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Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Untersuchung und Manipulation von mikroskopischen Objekten, mit einem Mikroskop, mit einer zur Beleuchtung des Objekts dienenden Lichtquelle, die einen entlang eines Beleuchtungsstrahlengangs verlaufenden Beleuchtungslichtstrahl erzeugt, der mittels einer Strahlablenkeinrichtung über und/oder durch das Objekt führbar ist, mit einem Detektor zur Detektion des von dem Objekt ausgehenden Lichts, das entlang eines Detektionstrahlengangs verläuft, mit einem Hauptstrahlteiler und mit einer zur Manipulation des Objekts dienenden Lichtquelle, die einen entlang eines Manipulationsstrahlengangs verlaufenden Manipulationslichtstrahl erzeugt.
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In der Scanmikroskopie werden zu untersuchende Objekte mit einem Beleuchtungslichtstrahl beleuchtet und das von dem Objekt emittierte Reflexions- oder Fluoreszenzlicht beobachtet. Der Fokus des Beleuchtungslichtstrahls wird mit Hilfe einer steuerbaren Strahlablenkeinrichtung, im Allgemeinen durch Verkippen zweier Spiegel, in einer Objektebene bewegt, wobei die Ablenkachsen im Allgemeinen senkrecht aufeinanderstehen, so dass ein Spiegel in x-, der andere in y-Richtung ablenkt. Die Verkippung der Spiegel wird beispielsweise mit Hilfe von Galvanometer-Stellelementen bewerkstelligt. Die Leistung des vom Objekt ausgehenden Lichts wird in Abhängigkeit von der Abtastposition des Beleuchtungslichtstrahls gemessen.
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Speziell in der konfokalen Scanmikroskopie wird ein Objekt mit dem Fokus eines Lichtstrahls in drei Dimensionen abgetastet.
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Ein konfokales Scanmikroskop umfasst im Allgemeinen eine Lichtquelle, eine Fokussieroptik, mit der das Licht der Quelle auf eine Lochblende – die sog. Anregungsblende – fokussiert wird, einen Hauptstrahlteiler, eine Strahlablenkeinrichtung zur Strahlsteuerung, eine Detektionsblende und mindestens einen Detektor zum Nachweis des von dem Objekt emittierten Reflexions- und/oder Fluoreszenzlichts. Der Hauptstrahlteiler, über den der Beleuchtungslichtstrahl eingekoppelt wird, ist derart ausgeführt, dass das Beleuchtungslicht im Wesentlichen reflektiert wird, wohingegen das vom Objekt kommende Reflexions- und/oder Fluoreszenzlicht den Hauptstrahlteiler im Wesentlichen passiert.
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Vorrichtungen der gattungsbildenden Art, die die Möglichkeit der Objektmanipulation bieten, werden insbesondere in der Zellbiologie eingesetzt, um beispielsweise das Innere ungeöffneter Zellen ungehindert zu manipulieren. Hierbei sind vor allem zwei unterschiedliche Manipulationsvorgänge üblich. Einerseits werden Objekte oder Objektbereiche mit fokussiertem Infrarotlicht beleuchtet, wodurch einzelne Partikel der Objekte bzw. Objektbereiche in der Nähe des Manipulationsfokus eingefangen und bei Veränderung der Position des Manipulationsfokus in der Fokalebene mit dem Fokus mitbewegt werden (optische Pinzette), so dass diese beispielsweise mit einer Kraft beaufschlagbar sind. Wird ein Objektbereich mit gepulstem, fokussiertem UV-Licht beaufschlagt, so kann biologisches Material aufgrund einer hohen Energiedichte des UV-Lichts mit hoher räumlicher Auflösung zerschnitten oder perforiert werden (Nano-Skalpell).
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Eine Vielzahl weiterer Anwendungen, bei der in der Scanmikroskopie zusätzlich zu dem Beleuchtungslichtstrahl ein Manipulationslichtstrahl zur Objektmanipulation eingesetzt wird, ist bekannt.
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In der
DE 100 39 520 A1 ist eine Vorrichtung zur Untersuchung und Manipulation von mikroskopischen Objekten beschrieben, bei der der Manipulationslichtstrahl und der Beleuchtungslichtstrahl mittels eines Scanspiegels einer Strahlablenkeinrichtung zusammengeführt werden. Der Scanspiegel ist dabei für das Licht der Manipulationslichtquelle transparent ausgeführt und reflektiert das Licht der Beleuchtungslichtquelle. Die bekannte Vorrichtung ist dahingehend nachteilig, dass insgesamt zwei Strahlablenkeinrichtungen erforderlich sind, wobei die eine Strahlablenkeinrichtung den Manipulationslichtstrahl und die andere Strahlablenkeinrichtung den Beleuchtungslichtstrahl steuert. Die Notwendigkeit zweier Strahlablenkeinrichtungen macht die bekannte Vorrichtung zum einen teuer in der Herstellung und zum anderen aufwendig in der Bedienung, da die beiden Strahlablenkeinrichtungen exakt synchronisiert werden müssen, um den Strahlwinkel zwischen Manipulationslichtstrahl und Beleuchtungslichtstrahl über den gesamten Scanvorgang hinweg konstant zu halten.
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Aus der
DE 102 33 549 A1 ist ebenfalls ein Scanmikroskop mit Manipulations- und Beleuchtungslichtstrahl bekannt, wobei die Vereinigung beider Lichtstrahlen hier mit Hilfe des Hauptstrahlteilers vorgenommen wird. Der Hauptstrahlteiler dient in erster Linie zur Separation von Beleuchtungslichtstrahl und Detektionslichtstrahl. Dazu ist der Hauptstrahlteiler im Allgemeinen entweder als Bandpass- oder Kantenfilter oder als teildurchlässige Neutralteiler ausgebildet, die das Licht des Beleuchtungslichtstrahls reflektieren und das Licht des Detektionslichtstrahls passieren lassen. Da die spektralen Kanten des Strahlteilers nicht unendlich steil sind, sondern einen gewissen Anstieg aufweisen, können bei einer zusätzlichen Einkopplung des Manipulationslichtstrahls die Wellenlängen bzw. Wellenlängenbereiche des Beleuchtungslichts, des Detektionslichts sowie des Manipulationslichts unter Umständen nur aus einem eng begrenzten Bereich ausgewählt werden, um exakt auf die spektralen Eigenschaften des Hauptstrahlteilers abgestimmt zu sein.
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Aus der
DE 102 47 249 A1 ist eine Vorrichtung zur Untersuchung und Manipulation von mikroskopischen Objekten bekannt, bei der eine Einrichtung zur Einkopplung eines Manipulationslichtstrahls als ein in den Beleuchtungsstrahlengang geführt einbringbarer Klappspiegel ausgeführt ist. Der Klappspiegel ist als dielektrisch beschichteter Spiegel ausgeführt, der den Beleuchtungslichtstrahl im Wesentlichen ungehindert passieren lässt, so dass dieser gemeinsam mit dem Manipulationslichtstrahl zur Probe gelangt.
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Aus der
DE 100 43 986 A1 ist ein konfokales Scan-Mikroskop bekannt, mit einer Strahlablenkungseinrichtung, einem Hauptstrahlteiler sowie einem Beleuchtungslichtstrahl. Zusätzlich weist das Mikroskop einen Manipulationslichtstrahl auf, der gezielt zugeschaltet werden kann und der mit Hilfe eines unmittelbar im Strahlengang angeordneten Strahlteilers bzw. Strahlvereinigers mit dem Beleuchtungslichtstrahl vereinigt wird.
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Aus der
DE 100 33 269 A1 ist eine Vorrichtung bekannt zum Einkoppeln von Licht mindestens einer Wellenlänge einer Laserlichtquelle in einen optischen Aufbau, umfassend eine Strahlablenkeinrichtung und einen Hauptstrahlteiler.
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Der vorliegenden Erfindung liegt nunmehr die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung zur Untersuchung und Manipulation von mikroskopischen Objekten anzugeben, die bei einfacher Konstruktion und mit geringem Justageaufwand eine flexible und zuverlässige Objektmanipulation ermöglicht.
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Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Untersuchung und Manipulation von mikroskopischen Objekten löst die voranstehende Aufgabe einerseits durch die Merkmale des Patentanspruchs 1. Danach ist die eingangs genannte Vorrichtung, bei der im Beleuchtungsstrahlengang zusätzlich zu der Strahlablenkeinrichtung und dem Hauptstrahlteiler eine Einrichtung zur Einkopplung des Manipulationslichtstrahls vorgesehen ist, dadurch gekennzeichnet, dass die Einrichtung zur Einkopplung des Manipulationslichtstrahls als Spiegel mit nachgeschalteter Spreizoptik ausgeführt ist, wobei der Spiegel beabstandet zum Beleuchtungslichtstrahl angeordnet ist und die Spreizoptik derart justierbar ist, dass der Strahlwinkel zwischen Beleuchtungslichtstrahl und Manipulationslichtstrahl veränderbar ist.
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In erfindungsgemäßer Weise ist zunächst erkannt worden, dass im Hinblick auf die Objektmanipulation eine hohe Flexibilität dadurch erreichbar ist, dass die Einkopplung des Manipulationslichtstrahls – räumlich und funktional – von der Strahlablenkeinrichtung und dem Hauptstrahlteiler separiert wird. In weiter erfindungsgemäßer Weise wird eine derartige Separierung dadurch erreicht, dass im Beleuchtungsstrahlengang eine zusätzliche Einrichtung vorgesehen ist, die speziell zur Einkopplung des Manipulationslichtstrahls dient. Somit ist es bspw. möglich, die spektralen Eigenschaften des Manipulationslichtstrahls in einem weiten Bereich frei zu wählen, ohne dabei die spektrale Zusammensetzung des Beleuchtungs- und des Detektionslichts berücksichtigen zu müssen.
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Erfindungsgemäß ist die Einrichtung zur Einkopplung des Manipulationslichtstrahls als Spiegel mit nachgeschalteter Spreizoptik ausgeführt. Durch eine derartige Ausgestaltung lassen sich störende Einflüsse, wie beispielsweise Teilreflexionen, Abbildungsfehler, Geisterbilder, Interferenzen, etc., die beim Einsatz eines Strahlteilers sowohl für den transmittierten als auch für den reflektierten Lichtstrahl auftreten können, weitestgehend vermeiden. Zur Vermeidung einer störenden Beeinflussung des Beleuchtungslichtstrahls durch den Spiegel kann dieser derart positioniert sein, dass er den Manipulationslichtstrahl in einer Weise umlenkt, die eine Positionierung des Spiegels in einem genügend großen Abstand zur optischen Achse erlaubt. Die dem Spiegel nachgeschaltete Spreizoptik, die im Wesentlichen eine Anordnung mehrerer Linsen umfasst, kann dann derart ausgeführt sein, dass sie den Strahlwinkel zwischen Beleuchtungslichtstrahl und Manipulationslichtstrahl in einem gewünschten Maß verkleinert.
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Weiter erfindungsgemäß ist eine Justierbarkeit der Spreizoptik vorgesehen, so dass sich eine Einstellbarkeit des Strahlwinkels zwischen den aus der Spreizoptik austretenden Lichtstrahlen ergibt. So könnte die Spreizoptik beispielsweise entlang der optischen Achse verschiebbar ausgeführt sein. Eine Veränderung des Strahlwinkels bewirkt gleichzeitig eine Veränderung des Abstandes auf dem Objekt, mit dem der Manipulationslichtstrahl dem Beleuchtungslichtstrahl bspw. vorauseilt.
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Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform kann zudem auch eine Justierbarkeit des Spiegels vorgesehen sein, derart, dass der Strahlwinkel zwischen Beleuchtungslichtstrahl und Manipulationslichtstrahl veränderbar ist. Beispielsweise könnte der Spiegel rotierbar ausgeführt sein.
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Die eingangs genannte Aufgabe wird des Weiteren durch eine Vorrichtung mit den Merkmalen des Patentanspruchs 3 gelöst. Danach ist die eingangs genannte Vorrichtung dadurch gekennzeichnet, dass der Manipulationslichtstrahl mittels eines akustooptischen Elements einkoppelbar ist, wobei das akustooptische Element als Bestandteil des Hauptstrahlteilers im Beleuchtungsstrahlengang angeordnet ist.
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In erfindungsgemäßer Weise ist zunächst erkannt worden, dass eine hohe Flexibilität im Hinblick auf die Einkopplung des Manipulationslichtstrahls auch ohne zusätzliches Bauteil erreicht werden kann, nämlich dann, wenn im Beleuchtungslichtstrahl ein akustooptisches Element zur Separation des Beleuchtungslichtstrahls und des Detektionslichtstrahls vorgesehen ist. In weiter erfindungsgemäßer Weise ist sodann erkannt worden, dass das akustooptische Element derart geschaltet werden kann, dass es – über die eigentliche Funktion der Separation des Beleuchtungslichtstrahls und des Detektionslichtstrahls hinaus – zur Einkopplung des Manipulationslichtstrahls dient. Dabei macht sich die erfindungsgemäße Vorrichtung u.a. die Tatsache zunutze, dass das akustooptische Element keine „Kantenfiltercharakteristik“ aufweist und somit eine hochauflösende Steuerung der Lichtstrahlen ermöglicht.
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In vorteilhafter Weise handelt es sich bei dem akustooptischen Element um einen AOBS (acousto optical beam splitter).
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In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass der AOBS derart schaltbar ist, dass der Manipulationslichtstrahl nach Passieren des AOBS – bei geeigneter Einkopplung in den AOBS – auf der optischen Achse des Mikroskops liegt. Auf diese Weise kann an dem Scanmikroskop ein zusätzlicher Port für sichtbares Licht bereitgestellt werden. Dieser Port weist eine AOBS-Charakteristik auf und kann entsprechend den Anforderungen konkreter Anwendungen konfiguriert werden.
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Es gibt nun verschiedene Möglichkeiten, die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die den Patentansprüchen 1 und 3 nachgeordneten Patentansprüche, andererseits auf die nachfolgende Erläuterung bevorzugter Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung zu verweisen. In Verbindung mit der Erläuterung der bevorzugten Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung werden auch im Allgemeinen bevorzugte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert. In der Zeichnung zeigen
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1 eine schematische Darstellung eines ersten Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Untersuchung und Manipulation von mikroskopischen Objekten und
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2 eine schematische Darstellung eines zweiten Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit einem akustooptischen Strahlteiler.
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1 zeigt schematisch einen Teil einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Untersuchung und Manipulation von mikroskopischen Objekten. Ein von einem Hauptstrahlteiler (nicht gezeigt) kommender Beleuchtungslichtstrahl 1 ist mit einer durchgezogenen Linie dargestellt. In einem Abstand zum Beleuchtungslichtstrahl 1 ist ein Spiegel 2 angeordnet, wobei der Abstand so gewählt ist, dass der Beleuchtungslichtstrahl 1 nicht beeinflusst wird. Ein Manipulationslichtstrahl 3, der zur Manipulation des zu untersuchenden Objekts dient, wird von dem Spiegel 2 reflektiert und auf eine Spreizoptik 4 gelenkt. Die Spreizoptik 4 umfasst eine Anzahl von Linsen, die derart angeordnet sind, dass sie den Beleuchtungslichtstrahl 1 und den Manipulationslichtstrahl 3 aufweiten und gleichzeitig den Strahlwinkel zwischen dem Beleuchtungslichtstrahl 1 und dem Manipulationslichtstrahl 3 verkleinern. Der Beleuchtungslichtstrahl 1 und der Manipulationslichtstrahl 3 treten somit unter einem kleinen Strahlwinkel aus der Spreizoptik 4 aus, wobei der Manipulationslichtstrahl 3 dem Beleuchtungslichtstrahl 1 vorauseilt. Beide Lichtstrahlen 1, 3 werden einer Strahlablenkeinrichtung (nicht gezeigt) zugeführt, mit der die Lichtstrahlen 1, 3 über bzw. durch das zu untersuchende Objekt geführt werden.
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Es sei angemerkt, dass der Strahlwinkel und damit der Abstand der beiden Lichtstrahlen 1, 3 auf dem Objekt in Abhängigkeit von den Anforderungen der jeweiligen konkreten Anwendung veränderbar sind. Dazu kann entweder der Spiegel 2 rotiert oder die Spreizoptik 4 bzw. einzelne Linsen der Spreizoptik 4 entlang der optischen Achse 5 verschoben werden.
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2 zeigt in einer schematischen Darstellung wiederum den Beleuchtungslichtstrahl 1 (durchgezogene Linie) sowie den einzukoppelnden Manipulationslichtstrahl 3 (gestrichelte Linie). Im Strahlengang des Beleuchtungslichtstrahls 1 ist ein akustooptisches Element 6 angeordnet, welches als AOBS 7 ausgeführt ist. In Abhängigkeit von der an das akustooptische Element 6 angelegten Hochfrequenz 8 können bestimmte Wellenlängen oder Wellenlängenbereiche gezielt beeinflusst werden, während andere Wellenlängen oder Wellenlängenbereiche das akustooptische Element 6 ungehindert passieren. In der in 2 dargestellten Vorrichtung ist der AOBS 7 derart abgestimmt, dass der Beleuchtungslichtstrahl 1 und der Manipulationslichtstrahl 3 den AOBS 7 unter einem kleinen relativen Strahlwinkel verlassen, wobei wiederum der Manipulationslichtstrahl 3 dem Beleuchtungslichtstrahl 1 vorauseilt.
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Bezugszeichenliste
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- 1
- Beleuchtungslichtstrahl
- 2
- Spiegel
- 3
- Manipulationslichtstrahl
- 4
- Spreizoptik
- 5
- optische Achse
- 6
- akustooptisches Element
- 7
- AOBS
- 8
- Hochfrequenz
