WO2014191383A1 - Verfahren zur lasermikrodissektion und lasermikrodissektionssystem - Google Patents

Verfahren zur lasermikrodissektion und lasermikrodissektionssystem Download PDF

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WO2014191383A1
WO2014191383A1 PCT/EP2014/060899 EP2014060899W WO2014191383A1 WO 2014191383 A1 WO2014191383 A1 WO 2014191383A1 EP 2014060899 W EP2014060899 W EP 2014060899W WO 2014191383 A1 WO2014191383 A1 WO 2014191383A1
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WO
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image data
dissectate
laser
microscope
dissected
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PCT/EP2014/060899
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Inventor
Falk Schlaudraff
Florian Hoffmann
Original Assignee
Leica Microsystems Cms Gmbh
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Publication date
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    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
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    • G01N2001/2873—Cutting or cleaving
    • G01N2001/2886—Laser cutting, e.g. tissue catapult

Definitions

  • the present invention relates to a method for laser microdissection, in which at least one collecting surface of a dissected collecting container is imaged to generate image data, and a laser microdissection system set up for carrying out the method.
  • a method for laser microdissection in which at least one collecting surface of a dissected collecting container is imaged to generate image data, and a laser microdissection system set up for carrying out the method.
  • a dissectate can be isolated from an object by means of an infrared or ultraviolet laser beam, either falling under the influence of gravity into a suitable dissektate collection container or catapulting it against gravity (so-called laser pressure catapulting). The dissectate can also be cut out of the object together with an adherent membrane.
  • thermoplastic membrane is heated by means of a corresponding laser beam.
  • the membrane merges with the desired area of the object and can be removed in a subsequent step.
  • Another alternative is to attach the dissectate by means of the laser beam to a lid of a Dissektatauffang practicers.
  • catapulted dissected-up can also be attached to the bottom of a dissektate collection container provided with an adhesive coating.
  • the present invention is used in particular in the methods in which a dissectate is separated from an object and collected in a dissected collecting container.
  • the invention is suitable for contact-free collection systems for dissectates.
  • the laser microdissection is usually performed with fully or semi-automatic microscope systems, with a monitor for visualization of the object and of corresponding cutting lines is provided. Even with the earliest systems, as described, for example, in the article by Isenberg et al. Although a mechanical microscope is used, the visualization is also done here via a "television camera".
  • the monitoring of the dissection process or control of the dissection success often proves difficult.
  • the respectively used microscope objective which is also used to focus the laser beam on the object, is focused on the bottom or the collecting surface of the dissected collecting container.
  • the object is necessarily located in the focal plane of the microscope objective during a dissection process, so that such a "refocusing" is required, in cases in which the free working distance of the used Lens is not sufficient for detecting the dissections in the dissected collecting container, even a lens change is required.
  • the present invention proposes a method for laser microdissection, in which at least one collecting area of a dissectate collecting container is imaged to generate image data, and a laser microdissection system designed for carrying out the method with the features of the independent patent claims.
  • Preferred embodiments are the subject of the dependent claims and the following description.
  • the invention is based on a method known per se for laser microdissection, in which at least one dissectate is separated from at least one object to be dissected by means of a laser beam and collected in a dissecting collecting container.
  • the method according to the invention is used in particular in such laser microdissection systems in which a segregated dissected matter falls by gravity into a corresponding dissektate collecting container.
  • the object is attached to one side, in upright systems of the underside, of an object carrier and is processed through the slide from the other side thereof with the laser beam.
  • Such laser microdissection systems include a microscope having a microscope stage carrying the object to be dissected, and an incident light device. By means of the incident light device, a laser beam from a laser light source is coupled into the observation beam path of the microscope. The laser beam is focused by the microscope objective, which is also used for viewing the object to be dissected, onto the object to be dissected.
  • the present invention is based, for example, on a laser microdissection system with a microscope that has a Auflichteinrich- device, a microscope objective, a laser unit and a Laserablenk- or laser scanning device.
  • a beam path of a laser beam of the laser unit in this laser microdissection system runs through the incident light device, through the laser scanning device and through the microscope objective and intersects an object plane of the microscope objective. It is therefore a laser microdissection system in which the laser beam is coupled into the incident light device and focused on the object by the respectively used microscope objective.
  • the illustrated laser microdissection system corresponds in its basic structure, for example, that disclosed in EP 1276 586 Bl.
  • the intersection of the beam path of the laser beam with the object plane and thus the point of impact of the laser beam on the object can be moved by suitable deflection. This is done by deflecting the beam path of the laser beam in accordance with at least one set value of the mentioned laser adjustment means.
  • a "point of impact" of the laser beam on an object or its "target point” the speech these are positions that arise directly from the intersection of the beam path of the laser beam with the object plane when an object in this is introduced. These terms can therefore be used synonymously.
  • the laser microdissection system used in the context of the invention is used with objects to be dissected which have already been prepared for microscopy. These may be, for example, thin sections which are separated out of a larger tissue block by means of a microtome. Such a tissue block may be, for example, a fixed organ or a biopsy of a corresponding organ.
  • the laser microdissection system according to the invention therefore does not serve for the extraction of objects to be dissected but for their processing as well as for the isolation of certain areas thereof. It is understood that the invention may also be used with other dissecting objects which are not obtained by means of a microtome, for example with smears, macerates, etc.
  • Microtomes are used exclusively in the preparation of microscopic objects. Microtomes can also have lasers for this purpose. The sections obtained by means of a microtome are applied to a microscope slide as mentioned above, possibly attached there, stained, etc. Only then are these available for use in the laser microdissection system according to the invention.
  • a microtome differs fundamentally in its operation from a laser microdissection system in that it produces cuts with as homogeneous a cutting thickness as possible. Microtomes are therefore designed to produce a large number of identical cuts with parallel cut surfaces, whereas laser microdissection systems for separating out dissectates according to object-dependent criteria, for example visual Criteria are set up. The person skilled in the art would therefore not transfer technical solutions used in microtomes to laser microdissection systems.
  • microtomes do not include microscopes into whose observation beam path a laser beam is coupled.
  • the laser beam in microtomes will therefore never be transmitted through a microscope objective, which is also used for viewing, onto a processed object, e.g. a tissue block, focused.
  • a laser microdissection system with a laser scanning device is used.
  • the microscope stage is fixedly arranged in laser microdissection systems with a laser scanning device with respect to the x-y direction (that is to say in the directions perpendicular to the optical axis of the microscope objective) during separation of the dissect, ie during the dissecting process.
  • the laser scanning device is integrated in the incident light device.
  • laser microdissection systems with a laser scanning device are easier and less costly to produce and have precision advantages.
  • the laser scanning device has two thick glass wedge plates which are inclined relative to an optical axis and can be rotated independently of one another about the optical axis, and which generate a beam deflection by means of their wedge angles. Due to the rotation of the glass wedge plates, the resulting deflection angle of the laser beam relative to the optical axis is variable.
  • the laser beam has a lateral beam offset with respect to the optical axis due to the thickness and the oblique position of the glass wedge plates and strikes the center of the objective pupil of the microscope objective for all deflection angles.
  • Such a laser scanning device is therefore particularly advantageous over other laser scanning devices such as mirror scanners, galvanometer scanners or stepper motor scanners because they do not have to be arranged in a plane conjugate to the objective pupil. Thus, no so-called pupil imaging is required in order to achieve that the deflected beam hits the objective pupil. In the case of microdissection with UV laser light, for example, a UV-capable pupil image would be required. Further advantages of such a laser scanning device with wedge plates are mentioned, for example, in EP 1 276 586 B1.
  • At least one collecting surface of the dissected collecting container is imaged to generate image data.
  • this is done by "refocusing” a corresponding laser microdissection system
  • the microscope objective focused or focusable visualization cameras can be provided.
  • the "collection surface" of a dissektate collection container is the “collection surface” of a dissektate collection container, on which a dissectate strikes the object after it has been removed.
  • a dissektate collecting container it can also be, in particular, a lid of a known lidded vessel, as is customarily used in the laboratory for receiving small quantities of liquid
  • a corresponding lid vessel is generally a tubular plastic vessel, which may be tapered in the lower region, and which has a vessel opening which can be closed by the said lid
  • the lid which can serve as a dissected collecting vessel, has a lid bottom and on one side of the cover bottom at least one hollow cylinder which can be inserted through the vessel opening into a sealing seat on the inner wall of the vessel s lidded container to be transported.
  • the collecting surface of the dissected collecting container is to be imaged at least two times, wherein the image data generated at the at least two points in time are compared with one another.
  • the collecting surface of the Dissektatauffang representatives is respectively detected before and after the separation of the at least one dissected from the at least one object imaging.
  • This allows an immediate control of the dissection process, in particular, this ensures that a dissection was performed in the specified manner.
  • a counting method and / or a comparison of shaping parameters can be carried out for this purpose.
  • the method according to the invention is suitable when several dissectates are separated from at least one object.
  • the Dissectats can be separated from a single object, for example in the form of several similar and / or different cells or tissue structures; However, corresponding dissecting can also be separated out of several objects.
  • the method according to the invention can be carried out by means of a desired value comparison, for example by comparing a desired number of dissected data with an actual number of dissecting data which are detected in the dissected collecting container on the collecting surface.
  • conventional methods include imaging the collection surface of a dissectate collection container, eg, its bottom, using a microscope objective used in separating out the at least one dissectate from the at least one object to focus the laser beam.
  • the method according to the invention can likewise be carried out accordingly.
  • a corresponding method proves to be particularly advantageous because no additional structural changes to a laser microdissection system are required for this purpose.
  • a distance of the collecting surface of the Dissektatauffang servingers to the microscope objective relative to a distance of the Dissektatauffang servingers to the microscope objective during the separation of the at least one dissectate from the at least one object (ie during the Dissetechnischsvor- gangs) be changed.
  • the refocusing can advantageously be carried out automatically, namely whenever an imaging detection of the collecting surface of the dissektate collecting container is pending.
  • a particularly advantageous method comprises carrying out the imaging acquisition of the collecting surface of the dissected collecting container as long as the collecting surface of the dissected collecting container is located outside a sharpening plane of the microscope objective.
  • a corresponding microscope objective is not or only partially focused on the collecting surface of the disseparate collecting container, ie a corresponding laser microdissection system is not or only partially refocused.
  • blurry images are obtained here.
  • if only qualitative statements are to be obtained by the comparison of the image data generated at the at least two points in time-for example, for counting dissecting data-such blurred imaging acquisition is however sufficient if necessary. Even in correspondingly blurred images, the dissected can be counted recognized.
  • a corresponding method is therefore particularly time-saving.
  • only a partial refocusing of a laser microdissection system can be carried out, which is just sufficient for the qualitative detection of the dissected areas on the collecting surface of the dissektate collecting container and is faster than a complete refocusing.
  • methods may also be advantageous in which the imaging detection of the collecting area of the dissected collecting container is carried out using one or more visualization cameras which are focused or focusable independently of the microscope objective. Corresponding cameras are aligned or alignable on the collecting surface of the Dissektatauffang reminders.
  • Corresponding cameras can, as explained in more detail below with reference to Figures 2 and 3, while the opening side
  • the visualization cameras can be arranged directly above the dissectate collecting container or above an object, ie on the objective side of a corresponding object, and can be directed through the object into the dissected collecting container. to attach one or more visualization cameras to a microscope objective.
  • An arrangement of corresponding visualization cameras on the bottom side of the dissecting collecting container can be useful in certain cases, because this allows a particularly space-saving arrangement.
  • the bottom of the Dissektatauffangitesers is advantageously transparent.
  • the bottom of the Dissektatauffangitesers corresponds to the collection area.
  • a laser protection device can be provided.
  • At least one of the visualization cameras can be designed to be movable or can be controlled by control means.
  • the microscope objective itself or a corresponding visualization camera therefore does not need to be designed to be movable, but can be firmly attached to a defined location and aligned with a collecting surface of the dissected collecting container. This allows a particularly accurate adjustment.
  • the explained method is particularly advantageous if the generation of the image data takes place in the form of pixel data and the comparison of the image data generated at the at least two times is carried out by pixel-by-pixel subtraction of the pixel image data. Since each pixel has a defined position in corresponding pixel image data, it is thus very easy to obtain coordinates of the corresponding dissectates. As a result, automatic retrieval of dissected data can be made possible, in particular in the case of non-contact dissections and collection processes.
  • a number of dissected data is determined by comparing the image data generated at the at least two points in time. This can, as also explained, be achieved by automatically visualizing and analyzing appropriate dissectates in the dissecting collecting container or its collecting surface by generating image data of the entire surface of the dissector collecting container before or during the dissection process. After a dissection process, recordings are made again over the entire collecting area of the dissektate collecting container and the images are adjusted in order to be able to automate the counting. The number of dissections in the dissektate catcher can be done automatically by counting the pixels of a corresponding match, as previously explained.
  • the method according to the invention is particularly suitable when a desired number of dissected data is predetermined and from which at least one object to be dissected is separated out by means of the laser beam until, on the basis of the determination of the number of dissected data, it is established that the desired number of dissected data is reached.
  • Certain biochemical methods such as enzyme activity determinations or PCR, require a minimum amount of material that can be obtained by the laser microsectoral section, for example, given as a minimum number of dissections.
  • the present invention allows in simpler How to determine this number of dissections and perform a procedure exactly until a minimum number is reached. This allows automatic recovery of dissecting material, which can also be automated dissection with appropriate automatic detection of target cells and the like in a microscopic object.
  • the comparison or the imaging detection of the at least one dissectate comprises the determination of shape parameters.
  • shape parameters for example, a completeness of a dissection can be verified. If, for example, a dissecting specimen having a specific shape is predefined by means of a desired cutting line, it can be verified that this dissectate has been completely cut out of the object by checking whether a dissected substance of corresponding shape is found again on the collecting surface of the dissected collecting container.
  • Dissectats in tissue association i. in an object that can be stored during marking and dissecting, and the coordinates on the collecting surface of the dissecting receptacle, for example, in the form of a before-and-after adjustment to verify a proper dissection.
  • This is of importance, for example, in living cell applications for the recultivation of dissected cells in order to ensure minimum distances of living cells which need neighboring cells for recultivation.
  • An essential advantage of the invention is the flexibility of the proposed method. For example, for rapid evaluation (counting), in particular in the case of large dissectates with good visibility even in blurred images, it is possible to quickly determine without refocusing whether there is a sufficient number of dissected data.
  • small dissectates eg bacteria, chromosomes or individual cells with, for example, less than 20 ⁇ m in diameter
  • uneven collecting containers for example in the case of lids of the illustrated lidded containers, which generally have two levels.
  • the software can be used to propose the user the two explained options, or the appropriate method (with or without refocusing) is automatically selected depending on the lens or dissected-medium diameter used and the respective dissectant collecting container.
  • the appropriate method with or without refocusing
  • color differences of dissecting data can be recognized and / or a classification can be made on this basis or on the basis of the dissectate size.
  • the present invention includes the following methods and apparatuses:
  • a method for laser microdissection in which a laser microdissection system is used with a microscope, wherein from at least one object to be dissected by means of a laser beam, which is focused by means of a Auflicht coupled of the microscope through a microscope objective of the microscope on the object to be dissected, at least one dissected and the falling-down dissectate is collected in a dissected collecting container, wherein at least one collecting surface of the dissectate collecting container is at least partially detected by generating image data, wherein the collecting surface of the dissected collecting container is captured at least two times by imaging and the image data generated thereby is compared with each other.
  • a further development of the method in which the collecting surface of the dissectate collecting container is detected by imaging before and after the separation of the at least one dissectate from the at least one object.
  • a further development of the method in which a bottom of the dissectate collecting container is recorded in an imaging manner as a collecting surface of the dissecting collecting container to produce the image data.
  • a development of the method in which the imaging detection of the collecting surface of the dissectate collecting container is carried out using the microscope objective, which is used in the separation of the at least one dissectate from the at least one object for focusing the laser beam.
  • a further development of the method in which a distance of the collecting surface to the microscope objective with respect to a distance during the separation of the at least one dissected from the at least one object is changed for imaging detection of the collecting surface of the Dissektatauffang feelingers.
  • a refinement of the method in which, for the imaging acquisition of the collecting surface of the dissected collecting container, it is scanned in sections and in this case partial image data obtained are combined to form the image data.
  • a further development of the method in which the dissektate collecting container is moved to the section-wise scanning of its collecting surface.
  • a development of the method in which the generation of the image data in
  • Form of pixel image data takes place and the comparison of the image data generated at the at least two points in time is performed with pixel-by-pixel subtraction of the pixel image data.
  • a development of the method in which a spatial position and / or a color and / or a shape parameter and / or a match with at least one predetermined shape parameter s at least one dissectate is determined by comparing the image data generated at least two times.
  • a development of the method in which a plurality of dissectates are separated from the object and divided into size classes on the basis of the image data.
  • the object is deflected variably by means of a laser scanning device in the incident light device.
  • a laser microdissection system comprising a microscope with an incident light device, with which a laser beam can be focused on an object through a microscope objective of the microscope, and a control unit, with which means for separating at least one dissectate from at least one object to be dissected can be controlled by means of the laser beam, as well as collecting means with at least one dissektate collecting container for the at least one dissectate and imaging means for generating image data for at least one collecting surface of the at least one dissected collecting container at least two times, and evaluating means for comparing the image data corresponding to the at least two times are generated, wherein as a means for imaging detection, a digital optical detection unit and / or one or more visualization cameras are arranged.
  • a refinement of the laser microdissection system in which a digital optical detection unit is arranged in the beam path of the microscope as a means for imaging detection, which detects the image generated by the microscope objective and which generates the image data at the at least two times.
  • a further development of the laser microdissection system in which at least one visualization camera is used as a means for imaging acquisition. is arranged outside the beam path of the microscope, which is focused or focusable independently of the microscope objective and is aligned or alignable with the collecting surface of the Dissektatauffang observationsers.
  • this laser microdissection system in which a plurality of visualization cameras are arranged, which are directed to different locations and record their images, wherein the different locations at least the collecting surface of the Dissektatauffang actuallyers and / or the object to be dissected and / or the Kontaminationstikplatte and / or the Dissektatauffang actuallyer and / or the opening of the dissectate collection container and / or the bottom of the dissectate collection container.
  • the means controlled by the control unit for separating out the at least one dissectate comprise electromechanical actuating means with which the location at which the laser beam strikes the object can be adjusted.
  • a refinement of the laser microdissection system in which a laser scanning unit with glass wedge plates rotatable about the optical axis is arranged as means for separating the at least one dissected disk, which generate a beam deflection of the laser beam by their wedge angles, wherein the resulting deflection angle of the laser beam is generated by the rotation of the glass wedge plates Laser beam with respect to the optical axis is variably adjustable.
  • FIG. 1 shows a laser microdissection system which can be used to carry out a method according to the invention.
  • FIG. 2 shows details of a laser microdissection system according to FIG. 1 in a first embodiment in a schematic representation.
  • FIG. 3 shows details of a laser microdissection system according to FIG. 1 in a second embodiment in a schematic representation.
  • FIG. 4 schematically shows image data that can be obtained in a method according to an embodiment of the invention.
  • FIG. 5 shows a schematic representation of image data that can be obtained in a method according to an embodiment of the invention.
  • FIG. 1 a laser microdissection system which can be used for carrying out a method according to the invention is shown schematically and designated 100 as a whole.
  • the laser microdissection system 100 substantially corresponds to that disclosed in EP 1 276 586 B1, which is incorporated herein by reference.
  • the laser microdissection system 100 comprises a microscope 10.
  • a lighting device 12, which is only partially illustrated here, may be provided in a microscope head 11 of the microscope 10.
  • the laser microdissection system 100 is in the However, in the same way, however, it can also be embodied as an inverse laser microdissection system.
  • the illumination device 12 may comprise, for example, a light source (not shown) and suitable means for influencing the illumination light provided by the light source, for example filters and / or diaphragms.
  • a user input and / or user information unit 13 can also be arranged on the microscope head 11, which can be embodied, for example, as a touch screen, and via which the user can input and / or read, for example, viewing and / or processing parameters.
  • a drive knob 14 is provided. This serves to operate a coarse and a fine drive for adjusting a height of a microscope stage 30.
  • An object 51 which is on a slide (here without designation) on a Dissek- tatauffang Nur 50, for example, applied to the slide section can thereby are brought into a focal plane of a lens 41.
  • a condenser unit 20 is used for through-illumination of the sample and for setting suitable contrast or observation methods.
  • the arrangement of the components explained is known to be reversed, ie. the lighting device 12 is at the top, the lens 41 at the bottom.
  • the laser microdissection system 100 has the already mentioned and illustrated in the following figures in more detail Dissektatauffangs worn 50, by means of which dissecting the object 51 can be collected.
  • the objective 41 is fastened next to other objectives 42 in a nosepiece 40.
  • a protective cover 15 may be provided to protect against laser radiation.
  • Outgoing observation light from the object 51 runs along an observation beam path a.
  • a preferably variable portion of the observation light for example by 60 °, can be coupled out and presented to a user by means of an eyepiece pair 62.
  • Another portion of the observation light enters a digital image acquisition unit 63 and can be captured there by imaging.
  • the laser microdissection system 100 has a laser unit 70 with a laser light source 75.
  • a laser beam b provided by the laser light source 75 which may, for example, be a UV laser light source, is deflected at a first original mirror 71 and a second deflection mirror 72 in a reflected-light unit, which is indicated as a whole here by 76 the lens 41 is focused on the object 51.
  • the location where the laser beam b is incident on the object 51 can basically be set in different ways.
  • a manual adjusting device 31 can be provided, by means of which the microscope stage 30 designed as a cross table can be adjusted in the x and y direction (that is to say, perpendicularly or parallel to the plane of the paper).
  • electromechanical adjusting means may be provided which can be controlled for example by a control unit 82 and whose position can be detected by the control unit 82.
  • the control unit 82 can also control any other functions of the laser micro dissection system 100 and in particular provide an interface to an external control computer 81, which can be connected via corresponding connections 83.
  • the control computer 81 and / or the control unit 82 are set up to acquire images which can be obtained by means of a digital-optical detection unit 63 and / or by means of visualization cameras 91 to 95 (see FIGS. 2 and 3).
  • a laser scanning device 73 may be provided in particular. By means of the laser scanning device 73, the laser beam b are also deflected relative to an optical axis c extending between the first deflection mirror 71 and the second deflection mirror 72.
  • the laser beam can therefore impinge on the second deflection mirror 72 at different positions, which can be embodied, for example, as a dichromatic divider, and is therefore also focused at different positions on the object 51.
  • a corresponding deflection by means of a laser scanning device 73 is shown in detail in EP 1 276 586 B1. It should be emphasized that different possibilities for deflecting a laser beam b or for positioning the object 51 relative to the laser beam b can be used. The invention is not limited to the illustrated example.
  • the laser scanning device 73 has two solid glass wedge plates 731, which are inclined relative to the optical axis c and are rotatable independently about the optical axis c.
  • the wedge plates 731 are mounted with ball bearings 732.
  • Each of the wedge plates is connected to a gear 733.
  • the gears 733 may each be rotated by means of rotators 734.
  • the rotation means 734 can be rotated manually and / or by means of suitable electromechanical devices, for example by means of stepping motors, and thereby drive the gears 733.
  • the rotators 734 may have position sensors 735 (shown here only on the right rotator 734). A position detected thereby can be transmitted to the control unit 82.
  • FIG. 2 shows a cross section through the microscope stage 30 with the sample catcher 50 mounted thereon in a plane spanned by the optical axis of the observation beam path a and the x direction (perpendicular to the paper plane of FIG. 1).
  • the microscope stage 30 has a fixed base plate 34, on which a in the y direction (that is perpendicular to the paper plane) movable plate 32 is arranged.
  • the movable plate 32 defines a table surface (without designation) of the Microscope stage 30.
  • the movable plate 32 is relative to the fixed base plate 34 by means of a suitable device, for example using bearing balls 33, displaceable.
  • a suitable device for example using bearing balls 33, displaceable.
  • the previously explained adjusting device 31 can be used for mutually displacing the fixed base plate 34 and the movable plate 32. If this is the case that the fixed base plate 34 "fixed”, this refers only to their position relative to the movable plate 32.
  • the "fixed" base plate 34 can in turn - in the x direction - against another plate of the microscope stage 30th moved and - in z-direction - be adjusted in their higher.
  • a dissektate collecting container 55 Arranged on the table surface of the microscope stage 30 is a dissektate collecting container 55 with a wall 552 and a bottom 551, which optionally can be displaced by means of a suitable adjusting device (see FIG. However, the dissectate catcher 55 may also be manually moved in a free working space 54 of the dissektate catcher 50.
  • the dissektate collecting container 55 can also, as explained, be a lid of a known lidded vessel which can be clamped in the dissektate collecting device 50.
  • the bottom 551 of the dissectate collecting container 55 here represents the dissektate collecting surface 551 of the dissectate collecting container 55.
  • the invention can also be used with dissektate collecting containers 55 in which the dissecting collecting surface 551 of the dissecting collecting container 55 does not correspond to its bottom 551.
  • a "bottom" 551 of the dissektate collecting container 55 will be referred to below.
  • the sample collecting device 50 has a carrier element 53, on which a slide 52 can be placed.
  • the object 51 is attached to the underside of the slide 52.
  • the slide 52 is advantageously positioned so that the object 51 is located completely in the free working space 54.
  • a height 541 of the free working space 54 may be adjustable by adjusting means and / or be defined by spacers (not shown).
  • the microscope objective 41 faces the object carrier 52 on the optical axis of the observation beam path a (in this case, as shown in FIG. 1, in phantom) and generates an image of the object 51 via a corresponding lens arrangement (without designation).
  • the object 51 is located for this purpose in a focal plane of the microscope objective 41.
  • a laser beam b coupled in as explained with reference to FIG. 1 is focused on the object 51 by the microscope objective 41 in order to cut out a corresponding dissecting object 51 from the object 51.
  • the dissecting receptacle 55 is disposed below the object 51 such that the dissectate falls down due to gravity.
  • the number of dissektate collecting containers 55 which, as shown in the following FIG. 3, can also be arranged on a common dissektate receiving container carrier 56, can be adapted to the requirements, for example the number of dissectats to be obtained.
  • the free working space 54 is dimensioned in such a way (see Height 541) that a visualization camera 91 can be arranged in the free working space 54.
  • the visualization camera 91 is positioned so that it can preferably detect the entire bottom of the dissectate collection container 55 (see observation cone 911). If this is not possible, for example for reasons of space, a corresponding visualization camera 91 may only partially detect the bottom of the disseparate collecting container 55, wherein preferably a complete image of the bottom of the disseparate collecting container 55 is obtained by joining individual images (so-called stitching).
  • stitching Several visualization cameras 91 for detecting partial areas can also be provided.
  • the visualization camera 91 may be designed to be movable, wherein corresponding (not shown) actuating means may be provided.
  • the visualization is at least adjustable in order to allow as complete as possible detection of the bottom of the Dissektatauffang feeling members 55.
  • a corresponding line 84 is provided for forwarding the images obtained by means of the visualization camera 91.
  • the images of the visualization camera 91 can be forwarded in any form provided by the visualization camera 91.
  • the forwarding in the form of analog and / or digital signals and / or by means of a suitable transmission protocol.
  • suitable transmission protocols or formats are USB and / or mJPEG.
  • the visualization camera 91 may perform rendering (eg, sharpening) to some extent.
  • the dissektate collecting container 55 for example, on a corresponding Dissek- tatauffang employ 56 is opposite the visualization camera 91 movable. In each case a Dissektatauffang practicer 55, or its bottom, can therefore be moved into the detection cone 911 of the visualization camera 91.
  • the present invention is suitable for both upright and inverse systems.
  • view A of Figure 4 a corresponding Inverssystem is shown. This essentially corresponds to that of the main view, but the arrangement of the microscope objective 51, the slide 52 with the object 51 attached to it, the dissecting receptacle 55 and the visualization camera 91 is rotated by 180 ° with respect to the horizontal.
  • FIG. 3 shows a corresponding section through a microscope stage 30 with a sample collecting device 50 arranged thereon according to a further embodiment.
  • the sectional plane corresponds to that of FIG. 2.
  • two retaining elements 57 of which only the left retaining element 57 is provided with a reference numeral, are fastened to the stationary base plate 34.
  • the holding elements 57 carry a contamination protection plate 58, which is fixed between the carrier element 53 and the Dissektatauffang efforter 55, which together with further Dissektatauffangb 55 is attached to a Dissektatauffang experienceer( 56 here.
  • the contamination protection plate 58 advantageously spans the entire table surface of the microscope stage 30 and thus limits the free working space 54 upwards.
  • the contamination protection plate 58 is provided with a cutout 581 about the optical axis of the observation beam path a.
  • a dissektate collecting container 55 of the Dissektatauffang electer versas 56 for example, in each case a well of a known microtiter plate, can be arranged below the cutout 581.
  • Contamination protection plate 58 prevents dust or other particles from the ambient air from falling into dissektate collecting containers 55. Furthermore, dissectates of the object 51 are prevented from falling into a "false" disseparate catcher 55 when ejected from the object 51 by the action of the laser beam b, in other words, all but the respective desired disseparate catcher 55, all other dissektate catchers 55 closed by the contamination protection plate 58. This allows the use of the illustrated microtiter plates, which are a simple and cost-effective solution for collecting dissectates.
  • An adjusting device 59 can be connected to the dissektate collecting container carrier 56, whereby a corresponding engaging element 591 can be provided.
  • the adjusting device 59 can be operated manually, preferably has However, a corresponding motor, by means of which the engagement member 591 and the attached Dissektatauffang practicer mich 56 can be moved.
  • the adjusting device 59 is connected via a corresponding connection 83 to a computer, for example the explained control computer 81.
  • the control computer 81 shifts the dissektate collecting container carrier 56 via the adjusting device 59 in such a way that in each case the desired dissecting receiving container 55 is below the cutout 581 and thus below the region of the object 51 which is being processed by means of the laser beam b.
  • visualization cameras designated here by 92 to 95, can be provided. Again, the arrangement shown in Figure 3 can be used, ie a visualization camera can be mounted above the Dissektatauffang practicers 55. Furthermore, it can be provided to install a visualization camera 92 below a dissektate collecting container 55 or a corresponding dissektate collecting container carrier 56 (with a transparent bottom).
  • the visualization camera 92 and also the further visualization cameras 93 to 95 of FIG. 5 are connected to the control computer 81 via corresponding lines 84 (shown only in the case of the visualization camera 92).
  • the arrangement of the visualization camera 93 corresponds in principle to the arrangement of the visualization camera 91 from FIG. 2.
  • the visualization camera 93 is arranged in the region of the cutout 581 of the contamination protection plate 58. It can also be provided to arrange the visualization camera 93 in the illustrated orientation above the contamination protection plate 58.
  • the contamination Nationalstoffplatte 58 may be transparent and / or have transparent trained areas.
  • a visualization camera 94 may also be mounted in or on a microscope objective 41.
  • the visualization camera 94 can be firmly integrated into the microscope objective 41 and / or reversibly attached to it, for example by means of a suitable slip-on sleeve 941.
  • the visualization camera 94 makes it possible, with sufficient transparency of the object 51, to grasp the bottom of the dissected collecting container 55 through the object carrier 52 and the object 51. Is a sufficient
  • a visualization camera 95 can be provided outside the axial axis of the observation beam path a, which makes it possible to detect dissected data in dissektate collecting containers 55 not currently positioned below the cutout 581. This allows, for example, a parallel evaluation of laser microdissection processes, in which the processing of the object 51 does not have to be interrupted and / or a before-after comparison.
  • FIG. 4 shows, in the views A, B and C, image data 550 obtained by an imaging detection according to the invention of a bottom 551 of a dissected collecting container 55 are obtained at least two times.
  • view A shows image data 550 obtained at a first time.
  • the bottom 551 of the disseparate collecting container 55 and its wall 552 can be seen.
  • the Dissektatauffang changinger 55 was taken in the example shown vertically from above. In the example shown, a focus was made on the bottom 551 of the dissectate collecting container 55.
  • the view A shows image data 550 obtained before a dissection process. Therefore, no dissectates (designated as 511 in view B) are still on the bottom 551 of the dissectate collection container 550. As illustrated by dashed areas 553, imaging of the bottom 551 of the dissectate catcher 55 may also be in the form of a slice scan. Corresponding partial image data are then combined to form the image data 550. Different sections 553 of a dissektate collecting container 55 or its bottom 552 can also be obtained by refocusing, in particular if the bottom 551 of the dissectate collecting container 55 is not planar.
  • View B of FIG. 4 shows image data 550 obtained after three dissectates 511 have been separated from one or more objects 51. Dissectates 511 here have different sizes, but they may also be dissectates 511 of the same size. Between the views A and B, further image data 550 can also be obtained, for example after the separation of each individual dissectate 511.
  • derived image data 555 obtained by comparing the image data 550 from the views A and B are shown.
  • the dissectates 511 are clearly recognizable here relative to the (subtracted) background.
  • an assignment of the respective dissected to certain tissues, Dissetechnischsvorêtn, size classes, form classes, color classes, etc. done. The evaluation is thus reliable and allows a simple and user-friendly control or monitoring of a dissection or a Dissetechnischs answerss.
  • FIG. 5 shows further image data 550, which are obtained by an inventive imaging acquisition of a bottom 551 of a dissektate collecting container 55 at at least two points in time.
  • the dissektate collecting container 55 is, for example, a lid of a lidded vessel explained at the beginning; However, the principles explained also apply generally to other dissektate collecting containers 55.
  • the bottom 551 of the dissectate collecting container 55 here has two bottom regions 551a and 551b, which merge into one another at a boundary 554 and are located at different heights (ie different z-planes). This may require refocusing.
  • the imaging detection of the bottom 551 of the dissektate collecting container 55 can also take place here in the form of a section-wise scan. For example, instead of the four regions 553 shown, nine, 16, 25, 36, etc.
  • regions 553 may also be detected, depending on the size of the dissectate collection container 55 and the magnification in the imaging acquisition.
  • differences from the state before the dissection process are taken into account by adapted camera and illumination settings and possibly "calculated out" (this applies, for example, to color differences) (x, y, and z) can be stored and reused to create a corresponding composite image, or alternatively to a determination and / or storage. corresponding positions are omitted and later with an image analysis method a billing of corresponding image data 550 done.
  • a dissected collecting container 55 may be necessary to acquire a plurality of individual images of a region 553, in particular if a dissected collecting container 55 has a plurality of bottom regions 551a and 551b which are located at different heights (ie different z-planes).
  • a size threshold for the detection or classification of objects on the bottom 551 of the dissectate collecting container 55.
  • large dissectates for example the dissectate 511a shown in hatched form
  • smaller dissectates dissectates 511b and 511c
  • contaminations in the form of small particles 556a or fibers 556b Detection of shape parameters may also be expedient for this distinction.
  • Shape parameters may also be used to distinguish dissectates 511d and 511e, which are partially superimposed in the example shown, and therefore differ altogether from an expected shape (eg, from a cut line for the dissection).
  • An a priori knowledge of a desired form of dissected data thus enables a review of a dissection success.
  • the shape and size of the dissectates may be advantageously adjustable as in pattern recognition software (AVC).
  • AVC pattern recognition software
  • Objects that are already present prior to a dissection and that originate, for example, from manufacturing inaccuracies of dissector catch containers 55, labels, etc. can be sorted out as false positive hits by a before-after comparison.
  • the diameter or the shortest side edge of a dissectate 511 can also be used for identification, since not all dissectates always rest smoothly on the bottom 551 of the dissectate collecting container 55, but also on one another. ner cutting edge can stand (not shown).
  • the size selection on the basis of the smallest diameter or the shortest cutting edge is an important sub-method to determine the most accurate number of dissecting data.

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Abstract

Es wird ein Verfahren zur Lasermikrodissektion, bei dem ein Lasermikrodissektionssystem (100) mit einem Mikroskop (10) verwendet wird, wobei aus wenigstens einem zu dissektierenden Objekt (51) mittels eines Laserstrahls (b), der mittels einer Auflichteinrichtung (76) des Mikroskops (10) durch ein Mikroskopobjektiv (41) des Mikroskops (10) auf das zu dissektierende Objekt (51) fokussiert wird, wenigstens ein Dissektat (511) herausgetrennt wird und in einem Dissektatauffangbehälter (55) aufgefangen wird, wobei zumindest eine Auffangfläche (551) des Dissektatauffangbehälters (55) unter Erzeugung von Bilddaten (550) zumindest abschnittsweise bildgebend erfasst wird, vorgeschlagen. Die Auffangfläche (551) des Dissektatauffangbehälters (55) wird zu wenigstens zwei Zeitpunkten bildgebend erfasst und die hierbei erzeugten Bilddaten (550) werden miteinander verglichen. Ein Lasermikrodissektionssystem (100), das zur Durchführung eines solchen Verfahrens eingerichtet ist, ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung.

Description

Verfahren zur Lasermikrodissektion und Lasermikrodissektionssystem
Beschreibung Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Lasermikrodissektion, bei dem zumindest eine Auffangfläche eines Dissektatauffangbehälters unter Erzeugung von Bilddaten bildgebend erfasst wird, und ein zur Durchführung des Verfahrens eingerichtetes Lasermikrodissektionssystem. Stand der Technik
Verfahren zur Bearbeitung mikroskopischer Proben durch die sogenannte Lasermikrodissektion existieren bereits seit Mitte der 1970er Jahre (siehe z.B. Isenberg, G. et al.: Cell surgery by laser micro-dissection: a preparative method. Journal of Microscopy, Band 107, 1976, Seiten 19-24) und wurden seitdem kontinuierlich weiterentwickelt.
Bei der Lasermikrodissektion können Zellen, Geweberegionen usw. aus einem Präparat („Objekt") isoliert und als sogenannte Dissektate gewonnen werden. Ein besonderer Vorteil der Lasermikrodissektion ist der kurze Kontakt des Gewebes mit dem Laserstrahl, durch den das Gewebe kaum verändert wird. Die spezifische Gewinnung der Dissektate kann dabei auf unterschiedliche Weise erfolgen (siehe z.B. Bancroft, J.D. und Gamble, M.: Theory and Practice of Histological Techniques. Elsevier Science, 2008, Seite 575, Kapitel„Laser Microdissection"). Beispielsweise kann in bekannten Verfahren aus einem Objekt mittels eines Infrarot- oder Ultraviolettlaserstrahls ein Dissektat isoliert werden, das entweder unter dem Einfluss der Schwerkraft in einen geeigneten Dissektatauffangbehälter fällt oder gegen die Schwerkraft in einen solchen katapultiert wird (sogenanntes Laser Pressure Catapulting). Das Dissektat kann dabei aus dem Objekt auch zusammen mit einer anhaftenden Membran ausgeschnitten werden. Bei der sogenannten Laser Capture Microdissection wird hingegen eine thermoplastische Membran mittels eines entsprechenden Laserstrahls erwärmt. Dabei verschmilzt die Membran mit dem gewünschten Bereich des Objekts und kann in einem darauffolgenden Schritt entfernt werden. Eine weitere Alternative besteht darin, das Dissektat mittels des Laserstrahls an einen Deckel eines Dissektatauffangbehälters anzuheften. Bei bekannten inversen Mikroskopsystemen zur Lasermikrodissektion können nach oben katapultierte Dissektate auch an den Boden eines Dissektatauffangbehälters, der mit einer adhäsiven Beschichtung versehen ist, angeheftet werden.
Die vorliegende Erfindung kommt hierbei insbesondere bei den Verfahren zum Einsatz, bei dem ein Dissektat aus einem Objekt herausgetrennt und in einem Dissektatauffangbehälter aufgefangen wird. Insbesondere ist die Erfindung für kontaktfreie Auffangsysteme für Dissektate geeignet.
Bekannte Mikroskopsysteme zur Lasermikrodissektion, wie sie beispielsweise aus der WO 98/14816 AI bekannt sind, weisen eine Auflichteinrichtung auf, in deren Strahlengang ein Laserstrahl eingekoppelt wird. Der Laserstrahl wird durch das jeweils verwendete Mikroskopobjektiv auf das Objekt fokussiert, das auf einem motorisch-automatisch verfahrbaren Mikroskoptisch aufliegt. Eine Schnittlinie wird dadurch erzeugt, dass der Mikroskoptisch beim Schneiden verfahren wird, um das Objekt relativ zu dem feststehenden Laserstrahl zu bewegen. Dies hat jedoch unter anderem den Nachteil, dass das Objekt während des Erzeugens der Schnittlinie nicht sinnvoll betrachtet werden kann, da sich dieses kontinuierlich oder schrittweise im Gesichtsfeld bewegt. Vorteilhafter sind daher Lasermikrodissektionssysteme, die Laserablenk- bzw. Laserscaneinrichtungen aufweisen, die dazu eingerichtet sind, den Laserstrahl bzw. dessen Auftreffpunkt auf dem dann feststehenden Objekt entsprechend zu verschieben. Derartige Lasermikrodissektionssysteme, die auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung besondere Vorteile bieten, werden unten im Detail erläutert. Ein besonders vorteilhaftes Lasermikrodissektionssystem, das eine Laserscaneinrichtung mit gläsernen Keilplatten aufweist, ist in der EP 1 276 586 Bl beschrieben. In beiden Fällen, also sowohl in Lasermikrodissektionssystemen, in denen der Mikroskoptisch verfahren wird, als auch in Lasermikrodissektionssystemen, die eine Laserscaneinrichtung aufweisen, wird in der Regel mit gepulsten Lasern gearbeitet, wobei durch jeden Laserpuls beispielsweise ein Loch im Objekt erzeugt wird. Eine Schnittlinie entsteht durch eine Aneinanderreihung derartiger Löcher, gegebenenfalls mit Überlappung.
Die Lasermikrodissektion wird üblicherweise mit voll- oder halbautomatischen Mikroskopsystemen durchgeführt, wobei ein Monitor zur Visualisierung des Objekts und von entsprechenden Schnittlinien vorgesehen ist. Auch bei den frühesten Systemen, wie sie beispielsweise aus dem eingangs erwähnten Artikel von Isenberg et al. bekannt sind, wird zwar ein mechanisches Mikroskop verwendet, die Visualisierung erfolgt jedoch auch hier über eine„Fernsehkamera".
In den erläuterten Systemen erweist sich die Überwachung des Dissektionsvor- gangs bzw. eine Kontrolle des Dissektionserfolgs häufig als schwierig. In der Regel wird nach dem Heraustrennen des Dissektats das jeweils verwendete Mikroskopobjektiv, das auch zur Fokussierung des Laserstrahls auf das Objekt verwendet wird, auf den Boden bzw. die Auffangfläche des Dissektatauffangbehälters fo- kussiert. Das Objekt befindet sich bei einem Dissektionsvorgang notwendigerweise in der Schärfenebene des Mikroskopobjektivs, so dass ein derartiges„Umfokussie- ren" erforderlich ist. In Fällen, in denen der freie Arbeitsabstand des verwendeten Objektivs zur Erfassung der Dissektate in dem Dissektatauffangbehälter nicht ausreicht, ist sogar ein Objektivwechsel erforderlich.
In herkömmlichen Mikroskopsystemen zur Lasermikrodissektion ist ferner nur eine rein visuelle Kontrolle des Dissektatauffangbehälters möglich. Insbesondere bei Optimierungsarbeiten, beispielsweise zur Ermittlung der zur Dissektion erforderlichen Laserleistung, oder in Fällen, in denen eine bestimmte, vorgegebene Anzahl an Dissektaten gewonnen werden soll, ist dies außerordentlich aufwendig. Es besteht daher der Bedarf nach verbesserten Möglichkeiten zur Überwachung des Dissektionsvorgangs bzw. zur Kontrolle des Dissektionserfolgs bei der Lasermikrodissektion.
Offenbarung der Erfindung
Vor diesem Hintergrund schlägt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Lasermikrodissektion, bei dem zumindest eine Auffangfläche eines Dissektatauffangbehälters unter Erzeugung von Bilddaten bildgebend erfasst wird, und ein zur Durchführung des Verfahrens eingerichtetes Lasermikrodissektionssystem mit den Merkmalen der unabhängigen Patentansprüche vor. Bevorzugte Ausgestaltungen sind jeweils Gegenstand der abhängigen Patentansprüche sowie der nachfolgenden Beschreibung.
Vorteile der Erfindung
Die Erfindung geht von einem an sich bekannten Verfahren zur Lasermikrodissektion aus, bei dem aus wenigstens einem zu dissektierenden Objekt mittels eines Laserstrahls wenigstens ein Dissektat herausgetrennt und in einem Dissektatauffangbehälter aufgefangen wird. Das erfindungsgemäße Verfahren kommt insbesondere in solchen Lasermikro- dissektionssystemen zum Einsatz, in denen ein herausgetrenntes Dissektat aufgrund der Schwerkraft in einen entsprechenden Dissektatauffangbehälter fällt. Das Objekt ist dabei an einer Seite, in Aufrechtsystemen der Unterseite, eines Objekt- trägers befestigt und wird durch den Objektträger hindurch von dessen anderer Seite aus mit dem Laserstrahl bearbeitet.
Derartige Lasermikrodissektionssysteme umfassen ein Mikroskop mit einem Mikroskoptisch, der das zu dissektierende Objekt trägt, und einer Auflichteinrichtung. Mittels der Auflichteinrichtung wird ein Laserstrahl aus einer Laserlichtquelle in den Beobachtungsstrahlengang des Mikroskops eingekoppelt. Der Laserstrahl wird durch das Mikroskopobjektiv, das auch zum Betrachten des zu dissektieren- den Objekts verwendet wird, auf das zu dissektierende Objekt fokussiert.
Anders ausgedrückt geht die vorliegende Erfindung beispielsweise von einem La- sermikrodissektionssystem mit einem Mikroskop aus, das eine Auflichteinrich- tung, ein Mikroskopobjektiv, eine Lasereinheit und eine Laserablenk- bzw. Laserscaneinrichtung aufweist. Ein Strahlengang eines Laserstrahls der Lasereinheit verläuft in diesem Lasermikrodissektionssystem durch die Auflichteinrichtung, durch die Laserscaneinrichtung und durch das Mikroskopobjektiv und schneidet eine Objektebene des Mikroskopobjektivs. Es handelt sich damit um ein Lasermikrodissektionssystem, bei dem der Laserstrahl in die Auflichteinrichtung eingekoppelt und durch das jeweils verwendete Mikroskopobjektiv auf das Objekt fokussiert wird. Das erläuterte Lasermikrodissektionssystem entspricht in seinem grundsätzlichen Aufbau beispielsweise dem in der EP 1276 586 Bl offenbarten.
Durch die Laserscaneinrichtung kann der Schnittpunkt des Strahlengangs des Laserstrahls mit der Objektebene und damit der Auftreffpunkt des Laserstrahls auf dem Objekt durch geeignete Ablenkmittel verschoben werden. Dies erfolgt dadurch, dass der Strahlengang des Laserstrahls nach Maßgabe wenigstens eines Einstellwerts der erwähnten Lasereinstellmittel abgelenkt wird. Ist im Rahmen dieser Anmeldung von einem„Auftreffpunkt" des Laserstrahls auf einem Objekt bzw. dessen„Zielpunkt" die Rede, handelt es sich hierbei um Positionen, die sich direkt aus dem Schnittpunkt des Strahlengangs des Laserstrahls mit der Objektebene ergeben, wenn ein Objekt in diese eingebracht ist. Diese Begriffe können daher synonym verwendet werden.
Zur Vermeidung von Missverständnissen sei an dieser Stelle betont, dass das im Rahmen der Erfindung eingesetzte Lasermikrodissektionssystem mit zu dissektie- renden Objekten verwendet wird, die bereits mikroskopietauglich vorbereitet sind. Hierbei kann es sich beispielsweise um Dünnschnitte handeln, die mittels eines Mikrotoms aus einem größeren Gewebeblock herausgetrennt werden. Bei einem solchen Gewebeblock kann es sich beispielsweise um ein fixiertes Organ oder eine Biopsie eines entsprechenden Organs handeln. Das erfindungsgemäße Lasermikrodissektionssystem dient daher nicht zur Gewinnung von zu dissektie- renden Objekten sondern zu deren Bearbeitung sowie zur Isolation von bestimmten Bereichen hiervon. Es versteht sich, dass die Erfindung auch mit anderen zu dissektierenden Objekten, die nicht mittels eines Mikrotoms gewonnen werden, zum Einsatz kommen kann, beispielsweise mit Ausstrichen, Mazeraten usw.
Mikrotome werden ausschließlich bei der Vorbereitung von mikroskopischen Objekten eingesetzt. Mikrotome können hierzu auch Laser aufweisen. Die mittels eines Mikrotoms erhaltenen Schnitte werden auf einen Objektträger, wie oben erwähnt, aufgebracht, ggf. dort befestigt, angefärbt usw. Erst dann stehen diese für einen Einsatz in dem erfindungsgemäßen Lasermikrodissektionssystem zur Verfügung. Ein Mikrotom unterscheidet sich in seinem Betrieb unter anderem dadurch fundamental von einem Lasermikrodissektionssystem, dass dort Schnitte mit möglichst homogener Schnittstärke gewonnen werden. Mikrotome sind daher dazu ausgebildet, eine große Anzahl an identischen Schnitten mit parallelen Schnittflä- chen zu erzeugen, wohingegen Lasermikrodissektionssysteme zum Heraustrennen von Dissektaten nach objektabhängigen Kriterien, beispielsweise nach visuellen Kriterien, eingerichtet sind. Der Fachmann würde daher bei Mikrotomen eingesetzte technische Lösungen nicht auf Lasermikrodissektionssysteme übertragen.
Mikrotome umfassen ferner keine Mikroskope, in deren Beobachtungsstrahlen- gang ein Laserstrahl eingekoppelt wird. Der Laserstrahl wird daher in Mikrotomen auch niemals durch ein Mikroskopobjektiv, das auch zur Betrachtung verwendet wird, auf ein bearbeitetes Objekt, z.B. einen Gewebeblock, fokussiert.
Ferner kommt im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorteilhafterweise ein La- sermikrodissektionssystem mit einer Laserscaneinrichtung zum Einsatz. Der Mikroskoptisch ist in Lasermikrodissektionssystemen mit einer Laserscaneinrichtung bezüglich der x-y-Richtung (also in den Richtungen senkrecht zur optischen Achse des Mikroskopobjektivs) beim Heraustrennen des Dissektats, also während des Dissektiervorgangs, feststehend angeordnet. Die Laserscaneinrichtung ist in der Auflichteinrichtung integriert.
Im Gegensatz zu Lasermikrodissektionssystemen mit einem während des Dissektiervorgangs motorisch verfahrenen Mikroskoptisch (Scanningtisch), der insbesondere bei stark vergrößernden Objektiven eine hohe Positioniergenauigkeit be- sitzen muss, um präzise Schnitte zu ermöglichen, erweisen sich Lasermikrodissektionssysteme mit einer Laserscaneinrichtung als einfacher und kostengünstiger in der Herstellung und besitzen Präzisionsvorteile.
Ferner erscheint einem Betrachter in Lasermikrodissektionssystemen mit einem während des Dissektiervorgangs motorisch verfahrenen Mikroskoptisch das Bild während des Dissektiervorgangs bewegt. Insbesondere störend ist dies, wenn die Betrachtung mit einer langsamen Kamera und einem Monitor erfolgt. Das Monitorbild verschwimmt in diesem Fall und zeigt ruckartige Veränderungen. Diesen Nachteil zeigen Lasermikrodissektionssysteme mit einer Laserscaneinrichtung hingegen nicht, weil der Mikroskoptisch feststeht. Die Laserscaneinrichtung weist in einer besonders vorteilhaften Ausführungsform zwei dicke, gegen eine optische Achse geneigte und unabhängig voneinander um die optische Achse drehbare gläserne Keilplatten auf, welche durch ihre Keilwinkel eine Strahlablenkung erzeugen. Durch die Drehung der gläsernen Keilplatten ist der resultierende Ablenkwinkel des Laserstrahls gegenüber der optischen Achse variabel. Am Ausgang der Laserscaneinrichtung weist der Laserstrahl durch die Dicke und die Schrägstellung der gläsernen Keilplatten einen seitlichen Strahlversatz gegenüber der optischen Achse auf und trifft für alle Ablenkwinkel die Mitte der Objektivpupille des Mikroskopobjektivs.
Eine derartige Laserscaneinrichtung ist insbesondere deshalb vorteilhaft gegenüber anderen Laserscaneinrichtungen wie beispielsweise Spiegelscannern, Galvanometerscannern oder Schrittmotorscannern, weil diese nicht in einer zu der Objektivpupille konjugierten Ebene angeordnet werden muss. Damit ist auch keine sogenannte Pupillenabbildung erforderlich, um zu erreichen, dass der abgelenkte Strahl die Objektivpupille trifft. Bei der Mikrodissektion mit UV-Laserlicht wäre dabei beispielsweise eine UV-taugliche Pupillenabbildung erforderlich. Weitere Vorteile einer derartigen Laserscaneinrichtung mit Keilplatten sind beispielsweise in der EP 1 276 586 Bl genannt.
Zumindest eine Auffangfläche des Dissektatauffangbehälters wird unter Erzeugung von Bilddaten bildgebend erfasst. Wie eingangs erläutert, erfolgt dies in herkömmlichen Systemen dadurch, dass ein entsprechendes Lasermikrodissektionssystem „umfokussiert" wird. Wie nachfolgend noch erläutert, können jedoch auch (zusätz- liehe) und unabhängig von dem Mikroskopobjektiv fokussierte oder fokussierbare Visualisierungskameras vorgesehen sein.
Die„Auffangfläche" ist dabei insbesondere der Boden des Dissektatauffangbehälters. Allgemein ist eine„Auffangfläche" eines Dissektatauffangbehälters der Be- reich, auf dem ein Dissektat nach dem Heraustrennen aus dem Objekt auftrifft. Ist hier von einem„Dissektatauffangbehälter" die Rede, kann es sich auch insbesondere um einen Deckel eines bekannten Deckelgefäßes handeln, wie es üblicherweise im Labor zur Aufnahme geringer Flüssigkeitsmengen eingesetzt wird. Ein entsprechendes Deckelgefäß ist beispielsweise in der EP 1 317 961 Bl in einer speziellen Ausgestaltung gezeigt. Bei einem entsprechenden Deckelgefäß handelt es sich im Allgemeinen um ein röhrenförmiges und ggf. im unteren Bereich spitz zulaufendes Kunststoffgefäß, das eine Gefäßöffnung aufweist, die durch den genannten Deckel verschließbar ist. Der Deckel, der als Dissektatauffangbehälter dienen kann, weist einen Deckelboden und auf einer Seite des Deckelbodens min- destens einen Hohlzylinder auf, der durch die Gefäßöffnung in einen Dichtsitz an der Gefäßinnenwand einsetzbar ist. Der Deckelboden bildet damit die erwähnte Auffangfläche. Durch Umklappen des Deckels und damit Verschließen des Deckelgefäßes kann das Dissektat in das Deckelgefäß befördert werden. Erfindungsgemäß ist vorgesehen, die Auffangfläche des Dissektatauffangbehälters zu wenigstens zwei Zeitpunkten bildgebend zu erfassen, wobei die zu den wenigstens zwei Zeitpunkten erzeugten Bilddaten miteinander verglichen werden. Die Erfindung ermöglicht damit die automatische Visualisierung von Dissektaten, die Auszählung entsprechender Dissektate, und sämtliche hieraus abgeleiteten Be- rechnungen und/oder Voraussagen auf einfache und bedienerfreundliche Weise.
Vorteilhafterweise wird dabei die Auffangfläche des Dissektatauffangbehälters jeweils vor und nach dem Heraustrennen des wenigstens einen Dissektats aus dem wenigstens einen Objekt bildgebend erfasst. Dies ermöglicht eine unmittelbare Kontrolle des Dissektionsvorgangs, insbesondere wird hierdurch sichergestellt, dass eine Dissektion in der vorgegebenen Weise durchgeführt wurde. Wie ebenfalls nachfolgend erläutert, kann hierzu insbesondere ein Zählverfahren und/oder ein Vergleich von Formparametern durchgeführt werden. In besonderer Weise eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren dann, wenn mehrere Dissektate aus wenigstens einem Objekt herausgetrennt werden. Die Dissektate können dabei aus einem einzigen Objekt herausgetrennt werden, beispielsweise in Form mehrerer gleichartiger und/oder unterschiedlicher Zellen o- der Gewebestrukturen; entsprechende Dissektate können jedoch auch aus mehreren Objekten herausgetrennt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren kann da- bei mittels eines Sollwertvergleichs durchgeführt werden, beispielsweise indem eine Sollanzahl von Dissektaten mit einer Istanzahl von Dissektaten, die in dem Dissektatauffangbehälter auf der Auffangfläche erfasst werden, verglichen wird.
Wie eingangs erläutert, umfassen herkömmliche Verfahren die bildgebende Erfas- sung der Auffangfläche eines Dissektatauffangbehälters, beispielsweise dessen Bodens, unter Verwendung eines Mikroskopobjektivs, das beim Heraustrennen des wenigstens einen Dissektats aus dem wenigstens einen Objekt zur Fokussie- rung des Laserstrahls verwendet wird. Das erfindungsgemäße Verfahren kann ebenfalls entsprechend durchgeführt werden. Ein entsprechendes Verfahren er- weist sich als besonders vorteilhaft, weil hierzu keine zusätzlichen baulichen Veränderungen an einem Lasermikrodissektionssystem erforderlich sind.
Hierbei kann zur bildgebenden Erfassung der Auffangfläche des Dissektatauffangbehälters ein Abstand der Auffangfläche des Dissektatauffangbehälters zu dem Mikroskopobjektiv gegenüber einem Abstand des Dissektatauffangbehälters zu dem Mikroskopobjektiv während des Heraustrennens des wenigstens einen Dissektats aus dem wenigstens einen Objekt (also während des Dissektionsvor- gangs) verändert werden. Dies entspricht dem eingangs erläuterten Umfokussie- ren eines Lasermikrodissektionssystems. Das Umfokussieren kann vorteilhafter- weise automatisch durchgeführt werden, nämlich immer dann, wenn eine bildgebende Erfassung der Auffangfläche des Dissektatauffangbehälters ansteht. In Form eines automatischen Ablaufs kann dabei jeweils alternierend dissektiert und die Auffangfläche des Dissektatauffangbehälters unter Erzeugung der Bilddaten bildgebend erfasst werden. Die Umfokussierung erfolgt dabei vollautomatisch, wodurch ein entsprechendes Verfahren besonders anwenderfreundlich wird. Ein entsprechendes Umfokussieren kann in einem hierzu geeignet ausgebildeten La- sermikrodissektionssystem auch„eingelernt" werden, was bedeutet, dass der Benutzer die Umfokussierung zunächst einmalig manuell vornimmt und sich das La- sermikrodissektionssystem den hierzu erforderlichen Verstellbereich bzw. Verstellbetrag„merkt". Wie erläutert, kann ein Umfokussieren auch nach dem Her- austrennen mehrerer Dissektate aus einem oder mehreren Objekten erfolgen.
Ein besonders vorteilhaftes Verfahren umfasst, die bildgebende Erfassung der Auffangfläche des Dissektatauffangbehälters durchzuführen, solange sich die Auffangfläche des Dissektatauffangbehälters außerhalb einer Schärfenebene des Mikro- skopobjektivs befindet. Ein entsprechendes Mikroskopobjektiv wird, mit anderen Worten, gemäß dieser Verfahrensvariante nicht oder nur teilweise auf die Auffangfläche des Dissektatauffangbehälters scharf eingestellt, ein entsprechendes Laser- mikrodissektionssystem also nicht oder nur teilweise umfokussiert. Hierbei werden naturgemäß unscharfe Bilder erhalten. Insbesondere dann, wenn durch den Vergleich der zu den wenigstens zwei Zeitpunkten erzeugten Bilddaten nur qualitative Aussagen erhalten werden sollen - beispielsweise zum Auszählen von Dissektaten - reicht eine derartige unscharfe bildgebende Erfassung jedoch gegebenenfalls aus. Auch in entsprechend unscharfen Bildern können die Dissektate zählbar erkannt werden. Ein entsprechendes Verfahren ist daher besonders zeit- sparend. In derartigen Fällen kann auch eine nur teilweise Umfokussierung eines Lasermikrodissektionssystems vorgenommen werden, die gerade noch zur qualitativen Erfassung der Dissektate auf der Auffangfläche des Dissektatauffangbehälters ausreicht und dabei schneller als eine vollständige Umfokussierung ist. In bestimmten Fällen können jedoch auch Verfahren vorteilhaft sein, bei denen die bildgebende Erfassung der Auffangfläche des Dissektatauffangbehälters unter Verwendung einer oder mehrerer unabhängig von dem Mikroskopobjektiv fokus- sierter oder fokussierbarer Visualisierungskameras durchgeführt wird. Entsprechende Kameras sind dabei auf die Auffangfläche des Dissektatauffangbehälters ausgerichtet oder ausrichtbar. Entsprechende Kameras können, wie unten unter Bezugnahme auf die Figuren 2 und 3 noch näher erläutert, dabei öffnungsseitig eines Dissektatauffangbehälters angeordnet sein und in den Dissektatauffangbe- hälter„blicken". Die Visualisierungskameras können direkt oberhalb des Dissektatauffangbehälters oder oberhalb eines Objekts, d.h. objektivseitig eines entsprechenden Objekts, angeordnet und durch das Objekt in den Dissektatauffangbehäl- ter gerichtet sein. Besonders praktisch kann sein, hierbei eine oder mehrere Visualisierungskameras an einem Mikroskopobjektiv anzubringen.
Auch eine Anordnung entsprechender Visualisierungskameras bodenseitig des Dissektatauffangbehälters kann in bestimmten Fällen sinnvoll sein, weil dies eine besonders platzsparende Anordnung ermöglicht. In diesem Fall ist der Boden des Dissektatauffangbehälters vorteilhafterweise transparent ausgebildet. Der Boden des Dissektatauffangbehälters entspricht dabei der Auffangfläche.
Insbesondere dann, wenn eine entsprechende Visualisierungskamera auf einer optischen Achse eines Lasers bzw. des Mikroskopobjektivs angeordnet ist, kann eine Laserschutzeinrichtung vorgesehen sein. Zumindest eine der Visualisierungskameras kann beweglich ausgebildet oder durch Steuermittel ansteuerbar sein.
Reicht das durch ein Mikroskopobjektiv oder durch eine Visualisierungskamera erfassbare Gesichtsfeld nicht aus, um die Auffangfläche des Dissektatauffangbehälters vollständig zu erfassen, kann es sich als vorteilhaft erweisen, den Dissektatauf- fangbehälter bzw. dessen Auffangfläche abschnittsweise abzutasten. Bei der abschnittsweisen Abtastung der Auffangfläche des Dissektatauffangbehälters erhaltene Teilbilddaten werden zu den bereits erläuterten Bilddaten zusammengesetzt.
Besonders vorteilhaft kann hierbei sein, den Dissektatauffangbehälter zum abschnittsweisen Abtasten seiner Auffangfläche entsprechend zu verschieben. Das Mikroskopobjektiv selbst bzw. eine entsprechende Visualisierungskamera braucht also nicht beweglich ausgebildet sein sondern kann fest an einem definierten Ort angebracht und auf eine Auffangfläche des Dissektatauffangbehälters ausgerichtet werden. Dies ermöglicht eine besonders exakte Justierung. Besonders vorteilhaft ist das erläuterte Verfahren, wenn die Erzeugung der Bilddaten in Form von Pixeldaten erfolgt und der Vergleich der zu den wenigstens zwei Zeitpunkten erzeugten Bilddaten durch pixelweise Subtraktion der Pixelbilddaten durchgeführt wird. Da in entsprechenden Pixelbilddaten jeder Pixel eine definierte Lage besitzt, können auf diese Weise sehr einfach Koordinaten der entsprechenden Dissektate erhalten werden. Hierdurch kann, insbesondere bei kontaktfreien Dissektionen und Sammelprozessen, ein automatisches Wiederfinden von Dissektaten ermöglicht werden.
Wie bereits erläutert, ist besonders vorteilhaft, wenn durch den Vergleich der zu den wenigstens zwei Zeitpunkten erzeugten Bilddaten eine Anzahl von Dissektaten bestimmt wird. Dies kann, wie ebenfalls erläutert, durch ein automatisches Visuali- sieren und Analysieren entsprechender Dissektate im Dissektatauffangbehälter bzw. dessen Auffangfläche erfolgen, indem von der gesamten Fläche des Dissek- tatauffangbehälters vor oder während des Dissektionsvorgangs Bilddaten erzeugt werden. Nach einem Dissektionsvorgang werden erneut über die gesamte Auffangfläche des Dissektatauffangbehälters Aufnahmen gemacht und es erfolgt ein Abgleich der Aufnahmen, um somit die Auszählung automatisieren zu können. Die Anzahl an Dissektaten im Dissektatauffangbehälter kann durch Auszählen der Pixel eines entsprechenden Abgleichs, wie zuvor erläutert, automatisch erfolgen.
In besonderer Weise eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren, wenn eine Sollanzahl von Dissektaten vorgegeben wird und aus dem wenigstens einen zu dissektierenden Objekt so lange mittels des Laserstrahls Dissektate herausgetrennt werden, bis auf Grundlage der Bestimmung der Anzahl von Dissektaten festgestellt wird, dass die Sollanzahl von Dissektaten erreicht ist. Für bestimmte biochemische Verfahren, beispielsweise Enzymaktivitätsbestimmungen oder die PCR, ist eine Mindestmenge an Material erforderlich, das durch die Lasermikro- dissektion gewonnen werden kann, und das beispielsweise als Mindestanzahl von Dissektaten vorgegeben wird. Die vorliegende Erfindung ermöglicht in einfacher Weise, diese Anzahl an Dissektaten zu bestimmen und ein Verfahren exakt so lange durchzuführen, bis eine entsprechende Mindestanzahl erreicht ist. Dies ermöglicht eine automatische Gewinnung von Dissektatmaterial, bei der auch eine automatische Dissektion mit entsprechender automatischer Erkennung von Zielzellen und dergleichen in einem mikroskopischen Objekt erfolgen kann.
Vorteilhafterweise umfasst der Vergleich bzw. die bildgebende Erfassung des wenigstens einen Dissektats die Bestimmung von Formparametern. Hierdurch kann beispielsweise eine Vollständigkeit einer Dissektion verifiziert werden. Wird bei- spielsweise mittels einer Sollschnittlinie ein Dissektat mit bestimmter Form vorgegeben, kann verifiziert werden, dass dieses Dissektat vollständig aus dem Objekt ausgeschnitten wurde, indem überprüft wird, ob ein Dissektat mit entsprechender Form auf der Auffangfläche des Dissektatauffangbehälters wiedergefunden wird. Hierbei besteht auch die vorteilhafte Möglichkeit, anhand von Koordinaten des
Dissektats im Gewebeverband, d.h. in einem Objekt, die während eines Markierens und Dissektierens gespeichert werden können, und der Koordinaten auf der Auffangfläche des Dissektatauffangbehälters, beispielsweise in Form eines Vorher- Nachher-Abgleichs, eine ordnungsgemäße Dissektion zu verifizieren. Dies ist bei- spielsweise bei Lebendzellanwendungen zur Rekultivierung dissektierter Zellen von Bedeutung, um Mindestabstände von lebenden Zellen zu gewährleisten, die für die Rekultivierung Nachbarzellen brauchen.
Ein wesentlicher Vorteil der Erfindung ist die Flexibilität des vorgeschlagenen Ver- fahrens. Beispielsweise kann zur Schnellauswertung (Auszählung), insbesondere bei großen Dissektaten mit guter Erkennbarkeit auch in unscharfen Bildern, ohne ein Nachfokussieren rasch bestimmt werden, ob eine ausreichende Anzahl von Dissektaten vorliegt. Bei kleinen Dissektaten (z.B. Bakterien, Chromosomen oder Einzelzellen mit beispielsweise weniger als 20 μιη im Durchmesser) und bei un- ebenen Auffangbehältern, beispielsweise bei Deckeln der erläuterten Deckelgefäße, welche i.d.R. zwei Ebenen aufweisen, kann hingegen ein Nachfokussieren erfol- gen. Dies ermöglicht eine besonders detaillierte Auswertung. Dem Anwender können softwareseitig beispielsweise die zwei erläuterten Möglichkeiten vorgeschlagen werden oder es wird je nach verwendetem Objektiv bzw. Dissektatdurchmes- ser und dem jeweiligen Dissektatauffangbehälter automatisch das geeignete Ver- fahren (mit oder ohne Nachfokussieren) ausgewählt. In einer nachgeschalteten Bildverarbeitungseinrichtung können beispielsweise farbliche Unterschiede von Dissektaten erkannt und/oder auf dieser Basis oder auf Basis der Dissektatgröße eine Einteilung nach vorgenommen werden. Entsprechend der vorausgegangenen Beschreibung umfasst die vorliegende Erfindung die folgenden Verfahren und Vorrichtungen:
Ein Verfahren zur Lasermikrodissektion, bei dem ein Lasermikrodissekti- onssystem mit einem Mikroskop verwendet wird, wobei aus wenigstens einem zu dissektierenden Objekt mittels eines Laserstrahls , welcher mittels einer Auflichteinrichtung des Mikroskops durch ein Mikroskopobjektiv des Mikroskops auf das zu dissektierende Objekt fokussiert wird, wenigstens ein Dissektat herausgetrennt wird und das herabfallende Dissektat in einem Dissektatauffangbehälter aufgefangen wird, wobei zumindest eine Auffangfläche des Dissektatauffangbehälters unter Erzeugung von Bilddaten zumindest abschnittsweise bildgebend erfasst wird, wobei die Auffangfläche des Dissektatauffangbehälters zu wenigstens zwei Zeitpunkten bildgebend erfasst wird und dass die hierbei erzeugten Bilddaten miteinander verglichen werden.
Eine Weiterbildung des Verfahrens, bei dem die Auffangfläche des Dissektatauffangbehälters vor und nach dem Heraustrennen des wenigstens einen Dissektats aus dem wenigstens einen Objekt bildgebend erfasst wird. Eine Weiterbildung des Verfahrens, bei dem als Auffangfläche des Dissek- tatauffangbehälters ein Boden des Dissektatauffangbehälters unter Erzeugung der Bilddaten bildgebend erfasst wird.
Eine Weiterbildung des Verfahrens, bei dem die bildgebende Erfassung der Auffangfläche des Dissektatauffangbehälters unter Verwendung des Mikroskopobjektivs durchgeführt wird, das bei dem Heraustrennen des wenigstens einen Dissektats aus dem wenigstens einen Objekt zur Fokussierung des Laserstrahls verwendet wird.
Eine Weiterbildung des Verfahrens, bei dem zur bildgebenden Erfassung der Auffangfläche des Dissektatauffangbehälters ein Abstand der Auffangfläche zu dem Mikroskopobjektiv gegenüber einem Abstand während des Heraustrennens des wenigstens einen Dissektats aus dem wenigstens einen Objekt verändert wird.
Eine Weiterbildung des Verfahrens, bei dem sich der Boden des Dissektatauffangbehälters bei der bildgebenden Erfassung außerhalb einer Schärfenebene des Mikroskopobjektivs befindet.
Eine Weiterbildung des Verfahrens, bei dem die bildgebende Erfassung der Auffangfläche des Dissektatauffangbehälters unter Verwendung einer oder mehrerer unabhängig von einem Mikroskopobjektiv fokussierter oder fo- kussierbarer Visualisierungskameras erfolgt.
Eine Weiterbildung des Verfahrens, bei dem zur bildgebenden Erfassung der Auffangfläche des Dissektatauffangbehälters diese abschnittsweise abgetastet wird und hierbei erhaltene Teilbilddaten zu den Bilddaten zusammengesetzt werden. Eine Weiterbildung des Verfahrens, bei dem der Dissektatauffangbehälter zum abschnittsweisen Abtasten seiner Auffangfläche verschoben wird. - Eine Weiterbildung des Verfahrens, bei dem die Erzeugung der Bilddaten in
Form von Pixelbilddaten erfolgt und der Vergleich der zu den wenigstens zwei Zeitpunkten erzeugten Bilddaten unter pixelweiser Subtraktion der Pixelbilddaten durchgeführt wird. - Eine Weiterbildung des Verfahrens, bei dem durch den Vergleich der zu den wenigstens zwei Zeitpunkten erzeugten Bilddaten eine Anzahl von Dissektaten bestimmt wird.
Eine Weiterbildung des Verfahrens, bei dem eine Sollanzahl von Dissektaten vorgegeben wird und aus dem wenigstens einen zu dissektierenden Objekt so lange mittels des Laserstrahls Dissektate herausgetrennt werden, bis auf Grundlage der Bestimmung der Anzahl von Dissektaten festgestellt wird, dass die Sollanzahl von Dissektaten erreicht ist.
Eine Weiterbildung des Verfahrens, bei dem durch den Vergleich der zu den wenigstens zwei Zeitpunkten erzeugten Bilddaten eine räumliche Lage und/oder eine Farbe und/oder ein Formparameter und/oder eine Übereinstimmung mit wenigstens einem vorgegebenen Formparameter s wenigstens einen Dissektats bestimmt wird.
Eine Weiterbildung des Verfahrens, bei dem mehrere Dissektate aus dem Objekt herausgetrennt und auf Grundlage der Bilddaten in Größenklassen eingeteilt werden.
Eine Weiterbildung des Verfahrens, bei dem der Laserstrahl während des Heraustrennens des wenigstens einen Dissektats aus dem zu dissektieren- den Objekt mittels einer Laserscaneinrichtung in der Auflichteinrichtung variabel abgelenkt wird.
Eine Weiterbildung des Verfahrens, bei dem eine Laserscaneinrichtung verwendet wird, die gegen eine optische Achse geneigte und unabhängig voneinander um die optische Achse drehbare gläserne Keilplatten zum variablen Ablenken des Laserstrahls aufweist.
Ein Lasermikrodissektionssystem umfassend ein Mikroskop mit einer Auflichteinrichtung, mit denen ein Laserstrahl durch ein Mikroskopobjektiv des Mikroskops auf ein Objekt fokussierbar ist, sowie eine Steuereinheit, mit welcher Mittel zum Heraustrennen wenigstens eines Dissektats aus wenigstens einem zu dissektierenden Objekt mittels des Laserstrahls ansteuerbar sind, sowie Auffangmittel mit wenigstens einem Dissektatauffangbehälter für das wenigstens eine Dissektat sowie Mittel zum bildgebenden Erfassen, mit denen für zumindest die eine Auffangfläche des wenigstens einen Dissektatauffangbehälters Bilddaten zu wenigstens zwei Zeitpunkten erstellbar sind, und Auswertemittel, die für ein Vergleichen der Bilddaten, die zu den wenigstens zwei Zeitpunkten erzeugt wurden, ausgebildet sind, wobei als Mittel zum bildgebenden Erfassen eine digitaloptische Erfassungseinheit und/oder eine oder mehrere Visualisierungskameras angeordnet sind.
Eine Weiterbildung des Lasermikrodissektionssystems, bei dem als Mittel zum bildgebenden Erfassen eine digitaloptische Erfassungseinheit im Strahlengang des Mikroskops angeordnet ist, welche das vom Mikroskopobjektiv erzeugte Bild erfasst und welche die Bilddaten zu den wenigstens zwei Zeitpunkten erzeugt.
Eine Weiterbildung des Lasermikrodissektionssystems, bei dem als Mittel zum bildgebenden Erfassen mindestens eine Visualisierungskamera au- ßerhalb des Strahlengangs des Mikroskops angeordnet ist, die unabhängig von dem Mikroskopobjektiv fokussiert oder fokussierbar ist und auf die Auffangfläche des Dissektatauffangbehälters ausgerichtet oder ausrichtbar ist.
Eine Weiterbildung dieses Lasermikrodissektionssystems, bei dem mehrere Visualisierungskameras angeordnet sind, die auf unterschiedliche Orte gerichtet sind und deren Bilder aufnehmen, bei dem die unterschiedlichen Orte mindestens die Auffangfläche des Dissektatauffangbehälters und/oder das zu dissektierende Objekt und/oder die Kontaminationsschutzplatte und/oder den Dissektatauffangbehälter und/oder die Öffnung des Dissektatauffangbehälters und/oder den Boden des Dissektatauffangbehälters umfassen.
Eine Weiterbildung des Lasermikrodissektionssystems, bei dem die von der Steuereinheit angesteuerten Mittel zum Heraustrennen des wenigstens eines Dissektats elektromechanische Stellmittel umfassen, mit denen der Ort , an dem der Laserstrahl auf das Objekt trifft, einstellbar ist.
Eine Weiterbildung des Lasermikrodissektionssystems, bei dem als Mittel zum Heraustrennen des wenigstens eines Dissektats eine Laserscaneinheit mit um die optische Achse drehbaren, gläsernen Keilplatten angeordnet ist, die durch ihre Keilwinkel eine Strahlablenkung des Laserstrahls erzeugen, wobei durch die Drehung der gläsernen Keilplatten der resultierende Ablenkwinkel des Laserstrahls gegenüber der optischen Achse variabel einstellbar ist.
Die vorliegende Erfindung und Ausführungsformen der Erfindung werden nachfolgend unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen erläutert. Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Figur 1 zeigt ein Lasermikrodissektionssystem, das zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden kann.
Figur 2 zeigt Details eines Lasermikrodissektionssystems gemäß Figur 1 in einer ersten Ausführungsform in schematischer Darstellung.
Figur 3 zeigt Details eines Lasermikrodissektionssystems gemäß Figur 1 in einer zweiten Ausführungsform in schematischer Darstellung.
Figur 4 zeigt Bilddaten, die in einem Verfahren gemäß einer Ausführungsform der Erfindung erhalten werden können, in schematischer Darstellung.
Figur 5 zeigt Bilddaten, die in einem Verfahren gemäß einer Ausführungsform der Erfindung erhalten werden können, in schematischer Darstellung.
In den Figuren werden einander entsprechende Elemente mit identischen Bezugszeichen angegeben und nicht wiederholt erläutert.
Ausführungsform (en) der Erfindung
In Figur 1 ist ein Lasermikrodissektionssystem, das zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden kann, schematisch dargestellt und insgesamt mit 100 bezeichnet. Das Lasermikrodissektionssystem 100 entspricht in wesentlichen Teilen jenem, das in der EP 1 276 586 Bl offenbart ist, auf die hier ausdrücklich Bezug genommen wird.
Das Lasermikrodissektionssystem 100 umfasst ein Mikroskop 10. In einem Mikroskopfuß 11 des Mikroskops 10 kann eine hier nur teilweise dargestellte Beleuchtungseinrichtung 12 vorgesehen sein. Das Lasermikrodissektionssystem 100 ist im dargestellten Beispiel als Aufrechtsystem 100 ausgebildet, kann in gleicher Weise jedoch auch als inverses Lasermikrodissektionssystem ausgebildet sein. Die Beleuchtungseinrichtung 12 kann beispielsweise eine (nicht dargestellte) Lichtquelle und geeignete Mittel zur Beeinflussung des durch die Lichtquelle bereitgestellten Beleuchtungslichts umfassen, beispielsweise Filter und/oder Blenden.
Am Mikroskopfuß 11 kann beispielsweise auch eine Benutzereingabe- und/oder Benutzerinformationseinheit 13 angeordnet sein, die beispielsweise als Touch- screen ausgebildet sein kann, und über die der Benutzer beispielsweise Betrach- tungs- und/oder Bearbeitungsparameter eingeben und/oder auslesen kann.
Ferner ist ein Triebknopf 14 vorgesehen. Dieser dient zur Bedienung eines Grob- und eines Feintriebs zur Einstellung einer Höhe eines Mikroskoptischs 30. Ein Objekt 51, das sich auf einem Objektträger (hier ohne Bezeichnung) auf einer Dissek- tatauffangeinrichtung 50 befindet, beispielsweise ein auf dem Objektträger aufgebrachter Schnitt, kann hierdurch in eine Schärfenebene eines Objektivs 41 gebracht werden. Zur Durchüchtbeleuchtung der Probe und zur Einstellung geeigneter Kontrast- bzw. Beobachtungsverfahren dient eine Kondensoreinheit 20. Bei inversen Lasermikrodissektionssystemen ist die Anordnung der erläuterten Komponenten bekanntermaßen umgekehrt, d.h. die Beleuchtungseinrichtung 12 befindet sich oben, das Objektiv 41 unten.
Das Lasermikrodissektionssystem 100 weist die bereits erwähnte und in den nach- folgenden Figuren näher veranschaulichte Dissektatauffangeinrichtung 50 auf, mittels derer Dissektate des Objekts 51 aufgefangen werden können. Das Objektiv 41 ist neben weiteren Objektiven 42 in einem Objektivrevolver 40 befestigt. Zum Schutz vor Laserstrahlung kann eine Schutzhaube 15 vorgesehen sein.
Von dem Objekt 51ausgehendes Beobachtungslicht verläuft entlang einem Beobachtungsstrahlengang a. In einer Tubuseinheit 60 mit geeigneten Auskoppelein- richtungen 61 kann ein vorzugsweise variabler Anteil des Beobachtungslichts, beispielsweise um 60°, ausgekoppelt und mittels eines Okularpaars 62 einem Benutzer dargeboten werden. Ein weiterer Anteil des Beobachtungslichts gelangt in eine digitale Bilderfassungseinheit 63 und kann dort bildgebend erfasst werden.
Das Lasermikrodissektionssystem 100 weist eine Lasereinheit 70 mit einer Laserlichtquelle 75 auf. Ein durch die Laserlichtquelle 75, bei der es sich beispielsweise um eine UV-Laserlichtquelle handeln kann, bereitgestellter Laserstrahl b wird in einer Auflichteinheit, die hier insgesamt mit 76 angegeben ist, an einem ersten Ura- lenkspiegel 71 und einem zweiten Umlenkspiegel 72 umgelenkt und durch das Objektiv 41 auf das Objekt 51 fokussiert.
Bei dem Lasermikrodissektionssystem 100 kann der Ort, an dem der Laserstrahl b auf das Objekt 51 auftrifft, grundsätzlich auf unterschiedliche Weise eingestellt werden. Einerseits kann eine manuelle Versteileinrichtung 31 vorgesehen sein, mittels derer der als Kreuztisch ausgebildete Mikroskoptisch 30 in x- und y- Richtung (also hier senkrecht bzw. parallel zur Papierebene) verstellt werden kann. Neben der Versteileinrichtung 31 können auch elektromechanische Stellmittel vorgesehen sein, die beispielsweise durch eine Steuereinheit 82 angesteuert bzw. deren Position durch die Steuereinheit 82 erfasst werden kann.
Die Steuereinheit 82 kann auch beliebige weitere Funktionen des Lasermikro- dissektionssystems 100 steuern und insbesondere eine Schnittstelle zu einem externen Steuerrechner 81, der über entsprechende Verbindungen 83 angebunden sein kann, bereitstellen. Insbesondere sind der Steuerrechner 81 und/oder die Steuereinheit 82 zur Erfassung von Bildern eingerichtet, die mittels einer digitaloptischen Erfassungseinheit 63 und/oder mittels Visualisierungskameras 91 bis 95 (siehe Figuren 2 und 3) erhalten werden können. Für die Lasermikrodissektion kann jedoch insbesondere eine Laserscaneinrichtung 73 vorgesehen sein. Mittels der Laserscaneinrichtung 73 kann der Laserstrahl b auch gegenüber einer zwischen dem ersten Umlenkspiegel 71 und dem zweiten Umlenkspiegel 72 verlaufenden optischen Achse c abgelenkt werden. Der Laserstrahl kann daher an unterschiedlichen Positionen auf den zweiten Umlenkspiegel 72 auftreffen, der beispielsweise als dichromatischer Teiler ausgebildet sein kann, und wird damit auch an unterschiedlichen Positionen auf das Objekt 51 fokussiert. Eine entsprechende Ablenkung mittels einer Laserscaneinrichtung 73 ist im Detail in der EP 1 276 586 Bl gezeigt. Es sei betont, dass unterschiedliche Möglichkeiten zur Ablenkung eines Laserstrahls b bzw. zur Positionierung des Objekts 51 gegenüber dem Laserstrahl b zum Einsatz kommen können. Die Erfindung ist nicht auf das dargestellte Beispiel beschränkt.
Im dargestellten Beispiel weist die Laserscaneinrichtung 73 zwei massive gläserne Keilplatten 731 auf, die gegen die optische Achse c geneigt und unabhängig voneinander um die optische Achse c drehbar sind. Hierzu sind die Keilplatten 731 mit Kugellagern 732 gelagert. Jede der Keilplatten ist mit einem Zahnrad 733 verbunden. Die Zahnräder 733 können jeweils mittels Rotationseinrichtungen 734 gedreht werden. Die Rotationseinrichtungen 734 können manuell und/oder mittels geeigneter elektromechanischer Vorrichtungen, beispielsweise mittels Schrittmotoren, in eine Drehbewegung versetzt werden und hierüber die Zahnräder 733 antreiben. Die Rotationseinrichtungen 734 können über Positonsgeber 735 verfügen (hier nur an der rechten Rotationseinrichtung 734 gezeigt). Eine hierdurch erfasste Position kann an die Steuereinheit 82 übermittelt werden.
In Figur 2 ist ein Querschnitt durch den Mikroskoptisch 30 mit der darauf ange- brachten Probenauffangeinrichtung 50 in einer durch die optische Achse des Beobachtungsstrahlengangs a und die x-Richtung (senkrecht zur Papierebene der Figur 1) aufgespannten Ebene dargestellt.
Der Mikroskoptisch 30 weist eine feststehende Basisplatte 34 auf, auf der eine in y- Richtung (also senkrecht zur Papierebene) verfahrbare Platte 32 angeordnet ist. Die verfahrbare Platte 32 definiert eine Tischoberfläche (ohne Bezeichnung) des Mikroskoptischs 30. Die verfahrbare Platte 32 ist gegenüber der feststehenden Basisplatte 34 mittels einer geeigneten Einrichtung, beispielsweise unter Verwendung von Lagerkugeln 33, verschiebbar. Zum wechselseitigen Verschieben der feststehenden Basisplatte 34 und der verfahrbaren Platte 32 kann die bereits er- läuterte Versteileinrichtung 31 verwendet werden. Ist hier davon die Rede, dass die feststehende Basisplatte 34„feststeht", bezieht sich dies nur auf ihre Position gegenüber der verfahrbaren Platte 32. Die„feststehende" Basisplatte 34 kann auch ihrerseits - in x-Richtung - gegenüber einer weiteren Platte des Mikroskoptischs 30 verschoben und - in z-Richtung - in ihrer Höher verstellt werden.
Auf der Tischoberfläche des Mikroskoptischs 30 ist ein Dissektatauffangbehälter 55 mit einer Wand 552 und einem Boden 551 angeordnet, der ggf. mit einer geeigneten VerStelleinrichtung (vgl. Figur 3) verschoben werden kann. Der Dissektatauffangbehälter 55 kann jedoch auch manuell in einem freien Arbeitsraum 54 der Dissektatauffangeinrichtung 50 bewegt werden. Bei dem Dissektatauffangbehälter 55 kann es sich auch, wie erläutert, um einen Deckel eines bekannten Deckelgefäßes handeln, der in der Dissektatauffangeinrichtung 50 eingespannt werden kann. Der Boden 551 des Dissektatauffangbehälters 55 stellt hier die Dissektatauffang- fläche 551 des Dissektatauffangbehälters 55 dar. Die Erfindung kann jedoch auch bei Dissektatauffangbehältern 55 zum Einsatz kommen, bei denen die Dissek- tatauffangfläche 551 des Dissektatauffangbehälters 55 nicht dessen Boden 551 entspricht. Der Einfachheit halber ist nachfolgend jedoch von einem„Boden" 551 des Dissektatauffangbehälters 55 die Rede.
Die Probenauffangeinrichtung 50 weist ein Trägerelement 53 auf, auf das ein Objektträger 52 aufgelegt werden kann. Das Objekt 51 ist an der Unterseite des Objektträgers 52 angebracht. Der Objektträger 52 wird vorteilhafterweise so positio- niert, dass sich das Objekt 51 vollständig in dem freien Arbeitsraum 54 befindet. Eine Höhe 541 des freien Arbeitsraums 54 kann durch Verstellmittel verstellbar ausgebildet sein und/oder durch Abstandshalter (nicht gezeigt) festgelegt sein.
Das Mikroskopobjektiv 41 ist auf der optischen Achse des Beobachtungsstrahlen- gangs a (hier, wie in Figur 1, strichpunktiert dargestellt) dem Objektträger 52 zugewandt und erzeugt über eine entsprechende Linsenanordnung (ohne Bezeichnung) ein Bild des Objekts 51. Das Objekt 51 befindet sich hierzu in einer Brennebene des Mikroskopobjektivs 41. Ferner wird durch das Mikroskopobjektiv 41 ein wie zu Figur 1 erläutert eingekoppelter Laserstrahl b auf das Objekt 51 fokussiert, um aus dem Objekt 51 ein entsprechendes Dissektat auszuschneiden. Der Dissektatauffangbehälter 55 ist derart unter dem Objekt 51 angeordnet, dass das Dissektat aufgrund der Schwerkraft in diesen herabfällt. Die Anzahl der Dissektatauffangbehälter 55, die, wie in der nachfolgenden Figur 3 dargestellt, auch an einem gemeinsamen Dissektatauf- fangbehälterträger 56 angeordnet sein können, kann an die Erfordernisse, beispielsweise die Anzahl der zu gewinnenden Dissektate, angepasst werden.
Im dargestellten Beispiel ist der freie Arbeitsraum 54 derart dimensioniert (vgl. Höhe 541), dass in dem freien Arbeitsraum 54 eine Visualisierungskamera 91 angeordnet werden kann. Die Visualisierungskamera 91 ist derart positioniert, dass sie vorzugsweise den gesamten Boden des Dissektatauffangbehälters 55 (vgl. Beobachtungskegel 911) erfassen kann. Ist dies, beispielsweise aus Platzgründen, nicht möglich, kann eine entsprechende Visualisierungskamera 91 den Boden des Dissektatauffangbehälters 55 auch nur teilweise erfassen, wobei vorzugsweise ein vollständiges Bild des Bodens des Dissektatauffangbehälters 55 durch Aneinanderfügen von Einzelbildern (sogenanntes Stitching) erhalten wird. Auch mehrere Visualisierungskameras 91 zur Erfassung von Teilbereichen können vorgesehen sein. Die Visualisierungskamera 91 kann beweglich ausgebildet sein, wobei ent- sprechende (nicht dargestellte) Stellmittel vorgesehen sein können. Die Visualisie- rungskamera 91 ist jedoch zumindest justierbar, um jeweils eine möglichst vollständige Erfassung des Bodens des Dissektatauffangbehälters 55 zu ermöglichen.
Zum Weiterleiten der mittels der Visualisierungskamera 91 erhaltenen Bilder ist eine entsprechende Leitung 84 vorgesehen. Mittels der Leitung 84 können die Bilder der Visualisierungskamera 91 in jeglicher Form, die die Visualisierungskamera 91 bereitstellt, weitergeleitet werden. Beispielsweise kann die Weiterleitung in Form von Analog- und/oder Digitalsignalen und/oder mittels eines geeigneten Übertragungsprotokolls erfolgen. Beispiele für geeignete Übertragungsprotokolle bzw. -formate sind USB und/oder mJPEG. Um eine möglichst kleine Ausbildung der Visualisierungskamera 91 zu ermöglichen, kann diese nur mit minimalen Bildaufbereitungsmitteln versehen sein. Alternativ kann die Visualisierungskamera 91 eine Bildaufbereitung (z.B. Schärfung) in gewissem Umfang durchführen. Der Dissektatauffangbehälter 55, beispielsweise an einem entsprechenden Dissek- tatauffangbehälterträger 56, ist gegenüber der Visualisierungskamera 91 beweglich. Jeweils ein Dissektatauffangbehälter 55, bzw. dessen Boden, kann daher in den Erfassungskegel 911 der Visualisierungskamera 91 verschoben werden. Wie erläutert, eignet sich die vorliegende Erfindung sowohl für Aufrecht- als auch für Inverssysteme. In Ansicht A der Figur 4 ist ein entsprechendes Inverssystem dargestellt. Dieses entspricht im Wesentlichen jenem der Hauptansicht, wobei jedoch die Anordnung des Mikroskopobjektivs 51, des Objektträgers 52 mit dem daran angebrachten Objekt 51, des Dissektatauffangbehälters 55 und der Visuali- sierungskamera 91 um 180° in Bezug auf die Horizontale gedreht ist. In derartigen Inverssystemen wird ein Dissektat aus dem Objekt 51 durch die Wirkung des Laserstrahls b herausgeschleudert. Der Boden des Dissektatauffangbehälters 55 ist hierbei vorzugsweise mit einer adhäsiven Beschichtung versehen, so dass ein Dissektat am Boden des Dissektatauffangbehälters 55 anhaften kann. In Figur 3 ist ein entsprechender Schnitt durch einen Mikroskoptisch 30 mit einer darauf angeordneten Probenauffangeinrichtung 50 gemäß einer weiteren Ausführungsform dargestellt. Die Schnittebene entspricht jener der Figur 2. In dem dargestellten Beispiel sind an der feststehenden Basisplatte 34 zwei Halteelemente 57, von denen nur das linke Halteelement 57 mit einem Bezugszeichen versehen ist, befestigt. Die Halteelemente 57 tragen eine Kontaminationsschutzplatte 58, die zwischen dem Trägerelement 53 und dem Dissektatauffangbehälter 55, der hier zusammen mit weiteren Dissektatauffangb ehältern 55 an einem Dissektatauffangbehälterträger 56 angebracht ist, feststeht. Die Kontaminationsschutzplatte 58 überspannt vorteilhafterweise die gesamte Tischoberfläche des Mikroskoptischs 30 und begrenzt damit den freien Arbeitsraum 54 nach oben. Die Kontaminationsschutzplatte 58 ist mit einem Ausschnitt 581 um die optische Achse des Beobachtungsstrahlengangs a versehen.
Jeweils ein Dissektatauffangbehälter 55 des Dissektatauffangbehälterträgers 56, beispielsweise jeweils eine Vertiefung einer bekannten Mikrotiterplatte, kann unterhalb des Ausschnitts 581 angeordnet werden. Durch die Kontaminationsschutzplatte 58 wird verhindert, dass Staub oder andere Partikel aus der Umge- bungsluft in die Dissektatauffangbehälter 55 fallen. Ferner wird verhindert, dass Dissektate des Objekts 51 in einen„falschen" Dissektatauffangbehälter 55 fallen, wenn sie durch die Wirkung des Laserstrahls b aus dem Objekt 51 herausgeschleudert werden. Mit anderen Worten werden, bis auf den jeweils gewünschten Dissektatauffangbehälter 55, sämtliche anderen Dissektatauffangbehälter 55 durch die Kontaminationsschutzplatte 58 verschlossen. Dies ermöglicht die Verwendung der erläuterten Mikrotiterplatten, die eine einfache und kostengünstige Lösung zum Auffangen von Dissektaten darstellen.
Eine Verstellvorrichtung 59 kann mit dem Dissektatauffangbehälterträger 56 ver- bunden werden, wobei ein entsprechendes Eingriffselement 591 vorgesehen sein kann. Die VerStelleinrichtung 59 kann manuell bedient werden, weist vorzugswei- se jedoch einen entsprechenden Motor auf, mittels dessen das Eingriffselement 591 und der daran befestigte Dissektatauffangbehälterträger 56 verfahren werden kann. Die Versteilvorrichtung 59 ist hierzu über eine entsprechende Verbindung 83 mit einem Rechner, beispielsweise dem erläuterten Steuerrechner 81, verbun- den. Der Steuerrechner 81 verschiebt über die Versteileinrichtung 59 den Dissektatauffangbehälterträger 56 derart, dass sich jeweils der gewünschte Dissektatauf- fangbehälter 55 unter dem Ausschnitt 581 und damit unter dem Bereich des Objekts 51 befindet, der mittels des Laserstrahls b bearbeitet wird. Nachdem jeweils ein Lasermikrodissektionsvorgang abgeschlossen ist, fällt das entsprechende Dissektat aufgrund der Schwerkraft in den Dissektatauffangbehälter 55. Der Steuerrechner 81 wird dann, falls erforderlich, einen anderen oder leeren Dissektatauffangbehälter 55 entsprechend positionieren, um damit ein oder mehrere neue Dissektate aufzufangen. Auch entsprechend der in Figur 3 gezeigten Ausführungsform können Visualisierungskameras, hier mit 92 bis 95 bezeichnet, vorgesehen sein. Auch hier kann die in der Figur 3 dargestellte Anordnung zum Einsatz kommen, d.h. eine Visualisierungskamera kann oberhalb des Dissektatauffangbehälters 55 angebracht werden. Ferner kann vorgesehen sein, eine Visualisierungskamera 92 unterhalb eines Dissektatauffangbehälters 55 bzw. eines entsprechenden Dissektatauffangbehäl- terträgers 56 (mit transparentem Boden) anzubringen.
Die Visualisierungskamera 92 und auch die weiteren Visualisierungskameras 93 bis 95 der Figur 5 sind über entsprechende Leitungen 84 (nur bei Visualisierungs- kamera 92 gezeigt) an den Steuerrechner 81 angebunden.
Die Anordnung der Visualisierungskamera 93 entspricht im Grundsatz der Anordnung der Visualisierungskamera 91 aus Figur 2. Die Visualisierungskamera 93 ist im Bereich des Ausschnitts 581 der Kontaminationsschutzplatte 58 angeordnet. Es kann auch vorgesehen sein, die Visualisierungskamera 93 in der dargestellten Ausrichtung oberhalb der Kontaminationsschutzplatte 58 anzuordnen. Die Kontami- nationsschutzplatte 58 kann transparent ausgebildet sein und/oder transparent ausgebildete Bereiche aufweisen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann auch eine Visualisierungskamera 94 in oder an einem Mikroskopobjektiv 41 angebracht werden. Die Visualisierungskamera 94 kann fest in das Mikroskopobjektiv 41 integriert und/oder, beispielsweise durch eine geeignete Aufsteckhülse 941, reversibel an dieses angebracht werden. Die Visualisierungskamera 94 ermöglicht es, bei ausreichender Transparenz des Objekts 51 den Boden des Dissektatauffangbehälters 55 durch den Ob- jektträger 52 und das Objekt 51 hindurch zu erfassen. Ist eine ausreichende
Transparenz des Objekts 51 nicht gegeben, kann der Boden des Dissektatauffangbehälters 55 dennoch erfasst werden, nämlich dann, wenn durch den Laserstrahl b und durch das Ausschneiden des entsprechenden Dissektats, ein ausreichend großes Fenster in dem Objekt 51 geschaffen wird.
Die dargestellten Ausführungsbeispiele sind nicht auf die Verwendung nur einer Visualisierungskamera 91 bis 95 beschränkt. Beispielsweise kann zu einer Überprüfung von Dissektaten in einem Dissektatauffangbehälter 55 außeraxial der optischen Achse des Beobachtungsstrahlengangs a eine Visualisierungskamera 95 vorgesehen sein, die eine Erfassung von Dissektaten in momentan nicht unterhalb des Ausschnitts 581 positionierten Dissektatauffangbehältern 55 ermöglicht. Dies ermöglicht beispielsweise eine parallele Auswertung von Lasermikrodissektions- vorgängen, bei der die Bearbeitung des Objekts 51 nicht unterbrochen werden muss und/oder einen Vorher-Nachher-Vergleich.
Zu weiteren Ausgestaltungen der in den Figuren 2 und 3 dargestellten Ausführungsformen sei insbesondere auf die DE 100 18 251 Cl verwiesen, auf die hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird. Figur 4 zeigt in den Ansichten A, B und C Bilddaten 550, die durch eine erfindungsgemäße bildgebende Erfassung eines Bodens 551 eines Dissektatauffangbehälters 55 zu wenigstens zwei Zeitpunkten erhalten werden. Hierbei zeigt Ansicht A zu einem ersten Zeitpunkt erhaltene Bilddaten 550. In den Bilddaten 550 ist der Boden 551 des Dissektatauffangbehälters 55 und dessen Wand 552 (vgl. Figur 2) zu sehen. Der Dissektatauffangbehälter 55 wurde im dargestellten Beispiel senkrecht von oben aufgenommen. Im dargestellten Beispiel erfolgte eine Fokussierung auf den Boden 551 des Dissektatauffangbehälters 55.
Die Ansicht A zeigt dabei Bilddaten 550, die vor einem Dissektionsvorgang erhalten wurden. Auf den Boden 551 des Dissektatauffangbehälters 550 befinden sich daher noch keine Dissektate (in Ansicht B mit 511 bezeichnet). Wie durch gestrichelte Bereiche 553 veranschaulicht, kann die bildgebende Erfassung des Bodens 551 des Dissektatauffangbehälters 55 auch in Form einer abschnittsweisen Abtastung erfolgen. Entsprechende Teilbilddaten werden anschließend zu den Bilddaten 550 zusammengesetzt. Unterschiedliche Abschnitte 553 eines Dissektatauffangbehälters 55 bzw. dessen Boden 552 können auch unter Umfokussieren erhalten werden, insbesondere dann, wenn der Boden 551 des Dissektatauffangbehälters 55 nicht planar ist.
Die Ansicht B der Figur 4 zeigt Bilddaten 550, die erhalten wurden, nachdem drei Dissektate 511 aus einem oder mehreren Objekten 51 herausgetrennt wurden. Die Dissektate 511 weisen hier unterschiedliche Größen auf, es kann sich jedoch auch um Dissektate 511 gleicher Größe handeln. Zwischen den Ansichten A und B können auch weitere Bilddaten 550 erhalten werden, beispielsweise nach der Heraustrennung jedes einzelnen Dissektats 511.
In Ansicht C sind abgeleitete Bilddaten 555 dargestellt, die durch einen Vergleich der Bilddaten 550 aus den Ansichten A und B erhalten wurden. Durch eine pixelweise Subtraktion der Bilddaten 550 aus den Ansichten A und B werden hierbei die Dissektate 511 gegenüber dem (subtrahierten) Hintergrund deutlich erkenn- bar. Wie durch unterschiedliche Schraffuren der Dissektate 511 veranschaulicht, kann bei der Erzeugung der abgeleiteten Bilddaten 555, beispielsweise in einer geeigneten Bildverarbeitungseinrichtung, auch eine Zuordnung der jeweiligen Dissektate zu bestimmten Geweben, Dissektionsvorgängen, Größenklassen, Formklassen, Farbklassen usw. erfolgen. Die Auswertung wird hierdurch zuverlässig und ermöglicht eine einfache und benutzerfreundliche Kontrolle bzw. Überwa- chung einer Dissektion bzw. eines Dissektionserfolgs.
In der Figur 5 sind weitere Bilddaten 550 gezeigt, die durch eine erfindungsgemäße bildgebende Erfassung eines Bodens 551 eines Dissektatauffangbehälters 55 zu wenigstens zwei Zeitpunkten erhalten werden.
Bei dem Dissektatauffangbehälter 55 handelt es sich hier beispielsweise um einen Deckel eines eingangs erläuterten Deckelgefäßes; die erläuterten Grundsätze gelten jedoch auch allgemein für andere Dissektatauffangbehälter 55. Der Boden 551 des Dissektatauffangbehälters 55 weist hier zwei Bodenbereiche 551a und 551b auf, die an einer Grenze 554 ineinander übergehen und sich auf unterschiedlichen Höhen (also unterschiedlichen z-Ebenen) befinden. Dies kann eine Umfokussierung erforderlich machen. Wie durch hier vier gestrichelt dargestellte Bereiche 553 veranschaulicht, kann die bildgebende Erfassung des Bodens 551 des Dissektatauffangbehälters 55 auch hier in Form einer abschnittsweisen Abtastung erfolgen. Statt den gezeigten vier Bereichen 553 können beispielsweise auch neun, 16, 25, 36 usw. Bereiche 553 erfasst werden, je nach Größe des Dissektatauffangbehälters 55 und der Vergrößerung bei der bildgebenden Erfassung. Zur Berechnung der Dissektate im Dissektatauffangbehälter 55 nach einem Dissek- tionsvorgang kann auch vorgesehen sein, Unterschiede zum Zustand vor dem Dissektionsvorgang durch angepasste Kamera- und Beleuchtungseinstellungen zu beachten und ggf.„herauszurechnen" (dies betrifft beispielsweise Farbunterschiede). Die genaue Position der Bereiche 553 (x, y und z) kann gespeichert werden und zur Erstellung eines entsprechenden zusammengesetzten Bilds wiederverwendet werden. Alternativ dazu kann auch auf eine Bestimmung und/oder Spei- cherung entsprechender Positionen verzichtet werden und später mit einem Bildanalyseverfahren eine Verrechnung entsprechender Bilddaten 550 erfolgen.
Ferner kann es erforderlich sein, mehrere Einzelbilder eines Bereichs 553 anzufer- tigen, insbesondere wenn ein Dissektatauffangbehälter 55 mehrere Bodenbereiche 551a und 551b aufweist, die sich auf unterschiedlichen Höhen (also unterschiedlichen z-Ebenen) befinden.
Es kann auch vorgesehen sein, einen Größenschwellwert für die Erkennung bzw. Klassifizierung von Objekten auf dem Boden 551 des Dissektatauffangbehälters 55 zu verwenden. Beispielsweise können hierdurch große Dissektate (z.B. das schraffiert dargestellte Dissektat 511a) von kleineren Dissektaten (Dissektate 511b und 511c) bzw. Kontaminationen in Form kleiner Partikel 556a bzw. Fasern 556b unterschieden werden. Für diese Unterscheidung kann auch eine Erkennung von Formparametern zweckmäßig sein.
Formparameter können auch zur Unterscheidung von Dissektaten 511d und 511e verwendet werden, die im dargestellten Beispiel teilweise übereinander liegen, und daher insgesamt von einer erwarteten Form (z.B. aus einer Schnittlinie für die Dissektion) abweichen. Ein A-Priori-Wissen um eine Sollform von Dissektaten ermöglicht damit eine Überprüfung eines Dissektionserfolgs. Form und Größe der Dissektate können daher vorteilhafterweise wie bei einer Mustererkennungssoftware (AVC) einstellbar sein. Entsprechendes gilt für unterschiedliche Farben, wodurch beispielsweise ebenfalls übereinanderliegende Objekte für eine Zählung berücksichtigt werden können. Objekte, die bereits vor einer Dissektion vorhanden sind, und die beispielsweise aus Fertigungsungenauigkeiten von Dissektatauf- fangbehältern 55, Beschriftungen usw. stammen, können durch einen Vorher- Nachher- Vergleich als falschpositive Treffer aussortiert werden. Neben der Form kann auch der Durchmesser bzw. die kürzeste Seitenkante eines Dissektats 511 zur Identifikation genutzt werden, da nicht immer sämtliche Dissektate glatt auf dem Boden 551 des Dissektatauffangbehälters 55 aufliegen, sondern auch auf ei- ner Schnittkante stehen können (nicht gezeigt). Somit ist die Größenselektion anhand des geringsten Durchmessers bzw. der kürzesten Schnittkante ein wichtiges Teilverfahren, um eine möglichst genaue Anzahl an Dissektaten zu ermitteln.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Lasermikrodissektion, bei dem ein Lasermikrodissektions- system (100) mit einem Mikroskop (10) verwendet wird,
wobei aus wenigstens einem zu dissektierenden Objekt (51) mittels eines Laserstrahls (b), welcher mittels einer Auflichteinrichtung (76) des Mikroskops (10) durch ein Mikroskopobjektiv (41) des Mikroskops (10) auf das zu dissektie- rende Objekt (51) fokussiert wird, wenigstens ein Dissektat (511) herausgetrennt wird
und das herabfallende Dissektat (511) in einem Dissektatauffangbehälter (55) aufgefangen wird,
wobei zumindest eine Auffangfläche (551) des Dissektatauffangbehälters (55) unter Erzeugung von Bilddaten (550) zumindest abschnittsweise bildgebend erfasst wird,
dadurch gekennzeichnet, dass die Auffangfläche (551) des Dissektatauffangbe- hälters (55) zu wenigstens zwei Zeitpunkten bildgebend erfasst wird und dass die hierbei erzeugten Bilddaten (550) miteinander verglichen werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Auffangfläche (551) des Dissektatauffangbehälters (55) vor und nach dem Heraustrennen des wenigstens einen Dissektats (511) aus dem wenigstens einen Objekt (51) bildgebend erfasst wird.
3. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem als Auffangfläche (551) des Dissektatauffangbehälters (55) ein Boden des Dissektatauffangbehälters (55) unter Erzeugung der Bilddaten (550) bildgebend erfasst wird.
4. Verfahren nach einem Ansprüche 1 bis 3, bei dem die bildgebende Erfassung der Auffangfläche (551) des Dissektatauffangbehälters (55) unter Verwendung des Mikroskopobjektivs (41) durchgeführt wird, das bei dem Heraustrennen des wenigstens einen Dissektats (511) aus dem wenigstens einen Objekt (51) zur Fokussierung des -Laserstrahls (b) verwendet wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem zur bildgebenden Erfassung der Auffangfläche (551) des Dissektatauffangbehälters (55) ein Abstand der Auffangfläche (551) zu dem Mikroskopobjektiv (41) gegenüber einem Abstand während des Heraustrennens des wenigstens einen Dissektats (511) aus dem wenigstens einen Objekt (51) verändert wird.
6. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem sich der Boden (551) des Dissektatauffangbehälters (55) bei der bildgebenden Erfassung außerhalb einer Schärfenebene des Mikroskopobjektivs (41) befindet.
7. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche 1 bis 3 , bei dem die bildgebende Erfassung der Auffangfläche (551) des Dissektatauffangbehälters (55) unter Verwendung einer oder mehrerer unabhängig von einem Mikroskopobjektiv (41) fokussierter oder fokussierbarer Visualisierungskameras (91-95) erfolgt.
8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem zur bildgebenden Erfassung der Auffangfläche (551) des Dissektatauffangbehälters (55) diese abschnittsweise abgetastet wird und hierbei erhaltene Teilbilddaten (553) zu den Bilddaten (550) zusammengesetzt werden.
9. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem der Dissektatauffangbehälter (55) zum abschnittsweisen Abtasten seiner Auffangfläche (551) verschoben wird.
10. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die Erzeugung der Bilddaten (550) in Form von Pixelbilddaten erfolgt und der Vergleich der zu den wenigstens zwei Zeitpunkten erzeugten Bilddaten (550) unter pixelweiser Subtraktion der Pixelbilddaten durchgeführt wird.
11. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem durch den Vergleich der zu den wenigstens zwei Zeitpunkten erzeugten Bilddaten (550) eine Anzahl von Dissektaten (511) bestimmt wird.
12. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem eine Sollanzahl von Dissektaten (511) vorgegeben wird und aus dem wenigstens einen zu dissektierenden Objekt (51) so lange mittels des Laserstrahls (b) Dissektate (511) herausgetrennt werden, bis auf Grundlage der Bestimmung der Anzahl von Dissektaten (511) festgestellt wird, dass die Sollanzahl von Dissektaten (511) erreicht ist.
13. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem durch den Vergleich der zu den wenigstens zwei Zeitpunkten erzeugten Bilddaten (550) eine räumliche Lage und/oder eine Farbe und/oder ein Formparameter und/oder eine Übereinstimmung mit wenigstens einem vorgegebenen Formparameter s wenigstens einen Dissektats (511) bestimmt wird.
14. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem mehrere
Dissektate (511) aus dem Objekt (51) herausgetrennt und auf Grundlage der Bilddaten (550) in Größenklassen eingeteilt werden.
15. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem der Laser- strahl (b) während des Heraustrennens des wenigstens einen Dissektats (511) aus dem zu dissektierenden Objekt (51) mittels einer Laserscaneinrichtung (73) in der Auflichteinrichtung (76) variabel abgelenkt wird.
16. Verfahren nach Anspruch 15, bei dem eine Laserscaneinrichtung (73) ver- wendet wird, die gegen eine optische Achse geneigte und unabhängig voneinander um die optische Achse drehbare gläsernen Keilplatten (731) zum variablen Ablenken des Laserstrahls aufweist.
17. Lasermikrodissektionssystem (100) umfassend
- ein Mikroskop (10) mit einer Auflichteinrichtung (76), mit denen ein Laserstrahl (b) durch ein Mikroskopobjektiv (41) des Mikroskops (10) auf ein Objekt (51) fokussierbar ist, ,
eine Steuereinheit (82), mit welcher Mittel zum Heraustrennen wenigstens eines Dissektats (511) aus wenigstens einem zu dissektierenden Objekt (51) mit- tels des Laserstrahls (b) ansteuerbar sind,
Auffangmittel mit wenigstens einem Dissektatauffangbehälter (55)für das wenigstens eine Dissektat (511)
Mittel (63; 91, 92, 93, 94, 95) zum bildgebenden Erfassen, mit denen für zumindest die eine Auffangfläche (551) des wenigstens einen Dissektatauffangbe- hälters (55) Bilddaten (550) zu wenigstens zwei Zeitpunkten erstellbar sind,
und Auswertemittel (81, 82), die für ein Vergleichen der Bilddaten (550), die zu den wenigstens zwei Zeitpunkten erzeugt wurden, ausgebildet sind,
wobei als Mittel (91-95) zum bildgebenden Erfassen eine digitaloptische Erfassungseinheit (63) und/oder eine oder mehrere Visualisierungskameras (91, 92, 93, 94, 95) angeordnet sind.
18. Lasermikrodissektionssystem (100) nach Anspruch 17, bei dem als Mittel (91-95) zum bildgebenden Erfassen eine digitaloptische Erfassungseinheit (63) im Strahlengang des Mikroskops (lO)angeordnet ist, welche das vom Mikroskopob- jektiv(41) erzeugte Bild erfasst und welche die Bilddaten (550) zu den wenigstens zwei Zeitpunkten erzeugt.
19. Lasermikrodissektionssystem (100) nach Anspruch 17, bei dem als Mittel (91-95) zum bildgebenden Erfassen mindestens eine Visualisierungskamera (91, 92, 93, 94, 95) außerhalb des Strahlengangs des Mikroskops (10) angeordnet ist, die unabhängig von dem Mikroskopobjektiv (41) fokussiert oder fokussierbar ist und auf die Auffangfläche (551) des Dissektatauffangbehälters (55) ausgerichtet oder ausrichtbar ist.
20. Lasermikrodissektionssystem (100) nach Anspruch 19, bei dem mehrere Visu- alisierungskameras (91, 92, 93, 94, 95) angeordnet sind, die auf unterschiedliche
Orte gerichtet sind und deren Bilder aufnehmen, bei dem die unterschiedlichen Orte mindestens die Auffangfläche (551) des Dissektatauffangbehälters (55) und/oder das zu dissektierende Objekt (51) und/oder die Kontaminationsschutzplatte (58) und/oder den Dissektatauffangbehälter (55) und/oder die Öffnung des Dissektatauffangbehälters (55) und/oder den Boden des Dissektatauffangbehälters (55) umfassen.
21. Lasermikrodissektionssystem (100) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die von der Steuereinheit (82) angesteuerten Mittel zum Heraustren- nen des wenigstens eines Dissektats (511) elektromechanische Stellmittel umfassen, mit denen der Ort , an dem der Laserstrahl auf das Objekt (51) trifft, einstellbar ist.
22. Lasermikrodissektionssystem (100) nach Anspruch 21, bei dem als Mittel zum Heraustrennen des wenigstens eines Dissektats (511) eine Laserscaneinheit (73) mit um die optische Achse drehbaren, gläsernen Keilplatten (731) angeordnet ist, die durch ihre Keilwinkel eine Strahlablenkung des Laserstrahls (b) erzeugen, wobei durch die Drehung der gläsernen Keilplatten (731) der resultierende Ablenkwinkel des Laserstrahls (b)gegenüber der optischen Achse variabel einstellbar ist.
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