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Die Erfindung betrifft ein Rastermikroskop mit mindestens einer Lichtquelle, die ein Beleuchtungslichtstrahlenbündel erzeugt, mit einem akustooptischen Bauteil zur Einstellung der Lichtleistung des Beleuchtungslichtstrahlenbündels und mit einer Strahlablenkeinrichtung zum Führen des Beleuchtungslichtstrahlenbündels über bzw. durch eine Probe.
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In der Scanmikroskopie wird eine Probe mit einem Lichtstrahl beleuchtet, um das von der Probe emittierte Reflexions- oder Fluoreszenzlicht zu beobachten. Der Fokus eines Beleuchtungslichtstrahles wird mit Hilfe einer steuerbaren Strahlablenkeinrichtung, im Allgemeinen durch Verkippen zweier Spiegel, in einer Objektebene bewegt, wobei die Ablenkachsen meist senkrecht aufeinander stehen, so dass ein Spiegel in x-, der andere in y-Richtung ablenkt. Die Verkippung der Spiegel wird beispielsweise mit Hilfe von Galvanometer-Stellelementen bewerkstelligt. Die Leistung des vom Objekt kommenden Lichtes wird in Abhängigkeit von der Position des Abtaststrahles gemessen. Üblicherweise werden die Stellelemente mit Sensoren zur Ermittlung der aktuellen Spiegelstellung ausgerüstet.
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Speziell in der konfokalen Scanmikroskopie wird ein Objekt mit dem Fokus eines Lichtstrahles in drei Dimensionen abgetastet. Ein konfokales Scanmikroskop umfasst im Allgemeinen eine Lichtquelle, eine Fokussieroptik, mit der das Licht der Quelle auf eine Lochblende - die sog. Anregungsblende - fokussiert wird, einen Strahlteiler, eine Strahlablenkeinrichtung zur Strahlsteuerung, eine Mikroskopoptik, eine Detektionsblende und die Detektoren zum Nachweis des Detektions- bzw. Fluoreszenzlichtes. Das Beleuchtungslicht wird beispielsweise über einen Strahlteiler eingekoppelt. Das vom Objekt kommende Fluoreszenz- oder Reflexionslicht gelangt über die Strahlablenkeinrichtung zurück zum Strahlteiler, passiert diesen, um anschließend auf die Detektionsblende fokussiert zu werden, hinter der sich die Detektoren befinden. Detektionslicht, das nicht direkt aus der Fokusregion stammt, nimmt einen anderen Lichtweg und passiert die Detektionsblende nicht, so dass man eine Punktinformation erhält, die durch sequentielles Abtasten des Objekts zu einem dreidimensionalen Bild führt.
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Anstelle des Strahlteilers kann zum Einkoppeln des Anregungslichts mindestens einer Lichtquelle in das Mikroskop und zum Ausblenden des am Objekt gestreuten und reflektierten Anregungslichts bzw. der Anregungswellenlänge aus dem über den Detektionsstrahlengang vom Objekt kommenden Lichts auch eine als akustooptisches Bauteil ausgestaltete optische Anordnung vorgesehen sein, wie beispielsweise aus der Deutschen Offenlegungsschrift
DE 199 06 757 A1 bekannt ist.
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Aus
DE 100 43 992 A1 ist ein Verfahren zur Untersuchung einer Probe und ein konfokales Scanmikrokop bekannt. Das konfokale Scanmikroskop weist einen AOTF auf, mit dem Beleuchtungslicht zum Beleuchten einer Probe aus dem von zwei Lichtquellen kommenden Licht ausgewählt werden kann. Das übrige Licht wird in eine Strahlfalle gelenkt.
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Meist wird ein dreidimensionales Bild durch schichtweise Bilddatennahme erzielt, wobei die Bahn des Abtastlichtstrahles auf bzw. in dem Objekt idealer Weise einen Mäander beschreibt. (Abtasten einer Zeile in x-Richtung bei konstanter y-Position, anschließend x-Abtastung anhalten und per y-Verstellung auf die nächste abzutastende Zeile schwenken und dann, bei konstanter y-Position, diese Zeile in negative x-Richtung abtasten u.s.w.). Um eine schichtweise Bilddatennahme zu ermöglichen, wird der Probentisch oder das Objektiv nach dem Abtasten einer Schicht verschoben und so die nächste abzutastende Schicht in die Fokusebene des Objektivs gebracht.
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Bei einigen mikroskopischen Anwendungen ist es notwendig, die Probe während des Abrasterns oder zwischen zwei Abrastervorgängen manipulieren zu können. Eine Manipulation kann beispielsweise das Freisetzen gebundener Farbstoffe, einen Bleichvorgang, einen Schneidvorgang oder die Anwendung einer optischen Pinzette beinhalten.
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Aus
US 6,094,300 A ist ein Laser-Scanning-Mikroskop mit einer ersten Lichtquelle, deren Licht von einem ersten Scanner über eine Probe geführt wird, und mit einer zweiten Lichtquelle, deren Licht als Manipulationslicht von einem zweiten Scanner über die Probe führbar ist, bekannt.
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Auch
DE 100 39 520 A1 offenbart ein Rastermikroskop mit zwei Strahlablenkeinrichtungen, die jeweils das Licht unterschiedlicher Lichtquellen, unabhängig voneinander über bzw. durch eine Probe führen.
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Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Rastermikroskop anzugeben, mit dem eine Probe sowohl beobachtbar als auch manipulierbar ist, wobei die Zahl der mindestens erforderlichen Lichtquellen reduziert ist und darüber hinaus eine schnelle Modulation der Manipulations- bzw. Beleuchtungslichtleistung ermöglicht ist.
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Diese Aufgabe wird durch ein Rastermikroskop gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass das akustooptische Bauteil ein Manipulationslichtstrahlenbündel aus dem Beleuchtungslichtstrahlenbündel räumlich abspaltet, und dass Strahlführungsmittel vorgesehen sind, die das Manipulationslichtstrahlenbündel zur Manipulation auf die Probe lenken, und dass das Rastermikroskop ein Objektiv aufweist, das das übrige Beleuchtungslichtstrahlenbündel auf die Probe fokussiert.
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Das erfindungsgemäße Rastermikroskop hat den Vorteil, dass mit dem Beleuchtungslichtstrahlenbündel und mit dem Manipulationslichtstrahlenbündel unabhängig voneinander die Probe simultan oder sequenziell beobachtet und manipuliert werden kann. Hierbei ist es ermöglicht, die Lichtleistung im Beleuchtungslichtstrahlenbündel und im Manipulationslichtstrahlenbündel präzise und schnell einzustellen.
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Vorteilhafterweise kann als Manipulationslichtstrahlenbündel das Licht verwendet werden, das ein die Lichtleistung regelndes akustooptisches Bauteil ohnehin in eine Strahlfalle lenken würde.
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In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung beinhaltet das akustooptische Bauteil einen AOTF (acousto optical tunable filter).
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Vorzugsweise ist eine weitere Strahlablenkeinrichtung zum Führen des Manipulationslichtstrahlenbündels über bzw. durch die Probe vorgesehen. Die weitere Strahlablenkeinrichtung kann, wie in der Rastermikroskopie üblich, Galvanometerspiegel oder akustooptisch ablenkende Scanner oder beispielsweise Mikrospiegel beinhalten.
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Das Rastermikroskop beinhaltet ein Objektiv, das das Beleuchtungslichtstrahlenbündel auf die Probe fokussiert. Vorzugsweise fokussiert das Objektiv auch das Manipulationslichtstrahlenbündel auf die Probe. Hierzu werden die Strahlengänge des Beleuchtungslichtstrahlenbündels und des Manipulationslichtstrahlenbündels nach Passieren der Strahlablenkeinrichtung bzw. der weiteren Strahlablenkeinrichtung vor dem Objektiv zusammengeführt.
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In einer anderen vorteilhaften Ausgestaltungsform des Rastermikroskops ist ein weiteres Objektiv vorgesehen, das das Manipulationslichtstrahlenbündel auf die Probe fokussiert. Bei dieser Variante kann die Probe beispielsweise von oben durch das Objektiv beobachtet werden, während gleichzeitig von unten durch ein weiteres Objektiv bzw. durch den Kondensor eine Probenmanipulation erfolgen kann.
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Vorzugsweise beinhalten die Strahlführungsmittel, die das Manipulationslichtstrahlenbündel auf die Probe lenken, einen Lichtleiter.
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In einer besonderen Variante spaltet das akustooptische Bauteil den Anteil aus dem Beleuchtungslichtstrahlenbündel als Manipulationslichtstrahlenbündel ab, der eine bestimmte Polarisationseigenschaft aufweist. Beispielsweise kann das von der Lichtquelle ausgehende Beleuchtungslichtstrahlenbündel linear polarisiert sein, wobei das akustooptische Bauteil beispielsweise den saggital polarisierten Anteil als Manipulationslichtstrahlenbündel abspaltet und den tangential polarisierten Anteil als Beleuchtungslichtstrahlenbündel passieren lässt. Durch Drehung der Polarisationsebene des von der Lichtquelle ausgehenden Beleuchtungslichtstrahlenbündels mit einem Polarisationsbeeinflussungsmittel, das beispielsweise als λ/2-Platte ausgebildet sein kann, lässt sich das Verhältnis der Lichtleistungen von Manipulationslichtstrahlenbündel und von dem durch das akustooptische Bauteil getretenen Beleuchtungslichtstrahlenbündels einstellen.
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Vorzugsweise sind Kompensationsmittel vorgesehen, die eine von dem akustooptischen Bauteil hervorgerufene räumliche spektrale Aufspaltung des Manipulationslichtstrahlenbündels und/oder des Beleuchtungslichtstrahlenbündels kompensieren. Diese Kompensationsmittel können beispielsweise als Prisma und/oder als Gitter und/oder als weiteres akustooptisches Bauteil ausgebildet sein. Die Kompensation einer räumlich spektralen Aufspaltung ist insbesondere dann wichtig, wenn das Manipulationslichtstrahlenbündel und/oder das Beleuchtungslichtstrahlenbündel zum weiteren Transport in eine Lichtleitfaser eingekoppelt werden sollen.
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In einer ganz besonders bevorzugten Ausgestaltungsvariante lenkt das akustooptische Bauteil von der Probe ausgehendes Detektionslicht mittelbar oder unmittelbar zu einem Detektor bzw. einer Detektoranordnung. In diesem Fall fungiert das akustooptische Bauteil zusätzlich als akustooptischer Beamsplitter, wie er beispielsweise in
DE 199 06 757 A1 offenbart ist.
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In einer besonders bevorzugten Ausführungsvariante ist das Rastermikroskop ein konfokales Rastermikroskop.
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In der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben, wobei gleiche oder gleich wirkende Elemente mit denselben Bezugszeichen versehen sind. Dabei zeigen:
- 1 eine erfindungsgemäßes Rastermikroskop,
- 2 ein weiteres erfindungsgemäßes Rastermikroskop,
- 3 ein anderes erfindungsgemäßes Rastermikroskop.
- 4 eine Detailansicht des Strahlverlaufs im Bereich eines akustooptischen Bauteils und
- 5 eine weitere Detailansicht des Strahlverlaufs im Bereich eines akustooptischen Bauteils.
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1 zeigt ein erfindungsgemäßes Rastermikroskop mit einer ersten Lichtquelle 1, die als Argon-Krypton-Laser ausgebildet ist und einer zweiten Lichtquelle 3, die als Helium-Neon-Laser ausgebildet ist. Das von der Lichtquelle 1 erzeugte erste Laserlicht 5 wird mit Hilfe eines dichroitischen Strahlteilers 7 mit dem von der zweiten Lichtquelle 3 emittierten zweite Laserlicht 9 zu einem Beleuchtungslichtstrahlenbündel 11 vereinigt. Im Strahlengang des Beleuchtungslichtstrahlenbündels 11 befindet sich ein als AOTF 13 ausgebildetes akustooptisches Bauteil 15 zur Einstellung der Lichtleistung des Beleuchtungslichtstrahlenbündels. Das akustooptische Bauteil spaltet aus dem Beleuchtungslichtstrahlenbündel 11 ein Manipulationslichtstrahlenbündel 16 ab, das über den Umlenkspiegel 17 zu einer weiteren Strahlablenkeinrichtung 19, die einen weiteren kardanisch aufgehängten Scanspiegel 21 beinhaltet, geführt wird. Von der weiteren Strahlablenkeinrichtung 19 gelangt das Manipulationslichtstrahlenbündel 16 über einen weiteren Umlenkspiegel 23 zu einem dichroitischen Strahlumlenker 26, der das Manipulationslichtstrahlenbündel 16 durch das Objektiv 25 zur Manipulation auf die Probe 27 lenkt. Der übrige Teil des Beleuchtungslichtstrahlenbündels wird mit einem Hauptstrahlteiler 29 zu einer Strahlablenkeinrichtung 31, die einen kardanisch aufgehängten Scanspiegel 33 beinhaltet, geführt. Die Strahlablenkeinrichtung 31 führt das Beleuchtungslichtstrahlenbündel 11 durch die nicht gezeigte Scanoptik und die ebenfalls nicht gezeigte Tubusoptik und das Objektiv 25 über die Probe 27. Das von der Probe ausgehende Detektionslicht 35 gelangt auf demselben Lichtweg, nämlich durch das Objektiv 25 durch die nicht gezeigte Scanoptik und die nicht gezeigte Tubusoptik hindurch zur Strahlablenkeinrichtung 31 zurück und trifft nach Passieren des Hauptstrahlteilers 29 und des Detektionspinholes 37 auf die Detektionseinrichtung 39, die zur Leistung des Detektionslichts proportionale elektrische Signale erzeugt. Die erzeugten elektrischen Detektionssignale werden an eine Verarbeitungseinheit 41 weitergegeben, die auf dem Monitor 43 eines PCs 46 ein Abbild der Probe darstellt. Die Strahlablenkeinrichtung 31 und die weitere Strahlablenkeinrichtung 19 werden gemäß den Vorgaben des Benutzers von der Verarbeitungseinheit 41 gesteuert. Im Strahlengang des ersten Lasers ist eine λ/2-Platte 45 vorgesehen, mit der die Polarisationslichtrichtung des vom ersten Laser emittierten Lichts 5 einstellbar ist. Ebenso ist im Strahlengang des zweiten Lasers 3 eine zweite λ/2-Platte 47 als Polarisationsbeeinflussungsmittel 49 vorgesehen, die zur Einstellung der Polarisationsrichtung des vom zweiten Laser emittierten Lichts 9 dient. Durch Drehen der λ/2-Platten 45, 47 lässt sich das Verhältnis der Lichtleistungen des Manipulationslichtstrahlenbündels 16 zu dem des Beleuchtungslichtstrahlenbündels 11 bezüglich der jeweiligen von den Lasern emittierten Lichtwellenlängen Anteile einstellen.
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2 zeigt ein weiteres erfindungsgemäßes Rastermikroskop, bei dem das akustooptische Bauteil 15 als AOTF 13 ausgebildet ist. Der AOTF 13 hat bei diesem Rastermikroskop zusätzlich die Aufgabe, das von der Probe ausgehende Detektionslicht 35, der Detektoreinrichtung 39 zuzuführen. Gleichzeitig spaltet der AOTF 13 ein Manipulationslichtstrahlenbündel 16 ab, das nach Durchlaufen eines als weiteren AOTF 51 ausgeführten Kompensationsmittel 53 mit Hilfe der Optik 55 in eine Lichtleitfaser 57 eingekoppelt wird. Das mit Hilfe der weiteren Optik 59 aus der Lichtleitfaser 57 ausgekoppelte Manipulationslichtstrahlenbündel 16 gelangt anschließend zu der weiteren Strahlablenkeinrichtung 19 und wird analog wie bei dem in 1 gezeigten Rastermikroskop über bzw. durch die Probe geführt.
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3 zeigt eine weitere Variante eines erfindungsgemäßen Rastermikroskops, bei dem ein weiteres Objektiv 61 vorgesehen ist, um das von der weiteren Strahlablenkeinrichtung 19 gesteuerte Manipulationslichtstrahlenbündel 16 von unten auf die Probe 27 zu lenken.
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4 zeigt eine Detailansicht der Wirkungsweise des akustooptischen Bauteils 15, das als AOTF 13 ausgeführt ist. Das von der ersten und der zweiten Lichtquelle kommende Licht 5, 9 wird mit einem Strahlvereiniger 7 zu einem Beleuchtungslichtstrahlenbündel 11 vereinigt und von der durch den AOTF 13 laufenden akustischen Welle gebeugt und aufgespalten. Der AOTF 13 spaltet aus dem Beleuchtungslichtstrahlenbündel 11 ein Manipulationslichtstrahlenbündel 16 ab, das über Strahlführungsmittel auf die Probe 27 gelenkt wird. Es handelt sich hierbei um die erste Beugungsordnung für saggital polarisiertes Licht. In der ersten Ordnung für tangential polarisiertes Licht befindet sich der Teil des Beleuchtungslichtstrahlenbündels 11, der zur Strahlablenkeinrichtung 31 geführt wird. Das übrige Licht, nämlich das, das akut nicht benötigt wird, befindet sich hauptsächlich in der nullten Beugungsordnung und wird in eine Strahlfalle 63 gelenkt. Prinzipiell wäre es jedoch auch möglich, dieses Licht zur Manipulation auf die Probe zu lenken. Mit Hilfe einer λ/2-Platte 45 im Strahlengang des Lichtes 5 lässt sich die Orientierung der Linearpolarisation des Lichts 5 und damit das Verhältnis der Lichtleistungen des Manipulationslichtstrahlenbündels 16 und des in die erste Ordnung gebeugten Beleuchtungslichtstrahlenbündels 11 einstellen.
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5 zeigt eine weitere Detailansicht, bei der der AOTF 13 ein Manipulationslichtstrahlenbündel 16 abspaltet, das von einem Umlenkspiegel 65 zu einem Kompensationsmittel 53 gelenkt wird. Das Kompensationsmittel besteht aus einem weiteren AOTF 51, der so angeordnet ist, dass er die räumlich spektrale Aufspaltung, die durch den AOTF 13 verursacht wurde, rückgängig macht, so dass die verschiedenen spektralen Anteile des Manipulationslichtstrahlenbündels 16 weitgehend koaxial verlaufen. Bei diesem Ausführungsbeispiel befindet sich das Manipulationslichtstrahlenbündel 16 in der nullten Beugungsordnung, während das der Strahlablenkeinrichtung zuzuführende Beleuchtungslichtstrahlenbündel 11 in der ersten Beugungsordnung zu finden ist.
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Die Erfindung wurde in Bezug auf eine besondere Ausführungsform beschrieben. Es ist jedoch selbstverständlich, dass Änderungen und Abwandlungen durchgeführt werden können, ohne dabei den Schutzbereich der nachstehenden Ansprüche zu verlassen.
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Bezugszeichenliste
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- 1
- Lichtquelle
- 3
- Lichtquelle
- 5
- erstes Laserlicht
- 7
- Strahlteilers
- 9
- zweites Laserlicht
- 11
- Beleuchtungslichtstrahlenbündel
- 13
- AOTF
- 15
- akustooptisches Bauteil
- 16
- Manipulationslichtstrahlenbündel
- 17
- Umlenkspiegel
- 19
- weitere Strahlablenkeinrichtung
- 21
- weiterer Scanspiegel
- 23
- weiterer Umlenkspiegel
- 25
- Objektiv
- 26
- Strahlumlenker
- 27
- Probe
- 29
- Hauptstrahlteiler
- 31
- Strahlablenkeinrichtung
- 33
- Scanspiegel
- 35
- Detektionslicht
- 37
- Detektionspinhole
- 39
- Detektionseinrichtung
- 41
- Verarbeitungseinheit
- 43
- Monitor
- 45
- λ/2-Platte
- 46
- PC
- 47
- λ/2-Platte
- 49
- Polarisationsbeeinflussungsmittel
- 51
- weiterer AOTF
- 53
- Kompensationsmittel
- 55
- Optik
- 57
- Lichtleitfaser
- 59
- weitere Optik
- 61
- weiteres Objektiv
- 63
- Strahlfalle
- 65
- Umlenkspiegel
