WO2015128447A1 - Lasermikrodissektionssystem und lasermikrodissektionsverfahren - Google Patents

Lasermikrodissektionssystem und lasermikrodissektionsverfahren Download PDF

Info

Publication number
WO2015128447A1
WO2015128447A1 PCT/EP2015/054102 EP2015054102W WO2015128447A1 WO 2015128447 A1 WO2015128447 A1 WO 2015128447A1 EP 2015054102 W EP2015054102 W EP 2015054102W WO 2015128447 A1 WO2015128447 A1 WO 2015128447A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
laser
sample
laser beam
sample area
area
Prior art date
Application number
PCT/EP2015/054102
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Falk Schlaudraff
Original Assignee
Leica Microsystems Cms Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Leica Microsystems Cms Gmbh filed Critical Leica Microsystems Cms Gmbh
Publication of WO2015128447A1 publication Critical patent/WO2015128447A1/de

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/286—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q involving mechanical work, e.g. chopping, disintegrating, compacting, homogenising
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/286—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q involving mechanical work, e.g. chopping, disintegrating, compacting, homogenising
    • G01N2001/2873—Cutting or cleaving
    • G01N2001/2886—Laser cutting, e.g. tissue catapult

Definitions

  • the present invention relates to a laser microdissection system and a
  • a dissectate can be isolated from a sample by means of an infrared or ultraviolet laser beam, which falls under the influence of gravity into a suitable dissektate collection container.
  • the dissectate can be cut out of the sample also together with a membrane attached to the sample.
  • a thermoplastic membrane is heated by means of a corresponding laser beam. The membrane fuses with the desired area of the sample and can be removed by tearing in a subsequent step.
  • Another alternative is to attach the dissectate by means of the laser beam to a lid of a Dissektatauffang practicers.
  • upwardly transported dissectates may also be attached to the bottom of a dissectate collection container provided with an adhesive coating.
  • pulsed lasers are generally used, a hole or depression being produced in the sample by each laser pulse.
  • a cutting line is formed by a juxtaposition of such holes or depressions, optionally with
  • the laser microdissection can be used to obtain single cells or defined areas of tissue, which are separated by a laser beam from the surrounding tissue and subsequently subjected to different diagnostic analysis methods, for example.
  • laser microdissection can be used to specifically isolate tumor cells from a microscopic section and to examine specific metabolites or proteins.
  • the laser microdissection can also be used for the manipulation of single cells or defined tissue areas.
  • the laser microdissection can also be used for the manipulation of single cells or defined tissue areas.
  • SSC Serial Section Cutting
  • two adjacent sample sections are removed from a preparation and each applied to a slide.
  • the first sample section is on a standard slide (with coverslip)
  • the second sample section is on a so-called dissection slide (without cover glass).
  • a sample area on the standard slide is examined microscopically, specifying a sample section of interest.
  • the image of the first sample section is superimposed with the image of the second sample section, so that the sample region of interest is projected from a first sample section onto the corresponding sample region in the second sample section.
  • This corresponding sample area can now be cut out by means of laser microdissection from the second sample section and fed to a further analysis. Also in this laser microdissection method, several interested
  • Sample areas can only be processed sequentially.
  • the present invention proposes
  • the present invention is based on a known per se
  • a laser microdissection system comprising a microscope, comprising a receiving device for receiving a biological sample and a Auflicht align with a
  • Laser deflection device which guides a laser beam provided by a laser unit through a microscope objective of the microscope on a sample area of the biological sample and which shifts a point of incidence of the laser beam on the sample area.
  • a corresponding laser microdissection system is detailed below
  • the laser beam from a laser light source is coupled into the observation beam path of the microscope in such a laser microdissection system.
  • the laser beam is focused through the microscope objective, which is also used to view the sample.
  • the beam path of the laser beam of the laser unit passes through the incident light device and through the microscope objective and intersects an object plane of the microscope objective at an adjustable one
  • the laser microdissection system used in the context of the present invention is used with samples that are already ready for microscopy and laser-disassemblable (ie without coverslip or similar cover, but not liquid-coated).
  • This may be, for example, tissue thin sections, which by means of a microtome from a larger tissue block
  • tissue block may be, for example, a fixed organ or a biopsy of a corresponding organ.
  • the laser microdissection system according to the invention therefore does not serve to obtain samples but to process them and to isolate certain areas thereof. It is understood that the present invention may also be used with samples that are not obtained by means of a microtome, e.g. with smears, macerates, etc. As mentioned, however, the invention is also suitable for processing thicker samples which have not been prepared by means of a microtome.
  • Microtomes are used exclusively in the preparation of microscopic samples. Microtomes can also have lasers for this purpose.
  • Microtomed sections are applied to a slide as mentioned above, optionally attached there, stained, etc. Only then are they available for use in the laser microdissection system.
  • a microtome differs fundamentally from a laser microdissection system in its operation in that it cuts with as homogeneous a shape as possible
  • Microtomes are therefore designed to produce a large number of identical cuts with parallel cut surfaces, whereas laser microdissection systems are designed to separate dissectates according to sample-dependent criteria, for example according to visual morphological criteria.
  • the laser microdissection system is used in particular for separating out sample particles, which are subsequently taken up in a suspending fluid. The person skilled in the art would therefore not transfer technical solutions used in microtomes to such laser microdissection systems due to the completely different objectives.
  • a sample area along a cutting line is completely severed and thus detached from the surrounding sample.
  • a dissectate obtained by laser microdissection always represents a "bulk sample area" throughout the entire thickness of the processed sample; a differentiation into individual tissue layers by means of
  • Laser microdissection is not possible or can only be done indirectly over the thickness of the sample area.
  • the microscope stage is in laser microdissection systems with a
  • Laser deflecting device during processing of the sample relative to the microscope objective with respect to the x and y direction (that is, perpendicular to the optical axis of the microscope objective) fixedly arranged.
  • Dissecting process motorized microscope stage which must have a high positioning accuracy, especially for strongly magnifying lenses, to allow precise cuts, turn out to be
  • Laser microdissection systems with a laser deflector are simpler and less expensive to manufacture and have precision advantages.
  • the laser deflection device has two thick glass wedge plates ("glass wedges") which are inclined relative to an optical axis and can rotate independently about an optical axis and which generate a beam deflection by their wedge angles
  • the resulting deflection angle of the laser beam with respect to the optical axis is variable.
  • the intersection of the laser beam with the object plane is thus adjustable.
  • Such a laser deflection device is therefore particularly advantageous over other laser deflection devices such as mirror scanners,
  • Galvanometercannern or stepper motor scanners because this does not have to be arranged in a conjugate to the lens pupil plane. Thus, no so-called pupil imaging is required in order to achieve that the deflected beam hits the objective pupil. In the case of laser microdissection with UV laser light, for example, a UV-compatible pupil image would be required. Further advantages of such a laser deflection device with wedge plates are mentioned, for example, in EP 1 276 586 B1.
  • the laser microdissection system according to the invention has a microscope which has a receiving device for receiving a biological sample and a
  • Incident light device having a laser deflection device, which guides a laser beam provided by a laser unit through a microscope objective of the microscope to a sample area of this biological sample and shifts the point of incidence of the laser beam on or within the sample area.
  • the laser microdissection system has at least one additional one
  • Laser deflection device which is arranged such that it leads at least one further laser beam on said sample area or leads to at least one other sample area and the impact point of this at least one further laser beam moves there.
  • the invention thus employs a further laser beam with associated laser deflection device for manipulating or cutting a sample.
  • Each additional laser beam is assigned a respective laser deflection device.
  • sample area is intended to mean a region of interest of the specimen under observation, wherein this specimen area is manipulated by means of the incident laser radiation or is cut out by means of a focused laser beam.
  • the laser beam is focused, for example, by a microscope objective on the sample area, in particular for the
  • two or more sample areas of a microscopically examined biological sample can be processed in parallel and in particular simultaneously with at least one laser beam in each case.
  • multiple sample regions of interest within a sample may be simultaneously dissected out of the sample.
  • a plurality of sample areas of respectively different samples can be processed in parallel and in particular simultaneously with corresponding laser beams.
  • PSC Parallel Section Cutting
  • the second alternative can be combined with the first alternative, so that several sample areas on a sample are processed in parallel with two or more laser beams in each case.
  • a plurality of corresponding sample areas on multiple samples would be processed in parallel by means of respective associated laser beams.
  • the further laser beam (or the further laser beams) can be generated by additional laser units and / or by one or more beam splitter arrangements which divide an existing laser beam into two or more beams.
  • the at least one further laser deflection device is assigned a further laser unit which provides one of the at least one laser beam.
  • at least one further laser deflection device with at least another laser unit available is particularly useful if the full laser power is required for example for laser cutting for each laser beam.
  • Beam splitting multiple laser beams are generated.
  • a further laser unit can be arranged downstream of a beam splitter arrangement, which in turn provides at least one further laser beam from the further laser beam provided by this further laser unit
  • the aforementioned laser deflection devices can guide the respective laser beams in different ways to a sample.
  • Laser deflecting device and at least one of (at least one) furthermore
  • Laser deflection devices set up so that of these
  • Laser deflectors deflected laser beams are passed through the microscope objective of the microscope of the laser microdissection system according to the invention.
  • a laser focusing lens can be provided for one, several or all of the other laser beams, each of which has the respective further one
  • one of the at least one further laser deflection device is set up such that it guides the laser beam deflected by it through a laser focusing lens onto the sample area or onto one of the at least one other sample area.
  • the microscope or the microscope objective of the microscope is set up such that it guides the laser beam deflected by it through a laser focusing lens onto the sample area or onto one of the at least one other sample area.
  • Lasermikrodissekomssystems be switched on at least one other Laserfokussierlinse. This is particularly useful if sample areas are to be processed that can not be processed by the same microscope objective, but not another microscope setup is necessary for processing. Finally, it can also be useful or necessary if the said
  • Laserfokussierlinse represents another microscope objective of another microscope.
  • the laser microdissection system according to the invention thus comprises several microscopes for the parallel processing of sample areas, as may be of advantage in particular for the above-mentioned parallel section cutting.
  • Laser microdissection system set up such that it leads the laser beam associated therewith to the sample area of a first biological sample, wherein at least one further laser deflection device is provided, which is set up in such a way that it guides the respectively associated further laser beam to a respective different sample area of another sample.
  • sample areas for example, adjacent serial sections of a preparation.
  • one of the serial sections may be colored so that the sample area of interest can be identified (in a known manner).
  • the other inserted series cuts can be uncoloured.
  • one or more target areas can be identified and marked.
  • suitable cut lines may be placed around the sample areas of interest to be obtained as dissectates. The marks or cut lines are then
  • each of the at least one further laser deflecting device is assigned in each case a Laserfokussierlinse for guiding the respective further laser beam to the respective sample area.
  • a Laserfokussierlinse for guiding the respective further laser beam to the respective sample area.
  • the further laser beams on each one another microscope with microscope objective can be dispensed with. This is possible in particular if, for example, the serial sections are calibrated perfectly, so that a generated section line in the reference sample directly on the parallel
  • Microscope lenses corresponding microscopes represent.
  • the laser deflection device of the invention For the first mentioned inventive possibility of parallel cutting or manipulation of a sample area on a sample with at least two laser beams is the laser deflection device of the invention
  • Laser microdissection system set up such that the laser beam on the
  • Sample area of the biological sample is performed, and the at least one further laser deflection device is arranged such that it leads the at least one further laser beam on the same sample area of this sample.
  • Sample area can thus be manipulated or cut by multiple laser beams.
  • the editing is done in particular on the same field of view as given by the microscope objective. Due to the existing several
  • Laser deflection devices the laser beams or Laserfoki simultaneously and independently of each other are controlled so that a plurality of markers or cutting lines are processed simultaneously. It is also conceivable to work at least partially outside the field of view. Depending on the number of laser beams, a corresponding number of markings or cut lines can be manipulated or
  • the laser microdissection system according to the invention has the
  • Laser deflecting device which is arranged such that the laser beam is guided onto the sample area of the biological sample
  • the at least one further laser deflection device which is arranged such that it leads the at least one further laser beam on the at least one other sample area of the same biological sample.
  • the invention further relates to uses according to furnished
  • At least one further laser beam is initially provided.
  • a sample area of a biological sample is processed by means of a (first) laser beam.
  • at least one further sample area of one or more other samples can be processed in parallel and in particular simultaneously.
  • machining is understood to mean the cutting of a sample area by means of a laser beam or the manipulation of a sample area by means of a laser beam.
  • a sample area of a reference sample can be selected as the reference sample area and further sample areas of respectively different samples can be processed by means of respectively assigned laser beams.
  • This type of parallel manipulation or the parallel cutting of sample areas is particularly useful if the reference sample area and the other sample areas are components of samples of a serial section of the same preparation. Selecting one
  • Reference sample range is carried out in a conventional manner, for example by staining or other contrasting methods.
  • Reference sample area can be transferred to corresponding sample areas of the other samples, and in particular in a serial section, it is to be assumed that the properties of the reference sample area and of the further sample areas determined in this way are not or not significantly different.
  • the reference sample area is therefore microscopically visualized and marked by means of a microscope or by means of the microscope of the laser microdissection system and then the marking is transferred to the further sample areas.
  • the marking and the transmission of the marking takes place in a manner known per se by means of image processing.
  • the mentioned method of parallel section cutting is advantageous in particular for the parallel cutting of sample areas corresponding to one another, since the cutting can take place at a significantly higher speed than in the previously known serial section cutting.
  • inventive possibility of parallel cutting or manipulation relates to the parallel processing of a single sample area by means of several
  • machining by the laser beam may involve cutting the sample area along a predetermined cutting line.
  • Methods for determining suitable cut lines are well known in the art. The inventive method not only allows the parallel
  • corresponding laser focusing lenses can be arranged above and below the sample area to be cut.
  • all laser focusing lenses can be arranged on one side of the sample area, wherein at least one laser beam is deflected to the other side of the sample area by means of deflection devices.
  • Figure 1 shows a laser microdissection system, which is preferably the starting point of the present invention, in a schematic representation.
  • FIG. 2 shows schematically a possibility according to the invention for parallel
  • FIG. 3 shows schematically a possibility according to the invention of the parallel
  • FIG 4 shows schematically a possibility according to the invention of the parallel
  • FIG. 5 shows schematically a possibility according to the invention of the parallel
  • Figure 6 shows schematically a possibility of providing further laser beams by further laser units.
  • Figure 7 shows schematically the provision of further laser beams by means of a beam splitter arrangement
  • FIG. 8 shows schematically a possible combination of the examples of FIGS. 5 and 6.
  • FIG. 1 a laser microdissection system that can be used to practice the invention is shown schematically and designated 100 as a whole.
  • the laser microdissection system 100 corresponds in substantial parts to that disclosed in EP 1 276 586 B1, to which reference is expressly made.
  • Directions x, y and z are illustrated in FIG. 1 as 200.
  • the laser microdissection system 100 includes a microscope 10. In one
  • Lighting device 12 may be provided. This can, for example, a (not shown) light source and suitable means for influencing the by the
  • illumination light such as filters and / or aperture.
  • condenser unit 90 can be provided for transmitted light illumination and for setting suitable contrast or observation methods.
  • the microscope 10 may be designed as a confocal, in particular as a spinning disk microscope and in this case has corresponding further or alternative means (not shown in Figure 1).
  • a user input and / or user information unit 13 may be arranged, which may be formed for example as a touch screen, and via which the user can input and / or read, for example, viewing and / or processing parameters.
  • a drive knob 14 is provided. This serves to operate a coarse and a fine drive for adjusting a height of a microscope stage 30.
  • a sample 51 for example a tissue sample attached in a corresponding receiving device or holder 52, can thereby be brought into an object plane of an objective 41.
  • the lens 41 is next to other lenses 42 in one
  • a protective cover 15 may be provided.
  • Auskoppel painen 61 may be a preferably variable portion of
  • Eyepiece pairs 62 are presented to a user. Another share of
  • Observation light can be coupled into a digital image acquisition unit 63 and detected by imaging.
  • the image acquisition unit 63 can be assigned, locally, in a control unit 82 or a control computer 81 (see below), or in another spatial arrangement, an image evaluation module 64.
  • the laser microdissection system 100 has a laser unit 70 with a
  • Laser light source 75 on. A through the laser light source 75, in which it is
  • Laser beam 77 with laser beam axis b provided in a reflected-light unit, which is indicated as a whole here at 76, at a first deflecting mirror 71 and a second deflecting mirror can be used, for example, to act as a UV laser light source 72 and focused by the lens 41 on the sample 51 in the sample area 50.
  • a manual adjusting device 31 may be provided by means of which the microscope stage 30 designed as a cross table can be adjusted in the x and y directions (that is to say, perpendicularly or parallel to the plane of the paper).
  • the adjusting device 31 and electromechanical adjusting means may be provided, for example, by a
  • Controlled control unit 82 and whose position can be detected by the control unit 82.
  • the control unit 82 may also be any other motorized functions of the
  • Laser microdissection system 100 and in particular provide an interface to an external control computer 81, which may be connected via corresponding connections 83 provide.
  • the control unit 82 or the control computer 81 can also evaluate data obtained, for example, by the image evaluation module 64. By way of example, a sequence of tissue layers or other structures of the sample 51 can thereby be recognized.
  • a laser deflection device 73 can be provided.
  • the laser deflection device 73 By means of the laser deflection device 73, the laser beam 77 with respect to one between the first deflection mirror 71 and the second
  • Deflection mirror 72 extending optical axis c are deflected.
  • the laser beam can therefore impinge on the second deflection mirror 72 at different positions, which can be embodied, for example, as a dichromatic divider, and is therefore also focused at different positions on the sample 51 in the object plane.
  • a deflection by means of a laser deflection device 73 is shown in detail in EP 1 276 586 B1. It should be emphasized that here different possibilities for the deflection of a laser beam 77 and for positioning the sample 51 in the
  • Object level opposite the laser beam 77 can be used.
  • the invention is not limited to the illustrated example.
  • the laser deflection device 73 has two solid glass wedge plates 731, which are inclined relative to the optical axis c and are rotatable independently of each other about the optical axis c.
  • the wedge plates 731 are mounted with ball bearings 732.
  • Each of the wedge plates is connected to a gear 733.
  • the gears 733 can each be rotated by means of actuators 734, which can be acted upon by corresponding drive signals and accordingly drive the gears 733.
  • the rotators may have position sensors 735 (shown here only on the right actuator 734). A position detected by the position sensors 735 may be transmitted to the control unit 82.
  • FIG. 2 shows a possibility according to the invention of the parallel processing of sample areas on different samples. Without restricting generality, it will be assumed below that the sample areas are intersected by means of a focused laser beam in order to generate dissected data. That in Figure 2
  • FIG. 2 shows a lens 41 which focuses a laser beam 77 onto a sample 51.
  • the laser beam 77 is arranged by means of a on the optical axis c
  • FIG. 1 For further explanations of this system, reference is made in full to the explanations concerning FIG.
  • the laser microdissection system 100 from FIG. 1 is not shown in its entirety in FIG. Only the components necessary for understanding the invention are shown and described below.
  • the sample 51 is applied to a suitable holder 52, which is a
  • the sample area which is cut out by means of the focused laser beam 77, is designated by 510.
  • the sample area 510 forms a partial area of the sample 51, the sample area being identified in a manner known per se as a sample area of interest. This is usually done on the basis of a microscopic visualization of the sample 51 and of the sample region 510, wherein the sample region 510 of interest can be determined by coloring the sample 51 and by means of suitable (fluorescence) examination of the sample 51. In a manner also known per se, an individual cutting line is laid around this sample region 510, for example. This process can be done manually or preferably by means of image processing. The result can be checked, for example, at the external control computer 81 (see FIG.
  • the control unit 82 controls the laser deflecting means 73 such that the laser beam focus on the sample 51 describes the cutting line and thus separates the sample area 510 from the rest of the sample.
  • further samples 53, 54 are received on corresponding holders in order to be able to be processed in parallel.
  • further laser beams 77 'and 77 are provided, each of these further laser beams being assigned a further laser deflection device 73', 73".
  • the optical axes are designated by c 'and c ", respectively, and the samples 53 and 54 are expediently, in particular, adjacent sections of a serial section from a specimen
  • the specimens 53 and 54 need not necessarily be colored. to work with undyed samples, since dyeings are the
  • the cut line defined around the sample area 510 of the sample 51 is transferred to the uncolored sample areas 530 and 540 so that the sample areas 530 and 540 correspond to the reference sample area 510. Under "transfer of the cutting line" is to be understood that control commands to appropriate
  • Control units of the laser deflecting means 73 ', 73 are transmitted to guide the laser beam 77' and 77" according to the predetermined cutting line on the sample 53 and 54, respectively.
  • the embodiment according to FIG. 2 is not limited to the number of samples shown there.
  • other markings can also be used as cutting lines for parallel section cutting.
  • target areas can be identified as sample areas, marked and then manipulated.
  • the possibilities for generating further laser beams 77 ', 77 will be discussed in more detail below, with only the corresponding laser deflection devices 73', 73" being illustrated in FIG.
  • the Laserfokussierlinsen 41 ', 41 provide in Figure 2 for the focusing of the corresponding associated laser beams 77', 77" on the respective sample 53, 54.
  • FIG. 3 schematically shows a possibility of parallel processing of a
  • a laser beam 77 is focused onto a sample 51 by means of a microscope objective 41.
  • the position of the focus of the laser beam 77 on the sample 51 is controlled by means of a laser deflector 73.
  • Laser deflector 73 ' the same sample area 510 of the sample 51 can be processed.
  • both laser beams 77 and 77 ' can be parallel and
  • the foci of the lasers 77, 77 ' can be in different sample depths in order to cut thick samples more quickly and effectively.
  • FIG 4 shows schematically a possibility according to the invention for parallel
  • the embodiment according to Figure 4 can be understood as a further embodiment of the parallel processing of a sample area 510 on a sample 51 (see Figure 3).
  • Microscope lens or an associated focusing lens 41 or 41 ' This allows, for example, not only within the field of view of a microscope objective, but also outside this field of view and finally to work within the fields of view of two microscope objectives, depending on whether 41 and 41 'denotes a focusing lens and a microscope objective or two microscope objectives.
  • Laser beams 77, 77 'on two different sample areas (not separately designated). In this way it is possible to cut or to separate different sample areas of a sample 51 in parallel and in particular simultaneously
  • a plurality of marked sample regions of interest can be simultaneously cut from a sample 51, which simplifies the process of
  • FIG. 5 shows a further embodiment of the arrangement according to FIG. 4.
  • an additional third laser beam 77 " is provided, which in the illustration according to FIG. 5 is directed to the underside of the sample 51, while the two laser beams 77, 77 'are placed on the upper side thereof Sample 51.
  • the laser beam 77 "directed to the underside of the sample 51 has a laser deflection device 73" assigned to it.
  • the device shown in FIG. 5 is again suitable for cutting (or otherwise processing) a single sample region 510 on the sample 51 or a plurality of sample areas (not separately designated) on the sample 51.
  • FIGS. 4 and 5 can be used in particular for cutting thick sample areas, for example the laser beam 77 'can be guided from above onto the cutting line, while the laser beam 77 "is guided from below onto the same cutting line, so that the laser beam 77" Cut line is cut from two sides. In this way, a thicker sample area can be cut more gently than if a single laser beam of correspondingly high energy were cut from one side only. Concerning. FIGS. 4 and 5 further emphasize that the one shown there
  • Laser focusing lenses can be achieved.
  • a corresponding angle of incidence of the laser beam on the sample as explained with reference to Figures 1 and 3, also and preferably with lenses or Laserfokussierlinsen be achieved whose optical axes are perpendicular to the sample, the inclinations of the laser axes then alone by the associated laser deflection be effected.
  • the inclinations of the axes in Figures 4 and 5 thus serve for ease of understanding.
  • FIG. 6 shows schematically a possibility of providing further laser beams by further laser units.
  • two laser units 70 and 70 ' are present in a laser microdissection system 100 (see FIG.
  • FIG. 7 shows schematically the provision of further laser beams by means of a beam splitter arrangement.
  • the laser unit 70 generates a laser beam, which is a
  • Beam splitter arrangement 78 passes through.
  • the laser beam is divided into two beams, wherein one of the two beams is denoted by 77.
  • the other of the two divided beams is denoted by 77 '.
  • two laser beams 77, 77 ' can be generated whose intensity is correspondingly lower than that of the original laser beam 77.
  • the laser beam 77' can be reflected at a deflecting mirror 74 and fed to a laser deflecting device 73 'associated therewith.
  • the embodiment according to FIG. 6 makes sense in particular for cutting processes in which the full laser intensity is required
  • the embodiment according to FIG. 7 is advantageous for processes such as manipulations, for which part of the original laser power is sufficient.
  • FIG. 8 shows a possible combination of the embodiments of FIGS. 6 and 7.
  • the laser beam 77 generated by the laser unit 70 is fed to a laser deflection device 73.
  • Another laser beam is generated by a further laser unit 70 '.
  • This further laser beam is split into two laser beams, again one of the two split laser beams with 77 ', The splitting is again effected in a beam splitter arrangement 78 '
  • the partial beams 77' and 77 "produced in this way are then respectively fed to corresponding laser deflection devices 73 'and 73", with the laser beam 77 "again a deflecting mirror 74 can be used.
  • An arrangement such as shown in Figure 8 can be used, for example, for parallel cutting of thick samples (with laser beam 77) and thin samples (with laser beams 77 'and 77 ”) from Figures 6 to 8 further combination options.

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Sampling And Sample Adjustment (AREA)

Abstract

Lasermikrodissektionssystem (100) mit einem Mikroskop (10), das eine Aufnahmeeinrichtung (52) zur Aufnahme einer biologischen Probe (51) und eine Auflichteinrichtung (76) mit einer Laserablenkeinrichtung (73) aufweist, welche einen durch eine Lasereinheit (70) bereitgestellten Laserstrahl (77) durch ein Mikroskopobjektiv (41) des Mikroskops (10) auf einen Probenbereich (510) der biologischen Probe (51) führt und welche einen Auftreffpunkt des Laserstrahls (77) auf dem Probenbereich (510) verschiebt, wobei das Lasermikrodissektionssystem (100) mindestens eine weitere Laserablenkeinrichtung (73', 73") zum Führen mindestens eines weiteren Laserstrahls (77', 77") auf den Probenbereich (510) oder auf mindestens einen anderen Probenbereich (530, 540) und zum Verschieben des Auftreffpunkts des mindestens einen weiteren Laserstrahls (77', 77") auf dem jeweiligen Probenbereich aufweist.

Description

Lasermikrodissektionssystem und Lasermikrodissektionsverfahren
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Lasermikrodissektionssystem und ein
Lasermikrodissektionsverfahren gemäß den jeweiligen Oberbegriffen der
unabhängigen Patentansprüche sowie verschiedene Verwendungen des
beanspruchten Lasermikrodissektionssystems.
Stand der Technik
Verfahren zur Bearbeitung biologischer Proben durch Lasermikrodissektion existieren bereits seit Mitte der 1970er Jahre und wurden seitdem kontinuierlich weiterentwickelt. Bei der Lasermikrodissektion können Zellen, Geweberegionen usw. aus einer biologischen Probe ("Objekt") isoliert und als sogenannte Dissektate gewonnen werden. Ein besonderer Vorteil der Lasermikrodissektion ist der kurze Kontakt der Probe mit dem Laserstrahl, durch den diese kaum verändert wird. Die Gewinnung der Dissektate kann auf unterschiedliche Weise erfolgen.
Beispielsweise kann in bekannten Verfahren aus einer Probe mittels eines Infrarotoder Ultraviolettlaserstrahls ein Dissektat isoliert werden, das unter dem Einfluss der Schwerkraft in einen geeigneten Dissektatauffangbehälter fällt. Das Dissektat kann dabei aus der Probe auch zusammen mit einer an der Probe anheftenden Membran ausgeschnitten werden. Bei der sogenannten "Laser Capture Microdissection" wird hingegen eine thermoplastische Membran mittels eines entsprechenden Laserstrahls erwärmt. Dabei verschmilzt die Membran mit dem gewünschten Bereich der Probe und kann in einem darauffolgenden Schritt durch Reißen entfernt werden. Eine weitere Alternative besteht darin, das Dissektat mittels des Laserstrahls an einen Deckel eines Dissektatauffangbehälters anzuheften. Bei bekannten inversen Mikroskopsystemen zur Lasermikrodissektion können nach oben transportierte Dissektate auch an den Boden eines Dissektatauffangbehälters, der mit einer adhäsiven Beschichtung versehen ist, angeheftet werden.
Bekannte Mikroskopsysteme zur Lasermikrodissektion weisen eine Auflichteinrichtung auf, in deren Strahlengang ein Laserstrahl eingekoppelt wird. Der Laserstrahl wird durch das jeweils verwendete Mikroskopobjektiv auf die Probe fokussiert, die auf einem motorisch-automatisch verfahrbaren Mikroskoptisch aufliegt. Eine Schnittlinie kann dadurch erzeugt werden, dass der Mikroskoptisch beim Schneiden verfahren wird, um die Probe relativ zu dem feststehenden Laserstrahl zu bewegen. Dies hat jedoch unter Anderem den Nachteil, dass die Probe während des Erzeugens der Schnittlinie nicht ohne weiteres betrachtet werden kann, da sich die Probe im
Gesichtsfeld bewegt und das Bild ohne weitere Kompensationsmaßnahmen verschwommen bzw. verschmiert erscheint.
Vorteilhafter sind daher Lasermikrodissektionssysteme, die Laserablenk- bzw.
Laserscaneinrichtungen aufweisen, die dazu eingerichtet sind, den Laserstrahl bzw. dessen Auftreffpunkt auf der zu dissektierenden feststehenden Probe zu bewegen. Derartige Lasermikrodissektionssysteme, die auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung zum Einsatz kommen sollen und dort besondere Vorteile bieten, werden unten im Detail erläutert. Ein besonders vorteilhaftes Lasermikroskopsystem das eine Laserablenkeinrichtung mit gegeneinander verstellbaren Glaskeilen im
Laserstrahlengang aufweist, ist beispielsweise in der EP 1 276 586 B1 beschrieben.
In beiden Fällen, also in Systemen mit bewegter oder feststehender Probe, wird in der Regel mit gepulsten Lasern gearbeitet, wobei durch jeden Laserpuls ein Loch bzw. eine Vertiefung in der Probe erzeugt wird. Eine Schnittlinie entsteht durch eine Aneinanderreihung derartiger Löcher bzw. Vertiefungen, gegebenenfalls mit
Überlappung.
Die Lasermikrodissektion kann zur Gewinnung von Einzelzellen oder definierten Gewebebereichen verwendet werden, die mit einem Laserstrahl vom umliegenden Gewebe separiert und anschließend beispielsweise unterschiedlichen diagnostischen Analyse verfahren unterworfen werden. In der Onkologie kann die Lasermikrodissektion beispielsweise dafür eingesetzt werden, um spezifisch Tumorzellen aus einem mikroskopischen Schnitt zu isolieren und auf spezifische Metaboliten oder Proteine zu untersuchen.
Weiterhin kann die Lasermikrodissektion auch zur Manipulation von Einzelzellen oder definierten Gewebebereichen eingesetzt werden. Hier ist beispielsweise an eine Fluoreszenzanregung zu denken oder an die Verwendung als optische Pinzette.
Ein Problem bei den Lasermikrodissektionstechniken ist die
Geschwindigkeitsbegrenzung beim Ausschneiden eines Dissektats oder beim
Manipulieren einer Zielregion auf einer Probe mit mehreren auszuschneidenden bzw. zu manipulierenden Probenabschnitten. Solche Probenabschnitte werden sequentiell abgearbeitet. Bei diesem sogenannten Serial Section Cutting (SSC) werden verschiedene
Serienschnitte, die aus ein und demselben Präparat stammen, parallel bearbeitet. Ein solches Verfahren ist beispielsweise aus der US 2012/0045790 A1 bekannt.
Gemäß dieser US 2012/0045790 A1 werden aus einem Präparat zwei insbesondere benachbarte Probenschnitte entnommen und jeweils auf einen Objektträger aufgebracht. Der erste Probenschnitt befindet sich auf einem Standardobjektträger (mit Deckglas), der zweite Probenschnitt befindet sich auf einem sogenannten Dissektions- Objektträger (ohne Deckglas). Ein Probenbereich auf dem Standardobjektträger wird mikroskopisch untersucht, wobei ein interessierender Probenabschnitt festgelegt wird. Das Bild des ersten Probenschnitts wird mit dem Bild des zweiten Probenschnitts überlagert, so dass der interessierende Probenbereich aus einem ersten Probenschnitt auf den entsprechenden Probenbereich im zweiten Probenschnitt projiziert wird. Dieser entsprechende Probenbereich kann nun mittels Lasermikrodissektion aus dem zweiten Probenschnitt herausgeschnitten und einer weiteren Analyse zugeführt werden. Auch bei diesem Lasermikrodissektionsverfahren können mehrere interessierende
Probenbereiche nur sequentiell bearbeitet werden.
Aufgabe vorliegender Erfindung ist es daher, den Prozess der Lasermikrodissektion zu beschleunigen, wobei insbesondere gleichzeitig eine Flexibilisierung dieses Prozesses ermöglicht werden soll. Offenbarung der Erfindung
Zur Lösung der genannten Aufgabe schlägt die vorliegende Erfindung ein
Lasermikrodissektionssystem, Verwendungen dieses Systems sowie entsprechende Verfahren zur Lasermikrodissektion gemäß den unabhängigen Patentansprüchen vor. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind Gegenstand der jeweiligen Unteransprüche sowie der nachfolgenden Beschreibung.
Die vorliegende Erfindung geht aus von einem an sich bekannten
Lasermikrodissektionssystem mit einem Mikroskop, das eine Aufnahmeeinrichtung zur Aufnahme einer biologischen Probe und eine Auflichteinrichtung mit einer
Laserablenkeinrichtung aufweist, welche einen durch eine Lasereinheit bereitgestellten Laserstrahl durch ein Mikroskopobjektiv des Mikroskops auf einen Probenbereich der biologischen Probe führt und welche einen Auftreffpunkt des Laserstrahls auf dem Probenbereich verschiebt. Ein entsprechendes Lasermikrodissektionssystem ist unten ausführlich unter
Bezugnahme auf die Figur 1 erläutert. Mittels der Auflichteinrichtung wird in einem solchen Lasermikrodissektionssystem der Laserstrahl aus einer Laserlichtquelle in den Beobachtungsstrahlengang des Mikroskops eingekoppelt. Der Laserstrahl wird durch das Mikroskopobjektiv, das auch zum Betrachten der Probe verwendet wird, auf diese fokussiert. Somit verläuft, mit anderen Worten, der Strahlengang des Laserstrahls der Lasereinheit durch die Auflichteinrichtung und durch das Mikroskopobjektiv und schneidet eine Objektebene des Mikroskopobjektivs an einem einstellbaren
Schnittpunkt, der mittels Ansteuersignalen an die Laserablenkeinrichtung vorgegeben wird.
Zur Vermeidung von Missverständnissen sei an dieser Stelle betont, dass das im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzte Lasermikrodissektionssystem mit Proben verwendet wird, die bereits mikroskopietauglich und laserdissizierbar (also ohne Deckgläschen oder ähnliche Abdeckung, nicht jedoch flüssigkeitsüberzogen) vorbereitet sind. Hierbei kann es sich beispielsweise um Gewebe-Dünnschnitte handeln, die mittels eines Mikrotoms aus einem größeren Gewebeblock
herausgetrennt wurden, im vorliegenden Fall jedoch auch um dickere Schnitte aus einem entsprechenden Gewebeblock. Bei einem solchen Gewebeblock kann es sich beispielsweise um ein fixiertes Organ oder eine Biopsie eines entsprechenden Organs handeln. Das erfindungsgemäße Lasermikrodissektionssystem dient daher nicht zur Gewinnung von Proben, sondern zu deren Bearbeitung sowie zur Isolation von bestimmten Bereichen hiervon. Es versteht sich, dass die vorliegende Erfindung auch mit Proben, die nicht mittels eines Mikrotoms gewonnen werden, zum Einsatz kommen kann, z.B. mit Ausstrichen, Mazeraten usw. Wie erwähnt, eignet sich die Erfindung jedoch auch zur Verarbeitung dickerer Proben, die nicht mittels eines Mikrotoms vorbereitet wurden.
Mikrotome werden ausschließlich bei der Vorbereitung von mikroskopischen Proben eingesetzt. Mikrotome können hierzu auch Laser aufweisen. Die mittels eines
Mikrotoms erhaltenen Schnitte werden auf einen Objektträger, wie oben erwähnt, aufgebracht, gegebenenfalls dort befestigt, angefärbt usw. Erst dann stehen diese für einen Einsatz in dem Lasermikrodissektionssystem zur Verfügung. Ein Mikrotom unterscheidet sich in seinem Betrieb unter anderem dadurch fundamental von einem Lasermikrodissektionssystem, dass dort Schnitte mit möglichst homogener
Schnittstärke gewonnen werden. Mikrotome sind daher dazu ausgebildet, eine große Anzahl an identischen Schnitten mit parallelen Schnittflächen zu erzeugen, wohingegen Lasermikrodissektionssysteme zum Heraustrennen von Dissektaten nach probenabhängigen Kriterien, beispielsweise nach visuellen morphologischen Kriterien, eingerichtet sind. Im vorliegenden Fall dient das Lasermikrodissektionssystem insbesondere zum Heraustrennen von Probenpartikeln, die anschließend in einem Suspendierfluid aufgenommen werden. Der Fachmann würde daher bei Mikrotomen eingesetzte technische Lösungen aufgrund der völlig unterschiedlichen Zielsetzung nicht auf derartige Lasermikrodissektionssysteme übertragen.
Zum Heraustrennen von Probenpartikel bzw. Probenbereichen, also zur Gewinnung von Dissektaten, wird ein Probenbereich entlang einer Schnittlinie vollständig durchtrennt und somit von der umgebenden Probe abgelöst. Es ist beispielsweise nicht möglich, Material unterschiedlicher, übereinander liegender Gewebeschichten getrennt voneinander zu isolieren. Ein mittels Lasermikrodissektion gewonnenes Dissektat stellt daher stets ein "Sammelprobenbereich" durch die gesamte Dicke der bearbeiteten Probe dar; eine Differenzierung in einzelne Gewebeschichten mittels
Lasermikrodissektion ist nicht möglich bzw. kann nur indirekt über die Dicke des Probenbereichs geschehen.
Der Mikroskoptisch ist in Lasermikrodissektionssystemen mit einer
Laserablenkeinrichtung, wie erfindungsgemäß eingesetzt, beim Bearbeiten der Probe gegenüber dem Mikroskopobjektiv bezüglich der x- und y-Richtung (also senkrecht zur optischen Achse des Mikroskopobjektivs) feststehend angeordnet.
Im Gegensatz zu Lasermikrodissektionssystemen mit einem während des
Dissektiervorgangs motorisch verfahrenen Mikroskoptisch (Scanningtisch), der insbesondere bei stark vergrößernden Objektiven eine hohe Positioniergenauigkeit besitzen muss, um präzise Schnitte zu ermöglichen, erweisen sich
Lasermikrodissektionssysteme mit einer Laserablenkeinrichtung als einfacher und kostengünstiger in der Herstellung und besitzen Präzisionsvorteile.
Die Laserablenkeinrichtung weist in einer besonders vorteilhaften Ausführungsform zwei dicke, gegen eine optische Achse geneigte und unabhängig voneinander um eine optische Achse drehbare gläserne Keilplatten („Glaskeile") auf, welche durch ihre Keilwinkel eine Strahlablenkung erzeugen. Durch die Drehung der gläsernen
Keilplatten ist der resultierende Ablenkwinkel des Laserstrahls gegenüber der optischen Achse variabel. Am Ausgang der Laserablenkeinrichtung weist der
Laserstrahl durch die Dicke und die Schrägstellung der gläsernen Keilplatten einen seitlichen Strahlversatz gegenüber der optischen Achse auf und trifft für alle Ablenkwinkel die Mitte der Objektivpupille des Mikroskopobjektivs. Der Schnittpunkt des Laserstrahls mit der Objektebene ist damit einstellbar.
Eine derartige Laserablenkeinrichtung ist insbesondere deshalb vorteilhaft gegenüber anderen Laserablenkeinrichtungen wie beispielsweise Spiegelscannern,
Galvanometerscannern oder Schrittmotorscannern, weil diese nicht in einer zu der Objektivpupille konjugierten Ebene angeordnet werden muss. Damit ist auch keine sogenannte Pupillenabbildung erforderlich, um zu erreichen, dass der abgelenkte Strahl die Objektivpupille trifft. Bei der Lasermikrodissektion mit UV-Laserlicht wäre dabei beispielsweise eine UV-taugliche Pupillenabbildung erforderlich. Weitere Vorteile einer derartigen Laserablenkeinrichtung mit Keilplatten sind beispielsweise in der EP 1 276 586 B1 genannt.
Vorteile der Erfindung
Das erfindungsgemäße Lasermikrodissektionssystem besitzt ein Mikroskop, das eine Aufnahmeeinrichtung zur Aufnahme einer biologischen Probe und eine
Auflichteinrichtung mit einer Laserablenkeinrichtung aufweist, die einen durch eine Lasereinheit bereitgestellten Laserstrahl durch ein Mikroskopobjektiv des Mikroskops auf einen Probenbereich dieser biologischen Probe führt und den Auftreffpunkt des Laserstrahls auf dem bzw. innerhalb des Probenbereichs verschiebt. Dieses
Lasermikrodissektionssystem weist zusätzlich mindestens eine weitere
Laserablenkeinrichtung auf, die derart eingerichtet ist, dass sie mindestens einen weiteren Laserstrahl auf den genannten Probenbereich führt oder auf mindestens einen anderen Probenbereich führt und den Auftreffpunkt dieses mindestens einen weiteren Laserstrahls dort verschiebt.
Die Erfindung setzt somit zur Manipulation oder zum Schneiden einer Probe einen weiteren Laserstrahl mit zugeordneter Laserablenkeinrichtung ein. Jedem weiteren Laserstrahl ist jeweils eine entsprechende Laserablenkeinrichtung zugeordnet. Unter "Probenbereich" soll ein interessierender Teilbereich der mikroskopisch betrachteten Probe verstanden werden, wobei dieser Probenbereich mittels der auftreffenden Laserstrahlung manipuliert oder mittels eines fokussierten Laserstrahls ausgeschnitten wird. In der Regel, jedoch nicht zwingend, wird der Laserstrahl beispielsweise durch ein Mikroskopobjektiv auf den Probenbereich fokussiert, insbesondere für das
Laserschneiden. Aufgrund des erfindungsgemäßen Einsatzes mehrerer (mindestens zwei)
Laserstrahlen eröffnen sich drei verschiedene Möglichkeiten der Probenbearbeitung:
Erstens ist es möglich, einen einzigen Probenbereich auf einer Probe durch mehrere Laserstrahlen zu bearbeiten, beispielsweise einen Probenbereich mittels mehrerer fokussierter Laserstrahlen aus der Probe zu schneiden.
Zweitens können zwei oder mehr Probenbereiche einer mikroskopisch untersuchten biologischen Probe parallel und insbesondere gleichzeitig mit jeweils mindestens einem Laserstrahl bearbeitet werden. Auf diese Weise können beispielsweise mehrere interessierende Probenbereiche innerhalb einer Probe gleichzeitig aus der Probe dissektiert werden.
Schließlich können drittens mehrere Probenbereiche jeweils verschiedener Proben parallel und insbesondere gleichzeitig mit jeweils entsprechenden Laserstrahlen bearbeitet werden. Auf diese Weise ist es beispielsweise möglich, in einer Reihe von Probenschnitten korrespondierende Probenbereiche parallel aus den jeweiligen Proben zu schneiden. In dem Folgenden soll dies als "Parallel Section Cutting" (PSC) bezeichnet werden.
Alle drei der genannten Alternativen sind auch untereinander kombinierbar.
Beispielsweise kann die zweite Alternative mit der ersten Alternative kombiniert werden, so dass mehrere Probenbereiche auf einer Probe jeweils mit zwei oder mehr Laserstrahlen parallel bearbeitet werden. Bei Kombinationen der zweiten und dritten Alternative würden beispielsweise mehrere korrespondierende Probenbereiche auf mehreren Proben mittels jeweiliger zugeordneter Laserstrahlen parallel bearbeitet werden. Dem Fachmann erschließen sich die weiteren möglichen Kombinationen der ersten mit der dritten Alternative und die aller drei Alternativen.
Bevor auf die genannten Ausführungsformen näher eingegangen wird, sollen im
Folgenden mögliche und bevorzugte Ausführungsformen für die Bereitstellung weiterer Laserablenkeinrichtungen mit zugeordneten Laserstrahlen erörtert werden. Allgemein kann der weitere Laserstrahl (oder die weiteren Laserstrahlen) durch zusätzliche Lasereinheiten und/oder durch einen oder mehrere Strahlteileranordnungen erzeugt werden, die einen vorhandenen Laserstrahl in zwei oder mehr Strahlen aufteilen.
Es kann vorteilhaft sein, wenn der mindestens einen weiteren Laserablenkeinrichtung eine weitere Lasereinheit zugeordnet ist, die einen des mindestens einen Laserstrahls bereitstellt. Somit ist mindestens eine weitere Laserablenkeinrichtung mit mindestens einer weiteren Lasereinheit vorhanden. Dies ist insbesondere dann zweckmäßig, wenn für jeden Laserstrahl die volle Laserleistung beispielsweise beim Laserschneiden benötigt wird.
Es kann vorteilhaft sein, wenn der Lasereinheit eine Strahlteileranordnung
nachgeordnet ist, die aus dem von der Lasereinheit bereitgestellten Laserstrahl den mindestens einen weiteren Laserstrahl durch Strahlteilung erzeugt. Es wäre somit prinzipiell ausreichend, wenn eine Lasereinheit vorhanden ist, aus der durch
Strahlteilung mehrere Laserstrahlen erzeugt werden.
Selbstverständlich können auch Mischformen der beiden genannten Ausgestaltungen zweckmäßig sein. So kann einer weiteren Lasereinheit eine Strahlteileranordnung nachgeordnet sein, die aus dem von dieser weiteren Lasereinheit bereitgestellten weiteren Laserstrahl wiederum mindestens einen weiteren Laserstrahl durch
Strahlteilung erzeugt.
Die genannten Laserablenkeinrichtungen können die jeweiligen Laserstrahlen auf verschiedene Weise auf eine Probe führen.
Zum einen ist es möglich, alle Laserstrahlen durch dasselbe Mikroskopobjektiv des Mikroskops der Lasermikrodissektionseinrichtung zu leiten. Selbstverständlich ist es auch möglich, nur einen Teil aller zur Verfügung stehenden Laserstrahlen durch dasselbe Mikroskopobjektiv zu leiten. Hierbei ist die vorhandene
Laserablenkeinrichtung und mindestens eine der (mindestens einen) weiteren
Laserablenkeinrichtungen derart eingerichtet, dass die von diesen
Laserablenkeinrichtungen abgelenkten Laserstrahlen durch das Mikroskopobjektiv des Mikroskops des erfindungsgemäßen Lasermikrodissektionssystems geführt werden.
Zum Anderen kann für einen, für mehrere oder für alle der weiteren Laserstrahlen jeweils eine Laserfokussierlinse vorgesehen sein, die den jeweiligen weiteren
Laserstrahl auf dieselbe oder auf eine andere Probe führt. Hierzu ist eine der mindestens einen weiteren Laserablenkeinrichtung derart eingerichtet, dass sie den von ihr abgelenkten Laserstrahl durch eine Laserfokussierlinse auf den Probenbereich oder auf einen des mindestens einen anderen Probenbereichs führt. Bei dieser Ausgestaltung würde dem Mikroskop bzw. dem Mikroskopobjektiv des
Lasermikrodissektionssystems mindestens eine weitere Laserfokussierlinse zugeschaltet sein. Dies ist insbesondere dann sinnvoll, wenn Probenbereiche zu bearbeiten sind, die nicht durch das selbe Mikroskopobjektiv bearbeitet werden können, wobei zur Bearbeitung aber nicht ein weiterer Mikroskopaufbau notwendig ist. Schließlich kann es auch sinnvoll oder notwendig sein, wenn die genannte
Laserfokussierlinse ein weiteres Mikroskopobjektiv eines weiteren Mikroskops darstellt. In diesem Fall umfasst das erfindungsgemäße Lasermikrodissektionssystem somit mehrere Mikroskope zur parallelen Bearbeitung von Probenbereichen, wie es insbesondere für das oben genannte Parallel Section Cutting von Vorteil sein kann.
Selbstverständlich sind auch die oben genannten drei Ausführungsformen wiederum beliebig miteinander kombinierbar, ohne dass es hierzu näherer Erläuterungen bedürfte.
Für das bereits erwähnte Parallel Section Cutting (dritte erfindungsgemäße
Möglichkeit) ist die Laserablenkeinrichtung des erfindungsgemäßen
Lasermikrodissektionssystems derart eingerichtet, dass sie den ihr zugeordneten Laserstrahl auf den Probenbereich einer ersten biologischen Probe führt, wobei mindestens eine weitere Laserablenkeinrichtung vorgesehen ist, die derart eingerichtet ist, dass sie den ihr jeweils zugeordneten weiteren Laserstrahl auf jeweils einen anderen Probenbereich einer anderen Probe führt. Hierdurch ist das parallele
Betreiben mehrerer Laserstrahlen zum parallelen Schneiden oder Manipulieren von Proben möglich. Beispielsweise sind hierzu mehrere (mindestens zwei) Laserachsen parallel mit gleicher Optik aufgebaut und auf Probenbereiche beispielsweise benachbarter Serienschnitte eines Präparats gerichtet. Beispielsweise kann einer der Serienschnitte gefärbt sein, damit der interessierende Probenbereich (in bekannter Weise) identifiziert werden kann. Die weiteren eingelegten Serienschnitte können ungefärbt sein. Mit Hilfe des gefärbten Schnittes kann ein oder mehrere Zielareale (Probenbereiche) identifiziert und markiert werden. Beispielsweise können geeignete Schnittlinien um die interessierenden Probenbereiche gelegt werden, die als Dissektate gewonnen werden sollen. Die Markierungen bzw. Schnittlinien werden dann
entsprechend auf die weiteren Serienschnitte übertragen, so dass korrespondierende Probenbereiche auf unterschiedlichen Serienschnitten parallel manipuliert oder dissektiert und gesammelt werden können. Das Übertragen einer Markierung oder Schnittlinie erfolgt (in bekannter Weise) über Bildverarbeitung.
Das genannte Parallel Section Cutting, das neben der Dissektion auch die
Manipulation von Probenbereichen umfassen soll, kann dadurch erfolgen, dass jeder der mindestens einen weiteren Laserablenkeinrichtung jeweils eine Laserfokussierlinse zum Führen des jeweiligen weiteren Laserstrahls auf den jeweiligen Probenbereich zugeordnet ist. In diesem Fall könnte für die weiteren Laserstrahlen auf jeweils ein weiteres Mikroskop mit Mikroskopobjektiv verzichtet werden. Dies ist insbesondere dann möglich, wenn beispielsweise die Serienschnitte perfekt kalibriert sind, so dass eine erzeugte Schnittlinie in der Referenzprobe unmittelbar auf die parallelen
Serienschnitte übertragbar ist. Wenn hingegen weitere Kalibrierungsschritte notwendig sind, ist es vorteilhaft, wenn die genannten Laserfokussierlinsen weitere
Mikroskopobjektive entsprechender Mikroskope darstellen.
Für die Eingangs genannte erste erfindungsgemäße Möglichkeit des parallelen Schneidens oder Manipulierens eines Probenbereichs auf einer Probe mit mindestens zwei Laserstrahlen ist die Laserablenkeinrichtung des erfindungsgemäßen
Lasermikrodissektionssystems derart eingerichtet, dass der Laserstrahl auf den
Probenbereich der biologischen Probe geführt wird, und die mindestens eine weitere Laserablenkeinrichtung ist derart eingerichtet, dass sie den mindestens einen weiteren Laserstrahl auf den selben Probenbereich dieser Probe führt. Der genannte
Probenbereich kann somit durch mehrere Laserstrahlen manipuliert oder geschnitten werden. Das Bearbeiten erfolgt insbesondere auf demselben Sichtfeld, wie es durch das Mikroskopobjektiv gegeben ist. Aufgrund der vorhandenen mehreren
Laserablenkeinrichtungen können die Laserstrahlen bzw. Laserfoki gleichzeitig und unabhängig voneinander derart gesteuert werden, dass mehrere Markierungen bzw. Schnittlinien gleichzeitig bearbeitet werden. Hierbei ist es auch denkbar, zumindest zum Teil außerhalb des Sichtfeldes zu arbeiten. Je nach Anzahl der Laserstrahlen können entsprechend viele Markierungen oder Schnittlinien manipuliert bzw.
geschnitten werden. Es ist auch möglich, eine Schnittlinie mit zwei oder mehr Laserfoki zu schneiden.
Diese Ausführungsform führt zu einer enormen Beschleunigung bisheriger
Lasermikrodissektionsverfahren.
Schließlich können gemäß der eingangs genannten zweiten erfindungsgemäßen Möglichkeit auch mehrere Probenbereiche auf einer Probe parallel bearbeitet werden. Hierzu weist das erfindungsgemäße Lasermikrodissektionssystem die
Laserablenkeinrichtung auf, die derart eingerichtet ist, dass der Laserstrahl auf den Probenbereich der biologischen Probe geführt wird, sowie die mindestens eine weitere Laserablenkeinrichtung, die derart eingerichtet ist, dass sie den mindestens einen weiteren Laserstrahl auf den mindestens einen anderen Probenbereich derselben biologischen Probe führt. Bezügliche Ausgestaltungen und Vorteile dieser Ausführungsform sei auf die gerade eben besprochene vorherige Ausführungsform verwiesen.
Bei den letztgenannten beiden Ausführungsformen (eingangs genannte erste und zweite erfindungsgemäße Möglichkeit) ist es möglich und vorteilhaft, die Laserstrahlen über das Mikroskopobjektiv des Mikroskops zu führen und mittels der jeweiligen Laserablenkeinrichtungen in den jeweiligen Probenbereichen zu verschieben.
Selbstverständlich kann es auch wiederum zweckmäßig sein, neben dem vorhandenen Mikroskopobjektiv eine oder mehrere weitere Laserfokussierlinsen einzusetzen, wie bereits oben im Zusammenhang mit dem Parallel Section Cutting erläutert. Auch Mischformen sind denkbar. Insofern sei auf die obigen Erläuterungen verwiesen.
Die Erfindung betrifft weiterhin Verwendungen entsprechend eingerichteter
Lasermikrodissektionssysteme zum parallelen Schneiden oder Manipulieren eines Probenbereichs bzw. mehrerer Probenbereiche gemäß der oben geschilderten ersten, zweiten oder dritten erfindungsgemäßen Möglichkeit sowie entsprechende
Lasermikrodissektionsverfahren. Zur Vermeidung von Wiederholungen seien die entsprechenden Verwendungen und Lasermikrodissektionsverfahren im Folgenden gemeinsam dargestellt. Nähere Details ergeben sich aus den Ausführungsbeispielen. Der Einfachheit halber soll nachfolgend Bezug auf die erfindungsgemäßen
Lasermikrodissektionsverfahren genommen werden, wobei die Ausführungen völlig analog auf die erfindungsgemäßen Verwendungen zu lesen sind.
Beim erfindungsgemäßen Lasermikrodissektionsverfahren wird zunächst mindestens ein weiterer Laserstrahl bereitgestellt. In bekannter Weise wird ein Probenbereich einer biologischen Probe mittels eines (ersten) Laserstrahls bearbeitet. Durch parallelen Betrieb des mindestens einen weiteren Laserstrahls kann mindestens ein weiterer Probenbereich jeweils einer oder mehrerer anderer Proben parallel und insbesondere gleichzeitig bearbeitet werden. Unter "Bearbeiten" sei, wie bereits erwähnt, das Schneiden eines Probenbereichs mittels eines Laserstrahls oder das Manipulieren eines Probenbereichs mittels eines Laserstrahls verstanden.
Die (dritte) erfindungsgemäße Möglichkeit des Parallel Section Cutting wurde bereits oben im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Lasermikrodissektionssystem behandelt. Bei dem vorliegenden entsprechenden Verfahren kann insbesondere ein Probenbereich einer Referenzprobe als Referenzprobenbereich ausgewählt und weitere Probenbereiche jeweils verschiedener Proben mittels jeweils zugeordneter Laserstrahlen bearbeitet werden. Diese Art der parallelen Manipulation oder des parallelen Schneidens von Probenbereichen ist insbesondere sinnvoll, wenn der Referenzprobenbereich und die weiteren Probenbereiche Bestandteile von Proben eines Serienschnitts desselben Präparats sind. Das Auswählen eines
Referenzprobenbereichs erfolgt in an sich bekannter Weise beispielsweise durch Färbung oder andere Kontrastiermethoden. Die Koordinaten des
Referenzprobenbereichs können auf entsprechende Probenbereiche der anderen Proben übertragen werden, wobei insbesondere bei einem Serienschnitt davon auszugehen ist, dass sich die Eigenschaften des Referenzprobenbereichs und der auf diese Weise bestimmten weiteren Probenbereiche nicht oder nicht wesentlich unterscheiden. Der Referenzprobenbereich wird folglich mittels eines Mikroskops bzw. mittels des Mikroskops des Lasermikrodissektionssystems mikroskopisch visualisiert und markiert und anschließend wird die Markierung auf die weiteren Probenbereiche übertragen. Das Markieren und das Übertragen der Markierung erfolgt in an sich bekannter Weise mittels Bildverarbeitung.
Das genannte Verfahren des Parallel Section Cutting ist insbesondere für das parallele Schneiden von einander entsprechenden Probenbereichen vorteilhaft, da das Schneiden in erheblich höherer Geschwindigkeit erfolgen kann als beim bisher bekannten Serial Section Cutting.
Ein Lasermikrodissektionsverfahren gemäß bereits erwähnter erster
erfindungsgemäßer Möglichkeit des parallelen Schneidens oder Manipulierens betrifft die parallele Bearbeitung eines einzigen Probenbereichs mittels mehrerer
Laserstrahlen. Wiederum kann das Bearbeiten mittels des Laserstrahls das Schneiden des Probenbereichs entlang einer vorgegebenen Schnittlinie umfassen. Verfahren zum Bestimmen geeigneter Schnittlinien sind aus dem Stand der Technik zahlreich bekannt. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht nicht nur das parallele
Schneiden mittels mehrerer Laserstrahlen entlang einer solchen Schnittlinie, sondern auch insbesondere das Schneiden von dicken Proben, wobei hierfür insbesondere zumindest ein Laserstrahl auf die Oberseite des Probenbereichs und zumindest ein anderer Laserstrahl auf die Unterseite des Probenbereichs geführt bzw. gelenkt wird. Die Laserablenkeinrichtungen der entsprechenden Laserstrahlen sind zu diesem
Zweck entsprechend eingerichtet. Dazu können entsprechende Laserfokussierlinsen ober- und unterhalb des zu schneidenden Probenbereichs angeordnet sein. Alternativ können alle Laserfokussierlinsen auf einer Seite des Probenbereichs angeordnet sein, wobei mittels Umlenkeinrichtungen zumindest ein Laserstrahl auf die andere Seite des Probenbereichs gelenkt wird. Schließlich ermöglicht das Lasermikrodissektionsverfahren gemäß oben erwähnter zweiter erfindungsgemäßer Möglichkeit des parallelen Schneidens oder Manipulierens das parallele Bearbeiten von mehreren Probenbereichen einer einzigen Probe mittels mehrerer parallel betriebener Laserstrahlen. Figurenbeschreibung
Figur 1 zeigt ein Lasermikrodissektionssystem, das vorzugsweise den Ausgangspunkt der vorliegenden Erfindung darstellt, in schematischer Darstellung.
Figur 2zeigt schematisch eine erfindungsgemäße Möglichkeit zum parallelen
Bearbeiten von Probenbereichen auf verschiedenen Proben.
Figur 3zeigt schematisch eine erfindungsgemäße Möglichkeit des parallelen
Bearbeitens eines Probenbereichs auf einer Probe.
Figur 4zeigt schematisch eine erfindungsgemäße Möglichkeit des parallelen
Bearbeitens eines oder mehrerer Probenbereiche auf einer Probe.
Figur 5zeigt schematisch eine erfindungsgemäße Möglichkeit des parallelen
Bearbeitens eines oder mehrerer Probenbereiche auf einer Probe.
Figur 6zeigt schematisch eine Möglichkeit der Bereitstellung weiterer Laserstrahlen durch weitere Lasereinheiten.
Figur 7zeigt schematisch die Bereitstellung weiterer Laserstrahlen mittels einer Strahlteileranordnung, und
Figur 8zeigt schematisch eine Kombinationsmöglichkeit aus den Beispielen der Figuren 5 und 6.
In den Figuren sind einander entsprechende Elemente mit identischen Bezugszeichen angegeben und werden nicht wiederholt erläutert.
In Figur 1 ist ein Lasermikrodissektionssystem, das zur Durchführung der Erfindung verwendet werden kann, schematisch dargestellt und insgesamt mit 100 bezeichnet. Das Lasermikrodissektionssystem 100 entspricht in wesentlichen Teilen jenem, das in der EP 1 276 586 B1 offenbart ist, auf die hier ausdrücklich Bezug genommen wird. Ein Koordinatensystem, anhand dessen die nachfolgend erwähnten Achsen bzw.
Richtungen x, y und z veranschaulicht sind, ist in der Figur 1 mit 200 bezeichnet.
Das Lasermikrodissektionssystem 100 umfasst ein Mikroskop 10. In einem
Mikroskopfuß 1 1 des Mikroskops 10 kann eine hier nur teilweise dargestellte Beleuchtungseinrichtung 12 vorgesehen sein. Diese kann beispielsweise eine (nicht dargestellte) Lichtquelle und geeignete Mittel zur Beeinflussung des durch die
Lichtquelle bereitgestellten Beleuchtungslichts umfassen, beispielsweise Filter und/oder Blenden. Zur Durchlichtbeleuchtung und zur Einstellung geeigneter Kontrast- bzw. Beobachtungsverfahren kann eine Kondensoreinheit 90 vorgesehen sein.
Das Mikroskop 10 kann als Konfokal-, insbesondere als Spinning-Disk-Mikroskop ausgebildet sein und verfügt in diesem Fall über entsprechende weitere oder alternative Mittel (in Figur 1 nicht dargestellt).
Am Mikroskopfuß 1 1 kann beispielsweise auch eine Benutzereingabe- und/oder Benutzerinformationseinheit 13 angeordnet sein, die beispielsweise als Touchscreen ausgebildet sein kann, und über die der Benutzer beispielsweise Betrachtungsund/oder Bearbeitungsparameter eingeben und/oder auslesen kann.
Ferner ist ein Triebknopf 14 vorgesehen. Dieser dient zur Bedienung eines Grob- und eines Feintriebs zur Einstellung einer Höhe eines Mikroskoptischs 30. Eine Probe 51 , beispielsweise eine in einer entsprechenden Aufnahmeeinrichtung bzw. Halterung 52 angebrachte Gewebeprobe, kann hierdurch in eine Objektebene eines Objektivs 41 gebracht werden. Das Objektiv 41 ist neben weiteren Objektiven 42 in einem
Objektivrevolver 40 befestigt. Zum Schutz vor Laserstrahlung kann eine Schutzhaube 15 vorgesehen sein.
Von der Probe 51 ausgehendes Beobachtungslicht verläuft entlang eines
Beobachtungsstrahlengangs a. In einer Tubuseinheit 60 mit geeigneten
Auskoppeleinrichtungen 61 kann ein vorzugsweise variabler Anteil des
Beobachtungslichts, beispielsweise um 60°, ausgekoppelt und mittels eines
Okularpaars 62 einem Benutzer dargeboten werden. Ein weiterer Anteil des
Beobachtungslichts kann in eine digitale Bilderfassungseinheit 63 eingekoppelt und bildgebend erfasst werden. Der Bilderfassungseinheit 63 kann, vor Ort, in einer Steuereinheit 82 oder einem Steuerrechner 81 (siehe unten), oder in anderer räumlicher Anordnung, ein Bildauswertungsmodul 64 zugeordnet sein.
Das Lasermikrodissektionssystem 100 weist eine Lasereinheit 70 mit einer
Laserlichtquelle 75 auf. Ein durch die Laserlichtquelle 75, bei der es sich
beispielsweise um eine UV-Laserlichtquelle handeln kann, bereitgestellter Laserstrahl 77 mit Laserstrahlachse b wird in einer Auflichteinheit, die hier insgesamt mit 76 angegeben ist, an einem ersten Umlenkspiegel 71 und einem zweiten Umlenkspiegel 72 umgelenkt und durch das Objektiv 41 auf die Probe 51 in dem Probenbereich 50 fokussiert.
Bei dem Lasermikrodissektionssystem 100 kann der Ort, an dem der Laserstrahl 77 auf die Probe 51 in der Objektebene, und damit auch in dem Probenbereich 50 auftrifft, grundsätzlich auf unterschiedliche Weise eingestellt werden. Einerseits kann eine manuelle Versteileinrichtung 31 vorgesehen sein, mittels derer der als Kreuztisch ausgebildete Mikroskoptisch 30 in x- und y-Richtung (also hier senkrecht bzw. parallel zur Papierebene) verstellt werden kann. Neben der Versteileinrichtung 31 können auch elektromechanische Stellmittel vorgesehen sein, die beispielsweise durch eine
Steuereinheit 82 angesteuert bzw. deren Position durch die Steuereinheit 82 erfasst werden kann.
Die Steuereinheit 82 kann auch beliebige weitere motorisierte Funktionen des
Lasermikrodissektionssystems 100 steuern und insbesondere eine Schnittstelle zu einem externen Steuerrechner 81 , der über entsprechende Verbindungen 83 angebunden sein kann, bereitstellen. Die Steuereinheit 82 oder der Steuerrechner 81 kann auch beispielsweise mittels des Bildauswertungsmoduls 64 erhaltene Daten auswerten. Beispielsweise kann hierdurch eine Abfolge von Gewebeschichten oder anderer Strukturen der Probe 51 erkannt werden.
Für die Lasermikrodissektion kann insbesondere eine Laserablenkeinrichtung 73 vorgesehen sein. Mittels der Laserablenkeinrichtung 73 kann der Laserstrahl 77 gegenüber einer zwischen dem ersten Umlenkspiegel 71 und dem zweiten
Umlenkspiegel 72 verlaufenden optischen Achse c abgelenkt werden. Der Laserstrahl kann daher an unterschiedlichen Positionen auf den zweiten Umlenkspiegel 72 auftreffen, der beispielsweise als dichromatischer Teiler ausgebildet sein kann, und wird damit auch an unterschiedlichen Positionen auf die Probe 51 in der Objektebene fokussiert. Eine Ablenkung mittels einer Laserablenkeinrichtung 73 ist im Detail in der EP 1 276 586 B1 gezeigt. Es sei betont, dass hier unterschiedliche Möglichkeiten zur Ablenkung eines Laserstrahls 77 bzw. zur Positionierung der Probe 51 in der
Objektebene gegenüber dem Laserstrahl 77 zum Einsatz kommen können. Die Erfindung ist nicht auf das dargestellte Beispiel beschränkt.
Im dargestellten Beispiel weist die Laserablenkeinrichtung 73 zwei massive gläserne Keilplatten 731 auf, die gegen die optische Achse c geneigt und unabhängig voneinander um die optische Achse c drehbar sind. Hierzu sind die Keilplatten 731 mit Kugellagern 732 gelagert. Jede der Keilplatten ist mit einem Zahnrad 733 verbunden. Die Zahnräder 733 können jeweils mittels Aktoren 734 gedreht werden, die mit entsprechenden Ansteuersignalen beaufschlagt werden können und entsprechend die Zahnräder 733 antreiben. Die Rotationseinrichtungen können über Positonsgeber 735 verfügen (hier nur an dem rechten Aktor 734 gezeigt). Eine durch die Positonsgeber 735 erfasste Position kann an die Steuereinheit 82 übermittelt werden.
Figur 2 zeigt eine erfindungsgemäße Möglichkeit des parallelen Bearbeitens von Probenbereichen auf verschiedenen Proben. Ohne Beschränkung der Allgemeinheit sei im Folgenden von einem Schneiden der Probenbereiche mittels eines fokussierten Laserstrahls zur Erzeugung von Dissektaten ausgegangen. Das in Figur 2
beschriebene Ausführungsbeispiel stellt eine Ausführungsform des in der
Beschreibung diskutierten Parallel Section Cutting dar.
Figur 2 zeigt ein Objektiv 41 , das einen Laserstrahl 77 auf eine Probe 51 fokussiert. Der Laserstrahl 77 wird mittels einer auf der optischen Achse c angeordneten
Laserablenkeinrichtung 73 in x-y-Richtung innerhalb eines Probenbereichs 510 der Probe 51 verschoben. Zu näheren Erläuterungen dieses Systems sei vollumfänglich auf die Erläuterungen zur Figur 1 verwiesen. Der Einfachheit halber ist in Figur 2 das Lasermikrodissektionssystem 100 aus Figur 1 nicht in Gänze dargestellt. Es sind lediglich die zum Verständnis der Erfindung notwendigen Komponenten dargestellt und im Folgenden beschrieben.
Die Probe 51 ist auf einer geeigneten Halterung 52 aufgebracht, die eine
Laserdissektion erlaubt. Der Probenbereich, der mittels des fokussierten Laserstrahls 77 ausgeschnitten wird, ist mit 510 bezeichnet. Der Probenbereich 510 bildet einen Teilbereich der Probe 51 , wobei der Probenbereich in an sich bekannter Weise als interessierender Probenbereich identifiziert wird. Dies geschieht üblicherweise anhand einer mikroskopischen Visualisierung der Probe 51 und des Probenbereichs 510, wobei durch eine Einfärbung der Probe 51 und mittels geeigneter (Fluoreszenz-) Untersuchung der Probe 51 der interessierende Probenbereich 510 ermittelt werden kann. In ebenfalls an sich bekannter Weise wird um diesen Probenbereich 510 eine beispielsweise individuelle Schnittlinie gelegt. Dieser Vorgang kann manuell oder bevorzugt mittels Bildverarbeitung erfolgen. Das Ergebnis kann beispielsweise am externen Steuerrechner 81 (vgl. Figur 1 ) überprüft werden. Ergeht der Befehl zum Schneiden der Probe 51 , steuert die Steuereinheit 82 die Laserablenkeinrichtung 73 derart an, dass der Laserstrahlfokus auf der Probe 51 die Schnittlinie beschreibt und auf diese Weise den Probenbereich 510 von der übrigen Probe trennt. Bei dem dargestellten Parallel Section Cutting sind weitere Proben 53, 54 auf entsprechenden Halterungen aufgenommen, um parallel bearbeitet werden zu können. Hierzu sind weitere Laserstrahlen 77' und 77" vorgesehen. Jedem dieser weiteren Laserstrahlen ist jeweils eine weitere Laserablenkeinrichtung 73', 73" zugeordnet. Die optischen Achsen sind mit c' bzw. c" bezeichnet. Bei den Proben 53 und 54 handelt es sich zweckmäßigerweise um insbesondere benachbarte Schnitte eines Serienschnitts aus einem Präparat. Die Proben 53 und 54 müssen nicht zwingend gefärbt sein. Es ist im Gegenteil günstig, mit ungefärbten Proben zu arbeiten, da Färbungen die
Eigenschaften oder die biologischen Prozesse der Probe beeinflussen können.
Die um den Probenbereich 510 der Probe 51 festgelegte Schnittlinie wird auf die ungefärbten Probenbereiche 530 und 540 übertragen, so dass die Probenbereiche 530 und 540 dem Referenzprobenbereich 510 entsprechen. Unter "Übertragen der Schnittlinie" soll verstanden werden, dass Steuerbefehle an entsprechende
Steuereinheiten der Laserablenkeinrichtungen 73', 73" übertragen werden, um den Laserstrahl 77' bzw. 77" entsprechend der festgelegten Schnittlinie auf der Probe 53 bzw. 54 zu führen.
Auf diese Weise ist es folglich möglich, entsprechend der einmal festgelegten
Schnittlinie um den Referenzprobenbereich 510 parallel und insbesondere gleichzeitig mehrere entsprechende Probenbereiche 530, 540 aus weiteren Proben 53, 54 herauszuschneiden. Hierbei besteht die Option, auch den Laserstrahl 77 entsprechend abzulenken, so dass sein Fokus entlang der Schnittlinie verschoben wird, um den Referenzprobenbereich 510 zu dissektieren. Dies muss aber nicht zwangsläufig der Fall sein, wenn etwa der gefärbte Referenzprobenbereich als Dissektat für die weitere Analyse weniger brauchbar oder ganz unbrauchbar sein sollte. Aus diesem Grund ist der Laserstrahl 77 nur gestrichelt gezeichnet.
Das Ausführungsbeispiel gemäß Figur 2 ist selbstverständlich nicht nur auf die dort dargestellte Anzahl von Proben beschränkt. Wie außerdem bereits erwähnt, können auch andere Markierungen als Schnittlinien für das Parallel Section Cutting eingesetzt werden. Beispielsweise können Zielareale als Probenbereiche identifiziert, markiert und anschließend manipuliert werden. Auf die Möglichkeiten zur Erzeugung von weiteren Laserstrahlen 77', 77" wird weiter unten näher eingegangen werden. In Figur 2 sind lediglich die entsprechenden Laserablenkeinrichtungen 73', 73" dargestellt. Die Laserfokussierlinsen 41 ', 41 " sorgen in Figur 2 für die Fokussierung der entsprechend zugeordneten Laserstrahlen 77', 77" auf die jeweilige Probe 53, 54. Wenn diese Proben 53, 54 exakt kalibriert sind, kann es bei der Verwendung von Laserfokussierlinsen 41 ', 41 " bleiben. Sind jedoch Kalibrierungen notwendig, um sicherzustellen, dass einander korrespondierende Probenbereiche gleiche Koordinaten besitzen, ist es vorteilhaft, wenn die dargestellten Laserfokussierlinsen 41 ', 41 " Mikroskopobjektive weiterer Mikroskope (nicht dargestellt) darstellen. Solch weitere "Mikroskope" werden die wesentlichen Komponenten des in Figur 1 dargestellten Systems beinhalten müssen, soweit durch diese Komponenten eine Kalibrierung und eine anschließende Dissektion ermöglicht wird, nämlich im Wesentlichen Lasereinheit, Laserablenkeinrichtung, Objektiv und Aufnahmeeinrichtung für die Probe.
Figur 3 zeigt schematisch eine Möglichkeit des parallelen Bearbeitens eines
Probenbereichs auf einer Probe. Ohne Beschränkung der Allgemeinheit soll hier wiederum von einem Schneiden der Probe ausgegangen werden. Wie anhand von Figur 2 oben bereits erläutert, wird hierzu ein Laserstrahl 77 auf eine Probe 51 mittels eines Mikroskopobjektivs 41 fokussiert. Die Position des Fokus des Laserstrahls 77 auf der Probe 51 wird mit Hilfe einer Laserablenkeinrichtung 73 gesteuert.
Mittels eines weiteren Laserstrahls 77' mit zugeordneter weiterer
Laserablenkeinrichtung 73' kann derselbe Probenbereich 510 der Probe 51 bearbeitet werden. Insbesondere können beide Laserstrahlen 77 und 77' parallel und
insbesondere gleichzeitig den Probenbereich 510 entlang einer Schnittlinie schneiden. Auf diese Weise kann die Geschwindigkeit des Dissektierens erhöht werden. Die parallelen Laser 77, 77' können also entlang derselben Schnittlinie an
unterschiedlichen Koordinaten gleichzeitig schneiden, aber prinzipiell auch an gleichen Koordinaten, etwa bei dicken Proben. Hierbei können die Foki der Laser 77, 77' in unterschiedlichen Probentiefen liegen, um dicke Proben schneller und effektiver zu schneiden.
Mittels entsprechender Umlenkspiegel 72, 72' können die Achsen b, b' der
Laserstrahlen 77, 77' in die optische Achse c des Objektivs 41 eingekoppelt werden.
Figur 4 zeigt schematisch eine erfindungsgemäße Möglichkeit zum parallelen
Bearbeiten eines oder mehrerer Probenbereiche auf einer Probe. Gleiche
Bezugszeichen bezeichnen wiederum gleiche Elemente wie in den vorangegangen Figuren.
Die Ausführungsform gemäß Figur 4 kann als weitere Ausgestaltung des parallelen Bearbeitens eines Probenbereichs 510 auf einer Probe 51 (vgl. Figur 3) verstanden werden. Im Gegensatz zu der Ausführungsform gemäß Figur 3 sind in Figur 4 aber zwei Fokussierlinsen 41 , 41 ' bzw. ein Mikroskopobjektiv 41 und eine Fokussierlinse 41 ' bzw. zwei Mikroskopobjektive 41 , 41 ' vorgesehen. Somit werden die beiden
Laserstrahlen 77, 77' nicht durch eine einzige Fokussierlinse bzw. ein einziges
Mikroskopobjektiv 41 geführt, sondern durch jeweils ein zugeordnetes
Mikroskopobjektiv oder eine zugeordnete Fokussierlinse 41 bzw. 41 '. Dies ermöglicht beispielsweise nicht nur innerhalb des Sichtfelds eines Mikroskopobjektivs, sondern auch außerhalb dieses Sichtfelds und schließlich innerhalb der Sichtfelder zweier Mikroskopobjektive zu arbeiten, je nachdem ob 41 und 41 ' eine Fokussierlinse und ein Mikroskopobjektiv oder zwei Mikroskopobjektive bezeichnet.
In einer anderen Ausführungsform des Beispiels gemäß Figur 4 treffen die
Laserstrahlen 77, 77' auf zwei voneinander unterschiedliche Probenbereiche (nicht gesondert bezeichnet). Auf diese Weise ist es möglich, verschiedene Probenbereiche einer Probe 51 parallel und insbesondere gleichzeitig zu schneiden oder zu
manipulieren. Somit können etwa mehrere markierte interessierende Probenbereiche gleichzeitig aus einer Probe 51 geschnitten werden, was den Vorgang der
Lasermikrodissektion enorm beschleunigt. Bzgl. weiterer Einzelheiten zu diesen Vorgängen sei auf die vorangehenden Ausführungsbeispiele verwiesen.
Figur 5 zeigt eine weitere Ausgestaltung der Anordnung gemäß Figur 4. Hierbei ist ein zusätzlicher dritter Laserstrahl 77" vorgesehen, der in der Darstellung gemäß Figur 5 auf die Unterseite der Probe 51 gerichtet ist, während die beiden Laserstrahlen 77, 77' auf die Oberseite dieser Probe 51 gerichtet sind. Der auf die Unterseite der Probe 51 gerichtete Laserstrahl 77" besitzt eine ihm zugeordnete Laserablenkeinrichtung 73". Die in Figur 5 dargestellte Vorrichtung eignet sich wiederum zum Schneiden (oder sonstigen Bearbeiten) eines einzigen Probenbereichs 510 auf der Probe 51 oder aber mehrerer Probenbereiche (nicht gesondert bezeichnet) auf der Probe 51 . Hierzu sei auf die Erläuterungen im Zusammenhang mit Figur 4 verwiesen.
Der auf die Unterseite gerichtete Laserstrahl 77" gemäß Figur 5 kann insbesondere zum Schneiden dicker Probenbereiche eingesetzt werden. Beispielsweise kann der Laserstrahl 77' von oben auf die Schnittlinie geführt werden, während der Laserstrahl 77" von unten auf dieselbe Schnittlinie geführt wird, so dass die Schnittlinie von zwei Seiten geschnitten wird. Auf diese Weise kann ein dicker Probenbereich schonender geschnitten werden, als wenn mit einem einzigen Laserstrahl entsprechend hoher Energie nur von einer Seite aus geschnitten würde. Bzgl. der Figuren 4 und 5 sei weiterhin betont, dass die dort dargestellte
Schrägstellung der Laserachsen nicht unbedingt nur durch die dargestellte
Schrägstellung der optischen Achsen der Mikroskopobjektive bzw.
Laserfokussierlinsen erreicht werden kann. Ein entsprechender Auftreffwinkel des Laserstrahls auf die Probe kann, wie anhand der Figuren 1 und 3 erläutert, auch und vorzugsweise mit Objektiven bzw. Laserfokussierlinsen erzielt werden, deren optische Achsen senkrecht auf die Probe stehen, wobei die Schrägstellungen der Laserachsen dann allein durch die zugeordneten Laserablenkeinrichtungen bewirkt werden. Die Schrägstellungen der Achsen in den Figuren 4 und 5 dienen somit eher der leichteren Verständlichkeit.
Figur 6 zeigt schematisch eine Möglichkeit der Bereitstellung weiterer Laserstrahlen durch weitere Lasereinheiten. Hierbei sind zwei Lasereinheiten 70 und 70' in einem Lasermikrodissektionssystem 100 vorhanden (vgl. Figur 1 ). Die Lasereinheiten 70, 70' erzeugen entsprechende Laserstrahlen 77, 77', die durch ihnen zugeordnete
Laserablenkeinheiten 73, 73' auf einem Probenbereich geführt und dort verschoben werden.
Figur 7 zeigt schematisch die Bereitstellung weiterer Laserstrahlen mittels einer Strahlteileranordnung. Die Lasereinheit 70 erzeugt einen Laserstrahl, der eine
Strahlteileranordnung 78 durchläuft. Hierbei wird der Laserstrahl in zwei Strahlen geteilt, wobei einer der beiden Strahlen mit 77 bezeichnet ist. Der andere der beiden geteilten Strahlen sei mit 77' bezeichnet. Auf diese Weise können zwei Laserstrahlen 77, 77' erzeugt werden, deren Intensität entsprechend geringer ist als die des ursprünglichen Laserstrahls 77. Beispielsweise kann der Laserstrahl 77' an einem Umlenkspiegel 74 reflektiert und einer ihm zugeordneten Laserablenkeinrichtung 73' zugeführt werden.
Während die Ausführungsform gemäß Figur 6 insbesondere für Schneidprozesse sinnvoll ist, bei denen die volle Laserintensität benötigt wird, ist die Ausführungsform gemäß Figur 7 für Prozesse wie Manipulationen vorteilhaft, für die ein Teil der ursprünglichen Laserleistung ausreichend ist.
Schließlich zeigt Figur 8 eine Kombinationsmöglichkeit der Ausführungsformen von den Figuren 6 und 7. Hierbei wird der von der Lasereinheit 70 erzeugte Laserstrahl 77 einer Laserablenkeinrichtung 73 zugeführt. Ein weiterer Laserstrahl wird durch eine weitere Lasereinheit 70' erzeugt. Dieser weitere Laserstrahl wird in zwei Laserstrahlen aufgespalten, wobei wiederum einer der beiden aufgespaltenen Laserstrahlen mit 77', der andere hingegen mit 77" bezeichnet werden soll. Die Aufspaltung erfolgt wiederum in einer Strahlteileranordnung 78'. Die auf diese Weise erzeugten Teilstrahlen 77' und 77" werden dann jeweils entsprechenden Laserablenkeinrichtungen 73' und 73" zugeführt, wobei für den Laserstrahl 77" wiederum ein Umlenkspiegel 74 zum Einsatz kommen kann. Eine Anordnung, wie sie in Figur 8 gezeigt ist, kann beispielsweise zum parallelen Schneiden von dicken Proben bzw. Probenbereichen (mit Laserstrahl 77) und dünnen Proben bzw. Probenbereichen (mit den Laserstrahlen 77' und 77") verwendet werden. Dem Fachmann erschließen sich aus den Figuren 6 bis 8 weitere Kombinationsmöglichkeiten.
Bezugszeichenliste
10 Mikroskop
1 1 Mikroskopfuß
12 Beleuchtungseinrichtung
13 Benutzereingabe-/informationseinheit
14 Triebknopf
15 Schutzhaube
30 Mikroskoptisch
31 manuelle Versteileinrichtung
40 Objektivrevolver
41 Objektiv
41 ', 41 " Laserfokussierlinse, Objektiv
42 Objektiv
51 Probe
52 Aufnahmeeinrichtung
53 Probe
54 Probe
510 Probenbereich, Referenzprobenbereich
530 Probenbereich
540 Probenbereich
60 Tubuseinheit
61 Auskoppeleinrichtungen
62 Okularpaar
63 Bilderfassungseinheit
64 Bildauswertungsmodul
70, 70' Lasereinheit
71 Umlenkspiegel 72, 72' Umlenkspiegel
73, 73', 73" Laserablenkeinrichtung
74 Umlenkspiegel
75 Laserlichtquelle
76 Auflichteinheit
77, 77', 77" Laserstrahl
78, 78' Strahlteileranordnung
731 Keilplatten
732 Kugellager
733 Zahnrad
734 Aktor
735 Positionsgeber
81 Steuerrechner
82 Steuereinheit
83 Verbindungen
90 Kondensoreinheit
100 Lasermikrodissektionssystem a Beobachtungsstrahlengang b Laserstrahlachse c optische Achse

Claims

Patentansprüche
1 . Lasermikrodissektionssystem (100) mit einem Mikroskop (10), das eine
Aufnahmeeinrichtung (52) zur Aufnahme einer biologischen Probe (51 ) und eine Auflichteinrichtung (76) mit einer Laserablenkeinrichtung (73) aufweist, welche einen durch eine Lasereinheit (70) bereitgestellten Laserstrahl (77) durch ein
Mikroskopobjektiv (41 ) des Mikroskops (10) auf einen Probenbereich (510) der biologischen Probe (51 ) führt und welche einen Auftreffpunkt des Laserstrahls (77) auf dem Probenbereich (510) verschiebt,
dadurch gekennzeichnet, dass das Lasermikrodissektionssystem (100) mindestens eine weitere Laserablenkeinrichtung (73', 73") zum Führen mindestens eines weiteren Laserstrahls (77', 77") auf den Probenbereich (510) oder auf mindestens einen anderen Probenbereich (530, 540) und zum Verschieben des Auftreffpunkts des mindestens einen weiteren Laserstrahls (77', 77") auf dem jeweiligen Probenbereich aufweist.
2. Lasermikrodissektionssystem (100) nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens einen weiteren Laserablenkeinrichtung (73') eine weitere
Lasereinheit (70') zugeordnet ist, die einen des mindestens einen Laserstrahls (77') bereitstellt.
3. Lasermikrodissektionssystem (100) nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der Lasereinheit (70) eine Strahlteileranordnung (78) nachgeordnet ist, die aus dem von der Lasereinheit (70) bereitgestellten Laserstrahl (77) den mindestens einen weiteren Laserstrahl (77') durch Strahlteilung erzeugt.
4. Lasermikrodissektionssystem (100) nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der weiteren Lasereinheit (70') eine Strahlteileranordnung (78') nachgeordnet ist, die aus dem von der weiteren Lasereinheit (70') bereitgestellten weiteren Laserstrahl (77') mindestens einen weiteren Laserstrahl (77") durch Strahlteilung erzeugt.
5. Lasermikrodissektionssystem (100) nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Laserablenkeinrichtung (73) und eine der mindestens einen weiteren Laserablenkeinrichtung (73') derart eingerichtet sind, dass die von diesen Laserablenkeinrichtungen abgelenkten Laserstrahlen (77, 77') durch das
Mikroskopobjektiv (41 ) des Mikroskops (10) geführt werden.
6. Lasermikrodissektionssystem (100) nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass eine der mindestens einen weiteren Laserablenkeinrichtung (73') derart eingerichtet ist, dass sie den von ihr abgelenkten Laserstrahl (77') durch eine Laserfokussierlinse (41 ') auf den Probenbereich (510) oder auf einen des mindestens einen anderen Probenbereichs (530, 540) führt.
7. Lasermikrodissektionssystem (100) nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Laserfokussierlinse ein weiteres Mikroskopobjektiv (41 ') eines weiteren Mikroskops darstellt.
8. Lasermikrodissektionssystem (100) nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der andere Probenbereich ein anderer Probenbereich der selben
Probe (51 ) oder ein weiterer Probenbereich (530, 540) einer anderen Probe (53, 54) darstellt.
9. Lasermikrodissektionssystem (100) nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Lasermikrodissektionssystem (100) die Laserablenkeinrichtung (73) zum Führen des Laserstrahls (77) auf den Probenbereich (510) einer ersten biologischen Probe (51 ) aufweist und die mindestens eine weitere Laserablenkeinrichtung (73', 73") zum Führen des mindestens einen weiteren
Laserstrahls (77', 77") auf einen des mindestens einen anderen Probenbereichs (530, 540) einer anderen Probe (53, 54) oder - soweit auf Anspruch 8 zurückbezogen - der anderen Probe (53, 53) aufweist.
10. Lasermikrodissektionssystem (100) nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Lasermikrodissektionssystem (100) die
Laserablenkeinrichtung (73) zum Führen des Laserstrahls (77) auf den Probenbereich (510) der biologischen Probe (51 ) und die mindestens eine weitere
Laserablenkeinrichtung (73', 73") zum Führen des mindestens einen weiteren
Laserstrahls (77', 77") auf denselben Probenbereich (510) dieser biologischen Probe (51 ) aufweist.
1 1 . Lasermikrodissektionssystem (100) nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Lasermikrodissektionssystem (100) die La- serablenkeinrichtung (73) zum Führen des Laserstrahls (77) auf den Probenbereich (510) der biologischen Probe (51 ) aufweist und die mindestens eine weitere
Laserablenkeinrichtung (73', 73") zum Führen des mindestens einen weiteren Laserstrahls (77', 77") auf den mindestens einen anderen Probenbereich der selben biologischen Probe (51 ) aufweist.
12. Lasermikrodissektionssystem (100) nach Anspruch 9, 10 oder 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass jeder der mindestens einen weiteren Laserablenkeinrichtung (73', 73") jeweils eine Laserfokussierlinse (41 ', 41 ") zum Führen des jeweiligen weiteren Laserstrahls (77', 77") auf den jeweiligen Probenbereich zugeordnet ist.
13. Lasermikrodissektionssystem (100) nach Anspruch 12, dadurch
gekennzeichnet, dass mindestens eine der Laserfokussierlinsen ein weiteres Mikroskopobjektiv (41 ', 41 ") eines weiteren Mikroskops darstellt.
14. Verwendung eines Lasermikrodissektionssystems (100) nach Anspruch 9 zum parallelen Bearbeiten von Probenbereichen (510, 530, 540) jeweils verschiedener Proben (51 , 53, 54) mittels jeweils zugeordneter Laserstrahlen (77, 77', 77").
15. Verwendung nach Anspruch 14, wobei ein Probenbereich (510)einer
Referenzprobe (51 )als Referenzprobenbereich ausgewählt wird und weitere
Probenbereiche (530, 540) jeweils verschiedener Proben (53, 54) mittels jeweils zugeordneter Laserstrahlen (77', 77") bearbeitet werden.
16. Verwendung nach Anspruch 15, wobei der Referenzprobenbereich (510) und die weiteren Probenbereiche (530, 540) Bestandteile von Proben (51 , 53, 54) eines Serienschnitts desselben Präparats sind.
17. Verwendung nach Anspruch 15 oder 16, wobei der Referenzprobenbereich (540) mittels des Mikroskops (10) des Lasermikrodissektionssystems (100)
mikroskopisch visualisiert und markiert wird und die Markierung auf die weiteren Probenbereiche (530, 540) übertragen wird.
18. Verwendung nach Anspruch 17, wobei die Markierung eine Schnittlinie darstellt, die den Referenzprobenbereich (510) umgibt.
19. Verwendung nach Anspruch 18, wobei nach Übertragung der Schnittlinie die weiteren Probenbereiche (530, 540) mittels der zugeordneten parallel betriebenen
Laserstrahlen (77', 77") aus den jeweiligen Proben (53, 54) geschnitten werden.
20. Verwendung eines Lasermikrodissektionssystems nach Anspruch 10 zum parallelen Bearbeiten eines Probenbereichs (510) der Probe (51 ) mittels mehrerer Laserstrahlen.
21 . Verwendung nach Anspruch 20, wobei das Bearbeiten das Schneiden des Probenbereichs (510) entlang einer Schnittlinie umfasst.
22. Verwendung nach Anspruch 21 , wobei zumindest ein Laserstrahl (77') auf die Oberseite des Probenbereichs (510) und zumindest ein anderer Laserstrahl (77") auf die Unterseite des Probenbereichs (510) geführt wird.
23. Verwendung eines Lasermikrodissektionssystems nach Anspruch 1 1 zum parallelen Bearbeiten von mehreren Probenbereichen einer Probe (51 ) mittels den
Probenbereichen jeweils zugeordneter Laserstrahlen (77', 77").
24. Verwendung nach Anspruch 23, wobei das Bearbeiten das Schneiden der Probenbereiche entlang jeweiliger Schnittlinien umfasst.
25. Lasermikrodissektionsverfahren zum Bearbeiten eines Probenbereichs (510) einer biologischen Probe (51 ) mittels eines Laserstrahls (77),
dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein weiterer Laserstrahl (77', 77") bereitgestellt wird und mindestens ein weiterer Probenbereich (530, 540) jeweils verschiedener Proben (53, 54) sowie optional der Probenbereich (510) der Probe (51 ) mittels des mindestens einen weiteren Laserstrahls (77', 77") bzw. optional des Laserstrahls (77) parallel bearbeitet werden.
26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei ein Probenbereich (510) einer
Referenzprobe (51 ) als Referenzprobenbereich ausgewählt wird und weitere
Probenbereiche (530, 540) jeweils verschiedener Proben (53, 54) mittels jeweils zugeordneter Laserstrahlen (77', 77") bearbeitet werden.
27. Verfahren nach Anspruch 26, wobei der Referenzprobenbereich (510) und die weiteren Probenbereiche (530, 540) Bestandteile von Proben (51 , 53, 54) eines Serienschnitts des selben Präparats sind.
28. Verfahren nach Anspruch 26 oder 27, wobei der Referenzprobenbereich (510) mittels eines Mikroskops (10) mikroskopisch visualisiert und markiert wird und die Markierung auf die weiteren Probenbereiche (530, 540) übertragen wird.
29. Verfahren nach Anspruch 28, wobei die Markierung eine Schnittlinie darstellt, die den Referenzprobenbereich (510) umgibt.
30. Verfahren nach Anspruch 29, wobei nach Übertragung der Schnittlinie die weiteren Probenbereiche (530, 540) mittels der zugeordneten parallel betriebenen Laserstrahlen (77', 77") aus den jeweiligen Proben (53, 54) geschnitten werden.
31 . Lasermikrodissektionsverfahren zum Bearbeiten eines Probenbereichs (510) einer biologischen Probe (51 ) mittels eines Laserstrahls (77), dadurch gekennzeichnet, dass zumindest ein weiterer Laserstrahl (77') bereitgestellt wird und der Probenbereich (510) mittels des Laserstrahls (77) sowie des mindestens einen weiteren Laserstrahls (77') parallel bearbeitet wird.
32. Verfahren nach Anspruch 31 , wobei das Bearbeiten das Schneiden des
Probenbereichs (510) entlang einer Schnittlinie umfasst.
33. Verfahren nach Anspruch 32, wobei zumindest ein Laserstrahl (77') auf die Oberseite des Probenbereichs (510) und zumindest ein anderer Laserstrahl (77") auf die Unterseite des Probenbereichs (510) geführt wird.
34. Lasermikrodissektionsverfahren zum Bearbeiten eines Probenbereichs (510) einer biologischen Probe (51 ) mittels eines Laserstrahls (77),
dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein weiterer Laserstrahl (77') bereitgestellt wird und mindestens ein weiterer Probenbereich der Probe (51 ) mittels des mindestens einen weiteren Laserstrahls (77') parallel bearbeitet wird.
35. Verfahren nach Anspruch 34, wobei das Bearbeiten das Schneiden der
Probenbereiche entlang jeweiliger Schnittlinien umfasst.
PCT/EP2015/054102 2014-02-28 2015-02-27 Lasermikrodissektionssystem und lasermikrodissektionsverfahren WO2015128447A1 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102014203747.6A DE102014203747A1 (de) 2014-02-28 2014-02-28 Lasermikrodissektionssystem und Lasermikrodissektionsverfahren
DE102014203747.6 2014-02-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015128447A1 true WO2015128447A1 (de) 2015-09-03

Family

ID=52596493

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2015/054102 WO2015128447A1 (de) 2014-02-28 2015-02-27 Lasermikrodissektionssystem und lasermikrodissektionsverfahren

Country Status (2)

Country Link
DE (1) DE102014203747A1 (de)
WO (1) WO2015128447A1 (de)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102015108276B4 (de) * 2015-05-26 2017-03-09 Leica Microsystems Cms Gmbh System zur Lasermikrodissektion und Lasermikrodissektionsverfahren
EP3567362B1 (de) * 2018-05-09 2022-03-30 Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG Verfahren und vorrichtung zur segmentierung und vereinzelung flächig verteilter proben mittels laserschneidens

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5689109A (en) * 1993-01-13 1997-11-18 Schuetze; Raimund Apparatus and method for the manipulation, processing and observation of small particles, in particular biological particles
WO2001078937A1 (de) * 2000-04-13 2001-10-25 Leica Microsystems Wetzlar Gmbh Laser-mikro-dissektionsgerät
US20060087643A1 (en) * 2004-09-09 2006-04-27 Donovan Brian W Laser microdissection apparatus and method
WO2008011944A1 (de) * 2006-07-28 2008-01-31 P.A.L.M. Microlaser Technologies Gmbh Verfahren und vorrichtung zum bearbeiten von biologischen objekten
US20120045790A1 (en) 2009-04-28 2012-02-23 Koninklijke Philips Electronics N.V. Microdissection method and information processing system

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998014816A1 (en) * 1996-10-02 1998-04-09 Cell Robotics Inc. Microscope with laser port
JP2004170930A (ja) * 2002-10-31 2004-06-17 Olympus Corp マイクロダイセクション装置および方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5689109A (en) * 1993-01-13 1997-11-18 Schuetze; Raimund Apparatus and method for the manipulation, processing and observation of small particles, in particular biological particles
WO2001078937A1 (de) * 2000-04-13 2001-10-25 Leica Microsystems Wetzlar Gmbh Laser-mikro-dissektionsgerät
EP1276586B1 (de) 2000-04-13 2005-08-10 Leica Microsystems Wetzlar GmbH Laser-mikro-dissektionsgerät
US20060087643A1 (en) * 2004-09-09 2006-04-27 Donovan Brian W Laser microdissection apparatus and method
WO2008011944A1 (de) * 2006-07-28 2008-01-31 P.A.L.M. Microlaser Technologies Gmbh Verfahren und vorrichtung zum bearbeiten von biologischen objekten
US20120045790A1 (en) 2009-04-28 2012-02-23 Koninklijke Philips Electronics N.V. Microdissection method and information processing system

Also Published As

Publication number Publication date
DE102014203747A1 (de) 2015-09-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1745270B2 (de) Verfahren zur bearbeitung einer masse mittels laserbestrahlung und steuersystem
EP1186930B1 (de) Vorrichtung zur Untersuchung und Manipulation von mikroskopischen Objekten
DE102012218382B4 (de) Verfahren zum Festlegen eines Lasermikrodissektionsbereichs und zugehöriges Lasermikrodissektionssystem
EP3017296B1 (de) Lasermikrodissektionssystem und untersuchungsverfahren für nukleinsäurehaltige proben
EP2833125B1 (de) FIB-SEM Array Tomographie
DE102013216938B3 (de) Verfahren zur Kalibrierung einer Laserablenkeinrichtung einesLasermikrodissektionssystems und Lasermikrodissektionssystem
DE102012207240A1 (de) Laser-Mikrodissektionsgerät und -verfahren
DE19954933A1 (de) Anordnung zur Einkopplung einer optischen Pinzette und/oder eines Bearbeitungsstrahles in ein Mikroskop
WO2019038398A1 (de) Optische anordnung zum scannen von anregungsstrahlung und/oder manipulationsstrahlung in einem laser-scanning-mikroskop und laser-scanning-mikroskop
DE102013109481A1 (de) Lasermikrodissektionssystem und Lasermikrodissektionsverfahren
WO2019038404A1 (de) Optische anordnung zum scannen von anregungsstrahlung und/oder manipulationsstrahlung in einem laser-scanning-mikroskop und laser-scanning-mikroskop
DE102009022912B4 (de) Korrelative optische und Teilchenstrahl-Mikroskopie
DE102014202860A1 (de) Bereitstellen von Probeninformationen mit einem Lasermikrodissektionssystem
WO2014191383A1 (de) Verfahren zur lasermikrodissektion und lasermikrodissektionssystem
WO2015128447A1 (de) Lasermikrodissektionssystem und lasermikrodissektionsverfahren
DE10233549B4 (de) Scanmikroskop mit Manipulationslichtstrahl und Verfahren zur Scanmikroskopie
DE102015108276B4 (de) System zur Lasermikrodissektion und Lasermikrodissektionsverfahren
WO2014191451A1 (de) Lasermikrodissektionssystem mit visualisierungseinrichtung und verfahren zur lasermikrodissektion
DE102014203656B4 (de) Lasermikrodissektionsverfahren und Verwendung eines Lasermikrodissektionssystems
DE102016111781B3 (de) Kontaminationsschutzeinrichtung für ein Lasermikrodissektionssystem und Lasermikrodissektionssystem
EP3921619B1 (de) Verfahren zur lasermikrodissektion
DE102016111949B4 (de) Laser-Mikroskopsystem
DE102013209964B4 (de) Lasermikrodissektionssystem mit Benutzerinformationseinheit und Verfahren zur Lasermikrodissektion
DE102006009564B4 (de) Verfahren zur Bearbeitung einer Masse mittels eines Laserstrahls und entsprechende Vorrichtung
DE102020100587A1 (de) Verfahren zum Überprüfen eines Dissektiervorgangs in einem Laser-Mikrodissektionssystem und Mittel zu dessen Durchführung

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 15707125

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 15707125

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1