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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Untersuchung von biologischen
Proben mit einem Rastermikroskop.
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Die
Erfindung betrifft auch ein Rastermikroskop mit mindestens einer
Lichtquelle zur Erzeugung eines Manipulationslichtstrahls und eines
Anregungslichtstrahls, die nacheinander mit einem zeitlichen Abstand
mindestens einen Rasterpunkt beleuchten und mit einem Detektor zum
Messen der Lichtleistung von von dem mindestens einen Rasterpunkt
ausgehendem Fluoreszenzlicht.
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In
der Scanmikroskopie wird eine Probe mit einem Lichtstrahl beleuchtet,
um das von der Probe emittierte Reflexions- oder Fluoreszenzlicht
zu beobachten. Der Fokus eines Beleuchtungslichtstrahles wird mit
Hilfe einer steuerbaren Strahlablenkeinrichtung, im Allgemeinen
durch Verkippen zweier Spiegel, in einer Objektebene bewegt, wobei
die Ablenkachsen meist senkrecht aufeinander stehen, so dass ein
Spiegel in x-, der andere in y-Richtung ablenkt. Die Verkippung
der Spiegel wird beispielsweise mit Hilfe von Galvanometer-Stellelementen
bewerkstelligt. Die Leistung des vom Objekt kommenden Lichtes wird
in Abhängigkeit
von der Position des Abtaststrahles gemessen. Üblicherweise werden die Stellelemente
mit Sensoren zur Ermittlung der aktuellen Spiegelstellung ausgerüstet.
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Speziell
in der konfokalen Scanmikroskopie wird ein Objekt mit dem Fokus
eines Lichtstrahles in drei Dimensionen abgetastet.
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Ein
konfokales Rastermikroskop umfasst im Allgemeinen eine Lichtquelle,
eine Fokussieroptik, mit der das Licht der Quelle auf eine Lochblende – die sog.
Anregungsblende – fokussiert
wird, einen Strahlteiler, eine Strahlablenkeinrichtung zur Strahlsteuerung,
eine Mikroskopoptik, eine Detektionsblende und die Detektoren zum
Nachweis des Detektions- bzw. Fluoreszenzlichtes. Das Beleuchtungslicht wird über einen
Strahlteiler eingekoppelt. Das vom Objekt kommende Fluoreszenz-
oder Reflexionslicht gelangt über
die Strahlablenkeinrichtung zurück
zum Strahlteiler, passiert diesen, um anschließend auf die Detektionsblende
fokussiert zu werden, hinter der sich die Detektoren befinden. Detektionslicht,
das nicht direkt aus der Fokusregion stammt, nimmt einen anderen
Lichtweg und passiert die Detektionsblende nicht, so dass man eine
Punktinformation erhält,
die durch sequentielles Abtasten des Objekts zu einem dreidimensionalen
Bild führt.
Meist wird ein dreidimensionales Bild durch schichtweise Bilddatennahme
erzielt, wobei die Bahn des Abtastlichtstrahles auf bzw. in dem
Objekt idealerweise einen Mäander
beschreibt. (Abtasten einer Zeile in x-Richtung bei konstanter y-Position,
anschließend
x-Abtastung anhalten und per y-Verstellung
auf die nächste
abzutastende Zeile schwenken und dann, bei konstanter y-Position,
diese Zeile in negativer x-Richtung abtasten u.s.w.). Um eine schichtweise
Bilddatennahme zu ermöglichen,
wird der Probentisch oder das Objektiv nach dem Abtasten einer Schicht
verschoben und so die nächste
abzutastende Schicht in die Fokusebene des Objektivs gebracht.
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Beim
Untersuchen von biologischen Proben mit der sogenannten FRAP (Fluorescence
recovery after photobleaching) wird das zeitliche Erholungsverhalten
eines Probenbereichs nach einem Ausbleichprozess untersucht. Aus
DE 102 33 549 A1 ist ein
Scanmikroskop, das unter anderem für FRAP-Untersuchungen eingesetzt
werden kann, bekannt. Das Scanmikroskop weist eine Lichtquelle,
die einen Beleuchtungslichtstrahl zum Beleuchten einer Probe emittiert
auf. Der Beleuchtungslichtstrahl verläuft entlang eines Beleuchtungsstrahlenganges
und ist mit einer Strahlablenkeinrichtung über bzw. durch eine Probe führbar. Es
ist eine weitere Lichtquelle, die einen Manipulationslichtstrahl
emittiert vorgesehen, der entlang eines Manipulationsstrahlenganges verläuft. Sowohl
der Manipulationslichtstrahl als auch der Beleuchtungslichtstrahl
werden von der Strahlablenkeinrichtung über bzw. durch die Probe geführt.
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Aus
US 6,094,300 ist ein Laserscanningmikroskop
mit mindestens zwei Lichtquellen und zwei Strahlablenkeinrichtungen
bekannt. Jeder der Lichtquellen ist einer Strahlablenkeinrichtung
zugeordnet. Die von den Lichtquellen emittierten Laserlichtbündel können mit
den beiden Strahlablenkeinrichtungen unabhängig voneinander die Probe
abscannen.
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Aus
US 2002/0196535 A1 ist ein Verfahren zum Abscannen eines interessierenden
Bereichs einer Probe bekannt, wobei unterschiedliche Abtastlinien
unter unterschiedlichen Beleuchtungsbedingungen abgetastet werden.
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Es
ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Untersuchung
von biologischen Proben mit einem Rastermikroskop anzugeben, das
es ermöglicht,
anhand bislang nicht genutzter Parameter Aussagen über die
Eigenschaften und/oder die Beschaffenheit einer Probe bzw. eines Probenbereichs
zu machen.
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Diese
Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, das durch die folgenden
Schritte gekennzeichnet ist:
- a) Beleuchten
mindestens eines Rasterpunktes mit einem Manipulationslichtstrahl
und in einem zeitlichen Abstand mit einem Anregungslichtstrahl,
- b) Messen der Leistung von von dem mindestens einen Rasterpunkt
ausgehenden Fluoreszenzlicht,
- c) Zuordnen der gemessenen Leistung zu dem zeitlichen Abstand
in einem Datensatz,
- d) Beleuchten des mindestens einen Rasterpunktes und/oder mindestens
eines anderen Rasterpunktes mit dem Manipulationslichtstrahl und
in einem veränderten
zeitlichen Abstand mit dem Anregungslichtstrahl,
- e) Messen der Leistung von von dem mindestens einen Rasterpunkt
und/oder von von dem anderen Rasterpunkt ausgehenden Fluoreszenzlicht, und
- f) Zuordnen der gemessenen Leistung zu dem veränderten
zeitlichen Abstand in dem Datensatz.
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Es
ist eine weitere Aufgabe der Erfindung ein Scanmikroskop anzugeben,
das es ermöglicht,
bislang nicht genutzte Parameter zur Beurteilung der Eigenschaften
und/oder der Beschaffenheit einer Probe zu ermitteln und dem Benutzer
bereitzustellen.
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Diese
Aufgabe wird durch ein Scanmikroskop gelöst, das dadurch gekennzeichnet
ist, dass der Manipulationslichtstrahl und der Anregungslichtstrahl wiederholt
nacheinander auf Rasterpunkte richtbar sind und dass das Rastermikroskop
ein Veränderungsmittel
zur Veränderung
des zeitlichen Abstandes, eine Verarbeitungseinheit, die die jeweils
gemessene Leistung dem jeweiligen zeitlichen Abstand zuordnet und
so einen Datensatz erzeugt, und ein Datenbankmodul zum Ablegen des
Datensatzes umfasst.
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Die
Erfindung hat den Vorteil, dass die bei herkömmlichen Bleichexperimenten
lange Zeitspanne zwischen dem Bleichen und der Aufnahme der ersten
Daten nach dem Bleichen erfindungsgemäß drastisch reduziert ist.
Vorteilhafterweise können
mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
Dunkelzustände untersucht
werden. Dies war bislang rastermikroskopisch nicht oder nur indirekt
möglich.
Bislang wurde davon ausgegangen, dass die Fluorophore im ausgebleichten
Probenbereich weitgehend vollständig
irreversibel zerstört
werden, beispielsweise durch Bildung von Radikalen. Tatsächlich erfolgt
jedoch in der Regel auch eine Anregung in längerlebige Zustände (Größenordnung: μs), was jedoch
bislang mit einem Rastermikroskop nicht beobachtet werden konnte.
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In
einer bevorzugten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird mindestens
ein Rasterpunkt wiederholt nacheinander mit einem Manipulationslichtstrahl
und einem Anregungslichtstrahl beleuchtet. Der zeitliche Abstand
der Beleuchtung mit dem Manipulationslichtstrahl und der Beleuchtung mit
dem Anregungslichtstrahl wird verändert und die Ausbeute an Fluoreszenzlicht
in Abhängigkeit
von dem zeitlichen Abstand gemessen. Aus der Abhängigkeit der Ausbeute an Fluoreszenzlicht
vom zeitlichen Abstand lassen sich Rückschlüsse auf die Eigenschaften und/oder
die Beschaffenheit der Probe ziehen.
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Beispielsweise
bei FCS-Untersuchungen (Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie) spielen die langlebigen
Triplet-Zustände
eine sehr störende Rolle,
da ein Flurorphor, das in einen Triplet-Zustand angeregt ist, lange
Zeit unsichtbar erscheint. Das erfindungsgemäße Verfahren kann daher sinnvoll
zur Auswertung von FCS-Untersuchungen verwendet werden.
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Der
Datensatz kann durch einfaches oder mehrfaches Wiederholen der Schritte
d)–f)
bei jeweils weiter verändertem
zeitlichen Abstand, wobei der mindestens eine und/oder jeweils andere
Rasterpunkte beleuchtet werden.
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In
einer bevorzugten Ausgestaltungsvariante ist der gewonnene Datensatz
graphisch, beispielsweise in einem x-y-Diagramm darstellbar.
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Der
Manipulationslichtstrahl und der Anregungslichtstrahl können in
einer Ausgestaltungsvariante je einen Anteil gleicher Wellenlänge aufweisen. In
einer anderen Ausgestaltungsvariante weist der Manipulationslichtstrahl
und der Anregungslichtstrahl zumindest je einen Anteil unterschiedlicher
Wellenlänge
auf.
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In
einer ganz besonders bevorzugten Ausgestaltungsvariante bleicht
der Manipulationslichtstrahl die Probe in einem zuvor ausgewählten Probenbereich
aus.
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In
einer anderen Variante dient der Manipulationslichtstrahl zum gezielten
Aktivieren von Fluoreszenzfarbstoffen und/oder zum Freisetzen von Fluoreszenzfarbstoffen.
Bei den Fluoreszenzfarbstoffen kann es sich vorzugsweise um photoaktivierbare
fluoreszierende Proteine und/oder um Moleküle, die durch Lichteinwirkung
ein- oder ausgeschaltet werden können,
handeln. Es ist in einer Variante ermöglicht, mit dem Manipulationslichtstrahl
einen Fluoreszenzfarbstoff (z.B. GFP) zu aktivieren, also gewissermaßen „anzuschalten". Der Manipulationslichtstrahl kann
hierfür
beispielsweise eine Wellenlänge
von 405 nm aufweisen. Es kommt durch diese Manipulation zu einer Änderung
im Fluoreszenzfarbstoff, der dann mit dem Anregungslichtstrahl,
der beispielsweise eine Wellenlänge
um 480 nm aufweisen kann, anregbar ist. Die Emission von Fluoreszenzlicht
erfolgt im genannten Beispiel bei etwa 520 nm. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
kann verfolgt werden, wie schnell eine Photoaktivierung (Konformationsänderung)
stattfindet. Es ist erfindungsgemäß ermöglicht, gewissermaßen ein
Messprotokoll der Photoaktivierung zu erstellen.
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Vorteilhafterweise
werden die Detektoren des erfindungsgemäßen Scanmikroskops durch das Licht
des Manipulationslichtstrahls nicht „geblendet", weil diese erfindungsgemäß nur Licht
von den Rasterpunkten empfangen können, die gerade von dem Anregungslichtstrahl
beleuchtet werden. Eine Detektortotzeit gibt es bei dem erfindungsgemäßen Scanmikroskop
daher nicht, so dass wie bereits erwähnt, auch die Zustände, die
bei einem Bleichvorgang angeregt werden (Lebensdauer im Bereich
von μs)
untersucht werden können.
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In
einer bevorzugten Variante wird die Position des Manipulationslichtstrahls
in der Probe (also die Ausrichtung auf den zu beleuchtenden Rasterpunkt)
mit einer Strahlablenkeinrichtung gesteuert. Die Strahlablenkeinrichtung
kann beispielsweise aus einem oder mehreren Galvanometerspiegeln
gebildet sein.
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In
einer Variante ist eine weitere Strahlablenkeinrichtung vorgesehen,
die die Position des Anregungslichtstrahls in der Probe steuert.
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Besonders
bevorzugt ist eine Variante, bei der die Position des Anregungslichtstrahls
in der Probe mit der einen Strahlablenkeinrichtung, die auch die
Position des Manipulationslichtstrahls in der Probe steuert, gesteuert wird.
In dieser Variante sind sowohl der Manipulationslichtstrahls als
auch der Anregungslichtstrahl über
die Strahlablenkeinrichtung geführt
und weisen vorzugsweise einen von Null Grad verschiedenen Winkel
zueinander auf, so dass der zeitliche Abstand durch Variieren dieses
Winkels veränderbar
ist. Beispielsweise kann der Winkel von Zeile zu Zeile geändert werden,
um für
jede Zeile einen anderen zeitlichen Abstand einzustellen.
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Vorzugsweise
wird der Manipulationslichtstrahl und der Anregungslichtstrahl zeilenweise über oder
durch die Probe geführt.
Die Scanbahn kann hierbei vorzugsweise mäanderförmig ausgebildet sein. Bei
schneller Scanbewegung wird sich diese Mäanderform naturgemäß aufgrund
der Trägheit
der Strahlablenkeinrichtung der Form einer Sinuskurve annähern.
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Durch
Variieren der Ablenkgeschwindigkeit der Strahlablenkeinrichtung
kann in einer besonderen Ausgestaltungsvariante der zeitliche Abstand zwischen
dem Beleuchten mit dem Manipulationslichtstrahl und dem Beleuchten
mit dem Anregungslichtstrahl variiert werden.
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In
einer anderen Ausgestaltungsform wird der Manipulationslichtstrahl über eine
Strahlablenkeinrichtung und der Anregungslichtstrahl über eine weitere
Strahlablenkeinrichtung geführt.
Die eine Strahlablenkeinrichtung und die weitere Strahlablenkeinrichtung
sind vorzugsweise aufeinander synchronisiert, so dass der zeitliche
Abstand durch Variieren der Phase zwischen der einen Strahlablenkeinrichtung
und der weiteren Strahlablenkeinrichtung verändert werden kann.
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In
einer Variante erfolgt die Beleuchtung mit dem Manipulationslichtstrahl
beim Zeilenhinlauf und die Beleuchtung mit dem Anregungslichtstrahl
beim Zeilenrücklauf.
In dieser Variante kann der zeitliche Abstand durch Variieren des
räumlichen
Abstandes des zu beleuchtenden Rasterpunktes zum Umkehrpunkt zum
Zeilenhinlauf und Zeilenrücklauf
erfolgen. Vorzugsweise liegen die beleuchteten Rasterpunkte auf
einer Bilddiagonalen.
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Vorzugsweise
umfasst das erfindungsgemäße Rastermikroskop
einen Multibanddetektor. Kombiniert man zwei unterschiedliche Fluorchrome
auf ein und demselben Protein oder Molekül-Carrier, erhält man eine
einzige Diffusionsrate bei FCS-Untersuchungen in zwei Farbkanälen, jedoch
gegebenenfalls unterschiedliche Aussagen über die Dunkelzustände.
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Vorzugsweise
ist das Rastermikroskop als konfokales Rastermikroskop ausgebildet.
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In
den Zeichnungen ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt
und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben, wobei gleich wirkende
Bauteile mit denselben Bezugszeichen versehen sind. Dabei zeigt:
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1 Ein
erfindungsgemäßes Rastermikroskop,
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2 ein
anderes erfindungsgemäßes Rastermikroskop,
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3 eine
Illustration des Beleuchtungsvorgangs von Rasterpunkten gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren
und
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4 ein
weiteres erfindungsgemäßes Rastermikroskop.
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1 zeigt
ein erfindungsgemäßes Rastermikroskop
mit einer ersten Lichtquelle 1 und einer weiteren Lichtquelle 2,
die Lichtstrahlen 3, 5 unterschiedlicher Wellenlängen emittieren
die von einem dichromatischen Strahlteiler 7 zu einem Anregungslichtstrahl 9 vereinigt
werden. Das Rastermikroskop beinhaltet eine dritte Lichtquelle 11,
die einen Manipulationslichtstrahl 13 emittiert. Der Manipulationslichtstrahl 13 gelangt
zur Strahlablenkeinrichtung 15, die einen kardanisch aufgehängten Scanspiegel 17 beinhaltet
und von dieser über
den Umlenkspiegel 19 und den Neutralstrahlteiler 21, über die
in dieser Darstellung nicht gezeigte Scanoptik und die nicht gezeigte
Tubusoptik zum Mikroskopobjektiv 22, das den Manipulationslichtstrahl 13 auf
die Probe 23 fokussiert. Die Position des Manipulationslichtstrahls 13 in
der Probe bzw. die Position des Fokus des Manipulationslichtstrahls 13 in
der Probe 23 ist mit Hilfe der Strahlablenkeinrichtung 15 einstellbar.
Der Anregungslichtstrahl 9 passiert die Beleuchtungslochblende 25 und
gelangt zum Hauptstrahlteiler 27, der den Anregungslichtstrahl
zur weiteren Strahlablenkeinrichtung 29, die einen weiteren
kardanisch aufgehängten
Scanspiegel 31 beinhaltet, lenkt. Die weitere Strahlablenkeinrichtung 29 führt den
Anregungslichtstrahl durch den Neutralstrahlteiler 21,
die nicht gezeigte Scanoptik und die nicht gezeigte Tubusoptik hindurch
und zum Mikroskopobjektiv 21, das den Anregungslichtstrahl
auf die Probe 23 fokussiert. Die Position des Fokus des
Anregungslichtstrahls in der Probe 23 ist mit der weiteren
Strahlablenkeinrichtung 29 einstellbar. In der gezeigten
Ausgestaltungsvariante ist vorgesehen, dass der Manipulationslichtstrahl 13 und
der Anregungslichtstrahl 9 zeilenweise über das abzurasternde Scanfeld
geführt
werden, wobei der Fokus des Manipulationslichtstrahls 13 dem
Fokus des Anregungslichtstrahls 9 vorauseilt. Die Strahlablenkeinrichtung 15 und
die weitere Strahlablenkeinrichtung 29 sind über die
elektronische Einheit 33 aufeinander synchronisiert. Durch Einstellen
der relativen Phase zwischen den beiden strahlablenkenden kardanisch
aufgehängten
Scanspiegeln 17 und 31 läßt sich der zeitliche Abstand des
Eintreffens des Fokus des Manipulationslichtstrahls 13 und
des Fokus des Anregungslichtstrahls 9 an einem zu beleuchtenden
Rasterpunkt einstellen. Das von der Probe ausgehende Fluoreszenzlicht 35 gelangt
durch das Mikroskopobjektiv 21, den Neutralstrahlteiler 21, über die
weitere Strahlablenkeinrichtung 29 zurück zum Hauptstrahlteiler 27,
passiert diesen und die nachfolgende Detektionslochblende 37 und
gelangt schließlich
zu dem Detektor 39, der als Multibanddetektor 41 ausgeführt ist.
Im Detektor 39 werden wellenlängenspezifisch in mehreren
Wellenlängenkanälen elektrische
zur jeweiligen Lichtleistung der Fluoreszenzlichtanteile proportionale
elektrische Signale erzeugt und an eine Verarbeitungseinheit 43 weitergegeben.
Die Verarbeitungseinheit 43 ordnet die gemessenen Leistungen
den jeweiligen zeitlichen Abständen
zwischen Manipulationslichtstrahl 13 und Anregungslichtstrahl 9 zu
und erzeugt einen Datensatz, der an einen PC 45 weitergeben wird,
auf dessen Monitor 47 die Abhängigkeit der Fluoreszenzlichtausbeute
vom zeitlichen Abstand graphisch dargestellt wird.
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2 zeigt
ein anderes erfindungsgemäßes Rastermikroskop
mit einer Lichtquelle 1, die einen Anregungslichtstrahl 9 erzeugt,
der nach Passieren der Beleuchtungslochblende 25 vom Hauptstrahlteiler 27 zur Strahlablenkeinrichtung 15,
die einen kardanisch aufgehängten
Scanspiegel 17 beinhaltet, gelenkt wird. Die Strahlablenkeinrichtung 15 führt den Anregungslichtstrahl 9 durch
die Scanoptik 49, die Tubusoptik 51 und durch
das Mikroskopobjektiv 21 hindurch über bzw. durch die Probe 23.
Das erfindungsgemäße Rastermikroskop
umfasst eine weitere Lichtquelle 11, die einen Manipulationslichtstrahl 13 emittiert,
der ebenfalls von der Strahlablenkeinrichtung 15 durch
die Scanoptik 49, die Tubusoptik 51 und durch
das Mikroskopobjektiv 21 über bzw. durch die Probe 23 geführt wird.
Vor dem Eintreffen auf der Strahlablenkeinrichtung 15 weisen
der Manipulationslichtstrahl 13 und der Anregungslichtstrahl 9 einen
Winkel Θ zueinander
auf. Dieser Winkel legt den räumlichen
Abstand der Fokusse des Manipulationslichtstrahl 13 und
des Anregungslichtstrahls 9 in der Probe fest. Aus der
Kenntnis der Strahlablenkgeschwindigkeit ergibt sich hieraus der
zeitliche Abstand des Eintreffens des Manipulationsichtstrahls 13 und
des Anregungslichtstrahls 9 an einem zu beleuchtenden Rasterpunkt.
Dieser zeitliche Abstand läßt sich
durch Verändern
des Winkels einstellen. Zum Einstellen des Winkels Θ wird der
Manipulationslichtstrahls 13 mit einem ersten einstellbaren
Umlenkspiegel 53 und einem zweiten einstellbaren Umlenkspiegel 55 geführt. Der
erste und der zweite einstellbare Umlenkspiegel 53, 55 werden
so eingestellt, dass der Manipulationslichtstrahls 13,
den kardanisch aufgehängten
Scanspiegel 17 unabhängig
vom Winkel Θ stets
an der selben Stelle trifft. Das von der Probe ausgehende Fluoreszenzlicht 35 gelangt durch
das Mikroskopobjektiv 21, die Tubusoptik 51, die
Scanoptik 49 über
die Strahlablenkeinrichtung 15 sowie zurück zum Hauptstrahlteiler 27,
passiert diesen und die nachfolgende Detektionslochblende 37 und
gelangt schließlich
zum Detektor 39, der elektrische zur Lichtleistung des
Fluoreszenzlichts proportionale Signale erzeugt und an eine Verarbeitungseinrichtung 43 weitergibt.
In der Verarbeitungseinrichtung 43 werden die Detektionssignale
den jeweiligen Zeitlichen Abständen
zugeordnet und an einen PC 45 mit einem Monitor 47 übergeben.
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In 3 sind
exemplarisch die ersten drei Scanzeilen 57, 59, 61 eines
abzurasternden Scanfeldes 63 dargestellt. Beim Abrastern
der ersten Scanzeile 57 weist der Manipulationslichtstrahlfokus 65 einen
Abstand von drei Rasterpunkten zu dem Anregungslichtstrahlfokus 67 auf.
Der Manipulationslichtstrahlfokus 65 und der Anregungslichtstrahlfokus 67 werden
gemeinsam in konstantem Abstand entlang der Scanzeile 57 geführt. Aus
dem räumlichen
Abstand des Manipulationslichtstrahlfokus 65 zu dem Anregungslichtstrahlfokus 67 (in
diesem Fall drei Rasterpunkte) und aus der Scangeschwindigkeit,
mit der die Fokusse über
die Scanzeile 57 geführt
werden, läßt sich
der zeitliche Abstand des Eintreffens der beiden Fokusse am zu beleuchtenden
Rasterpunkt 69 errechnen. Beim Abrastern der zweiten Scanzeile 59 ist
der räumliche
Abstand des Manipulationslichtstrahlfokus 65 zu dem Anregungslichtstrahlfokus 67 um
einen Rasterpunkt vergrößert worden.
Hierdurch vergrößert sich
bei vorausgesetzt konstanter Scangeschwindigkeit auch der zeitliche Abstand
des Eintreffens der Fokusse am zu beleuchtenden weiteren Rasterpunkt 71.
Der Manipulationslichtstrahlfokus 65 und der Anregungslichtstrahlfokus 67 können beispielsweise
mit einem Rastermikroskop, wie es in 2 dargestellt
ist, von einer Strahlablenkeinrichtung 15 gemeinsam geführt werden. Bei
der in 2 gezeigten Anordnung gelangt kein reflektiertes
Manipulationslicht zum Detektor 39, da der Detektor stets
nur das Licht empfangen kann, das von dem Rasterpunkt ausgeht, der
gerade vom Anregungslichtstrahl beleuchtet wird. Woanders „schaut der
Detektor nicht hin".
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4 zeigt
ein weiteres erfindungsgemäßes Rastermikroskop.
Das Rastermikroskop weist einen UV-Laser 73 auf. Der Lichtstrahl 77 des
UV-Laser 73, wird
bei diesem Rastermikroskop normalerweise zum Anregen der Probe im üblichen
Imaging-Modus verwendet. In dieser Ausführungsvariante wird der Lichtstrahl 77 jedoch
als Manipulationslichtstrahl 13 verwendet. als Durch Verkippen
der Pinholeoptik 75 im Strahlengang des Lichtstrahls 77 trifft
der Lichtstrahl 77 unter einem Winkel Θ auf den Scanspiegel 17.
Der Winkel Θ und
damit der zeitliche Abstand lässt
sich durch Verstellen (laterale Verschiebung und/oder Verkippung)
der Pinholeoptik 75 variieren.
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Die
Erfindung wurde in Bezug auf eine besondere Ausführungsform beschrieben. Es
ist jedoch selbstverständlich,
dass Änderungen
und Abwandlungen durchgeführt
werden können,
ohne dabei den Schutzbereich der nachstehenden Ansprüche zu verlassen.
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- 1
- Lichtquelle
- 2
- weitere
Lichtquelle
- 3
- Lichtstrahl
- 5
- Lichtstrahl
- 7
- dichromatischer
Strahlteiler
- 9
- Anregungslichtstrahl
- 11
- dritte
Lichtquelle
- 13
- Manipulationslichtstrahl
- 15
- Strahlablenkeinrichtung
- 17
- Scanspiegel
- 19
- Umlenkspiegel
- 21
- Neutralstrahlteiler
- 22
- Mikroskopobjektiv
- 23
- Probe
- 25
- Beleuchtungslochblende
- 27
- Hauptstrahlteiler
- 29
- weitere
Strahlablenkeinrichtung
- 31
- weiterer
Scanspiegel
- 33
- elektronische
Einheit
- 35
- Fluoreszenzlicht
- 37
- Detektionslochblende
- 39
- Detektor
- 41
- Multibanddetektor
- 43
- Verarbeitungseinheit
- 45
- PC
- 47
- Monitor
- 49
- Scanoptik
- 51
- Tubusoptik
- 53
- erster
einstellbarer Umlenkspiegel
- 55
- zweiter
einstellbarer Umlenkspiegel
- 57
- erste
Scanzeile
- 59
- zweite
Scanzeile
- 61
- dritte
Scanzeile
- 63
- Scanfeld
- 65
- Manipulationslichtstrahlfokus
- 67
- Anregungslichtstrahlfokus
- 69
- Rasterpunkt
- 71
- weiterer
Rasterpunkt
- 73
- UV-Laser
- 75
- Pinholeoptik
- 77
- Lichtstrahl