DE10039520A1

DE10039520A1 - Vorrichtung zur Untersuchung und Manipulation von mikroskopischen Objekten

Info

Publication number: DE10039520A1
Application number: DE10039520A
Authority: DE
Inventors: Werner Knebel; Juergen Hoffmann
Original assignee: Leica Microsystems Heidelberg GmbH; Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2000-08-08
Filing date: 2000-08-08
Publication date: 2002-02-21
Also published as: JP5087178B2; US20020020800A1; JP2012141639A; DE50103520D1; JP2002082287A; EP1186930A2; US6677566B2; EP1186930B1; JP5142431B2; EP1186930A3

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Untersuchung und Manipulation von mikroskopischen Objekten (1), mit einem Mikroskop (2), einer zur Beleuchtung des Objekts (1) dienenden Lichtquelle (3, 4), einem Beleuchtungsstrahlengang (5), einem zur Detektion des vom Objekt (1) zurückkehrenden Lichts dienenden Detektor (6), einem Detektionsstrahlengang (7), einer zur Objektmanipulation dienenden Lichtquelle (8) und einem Manipulationslichtstrahlengang (9). Die erfindungsgemäße Vorrichtung bzw. das erfindungsgemäße Verfahren soll eine dreidimensionale Untersuchung und Manipulation von Objekten (1) ermöglichen, deren Ausdehnung entlang der optischen Achse größer als der Tiefenschärfenbereich des verwendeten Mikroskopobjektivs ist, wobei eine Objektmanipulation auch an allen Stellen des dreidimensionalen Objekts (1) möglich sein soll. Darüber hinaus soll eine dreidimensionale Detektion des Objekts (1) möglich sein, bei der eine Diskriminierung der Objektlichtbeiträge erfolgt, die von Bereichen kommen, die jenseits des Tiefenschärfenbereichs des Mikroskopobjektivs liegen. Die erfindungsgemäße Vorrichtung bzw. das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroskop ein konfokales Rastermikroskop ist.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Un tersuchung und Manipulation von mikroskopischen Objekten, mit einem Mi kroskop, einer zur Beleuchtung des Objekts dienenden Lichtquelle, einem Beleuchtungsstrahlengang, einem zur Detektion des vom Objekt zurückkeh renden Lichts dienenden Detektor, einem Detektionsstrahlengang, einer zur Objektmanipulation dienenden Lichtquelle und einem Manipulationslicht strahlengang.

Vorrichtungen der gattungsbildenden Art sind in der Praxis seit geraumer Zeit bekannt. Lediglich beispielhaft wird auf "Micromanipulation by Light in Biology and Medicine" von Karl Otto Greulich, Birkhäuser Verlag 1999 verwiesen. Dort wird beschrieben, wie bei der mikroskopischen Untersuchung von Objekten mit Hilfe von fokussierten Laserstrahlen Kräfte auf Partikel ausgeübt, Partikel zerkleinert, perforiert oder Ablationen vorgenommen werden können. Die Möglichkeiten der Objektmanipulation werden insbesondere in der Zellbiologie eingesetzt, um beispielsweise das Innere ungeöffneter Zellen ungehindert zu manipulieren. Hierbei sind vor allem zwei unterschiedliche Manipulationsvor gänge üblich. Einerseits werden Objekte oder Objektbereiche mit fokussiertem Infrarotlicht beleuchtet, wodurch einzelne Partikel der Objekte bzw. Objektbe reiche in der Nähe des Manipulationsfokusses eingefangen und bei Verän derung der Position des Manipulationsfokusses in der Fokalebene mit dem Fokus mitbewegt werden (optische Pinzette), so dass diese beispielsweise mit einer Kraft beaufschlagbar sind. Wird ein Objektbereich mit gepulstem, fokus siertem UV-Licht beaufschlagt, so kann biologisches Material aufgrund einer hohen Energiedichte des UV-Lichts mit hoher räumlicher Auflösung zer schnitten oder perforiert werden (Nannoskalpell).

Bei einer weiteren Untersuchungsmethode in der Zellbiologie werden Objekte mit sogenannten "Caged-Compound"-Verbindungen präpariert. Diese Verbin dungen enthalten Calcium oder Aminosäuren, wie beispielsweise Glutamat, und sind mit Komplexbildnern (Gelators) verbunden bzw. umgeben. Diese Verbindungen können durch Einstrahlung von UV-Licht aufgebrochen werden, wodurch das Calcium oder das freiwerdende Glutamat in der Lage ist, weitere Reaktionen in der Zelle auszulösen (Photoaktivierung). Eine Photoaktivierung kann auch mit Hilfe von Zwei-Photonen-Prozessen erzielt werden. Lediglich beispielhaft wird hierzu auf die US 5,034,613 und auf die DE 44 14 940 ver wiesen, die die Anwendung der Zwei-Photonen-Absorbtion von Fluoreszenz farbstoffen bei der Rastermikroskopie beschreiben.

Mit Hilfe von optischen Pinzetten ist es möglich, Bindungskräfte zwischen Zellelementen, beispielsweise zwischen Mikrotubuli und anderen Zytosklett elementen, zu bestimmen oder Kontahierungskräfte von Muskelfasern zu messen.

Derzeit wird das zur Manipulation des Objekts dienende Laserlicht in den Strahlengang eines konventionellen Lichtmikroskops eingekoppelt. Die Mani pulation des Objekts erfolgt im Allgemeinen durch Bewegen der Probe mit dem Mikroskoptisch. Die Manipulation und die Untersuchung bzw. Beob achtung des Objekts erfolgt dabei entweder im Fluoreszenzlicht-Modus oder im Durchlicht-Modus eines konventionellen Mikroskops.

Bei diesen Untersuchungen und Manipulationen von Objekten ist jedoch pro blematisch, dass aufgrund der Abbildungseigenschaften eines konventionellen Mikroskops nur der Objektbereich zweidimensional abgebildet wird, der sich in dem Tiefenschärfenbereich des Mikroskopobjektivs befindet. Die Objektberei che jenseits dieses Tiefenschärfenbereichs sind jedoch dem Bild störend überlagert, was eine exakte Objektmanipulation erschwert bzw. unmöglich macht. Dementsprechend werden solche Untersuchungen und Manipulatio nen hauptsächlich an Objekten ausgeführt, die eine geringe Ausdehnung ent lang der optischen Achse aufweisen, so dass diese Objekte komplett in dem Tiefenschärfenbereich des Mikroskopobjektivs gebracht werden können. So mit kann dann das Objekt bei einem Abbildungsvorgang vollständig abgebildet werden und störende Überlagerungen von Objektbereichen jenseits des Tiefenschärfenbereichs des Mikroskopobjektivs können auf diese Weise ver mieden werden.

Sollen nun Untersuchungen und Manipulationen an Objekten durchgeführt werden, die eine - verglichen zum Tiefenschärfenbereich des Mikroskopobjek tivs - große Ausdehnung entlang der optischen Achse haben, treten zum ei nen die bereits beschriebenen Abbildungsprobleme auf, zum anderen ist es nicht ohne weitere möglich, Objektmanipulationen in verschiedenen Ebenen parallel zur Fokalebene des Mikroskopobjektivs durchzuführen. Der Grund hierfür ist, dass eine gleichzeitige Manipulation an mehreren Objektstellen mit unterschiedlicher Position entlang der optischen Achse die Foki des zu mani pulierenden Lichts entsprechend unterschiedlich einzustellen wären, was der zeit bei herkömmlichen Geräten zur Objektmanipulation nicht vorgesehen ist. Eine entsprechende Ansteuerung einer solchen Manipulationsvorrichtung durch einen Benutzer würde weiterhin voraussetzen, dass zur Einstellung der zu manipulierenden Objektbereiche das dreidimensionale Objekt mit einer hinreichenden Auflösung entlang der optischen Achse abgebildet werden kann, was bei einem konventionellen Mikroskop jedoch jenseits einer Genauigkeit von einem Mikrometer so gut wie nicht möglich ist.

Der Einsatz eines Lasers für ein Nannoskalpell schneidet in nachteiliger Weise zylinderförmige Ausschnitte in das dreidimensionale Objekt, so dass diese Art der Manipulation für viele Anwendungen ungeeignet ist.

Aus der DE 199 24 709 ist eine Vorrichtung bekannt, mit der Bauteile schnell, mit hoher Auflösung und präzise positioniert werden können. Insbesondere kann mit dieser Vorrichtung ein Objektivrevolver eines Mikroskops entlang der optischen Achse positioniert werden können (Objektivrevolverscannanord nung).

Aus der DE 196 53 413 bzw. der EP 0 753 779 sind Vorrichtungen bekannt, die kollimiertes Laserlicht in 20 bis 50 Beleuchtungsfoki in die Zwischenbild ebene bzw. Objektebene eines Mikroskops fokussieren können. Bei dem Licht handelt es sich um Laserlicht, das zur Zweiphotonen-Anregung von Fluoreszenzobjekten geeignet ist.

Aus den DE 196 54 210 C2 und DE 100 33 549.7 sind für sich gesehen Vor richtungen zum Ablenken eines Lichtstrahls im Wesentlichen in zwei senk recht zueinander stehenden Richtungen bekannt.

Aus der DE 44 14 940 und US 5,034,613 sind konfokale Rastermikroskope bekannt, bei denen Fluoreszenzobjekte mit Zweiphotonen-Prozessen zur Fluoreszenz angeregt werden.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, auch dreidi mensionale Objekte zu untersuchen und zu manipulieren, deren Ausdehnung entlang der optischen Achse größer als der Tiefenschärfenbereich des ver wendeten Mikroskopobjektivs ist, wobei eine Objektmanipulation auch an allen Stellen des dreidimensionalen Objekts möglich sein soll. Darüber hinaus soll eine dreidimensionale Detektion des Objekts möglich sein, bei der eine Diskriminierung der Objektlichtbeiträge erfolgt, die von Bereichen kommen, die jenseits des Tiefenschärfenbereichs des Mikroskopobjektivs liegen.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung der gattungsbildenden Art löst die voran stehende Aufgabe durch die Merkmale des Patentanspruchs 1. Danach ist eine solche Vorrichtung dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroskop ein konfokales Rastermikroskop ist.

Erfindungsgemäß ist zunächst erkannt worden, dass mit einem konfokalen Rastermikroskop die vom Objekt kommenden und außerhalb des Tiefen schärfenbereichs des Mikroskopobjektivs stammenden Lichtbeiträge aufgrund des konfokalen Prinzips wirksam unterdrückt bzw. ausgeblendet werden kön nen. Weiterhin ist die Auflösung entlang der optischen Achse eines konfokalen Rastermikroskops höher als die eines konventionellen Lichtmikroskops, so dass einerseits eine dreidimensionale Abbildung des zu manipulierenden Ob jekts möglich ist und andererseits - aufgrund der vorliegenden dreidimensio nalen Information des Objekts - eine dreidimensionale Objektmanipulation hierdurch ermöglicht wird. Die dreidimensionale Objektinformation mit hoher Auflösung entlang der optischen Achse ist eine Grundvoraussetzung für eine exakte dreidimensionale Ansteuerung des Manipulationslichtstrahls. Eine Objektmanipulation kann die Anwendung mindestens einer optischen Pinzette, die Durchführung einer Objektveränderung durch mindestens ein Nanoskalpell, das Ausbleichen von Fluoreszenzfarbstoffen und/oder das Freisetzen von Caged-Compund-Verbindungen umfassen.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind mindestens zwei Strahlablenkvor richtungen vorgesehen. Als Strahlablenkvorrichtung könnte beispielsweise ein Spiegel vorgesehen sein, der um zwei Achsen drehbar gelagert ist und hierbei vorzugsweise kardanisch aufgehängt ist. Weiterhin könnte eine Strahlablenk vorrichtung ein Spiegelsystem, bestehend aus zwei jeweils um eine Achse drehbar gelagerten Spiegeln bestehen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Vorrichtung zum Ablenken eines Lichtstrahls im Wesentlichen in zwei senkrecht zueinander stehenden Richtungen gemäß der DE 196 54 210 C2 bzw. DE 100 33 549.7 eingesetzt. Die Verwendung eines AOD's (Acousto- Optical-Deflector) oder eines EOD's (Electro-Optical-Modulator) als Strahlab lenkvorrichtung wäre ebenfalls denkbar.

In einer konkreten Ausführungsform ist eine Ablenkung des Beleuchtungs lichtstrahls durch eine Strahlablenkvorrichtung vorgesehen. Der Manipula tionslichtstrahl wird ebenfalls von einer Strahlablenkvorrichtung abgelenkt. Die Ablenkung des Beleuchtungslichtstrahls erfolgt unabhängig von der Ab lenkung des Manipulationslichtstrahls, da im Allgemeinen der Beleuchtungs lichtstrahl zur zwei- bzw. dreidimensionalen Detektion des Objekts dient und der Manipulationslichtstrahl zur Manipulation des Objekts bzw. einzelner Ob jektbereiche und daher eine andere Ablenkung als bei der des Beleuchtungs lichtstrahls erforderlich ist.

In einer vorteilhaften Ausführungsform verlaufen der Manipulationslichtstrah lengang und der Detektions-/Beleuchtungsstrahlengang weitgehend getrennt voneinander. Hierzu könnte beispielsweise der Detektions- /Beleuchtungsstrahlengang durch ein Mikroskopobjektiv verlaufen und der Manipulationslichtstrahlengang könnte durch eine Optik verlaufen, die bezüg lich der Fokalebene des Mikroskopobjektivs dem Mikroskopobjektiv gegen überstehend angeordnet ist. Diese Optik könnte in einfachster Form als Mi kroskopkondensor ausgebildet sein, die Verwendung eines weiteren Mikro skopobjektivs als Optik ist ebenfalls möglich. Falls zwei gegenüberstehend an geordnete Mikroskopobjektive eingesetzt werden, werden bevorzugt Mikro skopobjektive verwendet, die die gleichen oder zumindest vergleichbare tech nische Eckdaten aufweisen, wie z. B. Vergrößerung, Immersionsmedium und/oder numerische Appertur.

Falls sich der Manipulationslichtstrahlengang und der Detektions- /Beleuchtungsstrahlengang zumindest teilweise überlappen, ist vorgesehen, dass der Manipulationslichtstrahlengang und der Detektions- /Beleuchtungsstrahlengang mit einem Strahlteiler zusammenführbar sind. Der Strahlteiler könnte hierbei entweder als Farbstahlteiler oder als Polarisations strahlteiler ausgeführt sein. Auch eine Strahlzusammenführung, bei der einer der im gemeinsamen Strahlengang angeordneten Scanspiegel einer Strahl ablenkvorrichtung zur Strahlzusammenführung dient, ist denkbar. In diesem Fall ist der Scanspiegel für einen der beiden Strahlengänge transparent, für den anderen Strahlengang wirkt er als Spiegel.

In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Fokusposition des Manipulationslichts entlang der optischen Achse veränder bar ist. Hierdurch ist eine dreidimensionale Objektmanipulation möglich, indem die Fokusposition des Manipulationslichts an unterschiedlichen Positionen entlang der optischen Achse eingestellt werden kann, so dass die Objekt manipulation auch in Objektbereichen möglich ist, die jenseits des momentan eingestellten Tiefenschärfenbereichs des Mikroskopobjektivs liegen. Im kon kreten könnte die Veränderung der Fokusposition des Manipulationslichts durch zwischen Lichtquelle und Objekt verschiebbar angeordnete Fokussier mittel erfolgen. Eine Strahlaufteilung des Manipulationslichts wäre ebenfalls denkbar, um nämlich mehrere Manipulationslichtfoki in unterschiedlichen Ebenen entlang der optischen Achse zu positionieren. Hierbei könnte das Manipulationslicht in soviel Teilstrahlen aufgeteilt werden, wie es unterschied liche Ebenen entlang der optischen Achse gibt, in denen Manipulationslichtfoki zu positionieren sind. Hierbei könnte jedem Teilstrahl des Manipulationslichts ein diesem Teilstrahl zugeordnetes Fokussiermittel vorgesehen sein. Durch das bzw. die lediglich im Manipulationslichtstrahlengang wirkenden Fokus siermittel ist eine Positionierung einer Fokusposition des Manipulationslichts auch außerhalb des aktuell eingestellten Tiefenschärfenbereichs des Mikro skopobjektivs möglich.

Die Veränderung der Manipulationslichtfokusposition geht in einer bevorzug ten Ausführungsform mit einer Veränderung der Beleuchtungslichtfokusposi tion einher. Insbesondere ist vorgesehen, dass die Veränderung der beiden Fokuspositionen simultan erfolgt. Hierbei könnte die Fokusveränderung durch eine gemeinsame Objektivrevolverscananordnung erfolgen, wie sie beispiels weise aus der DE 199 24 709 bekannt ist. In diesem Fall verläuft der Detek tions-/Beleuchtungsstrahlengang und der Manipulationslichtstrahlengang ge meinsam durch das von der Objektivrevolverscananordnung bewegte optische Bauteil, das beispielsweise in Form eines Mikroskopobjektivs ausgeführt ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform dient der Manipulationslichtstrahl als optische Pinzette und/oder als Nannoskalpell. Zur Veränderung der Form des Manipulationslichtfokusses ist eine Zoom-Optik im Manipulationslichtstrahlen gang vorgesehen. Somit kann beispielsweise der Fokusradius des Manipula tionslichtstrahls mit Hilfe der Zoom-Optik verkleinert oder vergrößert werden, was eine Veränderung der Kraft auf das zu manipulierende Objekt zur Folge hat, bzw. die Form des Nanoskalpells verändern kann.

Die Strahlablenkvorrichtung bzw. die Strahlablenkvorrichtungen sind in einer konkreten Ausführungsform an der Mikroskopschnittstelle für die konventio nelle Auflichtbeleuchtung und/oder an einer zusätzlichen Schnittstelle am Mi kroskop ankoppelbar. Hierdurch können in vorteilhafter Weise bereits beste hende Mikroskopschnittstellen genutzt werden, was eine einfache Aufrüstung bereits installierter Mikroskopsysteme ermöglicht.

Zu Einkoppeln des Beleuchtungs- und/oder Manipulationslichts ist mindestens ein spektral selektives Element vorgesehen. Mit dem spektral selektiven Ele ment kann Licht mindestens einer bestimmten Wellenlänge selektiert und in den jeweiligen Strahlengang eingekoppelt werden und/oder die Lichtleistung des einzukoppelnden Lichts verändert werden. Das spektral selektive Element könnte ein AOTF (Acousto-Optical-Tunable-Filter), AOBS (Acousto-Optical- Beam-Splitter), AOD (Acousto-Optical-Deflector) und/oder EOM (Electro- Optical-Modulator) umfassen und von einem Steuerrechner, vorzugsweise in Abhängigkeit der Beleuchtungs- und/oder Manipulationsstrahlposition, angesteuert werden. Hierdurch ist eine selektive Einkopplung von Licht mehrerer Wellenlängen in den Beleuchtungs- und/oder Manipulationslichtstrahlengang möglich, wobei die eingekoppelte Lichtleistung auch in Abhängigkeit der entsprechenden Strahlposition gesteuert werden kann. Insbesondere kann hierdurch ein schnelles Ein- und Ausschalten des Manipulationsstrahls realisiert werden, was bei der gleichzeitigen Manipulation mehrerer Manipulationsstellen mit einem Manipulationslichtstrahl im Allgemei nen erforderlich ist. Hierzu muss der Manipulationslichtstrahl zu den einzelnen Manipulationsstellen abgelenkt werden und während des Ablenkvorgangs muss der Manipulationslichtstrahl aus dem Manipulationslichtstrahlengang ausgeblendet werden.

In verfahrensmäßiger Hinsicht wird die eingangs genannte Aufgabe durch die Merkmale des Patentanspruchs 22 gelöst. Danach ist ein solches Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroskop auch als konfokales Rastermi kroskop arbeitet.

In einer besonders bevorzugten Weise erfolgt die Objektmanipulation simultan zur konfokalen Objektdetektion. Hierdurch kann in vorteilhafter Weise die vor genommene Objektmanipulation mit Hilfe der konfokalen Objektdetektion bei einer verglichen zur konventionellen Mikroskopie erhöhten Auflösung entlang der optischen Achse untersucht werden. Insbesondere ist vorgesehen, dass ein Objekt während der Objektmanipulation dreidimensional detektiert wird. Insoweit ist hierbei eine unabhängige Ablenkung bzw. Positionierung des De tektions-/Beleuchtungsstrahlengangs und des Manipulationslichtstrahlengangs erforderlich.

In besonders vorteilhafter Weise erfolgt die Objektmanipulation dreidimensio nal. Insbesondere ist hierbei vorgesehen, dass auch in den zur Fokalebene des Mikroskopobjektivs parallelen Ebenen eine Objektmanipulation an unter schiedlichen Manipulationsstellen durchgeführt wird.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, Bindungskräfte zwi schen einzelnen Objekten oder Objektbereichen indirekt zu messen. Hierzu können mit Hilfe der optischen Pinzette mindestens zwei mit dem Objekt oder Objektbereich zusammenhängende Manipulationsstellen eingefangen und im eingefangenen Zustand ausgelenkt werden. Während der Auslenkung der Manipulationsstellen ist vorgesehen, dass das Objekt oder die Objektbereiche und/oder die Auslenkung der Manipulationsstellen detektiert werden. Wenn beispielsweise an den beiden Enden einer Muskelfaser jeweils ein Latex-Bead spezifisch angebracht ist, so könnten die beiden Latex-Beads jeweils mit einer optischen Pinzette eingefangen werden. Eine Auslenkung eines oder beider Beads würde auch eine Veränderung der Muskelfaser bewirken. Die Detektion der Muskelfaser während der Auslenkung der optischen Pinzette kann Auf schluß auf die vorherrschenden Bindungskräfte sowie den Eigenschaften der Muskelfaser geben.

In einer alternativen Vorgehensweise werden mit Hilfe der optischen Pinzette mindestens zwei mit dem Objekt oder Objektbereich zusammenhängende Manipulationsstellen eingefangen. Bei einer Objektmanipulation wird eine Veränderung der Manipulationsstellen und/oder des Objekts detektiert. Die Objektmanipulation könnte hierbei durch den Manipulationslichtstrahl induziert werden. Der Manipulationslichtstrahl könnte beispielsweise das Ausbleichen von Fluoreszenzfarbstoffen oder das Freisetzten von Caged-Compuond-Ver bindungen induzieren.

Beispielsweise kann durch diese Vorgehensweise die Kontraktionskraft einer Muskelfaser indirekt gemessen werden. Hierzu ist die Muskelfaser mit Caged- Compound-Release-Calcium präpariert und zur Untersuchung bzw. Manipula tion in das erfindungsgemäße Mikroskopsystem eingebracht. Zur Objektde tektion wird die Muskelfaser kontinuierlich mit Beleuchtungslicht einer Wel lenlänge von 488 nm abgetastet. Lediglich im Bereich der Muskelfaser wird über den Manipulationsstrahlengang UV-Licht (z. B. 365 nm) eingestrahlt, wo durch das Caged-Compuond-Release-Calcium freigesetzt wird, wodurch die Muskelfaser kontrahiert. An den Muskelfaserenden wurde ebenfalls präparativ Aktien oder Myosin angekoppelt. Das Aktien oder Myosin wurde zuvor mit einer optischen Pinzette eingefangen. Durch die Kontraktion der Muskelfaser wird eine Auslenkung des Aktiens bzw. Myosins von der Ausgangsposition erzeugt, wobei die Auslenkung proportional zur Kontraktionskraft der Muskel faser ist. Durch Messung der Auslenkung der Ausgangspositionen während der Auslösung der Muskelkontraktion kann auf die Kontraktionskraft geschlos sen werden.

Weiterhin ist vorgesehen, dass die Objektmanipulation zur Untersuchung der Informationsweitergabe von Zelle zu Zelle eingesetzt werden kann. Der Infor mationstransport von Zelle zu Zelle vollzieht sich zum einen durch elektrische Informationsübertragung und zum anderen durch die Weitergabe von Neu rotransmittern, wie z. B. Calcium. So kann beispielsweise eine Caged-Calcium- Verbindung in eine Zelle eingebracht werden, die zu einem vorgegebenen Zeitpunkt durch Einstrahlung von UV-Licht oder Infrarotlicht aufgebrochen werden kann. Hierdurch löst das freiwerdende Calcium eine Reaktion in der Zelle aus, die sodann unabhängig von der Manipulation verläuft. Der gesamte Vorgang kann zur Untersuchung mit dem konfokalen Rastermikroskop un unterbrochen detektiert werden, so dass die Informationsweiterleitung an die mit einem Fluoreszenz-Calcium-Indikator präparierte Nachbarzelle nachweis bar ist. Es ist bereits bekannt, dass die Reaktion der Nachbarzelle ausbleiben kann, wenn innerhalb eines bestimmten Zeitfensters die Reizinformation einer dritten Zelle eintrifft. Zur Untersuchung dieser Phänomenologie ist es hilfreich, quasi gleichzeitig oder definiert zeitversetzt eine Informationsweiterleitungs reaktion in zwei benachbarten Zellen auszulösen. Diese Untersuchungen setzten eine schnelle Objektdetektion voraus, die beispielsweise durch eine Strahlablenkvorrichtung gemäß der DE 196 54 210 oder DE 100 33 549 erzielt werden kann.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sind noch weitere Anwendungen der Zellbiologie, Neurobiologie sowie Humangenomforschung denkbar.

Das während der Untersuchung und Manipulation detektierte Objekt samt Manipulationsstellen wird vorzugsweise an einem Monitor dargestellt. Hierbei ist eine zwei- und/oder dreidimensionale Darstellung vorgesehen. Die dreidi mensionale Darstellung erfolgt vorzugsweise in einer perspektivischen An sicht, wobei der perspektivische Ansichtspunkt frei gewählt wird. Die Wahl des Ansichtspunktes könnte mit Zeigegeräten, beispielsweise mit Maus oder Joy stick, erfolgen.

Zur Untersuchung des Objekts ist vorgesehen, dass von dem Objekt und ge gebenenfalls zusätzlich von den Manipulationsstellen Fluoreszenz- und/oder Reflexionslicht detektiert wird. Die Fluoreszenzanregung könnte hierbei auch mit Methoden der Mehrphotonenanregung erfolgen, wie sie beispielsweise in der DE 44 14 940 bzw. US 5,034,613 beschrieben werden.

In Abhängigkeit der jeweiligen Anwendung ist vorgesehen, dass die Wellen länge des Beleuchtungslichtstrahls gewählt werden kann. Insbesondere ist es hierdurch möglich, jederzeit während des Abtastens der Probe Licht minde stens einer weiteren Wellenlänge hinzuzuschalten. Hierzu ist eine Objektbe leuchtung durch mehrere Laser und/oder durch die Verwendung eines Mehrli nienlasers vorgesehen.

In einer weiteren Variante könnte beispielsweise ein "Mini-Labor" im erfin dungsgemäßen Mikroskopsystem realisiert werden. Dieses Mini-Labor könnte verschiedene Bereiche in der Objektaufnahmevorrichtung aufweisen, in denen ein Objekt verschiedenen Verarbeitungsschritten unterzogen wird. Diese un terschiedlichen Bereiche könnten unterschiedliche Umgebungs- bzw. Einbet tungsmedien aufweisen, so dass für den jeweiligen Bearbeitungsschritt geeig nete Randbedingungen vorliegen. Ein Objekt könnte mit Hilfe der optischen Pinzette von einem Bereich zu einem anderen Bereich transportiert werden, wo beispielsweise bei fortlaufender Objektdetektion Teile einer Zelle oder der vollständige Zellkern aus der Zelle herausgeschnitten wird und sodann mit einer weiteren optischen Pinzette zu einem anderen Bereich transportiert wird, wo eine Weiterverarbeitung des herausgeschnittenen Zellkerns erfolgt.

Zur ausführlichen und umfassenden Objektuntersuchung ist vorgesehen, dass ein Objekt simultan mit mindestens zwei Lichtstrahlen abgetastet wird, die von jeweils unterschiedlichen Strahlablenkvorrichtungen abgelenkt werden. Hier bei ist vorgesehen, dass die Strahlablenkvorrichtungen synchron zueinander arbeiten. Beispielsweise könnte ein Lichtstrahl zu Einphotonenanregung, ein zweiter Lichtstrahl zur Mehrphotonenanregung des Fluoreszenzobjekts die nen.

Im Hinblick auf eine schnelle Bildaufnahme des Objekts wird dieses mit meh reren Beleuchtungsfoki oder mit einem linienförmigen Beleuchtungsmuster abgetastet und entsprechend detektiert. Zur Objektabtastung mehrerer Be leuchtungsfoki könnte beispielsweise eine aus den DE 196 53 413 oder EP 0 753 779 bekannten Anordnungen verwendet werden, die in Verbindung mit Zweiphotonen-Fluoreszenzanregung arbeiten. Ein linienförmiges Be leuchtungsmuster könnte beispielsweise durch Einbringen eines Be leuchtungsspalts und unter Verwendung von Zylinderlinsen erzeugt werden.

In einer besonders bevorzugten Weise wird mindestens ein zwei- oder dreidi mensionaler Teilbereich eines Objekts festgelegt, der mit erhöhter Photonen statistik, mit verminderter Abtastgeschwindigkeit und/oder mit höherer Orts auflösung detektiert wird. Bei diesem Teilbereich handelt es sich vorzugs weise um den zu untersuchenden Teilbereich des Objekts, der für die jewei lige Anwendung relevant ist. Der übrige Bereich könnte mit einer verminderten Photonenstatistik, mit erhöhter oder maximaler Abtastgeschwindigkeit und/oder mit verminderter Ortsauflösung detektiert werden. Somit kann die gesamte Untersuchung des Objekts auf die wesentlichen Bereiche konzen triert werden, wodurch eine maximale Informationsausbeute dieser Bereiche des Objekts detektierbar sind. Alternativ hierzu könnte auch vorgesehen sein, dass der übrige Bereich überhaupt nicht detektiert wird und dass der Beleuchtungsstrahl derart abgelenkt wird, dass er von einem Teilbereich einen anderen Teilbereich auf dem kürzesten Weg erreicht. Bei dieser Vor gehensweise werden dann lediglich die festgelegten Teilbereiche ausgehend detektiert.

Es gibt nun verschiedene Möglichkeiten, die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die den Patentansprüchen 1 und 22 nachgeordneten Patentansprüche und andererseits auf die nachfolgende Erläuterung der bevorzugten Ausfüh rungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung zu verweisen. In Verbin dung mit der Erläuterung der bevorzugten Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung werden auch im Allgemeinen bevorzugte Ausgestal tungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert. In der Zeichnung zeigen

Fig. 1 eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Aus führungsbeispiels einer Vorrichtung zur Untersuchung und Ma nipulation von mikroskopischen Objekten,

Fig. 2 eine schematische Darstellung eines weiteren erfindungsge mäßen Ausführungsbeispiels einer Vorrichtung zur Untersu chung und Manipulation von mikroskopischen Objekten,

Fig. 3 eine schematische Darstellung eines dritten Ausführungsbei spiels einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Untersuchung und Manipulation von mikroskopischen Objekten,

Fig. 4 eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Ver fahrensschritts zur Bestimmung von Kontraktionskräften einer Muskelzelle,

Fig. 5 eine schematische Darstellung einer Schnittebene senkrecht zu der in Fig. 4 dargestellten Ebene und

Fig. 6 eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Ver fahrensschritts zur Untersuchung der Informationsweiterleitung zwischen drei Zellen.

Fig. 1 zeigt eine Vorrichtung zur Untersuchung und Manipulation von mikro skopischen Objekten 1 mit einem lediglich als Mikroskopobjektiv dargestellten Mikroskop 2, mit zwei zur Beleuchtung des Objekts 1 dienenden Lichtquellen 3, 4, einem Beleuchtungsstrahlengang 5, einem zur Detektion des vom Objekt 1 zurückkehrenden Lichts dienenden Detektor 6, einem Detektionsstrahlen gang 7, einer zur Objektmanipulation dienenden Lichtquelle 8 und einem Ma nipulationslichtstrahlengang 9.

Das Licht der Lichtquellen 3, 4 wird mit einem Strahlteiler 10 koaxial zusam mengeführt und in Richtung des dichroitischen Strahlteilers 11 reflektiert. Das von dem dichroitischen Strahlteiler 11 reflektierte Beleuchtungslicht der Licht quellen 3, 4 wird von der Strahlablenkvorrichtung 12 in zwei im wesentlichen senkrecht zueinanderstehenden Richtungen abgelenkt. Hierzu ist ein Scan spiegel 13 vorgesehen, der kardanisch aufgehängt ist und um zwei senkrecht zueinander stehenden Achsen (nicht eingezeichnet) gedreht werden kann.

Das vom Scanspiegel 13 reflektierte Licht wird in das schematisch dargestellte Mikroskop 2 eingekoppelt, wobei das Mikroskopobjektiv 2 das Beleuchtungs licht im Objektbereich fokussiert.

Erfindungsgemäß handelt es sich bei dem Mikroskop um ein konfokales Ra stermikroskop, dass nämlich ein Beleuchtungspinhole 14 und ein dazu optisch konjugiertes konfokales Detektionspinhole 15 aufweist.

Bei den Ausführungsbeispielen der Fig. 1 bis 3 sind zwei Strahlablenkvorrich tungen 12, 16 vorgesehen. Hierbei lenkt die Strahlablenkvorrichtung 12 den Beleuchtungslichtstrahl 5 ab, die Strahlablenkvorrichtung 16 hingegen den Manipulationslichtstrahl 9. Die Ablenkung des Beleuchtungslichstrahls 5 er folgt unabhängig von der Ablenkung des Manipulationslichtstrahls 9. Die Strahlablenkvorrichtung 12 wird über Verbindung 17 von dem Steuerrechner 18 angesteuert. Die Strahlablenkvorrichtung 16 wird über die Steuerverbin dung 19 von dem Steuerrechner 18 angesteuert.

In Fig. 3 ist gezeigt, dass der Manipulationslichtstrahlengang 9 weitgehend getrennt von dem Detektionsstrahlengang 7 und dem Beleuchtungsstrahlen gang 5 verläuft. Hierbei verläuft der Beleuchtungsstrahlengang 5 bzw. der Detektionsstrahlengang 7 durch das Mikroskopobjektiv 2 und der Manipula tionslichtstrahlengang 9 verläuft durch ein zweites Mikroskopobjektiv 20, das bezüglich der Fokalebene des Mikroskopobjektivs 2 dem Mikroskopobjektiv 2 gegenüberstehend angeordnet ist.

In den Fig. 1 und 2 wird der Manipulationsstrahlengang 9 und der Detektions- /Beleuchtungsstrahlengang 7, 5 mit einem Strahlteiler 21 bzw. 13 zusammen geführt. Hierbei ist der Strahlteiler 21 aus Fig. 2 als Farbstahlteiler ausgeführt, der Licht der Manipulationslichtquelle 8 zum Mikroskopobjektiv 2 reflektiert und der für das Beleuchtungs- und Detektionslicht 5, 7 transparent ist. Der Scanspiegel 13 der Strahlablenkvorrichtung 12 aus Fig. 1 dient zur Strahlzu sammenführung des Beleuchtungs-/Detektionslichts 5, 7 und dem Manipulationslichtstrahlengang 9. Hierbei ist der Scanspiegel 13 für das Licht der Manipulationslichtquelle 8 transparent, das Beleuchtungs-/Detektionslicht 5, 7 wird an dem Scanspiegel 13 in das Mikroskopobjektiv 2 reflektiert.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Untersuchung und Manipulation von mikroskopischen Objekten 1 erfolgt die Objektmanipulation simultan zur konfokalen Objektdetektion. Während der Objektmanipulation erfolgt eine dreidimensionale Objektdetektion. Fig. 4 zeigt einen Ausschnitt eines detek tierten dreidimensionalen Objektdatensatzes in Form einer xy-Schnittebene 22. Fig. 5 zeigt einen Ausschnitt aus dem gleichen detektierten Datensatz in Form einer yz-Schnittebene 23. Die Objektmanipulation erfolgt hierbei dreidi mensional, zum einen in der strichpunktiert angedeuteten xz-Manipulations ebene 24 sowie in der ebenfalls strichpunktiert angedeuteten xz- Manipulationsebene 25. Die beiden Ebenen 24, 25 sind zur Fokalebene des Mikroskopobjektivs 2 parallel.

Die Fig. 4 und 5 zeigen die Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfah rens zur Bestimmung von Kontraktionskräften von einer Muskelzelle 26. Hier bei werden mit Hilfe zweier optischer Pinzetten 27, 28 zwei mit der Muskel zelle 26 zusammenhängende Manipulationsstellen 29, 30 eingefangen. Die Manipulationsstellen 29, 30 sind jeweils mit der Muskelzelle 26 über eine Ak tin-Verbindung 31 verbunden. Nach einer Objektmanipulation durch einen nicht eingezeichneten weiteren Manipulationslichtstrahl wird das in der Muskelzelle 26 präparierte Caged-Compuond-Release-Calcium freigesetzt, wodurch sich die Muskelzelle 26 zusammenzieht, was mit den beiden Pfeilen in den Bildausschnitten 22, 23 angedeutet ist. Die Muskelzelle 26 wird vor, während und nach der Objektmanipulation ständig detektiert, so dass die Ort sänderung der Manipulationsstellen 29, 30, die sich aufgrund der Kontraktion der Muskelzelle 26 ergeben haben, detektiert werden kann und somit eine quantitative Auswertung des Kontraktionskräfte möglich ist.

Das detektierte Objekt 1, 26 wird samt Manipulationsstelle 29, 30 auf dem Monitor 31 des Bedienerrechners 32 des konfokalen Rastermikroskops dar gestellt. Die Darstellung erfolgt hierbei zweidimensional, beispielsweise in Form der xy- und yz-Schnittebenen 22, 23 der Fig. 4 und 5. In Fig. 4 ist schematisch das Abtastmuster 36 des Beleuchtungsfokusses dargestellt, wobei zur einfacheren Darstellung das Abtastmuster in y-Richtung einen großen Abtastabstand aufweist.

In Fig. 6 ist eine xy-Schnittebene 22 einer Bildaufnahme von drei Zellen 33, 34, 35 gezeigt. Bei diesen Zellen wird die Informationsweiterleitung von Zelle zu Zelle untersucht. Hierbei werden die Zellen 34 und 35 jeweils mit UV-Licht zur Objektmanipulation beaufschlagt, wodurch in die Zellen präparierte Ca ged-Calcium-Verbindungen aufgebrochen werden und das freiwerdende Cal cium eine Reaktion in der Zelle 34 bzw. 35 auslöst. Eine Reaktion der Zelle 35 zur Zelle 33 kann ausbleiben; wenn innerhalb eines bestimmten Zeitfensters die Reizinformation der Zelle 34 bei der Zelle 33 eintrifft. Hierzu werden die beiden Zellen 34, 35 definiert zeitversetzt mit UV-Licht beaufschlagt. Dieses Zeitintervall wird bei erneuten Versuchsdurchführungen stetig verringert, bis die beiden Zellen 34, 35 quasi gleichzeitig mit UV-Licht beaufschlagt werden. Ein ebenfalls in die Zellen präparierter Fluoreszenz-Calcium-Indikator ermög licht die Detektion der Informationsweiterleitung.

Abschließend sei ganz besonders darauf hingewiesen, dass die voranstehend erörterten Ausführungsbeispiele lediglich zur Beschreibung der beanspruchten Lehre dienen, diese jedoch nicht auf die Ausführungsbeispiele einschränken.

Bezugszeichenliste

1

Objekt

2

Mikroskop, Mikroskopobjektiv

3

Beleuchtungslichtquelle

4

Beleuchtungslichtquelle

5

Beleuchtungslicht, Beleuchtungsstrahlengang von (

3

), (

4

)

6

Detektor

7

Detektionsstrahlengang, Detektionslicht

8

Manipulationslichtquelle

9

Manipulationslichtstrahlengang, Manipulationslichtstrahl

10

Strahlteiler

11

dichroitischer Strahlteiler

12

Strahlablenkvorrichtung für (

5

), (

7

)

13

Scanspiegel von (

12

)

14

Anregungspinhole

15

Detektionspinhole

16

Strahlablenkvorrichtung für (

9

)

17

Steuerverbindung zwischen (

12

) und (

18

)

18

Steuerrechner

19

Steuerverbindung zwischen (

16

) und (

18

)

20

Optik, Mikroskopobjektiv

21

Strahlteiler zum Zusammenführen von (

9

) mit (

5

), (

7

)

22

xy-Schnittebene

23

yz-Schnittebene

24

xz-Manipulationsebene

25

xz-Manipulationsebene

26

Muskelzelle

27

erste optische Pinzette

28

zweite optische Pinzette

29

eingefangene Manipulationsstelle von (

27

)

30

eingefangene Manipulationsstelle von (

28

)

31

Monitor von (

32

)

32

Bedienerrechner

33

Zelle

34

Zelle

35

Zelle

36

Abtastmuster

Claims

1. Vorrichtung zur Untersuchung und Manipulation von mikroskopischen Objekten (1), mit einem Mikroskop (2), einer zur Beleuchtung des Objekts (1) dienenden Lichtquelle (3, 4), einem Beleuchtungsstrahlengang (5), ei nem zur Detektion des vom Objekt (1) zurückkehrenden Lichts dienenden Detektor (6), einem Detektionsstrahlengang (7), einer zur Objektmanipula tion dienenden Lichtquelle (8) und einem Manipulationslichtstrahlengang (9), dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroskop ein konfokales Rastermikroskop ist.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens zwei Strahlablenkvorrichtungen (12, 16) vorgesehen sind.

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass eine Strahlablenkvorrichtung (12) den Beleuchtungslichtstrahl (5) ablenkt.

4. Vorrichtung nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass eine Strahlablenkvorrichtung (16) den Manipulationslichtstrahl (9) ablenkt.

5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Ablen kung des Beleuchtungslichtstrahls (5) unabhängig von der Ablenkung des Manipulationslichtstrahls (9) erfolgt.

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Manipulationslichtstrahlengang (9) und Detektions-/Beleuch tungsstrahlengang (7, 5) weitgehend getrennt voneinander verlaufen.

7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Detek tions-/Beleuchtungsstrahlengang (7, 5) durch ein Mikroskopobjektiv (2) verläuft und der Manipulationslichtstrahlengang (9) durch eine Optik (20) verläuft, die bezüglich der Fokalebene des Mikroskopobjektivs (2) dem Mi kroskopobjektiv (2) gegenüberstehend angeordnet ist.

8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Manipulationslichtstrahlengang (9) und der Detektions- /Beleuchtungsstrahlengang (7, 5) mit einem Strahlteiler (21, 13) zusam menführbar ist.

9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Strahl teiler (21) als Farbstahlteiler oder als Polarisationsstrahlteiler ausgeführt ist.

10. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass zur Strahlzu sammenführung ein Scanspiegel (13) einer Strahlablenkvorrichtung (12) dient.

11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Fokusposition des Manipulationslichts (9) entlang der optischen Achse veränderbar ist.

12. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Verän derung der Fokusposition durch zwischen Lichtquelle (8) und Objekt (1) verschiebbar angeordnete Fokussiermittel erfolgt.

13. Vorrichtung nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Veränderung der Manipulationslichtfokusposition mit einer Veränderung der Beleuchtungslichtfokusposition einhergeht.

14. Vorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Verän derung der beiden Fokuspositionen simultan erfolgt.

15. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Fokus veränderung durch eine gemeinsame Objektivrevolverscananordnung er folgt.

16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Manipulationslichtstrahl als optische Pinzette (27, 28) und/oder als Nannoskalpell dient.

17. Vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass zur Verän derung der Form des Manipulationslichtfokusses eine Zoom-Optik im Ma nipulationslichtstrahlengang (9) vorgesehen ist.

18. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Strahlablenkvorrichtung bzw. die Strahlablenkvorrichtungen (12, 16) an der Mikroskopschnittstelle für die konventionelle Auflichtbeleuch tung und/oder an einer zusätzlichen Schnittstelle am Mikroskop ankoppel bar sind.

19. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass zum Einkoppeln des Beleuchtungs- und/oder Manipulationslichts mindestens ein spektral selektives Element dient.

20. Vorrichtung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass mit dem spektral selektiven Element Licht mindestens einer bestimmten Wellen länge selektierbar und einkoppelbar ist und/oder die Lichtleistung des ein zukoppelnden Lichts variierbar ist.

21. Vorrichtung nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass das spektral selektive Element ein AOTF (Acousto-Optical-Tunable-Filter), AOBS (Acousto-Optical-Beam-Splitter), AOD (Acousto-Optical-Deflector) und/oder EOM (Electro-Optical-Modulator) umfasst und von einem Steuerrechner vorzugsweise in Abhängigkeit der Beleuchtungs- und/oder Manipulationsstrahlposition ansteuerbar ist.

22. Verfahren zur Untersuchung und Manipulation von mikroskopischen Ob jekten (1), mit einem Mikroskop (2), einer zur Beleuchtung des Objekts (1) dienenden Lichtquelle (3, 4), einem Beleuchtungsstrahlengang (5), einem zur Detektion des vom Objekt (1) zurückkehrenden Lichts dienenden De tektor (6), einem Detektionsstrahlengang (7), einer zur Objektmanipulation dienenden Lichtquelle (8) und einem Manipulationslichtstrahlengang (9), vorzugsweise unter Verwendung einer Vorrichtung nach einem der An sprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroskop auch als konfokales Rastermikroskop arbeitet.

23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Objekt manipulation simultan zur konfokalen Objektdetektion erfolgt.

24. Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, dass ein Objekt während der Manipulation dreidimensional detektiert wird.

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Objektmanipulation dreidimensional erfolgt, insbesondere auch in den zu der Fokalebene des Mikroskopobjektivs (2) parallelen Ebenen (24, 25).

26. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass eine Bestimmung der Bindungskräfte zwischen einzelnen Objekten oder Objektbereichen erfolgt.

27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass mit Hilfe der optischen Pinzette (27, 28) mindestens zwei mit dem Objekt (26) oder Objektbereich zusammenhängende Manipulationsstellen (29, 30) einge fangen und im eingefangenen Zustand ausgelenkt werden.

28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass das Objekt (26) oder die Objektbereiche und/oder die Auslenkung der Manipulations stellen (29, 30) detektiert wird, vorzugsweise durch konfokale Objektde tektion.

29. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass mit Hilfe der optischen Pinzette (27, 28) mindestens zwei mit dem Objekt (26) oder Objektbereich zusammenhängende Manipulationsstellen (29, 30) einge fangen und dass bei einer Objektmanipulation eine Veränderung der Ma nipulationsstellen (29, 30) und/oder des Objekts (26) detektiert werden.

30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass die Objekt manipulation durch den Manipulationslichtstrahl induziert wird.

31. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass der Manipulationslichtstrahl das Ausbleichen von Fluoreszenzfarb stoffen und/oder das Freisetzen von Caged-Compound-Verbindungen in duziert.

32. Verfahren nach Anspruch 30 oder 31, dadurch gekennzeichnet, dass die Objektmanipulation zur Untersuchung der Informationsweitergabe von Zelle zu Zelle (33, 34, 35) dient.

33. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass das detektierte Objekt (26) samt Manipulationsstellen (29, 30) vor zugsweise an einem Monitor (31) dargestellt wird.

34. Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass die Darstel lung zwei- und/oder dreidimensional erfolgt.

35. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass der perspek tivische Ansichtspunkt der dreidimensionalen Darstellung frei gewählt wird.

36. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 35, dadurch gekennzeichnet, dass von dem Objekt Fluoreszenz- und/oder Reflexionslicht detektiert wird.

37. Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass ein Objekt mit Methoden der Mehrphotonenanregung zur Fluoreszenz angeregt wird.

38. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 37, dadurch gekennzeichnet, dass ein Objekt simultan mit mindestens zwei Lichtstrahlen abgetastet wird, die von jeweils unterschiedlichen Strahlablenkvorrichtungen abge lenkt werden.

39. Verfahren nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, dass die Strahl ablenkvorrichtungen synchron zueinander arbeiten.

40. Verfahren nach Anspruch 38 oder 39, dadurch gekennzeichnet, dass ein Lichtstrahl zur Einphotonenanregung und ein zweiter Lichtstrahl zur Mehr photonenanregung des Fluoreszenzobjekts dient.

41. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 40, dadurch gekennzeichnet, dass zur schnellen Bildaufnahme das Objekt mit mehreren Beleuchtungs foki oder mit einem linienförmigen Beleuchtungsmuster abgetastet wird.

42. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 41, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein zwei- oder dreidimensionaler Teilbereich des Objekts festgelegt wird, der mit erhöhter Photonenstatistik, mit verminderter Ab tastgeschwindigkeit und/oder mit höherer Ortsauflösung detektiert wird.

43. Verfahren nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, dass der übrige Bereich mit verminderter Photonenstatistik, mit erhöhter oder maximaler Abtastgeschwindigkeit und/oder mit verminderter Ortsauflösung detektiert wird.

44. Verfahren nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, dass der übrige Bereich überhaupt nicht detektiert wird und dass der Beleuchtungsstrahl derart abgelenkt wird, dass er ausgehend von einem Teilbereich einen anderen Teilbereich auf dem kürzesten Weg erreicht.