Folie bestehen. Zur Betrachtung der Probe 4 ist unterhalb des xy-Tisches 2 ein Beleuchtungssystem 5 angeordnet.
Ein Laser 6 erzeugt einen gepulsten Laserstrahl 7, der zum Schneiden der Probe 4 auf diese fokussiert wird. Der xy-Tisch 2 dient als Schnittlinien- Steuerungseinheit und erzeugt während des Schneidvorgangs eine Relativbewegung zwischen dem Laserstrahl 7 und der Probe 4. Die einzelnen Laserpulse des Laserstrahls 7 erzeugen in der Probe aneinandergereihte Schnittlöcher, welche durch die Relativbewegung zwischen dem Laserstrahl 7 und der Probe 4 eine Schnittlinie ergeben.
Bei dem dargestellten Mikroskop 1 handelt es sich um ein Durchlicht- Mikroskop, bei dem das Beleuchtungssystem 5 an einem Mikroskopstativ 8 unterhalb des xy-Tisches 2 und der Probe 4 angeordnet ist. Mindestens ein Objektiv 9 des Mikroskops 1 ist oberhalb des xy-Tisches 2 und der Probe 4 angeordnet. Das Objektiv 9 definiert eine optische Achse 10, die mit der optischen Achse des Beleuchtungssystems 5 fluchtet.
In dieser beschriebenen Anordnung wird die Probe 4 mit einer Durchlicht- Beleuchtung betrachtet. Das Laserschneiden könnte ebenso auch mit einem inversen Mikroskop ausgeführt werden, bei dem das Beleuchtungssystem 5 oberhalb des xy-Tisches 2 und das mindestens eine Objektiv 9 unterhalb des xy-Tisches 2 angeordnet ist.
Das von dem Beleuchtungssystem 5 ausgestrahlte Licht wird durch einen Kondensor 11 von unten auf den auf dem xy-Tisch 2 angeordneten Probenhalter 3 mit der Probe 4 gerichtet. Das die Probe 4 durchdringende Licht gelangt zum Objektiv 9 des Mikroskops 1. Innerhalb des Mikroskops 1 wird das Licht über nicht dargestellte Linsen und Spiegel mindestens einem Okular 12 des Mikroskops 1 zugeleitet, durch welches ein Bediener die auf dem xy-Tisch 2 angeordnete Probe 4 betrachten kann. Im Mikroskopstativ 8 des Mikroskops 1 ist ein optisches System 13 in der optischen Achse 10 des Objektivs 9 vorgesehen. Das optische System 13 kann z.B. ein dichromatischer Teiler sein. Ferner ist es denkbar, dass das optische System 13 aus mehreren optischen Bauteilen besteht. Dies ist dann der Fall, wenn der Laserstrahl 7 mehrfach umgelenkt werden muss.
Ferner ist im Laserstrahl 7 eine Blende 14 vorgesehen, mit welcher der Durchmesser des Laserstrahls 7 beschränkt werden kann, um eine definierte, konstante Schnittbreite für den Laserschneid-Vorgang einzustellen. Die Blende 14 kann z.B. als eine Festblende ausgebildet sein. In einer vorteilhaften Ausführungsform können mehrere Festblenden 14 auf einer Revolverscheibe oder einem Linearschieber angeordnet sein, um eine dieser Festblenden als die jeweils erforderliche Blende 14 in den Strahlengang einzubringen. Das Einbringen in den Laserstrahl 7 kann manuell durch den Benutzer erfolgen, wird jedoch vorzugsweise motorisch durchgeführt.
In der hier dargestellten Ausfüh ungsform ist die Blende 14 als eine Vario- blende, beispielsweise als eine Irisblende, ausgebildet, deren Durchmesser über einen Blenden-Motor 15 gesteuert wird. Der Blenden-Motor 15 erhält von einem Rechner 16 die nötigen Steuersignale zum Einstellen des erforderlichen Blendendurchmessers, welcher die Schnittbreite des Laserstrahls definiert.
Das Mikroskop 1 ist ferner mit einer Kamera 17 versehen, die ein Bild von der zu schneidenden Probe 4 aufnimmt. Dieses Bild wird auf einem Monitor 18 dargestellt, der mit dem Rechner 16 verbunden ist. Mit dem System aus Rechner 16, Kamera 1 und Monitor 18 wird der mit dem Laserstrahl 7 durchgeführte Schneidevorgang beobachtet und überwacht. So kann der Rechner 16 an den Laser 6 Triggersignale zur Auslösung von Laserpulsen und zur Steuerung der Laserleistung abgeben, den Blenden-Motor 15 ansteuern und eine (nicht dargestellte) Autofokuseinrichtung für den Laser 6 ansteuern. Der auszuschneidende, interessierende Probenbereich der Probe 12 wird auf dem Monitor 18 mittels eines Mauszeigers umfahren, wobei damit eine gewünschte Schnittlinie definiert wird. Entlang der so gekennzeichneten Schnittlinie wird dann der Schneidevorgang mittels des Laser 4 ausgeführt.
Beim Schneiden wird dann der xy-Tisch 2 schrittweise so verfahren, dass der Laserstrahl 7 nacheinander an den berechneten Sollposition auf die Probe 4 auftrifft, wobei die Restschnittlinie ausgelassen wird. In jeder Sollposition wird von dem Rechner 16 jeweils ein Triggersignal erzeugt, an den Laser 6 gesendet und von diesem entsprechend ein Laserimpuls abgestrahlt, der ein einzelnes Schnittloch in der Probe 4 erzeugt. Auf diese Weise wird mit dem Laser 6 um den interessierenden Probenbereich 23 eine geschlossene Schnittlinie 25 erzeugt.
Unterhalb der Probe 4 ist eine Auffangvorichtung mit mindestens einem Auffangbehältnis 19 angeordnet. Nach dem Schnitt fällt der ausgeschnittene Probenbereich, der aufgrund des Plasmas vom letzten schneidenden Laserpuls eine hohe Anfangsgeschwindigkeit aufweist, unter Einfluss der Schwerkraft in dieses Auffangbehältnis 19 herab und wird dort gesammelt.
Fig. 2 zeigt ein erfindungsgemäßes Laser-Mikro-Dissektionsgerät zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, welches beim Schneiden einen Laserstrahl über eine festgehaltene Probe bewegt.
Das Laser-Mikro-Dissektionsgerät umfasst ein Mikroskop 1 mit einem verfahrbaren xy-Tisch 2, auf dem ein Probenhalter 3 angeordnet ist. An der Unterseite des Probenhalters 3 befindet sich eine zu schneidende Probe 4. Unter dem xy-Tisch 2 sind ein Beleuchtungssystem 5 und ein Kondensor 11 angeordnet, der die Probe 4 beleuchtet. Der xy-Tisch 2 wird während des Schneidvorgangs horizontal, also in x-Richtung und in y-Richtung, nicht verfahren. Unterhalb der Probe 4 ist mindestens ein Auffangbehältnis 19 zum Auffangen des ausgeschnittenen, interessierenden Probenbereichs angeordnet. Von einem Laser 6, in diesem Beispiel ein gepulster UV-Laser, geht ein Laserstrahl 7 aus, der in einen Beleuchtungsstrahlengang 20 eingekoppelt wird. In dem Beleuchtungsstrahlengang 20 ist eine Laser-Scan-Einrichtung 21 angeordnet. Der Laserstrahl 7 durchläuft die Laser-Scan-Einrichtung 21 und gelangt über ein optisches System 13 zu einem Objektiv 9, das den Laserstrahl 7 auf die Probe 4 fokussiert. Das optische System 13 ist vorzugsweise als dichromatischer Teiler ausgeführt, durch den ein von der Probe 4 durch das Objektiv 9 ausgehender Abbildungsstrahlengang 22 zu mindestens einem Okular 12 gelangt.
Die Einstellung der Laser-Scan-Einrichtung 21 und damit die Verstellung des Laserstrahls 7 auf der Probe 4 erfolgt in dieser Ausführungsform mit einem der Laser-Scan-Einrichtung 21 zugeordneten Motor 23, einer Steuerungseinheit 24 und einem Rechner 16. Der Motor 23 ist mit der Steuerungseinheit 24 verbundenen, welche die Steuersignale zur Ansteuerung des Motors 23 liefert. Die Steuerungseinheit 24 ist mit dem Rechner 16 verbunden, an den ein Monitor 18 angeschlossen ist. Auf dem Monitor 18 wird das von einer Kamera 17 aufgenommene Bild der Probe 4 dargestellt. Mittels einer Rechner-Maus (nicht dargestellt) oder einer anderen beliebigen Cursorsteuerungseinrichtung kann auf dem Monitor 18 in dem Kamerabild eine gewünschte Soll-Schnittlinie definiert werden. Der Rechner 16 ist außerdem mit der Laserlichtquelle 6 verbunden und liefert diesem nur dann Triggersignale zum Auslösen von Laserimpulsen, wenn ein Schnittloch erzeugt wird.
Die Laser-Scan-Einrichtung 21 selbst dient als Schnittlinien- Steuerungseinheit, die während des Schneidvorgangs eine Relativbewegung zwischen dem Laserstrahl 7 und der Probe 4 erzeugt. Die Fokussierung des Laserstrahls 7 kann durch manuelles Verfahren des xy-Tisches 2 in der Höhe bei gleichzeitiger visueller Kontrolle des Kamerabildes durch einen Benutzer erfolgen. Bedienungsfreundlicher ist jedoch eine Ausführungsform der Vorrichtung, die eine Autofokus-Vorrichtung (nicht dargestellt) für den Laserstrahl 7 umfasst. Durch Ansteuerung der Laser-Scan-Einrichtung 21 erscheint der Laserstrahl 7 am Ausgang der Laser-Scan-Einrichtung 21 unter verschiedenen Ablenkwinkeln. Dabei kann der Laserstrahl 7 durch Variation des Ablenkwinkels auf beliebige Positionen auf der Probe 4 geführt werden, die innerhalb des Sehfeldes des Objektivs 10 liegen. Durch geeignete Ansteuerung der Laser-Scan-Einrichtung 21 werden mit den einzelnen Laserpulsen des Laserstrahls 7 auf der Probe 4 eine Vielzahl von Schnittlöchern erzeugt, die zusammenhängend angeordnet sind und damit eine Schnittlinie ergeben.
Die Schnittbreite eines Lasers in einer Probe hängt ab von den
Laserparametern, wie z.B. Laserleistung und Apertur des Laserstrahls 7, und der Beschaffenheit der Probe (Dicke, Anfärbung, Art des Probenmaterials usw.). Diese Schnittbreite wird vorher bestimmt oder ist in Abhängigkeit von den Laserparametern und dem Probenmaterial in einer Tabelle im Rechner 16 abgelegt. Entsprechend der vorgewählten Soll-Schnittlinie wird eine Anzahl von Sollpositionen der einzelnen Schnittlöcher der Laserpulse auf der Probe 4 berechnet, wobei die aneinander gereihten Sollpositionen der Schnittlöcher die gewünschte Soll-Schnittlinie ergeben.
Dann werden auf der Probe 4 nacheinander die Sollpositionen mit der Laser- Scan-Einrichtung 21 angefahren. Jedes Mal, wenn die Sollposition des Laserstrahls 7 auf der Probe 4 mittels der Laser-Scan-Einrichtung 21 vorbereitet bzw. eingestellt wurde, liefert der Rechner 16 Triggersignale zum Auslösen von Laserpulsen an die Laserlichtquelle 6. Auf diese Weise wird schrittweise die Schnittlinie erzeugt.
Erfindungsgemäß wird am Ende der Schnittlinie ein Endstück freigelassen, welches an die Schnittbreite des Laserstrahl 7 an die Schnittbreite des letzten Laserpulses angepasst ist. Dieses Endstück der Schnittlinie wird mit einem letzten Laserpuls geschnitten. Danach ist der interessierende Probenbereich von der Probe 4 vollständig getrennt und fällt unter Einwirkung der Schwerkraft in das darunter angeordnete Auffangbehältnis 19. Dabei wird durch die Anpassung des Endstücks der Schnittlinie an die Schnittbreite des letzten Laserpulses und somit an die beim letzten Laserpuls ablatierte Masse der Impulsübertrag durch den Laserschnitt möglichst groß, vorzugsweise maximal. Dies hat zur Folge, dass der ausgeschnittene Probenbereich eine maximale Anfangsgeschwindigkeit vor dem Herabfallen unter Schwerkraft aufweist.
Anhand Fig. 3 wird nachfolgend das erfindungsgemäße Verfahren beschrieben.
Dargestellt ist ein schematisches Kamerabild einer Probe 4 mit einer Vielzahl von Zellen 25. Ungefähr in der Mitte der Probe 4 liegt ein interessierender Probenbereich 26, in dem eine abweichende Zellstruktur 27, z.B. eine Krebszelle oder eine Zelle mit einem interessierenden genetischen Code, liegt. Dieser interessierende Probenbereich 26 soll für weitere Untersuchungen aus der Probe 4 ausgeschnitten werden.
Dazu wird von einem Benutzer unter Benutzung einer entsprechenden Software mittels einer Computermaus im Kamerabild eine gewünschte Soll- Schnittlinie für den durchzuführenden Sohneidvorgang markiert. Zum Vorbereiten des Schneidvorgangs wird dann die gewünschte Spotbreite und somit Schnittbreite des Laserstrahls 7 eingestellt. Dies kann, beispielsweise menügesteuert, durch den Benutzer erfolgen. Alternativ wird die Schnittbreite des Laserstrahls 7 von einer Steuersoftware der Vorrichtung zum
Laserschneiden vorgegeben. Die auf diese Weise eingestellte Spotbreite und somit Schnittbreite des Laserstrahls 7 bleibt dann für den gesamten Schneidvorgang konstant.
Von der gewünschten Soll-Schnittlinie wird Software-gesteuert am Ende der Schnittlinie 30 ein Endstück 28 freigehalten, das mit dem letzten Laserpuls geschnitten werden soll. Dieses Endstück 28 der Schnittlinie 30 entspricht einer am Ende des Schneidvorgangs zu schneidenden Masse, die mit dem letzten Laserpuls ablatiert werden muss. Durch Freihalten eines geeignet langen Endstücks 28 wird die beim letzten, den Schnitt vollendenden Laserpuls ablatierte Masse an die Schnittbreite des letzten schneidenden Laserpulses angepasst. Dieses Endstück 28 der Schnittlinie 30 ist beispielsweise abhängig von dem Absorptionsverhalten der Kunststoff-Folie und der Probe und der Foliendicke.
Entsprechend der aktuell eingestellten Soll-Schnittlinie und der eingestellten der Schnittbreite des Laserstrahls 7 wird mit dem Rechner 16 zu der definierten Soll-Schnittlinie, die jedoch um das freigehaltene Endstück 28 der Schnittlinie 30, verringert wurde, eine Anzahl von Soll-Positionen für die einzelnen Laserpulse des Laserstrahls 7 auf der Probe 4 berechnet. An jeder Soll-Position eines Laserpulses entsteht dann ein Schnittloch 29. Dabei ergeben die aneinander gereihten Soll-Positionen des Laserstrahls 7 die gewünschte Soll-Schnittlinie. Je nach Länge der eingestellten Soll-Schnittlinie, abzüglich des freigehaltenen Endstücks 28 der Schnittlinie 30, werden die Schnittbreiten der einzelnen Laserpulse mehr oder weniger überlappend auf der Soll-Schnittlinie positioniert, um auf diese Weise das Endstück 28 der Schnittlinie 30 freizuhalten. Die so aneinander gereihten Schnittlöcher 29 ergeben die tatsächliche Schnittlinie 30. Abschließend wird das freigehaltene Endstück 28 der Schnittlinie 30 mit dem letzten Laserpuls geschnitten und damit die Schnittlinie 30 vollendet.
Da die beim letzten, die Schnittlinie 30 vollendenden Laserpuls ablatierte Masse an die Schnittbreite des letzten schneidenden Laserpulses angepasst wurde, ist die Anfangsgeschwindigkeit des ausgeschnittenen Probenbereichs 26 nach dem Schnitt bei jedem so durchführten Schneidvorgang optimiert. Optimiert heißt dabei, dass die Anfangsgeschwindigkeit im günstigsten Fall maximal ist bzw. so optimal groß, wie sie nach Kenntnis der jeweiligen aktuellen Schnittbreite des Laserstrahls eingestellt werden kann.
Bezugszeichenliste
1. Mikroskop
2. verfahrbarer xy-Tisch
3. Probenhalter 4. Probe
5. Beleuchtungssystem
6. Laser
7. Laserstrahl
8. Mikroskopstativ 9. Objektiv
10. optische Achse
11. Kondensor
12. Okular
13. optisches System 14. Blende
15. Blenden-Motor
16. Rechner
17. Kamera
18. Monitor 19. Auffangbehältnis
20. Beleuchtungsstrahlengang
21. Laser-Scan-Einrichtung
22. Abbildungsstrahlengang
23. Motor für Laser-Scan- Einrichtung
24. Steuerungseinheit
25. Zellen
26. interessierender Probenbereich
27. abweichende Zellstruktur 28. Endstück der Schnittlinie
29. Schnittloch
30. Schnittlinie

Claims

Patentansprüche
1 ) Verfahren zur Laser-Mikrodissektion eines interessierenden Probenbereiche (26) einer Probe (4), - bei dem die Laserpulse eines gepulsten Laserstrahls (7) auf die Probe (4) fokussiert werden, - und bei dem der interessierende Probenbereich (26) durch Aneinanderreihen von durch die Laserpulse erzeugten Schnittlöchern (29) entlang einer geschlossenen Schnittlinie (30) ausgeschnitten wird, dadurch gekennzeichnet, dass die beim letzten, den Schnitt vollendenden Laserpuls ablatierte Masse an die Schnittbreite des letzten schneidenden Laserpulses angepasst und optimiert wird.
2) Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die beim letzten, den Schnitt vollendenden Laserpuls ablatierte Masse weitgehend maximiert wird, so dass die Anfangsgeschwindigkeit des ausgeschnittenen Probenbereichs (26) , welche durch die beim letzten Laserpuls erzeugte Ablation der Masse des Endstücks (28) der Schnittlinie erzielt wird, möglichst maximale Werte annimmt.
3) Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Endstück (28) der Schnittlinie, das mit dem letzten, den Schnitt vollendenden Laserpuls geschnitten wird, gleich der Schnittbreite des letzten schneidenden Laserpulses eingestellt wird. 4) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Schnittbreite des Laserstrahls (7) während des gesamten Schnitts konstant ist.
5) Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Laserstrahl-Apertur des Laserstrahls (7) während des gesamten Schnitts konstant ist.
6) Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Laser-Energie des Laserstrahls (7) während des gesamten Schnitts konstant ist.
7) Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die zu schneidende Probe (4) auf einer laserschneidbaren Kunststoff- Folie aufgebracht wird, dessen beim letzten, den Schnitt vollendenden Laserpuls ablatierte Masse an die Schnittbreite des letzten schneidenden Laserpulses angepasst und optimiert wird.
8) Kunststoff-Folie zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Kunststoff-Folie - aus PEN-Material besteht und eine Dicke gleich oder größer als 2,0 μm aufweist, - oder aus PET-Material besteht und eine Dicke gleich oder größer als 1,3 μm aufweist, - aus Polyethylen-Material besteht und eine Dicke gleich oder größer als 0,9 μm aufweist.
9) Kunststoff-Folie zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Kunststoff-Folie aus einem Schichtverbund aus mindestens zwei laserschneidbaren Kunststoff-Folien aus gleichem oder unterschiedlichem Material besteht. 10) Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet
- dass das mit dem letzten Laserpuls maximal schneidbare Endstück (28) der Schnittlinie (30) bestimmt wird und von der gesamten Schnittlinie (30) subtrahiert wird, - und dass die so ermittelte vorher zu schneidende Schnittlinie (30) mit gegebenenfalls überlappenden Schnittlöchern der Laserpulse geschnitten wird, um das maximal schneidbare Endstück (28) der Schnittlinie (30) für den letzten Laserpuls freizulassen.
11) Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 , welches - ein Mikroskop (1 ) mit mindestens einem eine optische Achse (10) definierenden Objektiv (9) zur Betrachtung einer Probe (4) mit einem interessierenden Probenbereich (26), - einen gepulsten Laser (6), der einen Laserstrahl (7) bestehend aus Laserpulsen erzeugt, - ein optisches System (13), das den Laserstrahl (7) in das Objektiv (9) einkoppelt, - und eine Schnittlinien-Steuerungseinheit (2; 21 ) zur Erzeugung einer Relativbewegung zwischen dem Laserstrahl (7) und der Probe (4), umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass sie Mittel zur Anpassung und Optimierung der beim letzten, den Schnitt vollendenden Laserpuls ablatierte Masse an die Schnittbreite des letzten schneidenden Laserpulses aufweist.
12) Vorrichtung nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, dass Mittel zur Einstellung des Endstücks (28) der Schnittlinie (30) , das mit dem letzten, den Schnitt vollendenden Laserpuls geschnitten wird, vorgesehen sind, welche eine Einstellung des Endstücks (28) auf die Schnittbreite des letzten schneidenden Laserpulses erlauben. 13) Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich eine Auffangvorrichtung zum Aufsammeln der ausgeschnittenen Probenbereiche (26) vorgesehen ist.
14) Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass dem Mikroskop ein Rechner (16) zur Steuerung der Schnittlinien Steuerungseinheit (2; 21) und der Laser-Steuerungseinheit und der zur Einstellung des Endstücks der Schnittlinie (30) zugeordnet ist.
15) Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass Mittel zur Auswahl der Schnittlinie (30) durch einen Benutzer vorgesehen sind.
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