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Die Erfindung betrifft ein Scanmikroskop
mit einer Lichtquelle, die einen Beleuchtungslichtstrahl zum Beleuchten
einer Probe emittiert, der entlang eines Beleuchtungsstrahlenganges
verläuft
und der mit einer Strahlablenkeinrichtung über und/oder durch die Probe
führbar
ist und mit einem Detektor, der von der Probe ausgehendes Detektionslicht,
das entlang eines Detektionsstrahlenganges verläuft, empfängt, und mit einer weiteren
Lichtquelle, die einen Manipulationslichtstrahl emittiert.
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In der Scanmikroskopie wird eine
Probe mit einem Lichtstrahl beleuchtet, um das von der Probe emittierte
Reflexions- oder Fluoreszenzlicht zu beobachten. Der Fokus eines
Beleuchtungslichtstrahles wird mit Hilfe einer steuerbaren Strahlablenkeinrichtung,
im Allgemeinen durch Verkippen zweier Spiegel, in einer Objektebene
bewegt, wobei die Ablenkachsen meist senkrecht aufeinander stehen,
so dass ein Spiegel in x-, der andere in y-Richtung ablenkt. Die
Verkippung der Spiegel wird beispielsweise mit Hilfe von Galvanometer-Stellelementen
bewerkstelligt. Die Leistung des vom Objekt kommenden Lichtes wird
in Abhängigkeit
von der Position des Abtaststrahles gemessen. Üblicherweise werden die Stellelemente
mit Sensoren zur Ermittlung der aktuellen Spiegelstellung ausgerüstet.
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Speziell in der konfokalen Scanmikroskopie wird
ein Objekt mit dem Fokus eines Lichtstrahles in drei Dimensionen
abgetastet.
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Ein konfokales Rastermikroskop umfasst
im Allgemeinen eine Lichtquelle, eine Fokussieroptik, mit der das
Licht der Quelle auf eine Lochblende – die sog. Anregungsblende – fokussiert
wird, einen Strahlteiler, eine Strahlablenkeinrichtung zur Strahlsteuerung,
eine Mikroskopoptik, eine Detektionsblende und die Detektoren zum
Nachweis des Detektions- bzw. Fluoreszenzlichtes. Das Beleuchtungslicht wird über einen
Strahlteiler eingekoppelt. Das vom Objekt kommende Fluoreszenz-
oder Reflexionslicht gelangt über
die Strahlablenkeinrichtung zurück
zum Strahlteiler, passiert diesen, um anschließend auf die Detektionsblende
fokussiert zu werden, hinter der sich die Detektoren befinden. Detektionslicht,
das nicht direkt aus der Fokusregion stammt, nimmt einen anderen
Lichtweg und passiert die Detektionsblende nicht, so dass man eine
Punktinformation erhält,
die durch sequentielles Abtasten des Objekts zu einem dreidimensionalen
Bild führt.
Meist wird ein dreidimensionales Bild durch schichtweise Bilddatennahme
erzielt, wobei die Bahn des Abtastlichtstrahles auf bzw. in dem
Objekt Idealerweise einen Mäander
beschreibt. (Abtasten einer Zeile in x-Richtung bei konstanter y-Position,
anschließend
x-Abtastung anhalten und per y-Verstellung
auf die nächste
abzutastende Zeile schwenken und dann, bei konstanter y-Position,
diese Zeile in negativer x-Richtung abtasten u.s.w.). Um eine schichtweise
Bilddatennahme zu ermöglichen,
wird der Probentisch oder das Objektiv nach dem Abtasten einer Schicht
verschoben und so die nächste
abzutastende Schicht in die Fokusebene des Objektivs gebracht.
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Aus der Deutschen Offenlegungsschrift
DE 199 54 933 A1 ist
eine Anordnung zur Einkopplung mindestens eines Strahles oder einer
optischen Pinzette zum Einfangen von Teilchen und/oder zur Einkopplung
eines Bearbeitungsstrahles in einen mikroskopischen Strahlengang,
vorzugsweise in einem Laser-Scanning-Mikroskop,
bekannt, wobei Mittel zur frei einstellbaren Veränderung der Lage des Strahlfokus
der optischen Pinzette und/oder des Bearbeitungsstrahles bezüglich der
Veränderung
der Fokusposition des Mikroskops vorgesehen sind. In dieser Anordnung
ist der Fokus des Bearbeitungsstrahles, bzw. der optischen Pinzette,
durch Verschieben einer Optik im Strahlengang des Bearbeitungsstrahles, bzw.
der optischen Pinzette in z-Richtung verschiebbar. Eine Verschiebung
des Fokus in x-y-Richtung ist nur durch Verschieben des Objekttisches
möglich. Dies
ist für
den Benutzer nachteilig, weil das Verschieben des Fokus zwangsläufig mit
einem Wechsel des Bildausschnitts einher geht. Darüber hinaus
ist ein schnelles Bewegen des Fokus nicht möglich.
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Aus der Deutschen Offenlegungsschrift
DE 100 39 520 A1 ist
eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Untersuchung und Manipulation
von mikroskopischen Objekten, mit einem Mikroskop, einer zur Beleuchtung
des Objekts dienenden Lichtquelle, einem Beleuchtungsstrahlengang,
einem zur Detektion des vom Objekt zurückkehrenden Lichts dienenden
Detektor, einem Detektionsstrahlengang, einer zur Objektmanipulation
dienenden Lichtquelle und einem Manipulationslichtstrahlengang offenbart.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung
bzw. das erfindungsgemäße Verfahren
ermöglicht
eine dreidimensionale Untersuchung und Manipulation von Objekten,
deren Ausdehnung entlang der optischen Achse größer als der Tiefenschärfenbereich
des verwendeten Mikroskopobjektivs ist, wobei eine Objektmanipulation
auch an allen Stellen des dreidimensionalen Objekts möglich sein
soll. Darüber
hinaus soll eine dreidimensionale Detektion des Objekts möglich sein,
bei der eine Diskriminierung der Objektlichtbeiträge erfolgt,
die von Bereichen kommen, die jenseits des Tiefenschärfenbereichs
des Mikroskopobjektivs liegen. Die erfindungsgemäße Vorrichtung bzw. das erfindungsgemäße Verfahren
ist dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroskop ein konfokales Rastermikroskop
ist. Die Vorrichtung beinhaltet eine Strahlablenkeinrichtung zum
Führen
des Beleuchtungslichtstrahles und eine weitere zum Führen des
Manipulationslichtstrahls, wobei vorgesehen sein kann, dass die
Strahlablenkvorrichtungen synchron zueinander arbeiten. Die Vorrichtung
ist daher sehr flexibel und erlaubt darüber hinaus ein schnelles Bewegen
des Manipulationslichtstrahls. Die Vorrichtung ist jedoch sehr aufwendig
und komplex im Aufbau und der Bedienung.
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Es ist Aufgabe der Erfindung ein
Scanmikroskop anzugeben, das bei breiter Flexibilität auf einfache
Weise eine Manipulation der Probe mit einem schnell bewegbaren Manipulationslichtstrahl
ermöglicht.
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Diese Aufgabe wird durch ein Scanmikroskop
gelöst,
das dadurch gekennzeichnet ist, dass ein in den Beleuchtungsstrahlengang
geführt
einbringbarer Spiegel vorgesehen ist, der den Manipulationslichtstrahl über die
Strahlablenkeinrichtung auf die Probe lenkt.
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Die Erfindung hat den Vorteil, dass
auf einfache Weise eine Manipulation der Probe ermöglicht ist,
ohne die Justierung des Beleuchtungsstrahlenganges des Scanmikroskops
zu beeinflussen. Da der Manipulationslichtstrahl von derselben Strahlablenkeinrichtung über bzw.
durch die Probe geführt
wird, wie der Beleuchtungslichtstrahl, ist das erfindungsgemäße Scanmikroskop
besonders einfach und kostengünstig
herstellbar, wobei eine weitere Strahlablenkeinrichtung gänzlich verzichtbar
ist.
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In einer besonderen Ausführung ist
der Spiegel als Klappspiegel ausgeführt. Der Spiegel beeinflusst
in einer Grundstellung den Beleuchtungsstrahlengang nicht. In dieser
Grundstellung passiert der Beleuchtungslichtstrahl den Spiegel ungehindert. Wenn
der Spiegel in den Beleuchtungsstrahlengang eingebracht ist, lenkt
er den Manipulationslichtstrahl zu der Strahlablenkeinrichtung,
die den Beleuchtungslichtstrahl über
bzw. durch die Probe führt.
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In der Regel wird der klappbare Spiegel
nach einem Schaltvorgang einige Zeit ausschwingen. Diese Zeit wird
beim Einblenden des Manipulationsstrahls vorzugsweise abgewartet,
da sich die Schwingungen als Lageänderungen auf der Probe störend bemerkbar
machen würden.
Der Spiegel ist vorzugsweise schwingungsfrei gelagert, so dass bei Einbringen
(Herausklappen) keine störenden Schwingungen
und Vibrationen erzeugt werden, die sich in störender Weise auf das Scanmikroskop übertragen.
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In einer bevorzugten Ausgestaltung
ist vorgesehen, dass der in den Beleuchtungsstrahlengang eingebrachte
Spiegel in dieser Stellung den Beleuchtungslichtstrahl automatisch
unterbricht. Ein großer Vorteil
dieser Ausgestaltung ist, dass während
des Manipulierens der Probe – nämlich dann
wenn durch den Manipulationslichtstrahl Licht einer hohen Lichtleistung
(z.B. 488 nm; 200 mW) in die Strahlengänge des Scanmikroskops eingetragen
werden – die
Detektoren, die beispielsweise empfindliche Photomultiplier sein
können,
von dem Spiegel abgedeckt sind und folglich geschont werden, da diese
nicht mit Restlicht des Manipulationslichtstrahl beaufschlagt bzw.
geblendet werden, was beispielsweise zu einer längeren Todzeit der Photomultiplier
führen
würde und
wodurch eine schnelle Messung verhindert werden würde. In
dieser Ausgestaltung ist der Spiegel für den Beleuchtungslichtstrahl
undurchlässig
und kann vorzugsweise eine Metallbeschichtung aufweisen.
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In einer anderen Ausgestaltung ist
der Spiegel für
den Beleuchtungslichtstrahl zumindest teilweise transparent. In
dieser Ausgestaltung sind der Beleuchtungslichtstrahl und der Manipulationslichtstrahl gemeinsam über und/oder
durch die Probe führbar, wobei
der Spiegel derart einstellbar ist, dass der Manipulationslichtstrahl
dem Beleuchtungslichtstrahl auf einer Scanbahn vorauseilt. Auf die
Weise kann man eine Recovery-Messung nach einem Vorlaufbleichen durchführen. Vorzugsweise
ist der Spiegel in dieser Ausgestaltung als dielektrischer Spiegel,
der für
den Beleuchtungslichtstrahl weitgehend transparent ist, während er
für den
Manipulationslichtstrahl vorzugsweise hochreflektierend ist. Der
Spiegel kann beispielsweise auch als teildurchlässiger Metallspiegel ausgeführt sein.
In dieser Ausführungsform
wird zusammen mit dem Klappspiegel ein Kompensationselement zum
Ausgleich eines Parallelstrahlversatzes des Beleuchtungslichtstrahls
in den Beleuchtungsstrahlengang eingebracht.
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Vorzugsweise ist der Beleuchtungslichtstrahl auf
einer Scanbahn über
und/oder durch die Probe führbar,
wobei die Scanbahn vorzugsweise weitgehend mäanderförmig oder sinusförmig ist.
Der Manipulationslichtstrahl ist insbesondere in der Ausgestaltungsvariante,
in der der Spiegel für
den Beleuchtungslichtstrahl zumindest teilweise transparent ist, vorzugsweise
gemeinsam mit dem Beleuchtungslichtstrahl auf derselben oder einer
parallelen Scanbahn führbar.
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In einer anderen bevorzugten Variante
besteht der Klappspiegel aus einem Polarisations-Strahlteiler. In
dieser Variante ist der Manipulationsstrahl beispielsweise senkrecht
polarisiert und wird am Strahlteiler reflektiert, während der
Beleuchtungslichtstrahl die gleiche Wellenlänge hat, allerdings parallel
polarisiert ist, und somit vom Strahlteiler nahezu ohne Verluste transmittiert
wird. Für
das Fluoreszenzlicht ist der Strahlteiler ebenfalls hoch transmittierend.
Bei der Wahl eines Strahlteilenwürfels
entfällt
das zusätzliche
Kompensationselement zum Ausgleich eines Parallelstrahlversatzes.
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In der Ausgestaltungsvariante, in
der der Spiegel den Beleuchtungslichtstrahl unterbricht, kann die
Strahlablenkeinrichtung den Manipulationsstrahl auf jeder beliebigen
beispielsweise vom Benutzer vorgegebenen – von der Scanbahn des Beleuchtungslichtstrahls
abweichenden – anderen
Scanbahn über
die Probe führen.
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Der Spiegel ist in einer ganz besonders
bevorzugten Ausgestaltung motorisch angetrieben, wobei der motorische
Antrieb vorzugsweise einen Stellmotor oder ein Galvanometer beinhaltet.
Ein Galvanometer hat den Vorteil, dass es ein schnelles Einbringen
und ein schnelles Herausbringen des Spiegels ermöglicht, so dass selbst im Takt
von Bruchteilen von Sekunden der Manipulationslichtstrahl ein- bzw.
zugeschaltet werden kann.
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In einer Variante bleicht der Manipulationslichtstrahl
die Probe zumindest partiell. In einer anderen Variante schneidet
der Manipulationslichtstrahl die Probe, was beispielsweise das Heraustrennen
eines Zellkerns umfassen könnte.
In einer anderen Ausführung
wirkt der Manipulationslichtstrahl als optische Pinzette. Denkbar
ist auch eine Beeinflussung der Probe durch Mehr-Photonen-Anregung oder durch Bestrahlung
mit UV-Licht.
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Das Scanmikroskop ist vorzugsweise
ein konfokales Scanmikroskop. Dieses kann beispielsweise punktscannend
ausgeführt
sein, wobei die Probe Rasterpunkt für Rasterpunkt abtastbar ist.
Das Scanmikroskop kann auch zeilenscannend ausgeführt sein,
wobei ganze Zeilen auf einmal beispielsweise mit einem aufgefächerten
Beleuchtungslichtstrahl beleuchtbar sind und im Ganzen abgetastet werden.
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In einer besonders bevorzugten Ausführung sind
Mittel zum Ein- und Ausschalten oder zum Abschwächen des Manipulationslichtstrahls
und/oder des Beleuchtungslichtstrahls vorgesehen. Diese Mittel sind
vorzugsweise als akustooptische Bauteile, wie beispielsweise akustooptische
Modulatoren oder akustooptische Filter, ausgeführt. Vorzugsweise ist eine
Zoomoptik im Manipulationsstrahlengang vorgesehen, mit der eine Änderung
der Fokussierung des Manipulationslichtes vorgenommen werden kann.
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In den Zeichnungen ist der Erfindungsgegenstand
schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend
beschrieben, wobei gleich wirkende Bauteile mit denselben Bezugszeichen
versehen sind. Dabei zeigen:
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1 ein
erfindungsgemäßes Scanmikroskop,
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2 ein
Detail des erfindungsgemäßen Scanmikroskops,
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3 ein
weiteres Detail des erfindungsgemäßen Scanmikroskops.
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1 zeigt
schematisch ein erfindungsgemäßes konfokales
Scanmikroskop. Das Scanmikroskop beinhaltet eine Lichtquelle 1,
die als Laser 3 ausgeführt
ist. Der von dem Laser 3 emittierte Beleuchtungslichtstrahl 5 ist
mit der Optik 7 auf eine Anregungsblende 9 fokussiert
und wird nach dem Passieren der Anregungsblende 9 von einem
Hauptstrahlteiler 11 zu einer Strahlablenkeinrichtung 13, die
einen kardanisch aufgehängten
Scanspiegel 15 beinhaltet, reflektiert und von der Strahlablenkeinrichtung 13 durch
eine Scanoptik 17, eine Tubusoptik 19 und ein
Objektiv 21 über
bzw. durch die Probe 23 geführt. Die Probe 23 ist
auf einem Objekttisch 25 positioniert, der von einem Motor
angetrieben in Bezug auf die optische Achse des Beleuchtungsstrahlenganges
axial verschiebbar ist. Das von der Probe 23 ausgehende
Detektionslicht 27 gelangt auf demselben Lichtweg über das
Objektiv 21, die Tubusoptik 19, die Scanoptik 17,
und die Strahlablenkeinrichtung 13 zurück zum Hauptstrahlteiler 11,
passiert diesen und trifft nach Passieren der Detektionsblende 29 auf den
Detektor 31, der als Photomultiplier 33 ausgeführt ist.
Der Detektor 31 erzeugt elektrische Detektionssignale,
die in einer Verarbeitungseinheit 35 weiterverarbeitet
werden, um beispielsweise ein anzeigbares Abbild 37 des
abgerasterten Bereichs der Probe 23 dem Benutzer auf dem
Monitor 39 eines PCs 41 anzeigen zu können.
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Eine weitere Lichtquelle 43,
die als Pulslaser 45 ausgeführt ist, erzeugt einen Manipulationslichtstrahl 47,
der auf einen Spiegel 49, der als Klappspiegel 51 ausgeführt ist,
trifft. Der Spiegel 49 lässt den Beleuchtungslichtstrahl 5 in
der gepunktet eingezeichneten Stellung ungehindert passieren und
lenkt den Manipulationslichtstrahl 47 auf eine in dieser
Figur nicht eingezeichnete Strahlfalle. In der Stellung, in der
der Klappspiegel 51 in den Beleuchtungsstrahlengang eingebracht
ist (in der Figur als durchgezogene Linie dargestellt) lenkt der
Spiegel 49 den Manipulationslichtstrahl 47 zur
Strahlablenkeinrichtung 13, der ihn über bzw. durch die Probe 23 führt. Der Klappspiegel 51 ist
als dielelektrisch beschichteter Spiegel ausgeführt, der den Beleuchtungslichtstrahl 5 im
Wesentlichen ungehindert passieren lässt, so das dieser gemeinsam
mit dem Manipulationslichtstrahl 47 zur Probe 23 gelangt.
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2 zeigt
ein Detail der Einkopplung des Manipulationslichtstrahls 47 mit
einem Spiegel 49, der als Metallspiegel 53 ausgeführt ist,
und der mit einem Galvanometer 55 um eine Drehachse 57 drehbar
ist. In der in 2 dargestellten
Stellung ist der Metallspiegel 53 in den Beleuchtungslichtstrahlengang
eingebracht und lenkt den Manipulationslichtstrahl 47 zur
Strahlablenkeinrichtung, während
er den Beleuchtungslichtstrahl 5 vollständig blockiert.
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3 zeigt
die in 2 bereits erläuterten Komponenten,
wobei der Metallspiegel 53 in der hier gezeigten Stellung
den Beleuchtungslichtstrahl 5 ungehindert passieren lässt und
den Manipulationslichtstrahl 47 in eine Strahlfalle 59 lenkt.
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Die Erfindung wurde in Bezug auf
eine besondere Ausführungsform
beschrieben. Es ist jedoch selbstverständlich, dass Änderungen
und Abwandlungen durchgeführt
werden können,
ohne dabei den Schutzbereich der nachstehenden Ansprüche zu verlassen.
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- 1
- Lichtquelle
- 3
- Laser
- 5
- Beleuchtungslichtstrahl
- 7
- Optik
- 9
- Anregungsblende
- 11
- Hauptstrahlteiler
- 13
- Strahlablenkeinrichtung
- 15
- Scanspiegel
- 17
- Scanoptik
- 19
- Tubusoptik
- 21
- Objektiv
- 23
- Probe
- 25
- Objekttisch
- 27
- Detektionslicht
- 29
- Detektionsblende
- 31
- Detektor
- 33
- Photomultiplier
- 35
- Verarbeitungseinheit
- 37
- Abbild
- 39
- Monitor
- 41
- PC
- 43
- weitere
Lichtquelle
- 45
- Pulslaser
- 47
- Manipulationslichtstrahl
- 49
- Spiegel
- 51
- Klappspiegel
- 53
- Metallspiegel
- 55
- Galvanometer
- 57
- Drehachse
- 59
- Strahlfalle