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Die Erfindung betrifft ein Scanmikroskop mit einer Lichtquelle, die einen Beleuchtungslichtstrahl zum Beleuchten einer Probe emittiert, der entlang eines Beleuchtungsstrahlenganges verläuft und der mit einer Strahlablenkeinrichtung über oder durch die Probe führbar ist und mit einem Detektor, der von der Probe ausgehendes Detektionslicht, das entlang eines Detektionsstrahlenganges verläuft, empfängt, und mit einer weiteren Lichtquelle, die einen Manipulationslichtstrahl, der entlang eines Manipulationsstrahlenganges verläuft, erzeugt.
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Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Scanmikroskopie.
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In der Scanmikroskopie wird eine Probe mit einem Lichtstrahl beleuchtet, um das von der Probe emittierte Reflexions- oder Fluoreszenzlicht zu beobachten. Der Fokus eines Beleuchtungslichtstrahles wird mit Hilfe einer steuerbaren Strahlablenkeinrichtung, im Allgemeinen durch Verkippen zweier Spiegel, in einer Objektebene bewegt, wobei die Ablenkachsen meist senkrecht aufeinander stehen, so dass ein Spiegel in x-, der andere in y-Richtung ablenkt. Die Verkippung der Spiegel wird beispielsweise mit Hilfe von Galvanometer-Stellelementen bewerkstelligt. Die Leistung des vom Objekt kommenden Lichtes wird in Abhängigkeit von der Position des Abtaststrahles gemessen. Üblicherweise werden die Stellelemente mit Sensoren zur Ermittlung der aktuellen Spiegelstellung ausgerüstet.
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Speziell in der konfokalen Scanmikroskopie wird ein Objekt mit dem Fokus eines Lichtstrahles in drei Dimensionen abgetastet.
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Ein konfokales Rastermikroskop umfasst im Allgemeinen eine Lichtquelle, eine Fokussieroptik, mit der das Licht der Quelle auf eine Lochblende - die sog. Anregungsblende - fokussiert wird, einen Strahlteiler, eine Strahlablenkeinrichtung zur Strahlsteuerung, eine Mikroskopoptik, eine Detektionsblende und die Detektoren zum Nachweis des Detektions- bzw. Fluoreszenzlichtes. Das Beleuchtungslicht wird über einen Strahlteiler eingekoppelt. Das vom Objekt kommende Fluoreszenz- oder Reflexionslicht gelangt über die Strahlablenkeinrichtung zurück zum Strahlteiler, passiert diesen, um anschließend auf die Detektionsblende fokussiert zu werden, hinter der sich die Detektoren befinden. Detektionslicht, das nicht direkt aus der Fokusregion stammt, nimmt einen anderen Lichtweg und passiert die Detektionsblende nicht, so dass man eine Punktinformation erhält, die durch sequentielles Abtasten des Objekts zu einem dreidimensionalen Bild führt. Meist wird ein dreidimensionales Bild durch schichtweise Bilddatennahme erzielt, wobei die Bahn des Abtastlichtstrahles auf bzw. in dem Objekt idealerweise einen Mäander beschreibt. (Abtasten einer Zeile in x-Richtung bei konstanter y-Position, anschließend x-Abtastung anhalten und per y-Verstellung auf die nächste abzutastende Zeile schwenken und dann, bei konstanter y-Position, diese Zeile in negativer x-Richtung abtasten u.s.w.). Um eine schichtweise Bilddatennahme zu ermöglichen, wird der Probentisch oder das Objektiv nach dem Abtasten einer Schicht verschoben und so die nächste abzutastende Schicht in die Fokusebene des Objektivs gebracht.
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Aus der Deutschen Offenlegungsschrift
DE 199 54 933 A1 ist eine Anordnung zur Einkopplung mindestens eines Strahles einer optischen Pinzette zum Einfangen von Teilchen und/oder zur Einkopplung eines Bearbeitungsstrahles in einen mikroskopischen Strahlengang, vorzugsweise in einem Laser-Scanning-Mikroskop, bekannt, wobei Mittel zur frei einstellbaren Veränderung der Lage des Strahlfokus der optischen Pinzette und/oder des Bearbeitungsstrahles bezüglich der Veränderung der Fokusposition des Mikroskops vorgesehen sind. In dieser Anordnung ist der Fokus des Bearbeitungsstrahles, bzw. der optischen Pinzette, durch Verschieben einer Optik im Strahlengang des Bearbeitungsstrahles, bzw. der optischen Pinzette in z-Richtung verschiebbar. Eine Verschiebung des Fokus in x-y-Richtung ist nur durch Verschieben des Objekttisches möglich. Dies ist für den Benutzer nachteilig, weil das Verschieben des Fokus zwangsläufig mit einem Wechsel des Bildausschnitts einher geht. Darüber hinaus ist ein schnelles Bewegen des Fokus nicht möglich.
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Aus der Deutschen Offenlegungsschrift
DE 100 39 520 A1 ist eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Untersuchung und Manipulation von mikroskopischen Objekten, mit einem Mikroskop, einer zur Beleuchtung des Objekts dienenden Lichtquelle, einem Beleuchtungsstrahlengang, einem zur Detektion des vom Objekt zurückkehrenden Lichts dienenden Detektor, einem Detektionsstrahlengang, einer zur Objektmanipulation dienenden Lichtquelle und einem Manipulationslichtstrahlengang offenbart. Die erfindungsgemäße Vorrichtung bzw. das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht eine dreidimensionale Untersuchung und Manipulation von Objekten, deren Ausdehnung entlang der optischen Achse größer als der Tiefenschärfenbereich des verwendeten Mikroskopobjektivs ist, wobei eine Objektmanipulation auch an allen Stellen des dreidimensionalen Objekts möglich sein soll. Darüber hinaus soll eine dreidimensionale Detektion des Objekts möglich sein, bei der eine Diskriminierung der Objektlichtbeiträge erfolgt, die von Bereichen kommen, die jenseits des Tiefenschärfenbereichs des Mikroskopobjektivs liegen. Die erfindungsgemäße Vorrichtung bzw. das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroskop ein konfokales Rastermikroskop ist. Die Vorrichtung beinhaltet eine Strahlablenkeinrichtung zum Führen des Beleuchtungslichtstrahles und eine weitere zum Führen des Manipulationslichtstrahls, wobei vorgesehen sein kann, dass die Strahlablenkvorrichtungen synchron zueinander arbeiten. Die Vorrichtung ist daher sehr flexibel und erlaubt darüber hinaus ein schnelles Bewegen des Manipulationslichtstrahls. Die Vorrichtung ist jedoch sehr aufwendig und komplex im Aufbau und der Bedienung.
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Aus der
DE 100 43 986 A1 ist bekannt, dass während einer fortlaufenden Aufnahme eines Übersichtsbilds mindestens eines Bereichs durch gezieltes, vorzugsweise zeitlich begrenztes, Zuschalten des Beleuchtungslichts einer zweiten Lichtquelle, vorzugsweise eines Lasers, eine chemische Reaktion ausgelöst wird oder Verbindungen aufgebrochen werden.
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Es ist Aufgabe der Erfindung ein Scanmikroskop anzugeben, das bei breiter Flexibilität auf einfache Weise eine Manipulation der Probe mit einem schnell bewegbaren Manipulationslichtstrahl ermöglicht.
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Diese Aufgabe wird durch ein Scanmikroskop gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass der Manipulationslichtstrahl ebenfalls von der Strahlablenkeinrichtung über oder durch die Probe führbar ist und dass der Manipulationslichtstrahl dem Beleuchtungslichtstrahl vorauseilt.
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Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung ein Verfahren zur Scanmikroskopie anzugeben mit dem einfach, unkompliziert und gleichzeitig schnell und flexibel eine Manipulation der Probe ermöglicht ist.
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Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, das die folgenden Schritte aufweist:
- • Erzeugen eines Beleuchtungslichtstrahles, der entlang eines Beleuchtungsstrahlenganges verläuft, mit einer Lichtquelle,
- • Erzeugen eines Manipulationslichtstrahls, der entlang eines Manipulationsstrahlenganges verläuft, mit einer weiteren Lichtquelle,
- • Führen des Beleuchtungslichtstrahles und des Manipulationslichtstrahls gemeinsam über oder durch eine Probe mit einer Strahlablenkeinrichtung,
- • Detektieren des von der Probe ausgehenden Detektionslichtes, das entlang eines Detektionsstrahlenganges verläuft, mit einem Detektor, dadurch gekennzeichnet, dass
- • der Manipulationslichtstrahl dem Beleuchtungslichtstrahl durch Einstellen des Winkels zwischen dem Beleuchtungslichtstrahl und dem Manipulationslichtstrahl vorauseilend geführt wird.
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Die Erfindung hat den Vorteil, dass auf einfache Weise ermöglicht wird, eine Probe gezielt in gewünschten Teilbereichen zu manipulieren und darüber hinaus gleichzeitig die Probe störungsfrei abzubilden.
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Vorteilhafter Weise ist der Manipulationsstrahlengang vom Beleuchtungsstrahlengang verschieden, wobei der Manipulationsstrahlengang und der Detektionsstrahlengang vorzugsweise nicht - auch nicht auf Teilstücken - koaxial verlaufen, sondern sich allenfalls schneiden. Diese offaxis-Einkopplung hat bei einem konfokalen Scanmikroskop zur Folge, dass Restlicht des Manipulationslichtstrahls, z.B. aufgrund von Reflexion oder Streuung, in keinem Fall zum Detektor gelangen kann, da er aufgrund des konfokalen Prinzips durch das Detektionspinhole ausgeblendet wird und so die Abbildung der Probe durch die Manipulation nicht gestört wird.
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In einer bevorzugten Ausgestaltung sind der Beleuchtungslichtstrahl und der Manipulationslichtstrahl gemeinsam über oder durch die Probe führbar. Vorzugsweise sind der und der Manipulationslichtstrahl gemeinsam zeilenweise und/oder gemeinsam mäanderförmig über oder durch die Probe führbar. Hierbei können der Beleuchtungslichtstrahl und der Manipulationslichtstrahl jeweils in derselben Zeile oder in unterschiedlichen Zeilen geführt werden. Beide Strahlen, der Beleuchtungslichtstrahl und der Manipulationslichtstrahl, werden gemeinsam von einem Objektiv auf die Probe fokussiert, wobei vorzugsweise der Fokus des Manipulationslichtstrahls dem Beleuchtungslichtstrahl auf seiner Scanbahn vorauseilt. Durch Einstellen des Winkels zwischen dem Beleuchtungslichtstrahl und dem Manipulationslichtstrahl lässt sich der Abstand der Fokusse innerhalb der Probe und bei Kenntnis der Scangeschwindigkeit der zeitliche Abstand des Eintreffens der Fokusse an einem Rasterpunkt einstellen. Dies kann besonders vorteilhaft bei FRAP-Untersuchungen (fluorescence recovery after photo-bleaching) und bei FCS-Untersuchungen (fluorescence correlated spectroscopy) ausgenutzt werden. Hierbei bleicht der Manipulationslichtstrahl die Probe zumindest partiell, wobei typischerweise einige µs danach das Verhalten der gebleichten Bereiche durch Abtasten mit dem Beleuchtungslichtstrahl untersucht wird. Der zeitliche Abstand kann erfindungsgemäß auch durch Variieren der Scangeschwindigkeit eingestellt werden; hierzu ist die Strahlablenkeinrichtung geeignet vorzugsweise über einen PC steuerbar.
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In einer anderen Variante schneidet der Manipulationslichtstrahl die Probe, was beispielsweise das Heraustrennen eines Zellkerns umfassen könnte. In einer anderen Ausführung wirkt der Manipulationslichtstrahl als optische Pinzette.
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In einer besonders bevorzugten Ausführung wird der Manipulationslichtstrahl über die Strahlablenkeinrichtung in das konfokale Scanmikroskop eingekoppelt, wobei der mögliche Drehwinkel mindestens eines der Drehspiegels, der als Galvanometerspiegel ausgeführt sein kann, ausgenutzt wird.
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Es wird vorzugsweise eine Strahlablenkeinrichtung verwendet, die insgesamt drei Drehspiegel umfasst. Ein erster Drehspiegel lenkt dabei beispielsweise in x-Richtung ab, während ein zweiter und ein dritter Drehspiegel die y-Ablenkung vornehmen, wobei der zweite Drehspiegel die Drehbewegung des dritten Drehspiegels soweit kompensiert, dass der Manipulationslichtstrahl bzw. der Beleuchtungslichtstrahl wieder in der Mitte des ersten Drehspiegels zu liegen kommt. Dadurch wird gewährleistet, dass eine perfekte Abbildung des Pivot-Punktes möglich ist. Der erste Drehspiegel kann soweit ausgelenkt werden, dass beispielsweise zuerst der Manipulationslichtstrahl auf die Probe gelenkt wird und bei weiterer Drehbewegung der Beleuchtungslichtstrahl. Dies ist vorzugsweise synchronisiert. Anstelle der Drei-Spiegel-Strahlablenkeinrichtung kann für diese besondere Ausführungsform auch jede andere Strahlablenkeinrichtung verwendet werden, bei welcher der erste Drehspiegel mindestens doppelt so weit ausgelenkt werden kann, als es für die Bildaufnahme nötig ist. Der doppelte Scanbereich wird in einer weiteren Variante auf zwei Strahlen verteilt, so dass immer nur einer gleichzeitig zur Probe gelenkt wird. Nachdem der Manipulationsstrahl die Probe beleuchtet hat, wird die gleiche Zeile mit dem Beleuchtungslichtstrahl abgerastert.
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Das Scanmikroskop ist vorzugsweise ein konfokales Scanmikroskop. Dieses kann beispielsweise punktscannend ausgeführt sein, wobei die Probe Rasterpunkt für Rasterpunkt abtastbar ist. Das Scanmikroskop kann auch zeilenscannend ausgeführt sein, wobei ganze Zeilen auf einmal beispielsweise mit einem aufgefächerten Beleuchtungslichtstrahl beleuchtbar sind und im Ganzen abgetastet werden.
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In einer besonders bevorzugten Ausführung sind Mittel zum Ein- und Ausschalten oder zum Abschwächen des Manipulationslichtstrahls und/oder des Beleuchtungslichtstrahls vorgesehen. Diese Mittel sind vorzugsweise als akustooptische Bauteile, wie beispielsweise akustooptische Modulatoren oder akustooptische Filter, ausgeführt.
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In den Zeichnungen ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben, wobei gleich wirkende Bauteile mit denselben Bezugszeichen versehen sind. Dabei zeigt:
- 1 ein erfindungsgemäßes konfokales Scanmikroskop,
- 2 die Einkopplung eines Manipulationslichtstrahls über eine Strah lablenkei nrichtung,
- 3 die Einkopplung eines Manipulationslichtstrahls über eine Strahlablenkeinrichtung,
- 4 in einer dreidimensionalen Darstellung die Einkopplung eines Manipulationslichtstrahls über eine Strahlablenkeinrichtung und
- 5 in einer dreidimensionalen Darstellung die Einkopplung eines Manipulationslichtstrahls über eine Strahlablenkeinrichtung.
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1 zeigt schematisch ein erfindungsgemäßes konfokales Scanmikroskop. Das Scanmikroskop beinhaltet eine Lichtquelle 1, die als Laser 3 ausgeführt ist. Der von dem Laser 3 emittierte Beleuchtungslichtstrahl 5 wird nach dem Passieren einer Anregungsblende 7 von einem Hauptstrahlteiler 9 zu einer Strahlablenkeinrichtung 11, die einen nicht gezeigten kardanisch aufgehängten Scanspiegel beinhaltet, reflektiert und von der Strahlablenkeinrichtung 11 durch die nicht gezeigte Scanoptik, die nicht gezeigte Tubusoptik und das nicht gezeigte Objektiv über bzw. durch die Probe 13 geführt. Die Probe 13 ist auf einem Objekttisch 29 positioniert, der von einem Motor angetrieben in Bezug auf die optische Achse des Beleuchtungsstrahlenganges axial verschiebbar ist. Das von der Probe 13 ausgehende Detektionslicht 15 gelangt auf demselben Lichtweg über die Strahlablenkeinrichtung 11 zurück zum Hauptstrahlteiler 9, passiert diesen und trifft nach Passieren der Detektionsblende 17 auf den Detektor 19, der als Photomultiplier 21 ausgeführt ist. Der Detektor 19 erzeugt elektrische Detektionssignale, die in einer nicht gezeigten Verarbeitungseinheit weiterverarbeitet werden, um beispielsweise ein anzeigbares Abbild des abgerasterten Bereichs der Probe 13 dem Benutzer anzeigen zu können.
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Eine weitere Lichtquelle 23 erzeugt einen Manipulationslichtstrahl 25, der mit einem Spiegel 27 durch den Hauptstrahlteiler 9, der für Licht der Wellenlänge des Manipulationslichtstrahls 25 durchlässig ist, auf die Strahlablenkeinrichtung 11 gelenkt wird. Diese führt den Manipulationslichtstrahl 25 gemeinsam mit dem Beleuchtungslichtstrahl 5 durch die nicht gezeigte Scanoptik, die nicht gezeigte Tubusoptik und das nicht gezeigte Objektiv über bzw. durch die Probe 13. Der Manipulationslichtstrahl 25 und der Beleuchtungslichtstrahl 5 treffen versetzt zueinander auf die Probe.
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In der Zeichnung ist der Beleuchtungslichtstrahl 5 mit einer durchgezogenen Linie dargestellt, während der Manipulationslichtstrahl 25 gestrichelt dargestellt ist.
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2 zeigt die Einkopplung eines Manipulationslichtstrahls über eine Strahlablenkeinrichtung 11, die insgesamt drei Drehspiegel umfasst. Ein erster Drehspiegel 31 lenkt dabei beispielsweise in x-Richtung ab, während ein zweiter Drehspiegel 33 und ein dritter Drehspiegel 35 die y-Ablenkung vornehmen, wobei der zweite Drehspiegel 33 die Drehbewegung des dritten Drehspiegels 35 soweit kompensiert, dass der Manipulationslichtstrahl 25 bzw. der Beleuchtungslichtstrahl 5 in der Mitte des ersten Drehspiegels 31 zum Liegen kommt. Dadurch wird gewährleistet, dass eine perfekte Abbildung des Pivot-Punktes möglich ist. Der erste Drehspiegel 31 kann soweit ausgelenkt werden, dass beispielsweise zuerst der Manipulationslichtstrahl 25 auf die Probe 13 gelenkt wird und bei weiterer Drehbewegung der Beleuchtungslichtstrahl 5. Dies ist vorzugsweise synchronisiert.
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3 zeigt die in 2 beschriebene Einkopplung eines Manipulationslichtstrahls über eine Strahlablenkeinrichtung 11 in der Stellung, in der der Manipulationslichtstrahl 25 auf die Probe trifft.
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4 und 5 zeigen in dreidimensionalen Darstellungen die Einkopplung eines Manipulationslichtstrahls 25 über eine Strahlablenkeinrichtung 11. Zusätzlich sind schematisch eine erste Strahlfalle 37 und eine zweite Strahlfalle 39 eingezeichnet.
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Bezugszeichenliste
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- 1
- Lichtquelle
- 3
- Laser
- 5
- Beleuchtungslichtstrahl
- 7
- Anregungsblende
- 9
- Hauptstrahlteiler
- 11
- Strahlablenkeinrichtung
- 13
- Probe
- 15
- Detektionslicht
- 17
- Detektionsblende
- 19
- Detektor
- 21
- Photomultiplier
- 23
- Lichtquelle
- 25
- Manipulationslichtstrahl
- 27
- Spiegel
- 29
- Objekttisch
- 31
- erster Drehspiegel
- 33
- zweiter Drehspiegel
- 35
- dritter Drehspiegel
- 37
- erste Strahlfalle
- 39
- zweite Strahlfalle
