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Die
Erfindung betrifft ein Mikroskop mit zumindest einer ersten und
einer zweiten Lichtquelle, wobei der ersten Lichtquelle eine erste
Lichtleitfaser und der zweiten Lichtquelle eine zweite Lichtleitfaser zugeordnet
ist, und wobei das von der jeweiligen Lichtquelle emittierte Licht
in die zugeordnete Lichtleitfaser einkoppelbar ist, und mit einem
in einem Beleuchtungsstrahlengang angeordneten Objektiv.
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In
der Rastermikroskopie (Scanmikroskopie) wird eine Probe mit einem
Lichtstrahl abgerastert, um das von der Probe emittierte Reflexions-
oder Fluoreszenzlicht zu beobachten. Hierzu werden oft Laser als
Lichtquelle eingesetzt. Aus der
EP
0 495 930 : „Konfokales
Mikroskopsystem für
Mehrfarbenfluoreszenz" ist
beispielsweise ein Anordnung mit einem einzelnen mehrere Laserlinien
emittierenden Laser bekannt. Derzeit werden hierfür meist
Mischgaslaser, insbesondere ArKr-Laser, eingesetzt. Der Fokus eines
Beleuchtungslichtstrahles wird mit Hilfe einer steuerbaren Strahlablenkeinrichtung,
im Allgemeinen durch Verkippen zweier Spiegel, in einer Objektebene
bewegt, wobei die Ablenkachsen meist senkrecht aufeinander stehen,
so dass ein Spiegel in x-, der andere in y-Richtung ablenkt. Die
Verkippung der Spiegel wird beispielsweise mit Hilfe von Galvanometer-Stellelementen
bewerkstelligt. Die Leistung des vom Objekt kommenden Lichtes wird
in Abhängigkeit von
der Position des Abtaststrahles gemessen. Üblicherweise werden die Stellelemente
mit Sensoren zur Ermittlung der aktuellen Spiegelstellung ausgerüstet.
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Speziell
in der konfokalen Rastermikroskopie wird ein Objekt mit dem Fokus
eines Lichtstrahles in drei Dimensionen abgetastet.
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Ein
konfokales Rastermikroskop umfasst im Allgemeinen eine Lichtquelle,
eine Fokussieroptik, mit der das Licht der Quelle auf eine Lochblende – die sog.
Anregungsblende – fokussiert
wird, einen Strahlteiler, eine Strahlablenkeinrichtung zur Strahlsteuerung,
eine Mikroskopoptik, eine Detektionsblende und die Detektoren zum
Nachweis des Detektions- bzw. Fluoreszenzlichtes. Das Beleuchtungslicht wird über einen
Strahlteiler eingekoppelt. Das vom Objekt kommende Fluoreszenz-
oder Reflexionslicht gelangt über
die Strahlablenkeinrichtung zurück
zum Strahlteiler, passiert diesen, um anschließend auf die Detektionsblende
fokussiert zu werden, hinter der sich die Detektoren befinden. Detektionslicht,
das nicht direkt aus der Fokusregion stammt, nimmt einen anderen
Lichtweg und passiert die Detektionsblende nicht, so dass man eine
Punktinformation erhält,
die durch sequentielles Abtasten des Objekts zu einem dreidimensionalen
Bild führt.
Meist wird ein dreidimensionales Bild durch schichtweise Bilddatennahme
erzielt, wobei die Bahn des Abtastlichtstrahles auf bzw. in dem
Objekt Idealerweise einen Mäander
beschreibt. (Abtasten einer Zeile in x-Richtung bei konstanter y-Position,
anschließend
x-Abtastung anhalten und per y-Verstellung
auf die nächste
abzutastende Zeile schwenken und dann, bei konstanter y-Position,
diese Zeile in negativer x-Richtung abtasten u.s.w.). Um eine schichtweise
Bilddatennahme zu ermöglichen,
wird der Probentisch oder das Objektiv nach dem Abtasten einer Schicht
verschoben und so die nächste
abzutastende Schicht in die Fokusebene des Objektivs gebracht.
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Aus
DE 196 33 185 ist eine
mehrfarbige Punktlichtquelle für
ein Laserscanmikroskop bekannt. Die mehrfarbige Punktlichtquelle
weist mindestens zwei Laser unterschiedlicher Wellenlänge auf,
die einen mehrfarbigen Lichtpunkt auf einer zu untersuchenden Probe
erzeugen, der über
die Probe hinweggerastert wird, wobei zwischen dem Laserscanmikroskop
und den Lasern ein mit den Lasern optisch verbundener Strahlvereiniger
vorgesehen ist, der die Laserstrahlen der Laser koaxial zusammenführt. In
einer möglichen
Ausgestaltungsvariante ist vorgesehen, das ein Laser unmittelbar
und weitere Laser über
Lichtleitfasern in den Strahlvereiniger einkoppeln. Der Strahlvereiniger
ist als monolitische Einheit ausgebildet. Zwischen dem Strahlvereiniger und
dem Laserscanmikroskop ist ein Lichtleiter vorgesehen, der die koaxial
zusammengeführte
Strahlung aller Laser zu dem Laserscanmikroskop überführt, wobei die Laserstrahlen
auf diesen Lichtleiter justierbar sind.
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Aus
DE 102 51 897 A1 ist
eine faseroptische Schaltvorrichtung mit beweglicher Lichtleitfaser
und ein Herstellungsverfahren bekannt. Die faseroptische Schaltvorrichtung
umfasst mindestens eine bewegliche Lichtleitfaser und mindestens
eine Steuerelektrode zum Erzeugen eines elektrostatischen Feldes, das
die räumliche
Lage der beweglichen Lichtleitfaser zur optischen Kopplung mit mindestens
einer zweiten Lichtleitfaser steuert. Um eine verbesserte faseroptische
Schaltvorrichtung anzugeben, weist die Schaltvorrichtung ein elektrisch
isolierendes Gehäuse
auf, dessen Innenwandung teilweise von der mindestens einen Steuerelektrode
gebildet ist.
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Üblicherweise
wird in der Mikroskopie, wenn in einem Mikroskop mehrere Lichtquellen
vorgesehen sind, ein dichroitischer bzw. dichromatischer Strahlteiler
zur Vereinigung der Strahlengänge
der Lichtquellen verwendet. Zur individuellen Steuerung der Lichtleistung
des von den Lichtquellen emittierten Lichtes sind zusätzliche
Bauteile, wie beispielsweise akustooptische Filter (AOTF) nötig, die
aufwendig justiert werden müssen.
Die Strahlvereinigung mit herkömmlicher
Optik ist daher sehr bauraumbeanspruchend und sehr kostenintensiv.
Ein weiterer Nachteil ist in dem hohen Justieraufwand und der hohen
Störanfälligkeit
zu sehen.
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Es
ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Mikroskop
anzugeben, dessen Lichtquellen bei einfacher kompakter und zuverlässiger Bauweise
optisch an den Beleuchtungsstrahlengang ankoppelbar sind.
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Diese
Aufgabe wird durch ein Mikroskop gelöst das dadurch gekennzeichnet,
dass im Beleuchtungsstrahlengang ein Faser-Multiplexer vorgesehen ist,
der an die erste und an die zweite Lichtleitfaser gekoppelt ist
und das Licht der Lichtquellen empfängt und der wahlweise das Licht
der ersten oder das Licht der zweiten Lichtquelle passieren lässt.
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Das
erfindungsgemäße Mikroskop
hat den Vorteil, das eine Probe auf einfache Weise mit lichtunterschiedlicher
Lichtquellen in Abhängigkeit
von den individuellen Anforderungen beleuchtet werden kann. Durch
die Verwendung von Lichtleitfasertechnik ist das erfindungsgemäße Mikroskop äußerst unanfällig gegen
Störungen,
wie Vibrationen oder Verschmutzung von optischen Bauteilen durch
Staub.
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Vorzugsweise
ist der Fasermultiplexer (Faseroptische Schaltvorrichtung) fest
in einem Gehäuse
integriert und somit robust in der Handhabung. Vorzugsweise wird
ein x in 1 Fasermultiplexer (z.B. 2 in 1, 3 in 1, 4 in 1, 5 in 1,
...) verwendet, wobei es bei den meisten Anwendungen nur eine untergeordnete Rolle
spielt, dass während
eines Beobachtungsvorganges nur das Licht einer einzigen Lichtquelle
zur Probe gelangt.
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Bei
aufwendigeren Fasermultiplexern kann vorgesehen sein, das Licht
mehrerer Lichtquellen passieren zu lassen und vorzugsweise in eine
Ausgangsfaser einzukoppeln.
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In
einer besonders bevorzugten Ausgestaltungsvariante ist eine Ausgangsfaser
vorgesehen, die an den Fasermultiplexer angekoppelt ist. Der Faserkoppler
koppelt das Licht einer oder mehrerer Lichtquellen in diese Ausgangsfaser
ein. Am Ende der Ausgangsfaser ist vorzugsweise eine Auskoppeloptik
vorgesehen, die das aus der Auskoppelfaser austretende Licht kollimiert.
Vorzugsweise umfasst die erste und/oder die zweite Lichtquelle einen
Laser. In einer besonders bevorzugten Ausgestaltungsvariante ist
dieser Laser als Pigtail-Laser, der direkt an eine Lichtleitfaser
angekoppelt ist, ausgestaltet.
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Zum
Einstellen bzw. zur Steuerung der Lichtleistung ist in einer Variante
des erfindungsgemäßen Mikroskops
in der ersten Lichtleitfaser und/oder in der zweiten Lichtleitfaser
ein Faserabschwächer
vorgesehen.
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In
einer anderen Variante ist dem Fasermultiplexer ein Abschwächer, der
beispielsweise als Faserabschwächer
ausgebildet sein kann, nachgeordnet.
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In
einer ganz besonders bevorzugten Ausgestaltungsform ist das Mikroskop
als Rastermikroskop, insbesondere als konfokales Rastermikroskop ausgebildet.
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Vorzugsweise
ist der Fasermultiplexer synchron zu einem punktweisen Abrastern
des Scanfeldes schaltbar. Hierdurch ist es ermöglicht, benachbarte Rasterpunkte
mit lichtunterschiedlicher Wellenlänge und oder Lichtleistung
zu beaufschlagen.
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In
einer anderen Variante ist vorgesehen, dass der Fasermultiplexer
synchron zu einem zeilenweisen Abrastern eines Scanfeldes schaltbar
ist. In dieser Variante ist es insbesondere ermöglicht, eine Scanzeile nacheinander
mit Licht unterschiedlicher Wellenlänge und oder Lichtleistung
zu beaufschlagen. Es ist auch ermöglicht, benachbarte Scanzeilen mit
Beleuchtungslicht unterschiedlicher Wellenlänge und oder Lichtleistung
zu beaufschlagen.
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In
einer anderen Ausgestaltungsform ist vorgesehen, dass der Fasermultiplexer
synchron zu einem frameweisen Abrastern eines Scanfeldes schaltbar
ist. Diese Variante ermöglicht
es, sequenziell ein Scanfeld mehrfach abzuscannen bei unterschiedlichen
Beleuchtungsbedingungen hinsichtlich Wellenlänge und oder Lichtleistung.
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Vorteilhafterweise
ersetzt die Fasermultiplexeranordnung des erfindungsgemäßen Mikroskops sowohl
eine aufwendige Strahlvereinigung als auch die üblicherweise vorgesehenen Shutter
nach jeder Lichtquelle zum Unterbrechen der Beleuchtungslichtstrahlung.
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In
einer besonderen Variante ist vorgesehen, einen Einkoppelport des
Fasermultiplexers ungenutzt zu lassen (also keine Lichtquelle anzukoppeln) und
zum vollständigen
Unterbrechen der Probenbeleuchtung den Fasermultiplexer auf diesen „Dummy-Port" zu schalten.
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In
den Zeichnungen ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt
und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben, wobei gleich wirkende
Bauteile mit denselben Bezugszeichen versehen sind. Dabei zeigt
die einzige Fig. ein erfindungsgemäßes Mikroskop.
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Die
Figur zeigt ein erfindungsgemäßes Mikroskop,
das als konfokales Rastermikroskop ausgebildet ist. Das Mikroskop
weist eine erste Lichtquelle 1, die als Laserlichtquelle
ausgebildet ist und Licht einer Wellenlänge von 488 nm emittiert, auf.
Weiterhin weist das Rastermikroskop eine zweite Lichtquelle 3, die
ebenfalls als Laser ausgebildet ist und Licht einer Wellenlänge von
532 nm emittiert, auf. Das Rastermikroskop umfasst eine dritte Lichtquelle 5,
die als Pigtail-Laser 7 ausgebildet ist und Licht einer
Wellenlänge
von 635 nm emittiert. Darüber
hinaus weist das Rastermikroskop eine vierte Lichtquelle 9 auf,
die ebenfalls als Laser ausgebildet ist und Licht einer Wellenlänge von
405 nm emittiert auf.
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Das
Licht der ersten Lichtquelle 1 wird mit einer ersten Koppeloptik 11 in
eine erste Lichtleitfaser 13, die an einen Fasermultiplexer 15 gekoppelt
ist, eingekoppelt. Das Licht der zweiten Lichtquelle 3 wird
mit einer zweiten Koppeloptik 17 in eine zweite Lichtleitfaser 19,
die ebenfalls mit dem Fasermultiplexer 15 verkoppelt ist,
eingekoppelt. Analog wird das Licht der vierten Lichtquelle 9 mit
Hilfe einer dritten Einkoppeloptik 21 in eine vierte Lichtleitfaser 23 eingekoppelt.
Die vierte Lichtleitfaser 23 ist ebenfalls optisch an den
Fasermultiplexer 15 angeschlossen. Der Pigtail-Laser 7 ist
an eine dritte Lichtleitfaser 25 angekoppelt, die das Licht
des Pigtail-Lasers 7 zu dem Fasermultiplexer transportiert.
Der Fasermultiplexer 15 wird über eine Ansteuereinheit 27 gemäß den Vorgaben
des Benutzers bzw. gemäß den individuellen Experimentanforderungen
gesteuert. Der Fasermultiplexer 15 lässt je nach Ansteuerung das
Licht der ersten Lichtquelle 1 oder das Licht der zweiten
Lichtquelle 3 oder das Licht der dritten Lichtquelle 5 oder das
Licht der vierten Lichtquelle 9 passieren und koppelt dieses
in eine Ausgangsfaser 29 ein. Im weiteren wird das Licht,
das die Ausgangsfaser 29 durchläuft als Beleuchtungslichtstrahl 31 bezeichnet.
Der Beleuchtungslichtstrahl 31 wird mit der Auskoppeloptik 33 ausgekoppelt
und gelangt anschließend
zu der Detektionslochblende 35, passiert diese und wird
von dem nachfolgenden Hauptstrahlteiler 37 zur Strahlablenkeinrichtung 39,
die einen kardanisch aufgehängten
Scanspiegel 41 beinhaltet, gelenkt. Die Strahlablenkeinrichtung 39 führt den
Beleuchtungslichtstrahl 31 durch die Scanoptik 43,
die Tubusoptik 45 und durch das Mikroskopobjektiv 47 hindurch über bzw.
durch die Probe 49. Das von der Probe ausgehende Detektionslicht 51 gelangt
auf demselben Lichtweg, nämlich
durch das Mikroskopobjektiv 47, die Tubusoptik 45 und
die Scanoptik 43 sowie über die
Strahlablenkeinrichtung 39 zurück zum Hauptstrahlteiler 37,
passiert diesen und die nachfolgende Detektionslochblende 53 und
gelangt schließlich
zu dem Detektor 55, der als Photomultiplier 57 ausgestaltet
ist. Der Detektor 55 erzeugt elektrische zur Lichtleistung
des Detektionslichts 51 proportionale Signale, die an eine
Verarbeitungseinheit 59 weitergegeben werden. In der Verarbeitungseinheit 59 werden
die elektrischen Signale den jeweiligen Positionssignalen der Strahlablenkeinrichtung 39 zugeordnet
und Bilddaten erzeugt, die an einen PC 61 weitergegeben
werden, auf dessen Monitor 63 ein Abbild der Probe dargestellt
wird. Die Verarbeitungseinheit 59 steuert gemäß den Anforderungen
des Experiments bzw. gemäß den Benutzervorgaben
das Ansteuermodul 27 des Fasermultiplexers 15.
Der Fasermultiplexer 15 verfügt über einen fünften Eingangsport, der jedoch
nicht an einen Laser gekoppelt ist. Zum vollständigen Abschalten der Probenbeleuchtung
wird der Fasermultiplexer 15 diesen Dummy-Port 65 geschaltet.
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Die
Erfindung wurde in Bezug auf eine besondere Ausführungsform beschrieben. Es
ist jedoch selbstverständlich,
dass Änderungen
und Abwandlungen durchgeführt
werden können,
ohne dabei den Schutzbereich der nachstehenden Ansprüche zu verlassen.
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- 1
- erste
Lichtquelle
- 3
- zweite
Lichtquelle
- 5
- dritte
Lichtquelle
- 7
- Pigtail-Laser
- 9
- vierte
Lichtquelle
- 11
- erste
Koppeloptik
- 13
- erste
Lichtleitfaser
- 15
- Fasermultiplexer
- 17
- zweite
Koppeloptik
- 19
- zweite
Lichtleitfaser
- 21
- dritte
Einkoppeloptik
- 23
- vierte
Lichtleitfaser
- 25
- dritte
Lichtleitfaser
- 27
- Ansteuereinheit
- 29
- Ausgangsfaser
- 31
- Beleuchtungslichtstrahl
- 33
- Auskoppeloptik
- 35
- Detektionslochblende
- 37
- Hauptstrahlteiler
- 39
- Strahlablenkeinrichtung
- 41
- Scanspiegel
- 43
- Scanoptik
- 45
- Tubusoptik
- 47
- Mikroskopobjektiv
- 49
- Probe
- 51
- Detektionslicht
- 53
- Detektionslochblende
- 55
- Detektor
- 57
- Photomultiplier
- 59
- Verarbeitungseinheit
- 61
- PC
- 63
- Monitor
- 65
- Dummy-Port