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Die Erfindung betrifft ein Verfahren
zum Kalibrieren eines Spektraldetektors in einem Scanmikroskop.
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Die Erfindung betrifft außerdem eine
Vorrichtung zum Kalibrieren eines Spektraldetektors.
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In der Scanmikroskopie wird eine
Probe mit einem Lichtstrahl beleuchtet, um das von der Probe emittierte
Reflexions- oder Fluoreszenzlicht zu beobachten. Der Fokus eines
Beleuchtungslichtstrahles wird mit Hilfe einer steuerbaren Strahlablenkeinrichtung,
im Allgemeinen durch Verkippen zweier Spiegel, in einer Objektebene
bewegt, wobei die Ablenkachsen meist senkrecht aufeinander stehen,
so dass ein Spiegel in x-, der andere in y-Richtung ablenkt. Die
Verkippung der Spiegel wird beispielsweise mit Hilfe von Galvanometer-Stellelementen
bewerkstelligt. Die Leistung des vom Objekt kommenden Lichtes wird
in Abhängigkeit
von der Position des Abtaststrahles gemessen. Üblicherweise werden die Stellelemente
mit Sensoren zur Ermittlung der aktuellen Spiegelstellung ausgerüstet.
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Speziell in der konfokalen Scanmikroskopie wird
ein Objekt mit dem Fokus eines Lichtstrahles in drei Dimensionen
abgetastet.
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Ein konfokales Rastermikroskop umfasst
im Allgemeinen eine Lichtquelle, eine Fokussieroptik, mit der das
Licht der Quelle auf eine Lochblende – die sog. Anregungsblende – fokussiert
wird, einen Strahlteiler, eine Strahlablenkeinrichtung zur Strahlsteuerung,
eine Mikroskopoptik, eine Detektionsblende und die Detektoren zum
Nachweis des Detektions- bzw. Fluoreszenzlichtes. Das Beleuchtungslicht wird über einen
Strahlteiler eingekoppelt. Das vom Objekt kommende Fluoreszenz-
oder Reflexionslicht gelangt über
die Strahlablenkeinrichtung zurück
zum Strahlteiler, passiert diesen, um anschließend auf die Detektionsblende
fokussiert zu werden, hinter der sich die Detektoren befinden. Detektionslicht,
das nicht direkt aus der Fokusregion stammt, nimmt einen anderen
Lichtweg und passiert die Detektionsblende nicht, so dass man eine
Punktinformation erhält,
die durch sequentielles Abtasten des Objekts zu einem dreidimensionalen
Bild führt.
Meist wird ein dreidimensionales Bild durch schichtweise Bilddatennahme
erzielt, wobei die Bahn des Abtastlichtstrahles auf bzw. in dem
Objekt Idealerweise einen Mäander
beschreibt. (Abtasten einer Zeile in x-Richtung bei konstanter y-Position,
anschließend
x-Abtastung anhalten und per y-Verstellung
auf die nächste
abzutastende Zeile schwenken und dann, bei konstanter y-Position,
diese Zeile in negative x-Richtung abtasten u.s.w.). Um eine schichtweise
Bilddatennahme zu ermöglichen,
wird der Probentisch oder das Objektiv nach dem Abtasten einer Schicht
verschoben und so die nächste
abzutastende Schicht in die Fokusebene des Objektivs gebracht.
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Bei vielen Anwendungen werden Proben
mit mehreren Markern, beispielsweise mehreren unterschiedlichen
Fluoreszenzfarbstoffen präpariert.
Diese Farbstoffe können
sequentiell, beispielsweise mit Beleuchtungslichtstrahlen, die unterschiedliche
Anregungswellenlängen
aufweisen, angeregt werden. Auch eine simultane Anregung mit einem
Beleuchtungslichtstrahl, der Licht mehrerer Anregungswellenlängen beinhaltet,
ist üblich.
Aus der Europäischen
Patentanmeldung
EP 0 495 930 : „Konfokales Mikroskopsystem
für Mehrfarbenfluoreszenz" ist beispielsweise
eine Anordnung mit einem einzelnen mehrere Laserlinien emittierenden
Laser bekannt. Derzeit sind in der Praxis solche Laser meist als Mischgaslaser,
insbesondere als ArKr-Laser, ausgebildet.
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Zur simultanen Detektion des von
der Probe ausgehenden Detektionslichtes werden oft Multibanddetektoren
eingesetzt. Aus der Offenlegungsschrift
DE 4330347 A1 ist eine Vorrichtung
zur Selektion und Detektion mindestens zweier Spektralbereiche eines
Lichtstrahls, mit einer Selektionseinrichtung und einer Detektionseinrichtung
bekannt. Die Vorrichtung ist zur zuverlässigen gleichzeitigen Selektion
und Detektion unterschiedlicher Spektralbereiche bei hoher Ausbeute
und bei einfachster Konstruktion derart ausgestaltet, dass die Selektionseinrichtung
Mittel zur spektralen Zerlegung des Lichtstrahls und Mittel einerseits
zum Ausblenden eines ersten Spektralbereichs und andererseits zur
Reflexion zumindest eines Teils des nicht ausgeblendeten Spektralbereichs
und die Detektionseinrichtung einen im Strahlengang des ausgeblendeten
ersten Spektralbereichs angeordneten ersten Detektor und einen im
Strahlengang des reflektierten Spektralbereichs angeordneten zweiten
Detektor umfasst. Als Mittel zum Ausblenden eines ersten Spektralbereichs und
andererseits zur Reflexion zumindest eines Teils des nicht ausgeblendeten
Spektralbereichs ist vorzugsweise eine Spaltblendenvorrichtung mit
verspiegelten Blendenbacken vorgesehen. Die Vorrichtung ist insbesondere
als Multibanddetektor in einem Scanmikroskop einsetzbar.
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In der Deutschen Offenlegungsschrift
DE 100 33 180 ist eine
Anordnung zur optischen Erfassung von charakteristischen Größen des
wellenlängenabhängigen Verhaltens
einer beleuchteten Probe beschrieben.
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Aus der Deutschen Offenlegungsschrift
DE 198 42 288 A1 ist
eine Vorrichtung zur einstellbaren Einkopplung und/oder Detektion
einer oder mehrerer Wellenlängen
in einem Mikroskop bekannt.
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Derzeit ist eine genaue quantitative
spektrale Analyse des von einer Probe ausgehenden Lichtes in der
Scanmikroskopie durch die Güte
der Kalibrierung der verwendeten Spektraldetektoren begrenzt. In
der Regel werden die Spektraldetektoren nach dem Einbau in ein Scanmikroskop
anhand der zur Verfügung stehenden
Laserlinien, die beim ArKr-Laser beispielsweise bei 476, 488, 568
und 647 nm liegen, kalibriert. Daher kann in den Randbereichen des
Detektionsspektrums, das typischerweise den Spektralbereich von
400 bis 800 nm umfasst, ein Funktionstest des Spektraldetektors
nicht sinnvoll durchgeführt werden.
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Es ist Aufgabe der Erfindung ein
Verfahren zur Kalibrierung anzugeben, dass eine hinsichtlich der
spektralen Genauigkeit verbesserte Untersuchung des von einer Probe
ausgehenden Detektionslichtes ermöglicht.
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- Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren zum
Kalibrieren eines Spektraldetektors in einem Scanmikroskop, das
einen Detektionsstrahlengang aufweist mit folgenden Schritten gelöst:
- – Erzeugen
von Referenzlicht, dessen spektrale Zusammensetzung bekannt ist,
mit einer Referenzlichtquelle,
- – Einkoppeln
des Referenzlichtes in den Detektionsstrahlengang des Scanmikroskops.
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Es ist außerdem Aufgabe der Erfindung
eine Vorrichtung zum Kalibrieren eines Spektraldetektors für ein Scanmikroskop
anzugeben, die ein verbessertes spektrales Auflösungsvermögen des Scanmikroskops ermöglicht.
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Diese Aufgabe wird durch eine Vorrichtung zum
Kalibrieren eines Spektraldetektors in einem Scanmikroskop, das
einen Detektionsstrahlengang aufweist, wobei eine Referenzlichtquelle
vorgesehen ist, die Referenzlicht erzeugt, dessen spektrale Zusammensetzung
bekannt ist und das in den Detektionsstrahlengang des Scanmikroskops
einkoppelbar ist, gelöst.
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Die Erfindung hat den Vorteil, dass
durch eine verbesserte Kalibrierung der Spektraldetektor genauer
an die Emissionsspektren der eingesetzten Fluoreszenzfarbstoffe
anpassbar ist. Die verbesserte Kalibrierung wird erfindungsgemäß dadurch
erreicht, dass sie direkt im Gerät
am eingebauten Spektraldetektor vorgenommen wird. Hierzu wird vorzugsweise eine
externe Referenzlichtquelle zur Erzeugung des Referenzlichtes verwendet,
die vorzugsweise als Spektrallampe, Dampflampe, Entladungslampe
oder Mehrlinienlaser ausgeführt
ist. Auch die Vereinigung von Licht mehrerer unterschiedlicher Laser
zu Referenzlicht ist beispielsweise möglich.
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In einer bevorzugten Ausführung erfolgt
das Einkoppeln im Bereich der Fokalebene des Objektivs des Scanmikroskops.
In einer bevorzugten Ausgestaltung wird das Referenzlicht mit einer
Lichtleitfaser an die Einkoppelstelle transportiert. Diese Ausführungsform
ist besonders flexibel.
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Das Ende der Lichtleitfaser wird
vorzugsweise mit einer Haltevorrichtung an der Einkoppelstelle fixiert.
Die Haltevorrichtung ist vorzugsweise derart ausgeführt, dass
sich die Positionierung durch Führungs-
und Anschlagelemente zwangsläufig
ergibt und ein weiteres Justieren nicht erforderlich ist.
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In einer bevorzugen Ausgestaltung
weist die Referenzlichtquelle eine nahezu punktförmige Emissionsfläche auf.
Ganz besonders vorteilhaft ist eine Anordnung, bei der das Ende
der Lichtleitfaser nahezu als Punktlichtquelle wirkt und daher in
besonderer Weise dem Strahlengang des Scanmikroskops angepasst ist.
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Besonders vorteilhaft ist einer Variante,
bei der die Lichtleitfaser Stecker, die ein einfaches Ankoppeln
an die Referenzlichtquelle einerseits und an die Haltevorrichtung
andererseits ermöglicht.
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In einer bevorzugten Ausgestaltung
beinhaltet die Haltevorrichtung eine an dem Objektiv befestigbare
Hülse.
Die Hülse
ist vorzugsweise so ausgestaltet, dass ein Ende der Hülse über das
Objektiv steckbar ist, während
das andere Ende der Hülse eine
Lichtleitfaser-Auskoppeloptik aufnimmt, an die die Lichtleitfaser
ankoppelbar ist.
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In einer bevorzugten Ausgestaltung
ist der Spektraldetektor ein Gitter- oder Prismenspektrometer. Vorzugsweise
weist der Spektraldetektor mehrere Detektionskanäle auf, wobei das Kalibrieren
das Zuordnen von Wellenlängen
des Referenzlichtes zu Detektionskanälen umfasst.
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In einer besonders bevorzugten Ausführung ist
der Spektraldetektor ein Multibanddetektor. Der Multibanddetektor
weist vorzugsweise Spiegelschieber auf, die in verschiedenen Stellungen
positionierbar sind, wobei das Kalibrieren das Zuordnen von Wellenlängen des
Referenzlichtes zu Stellungen der Spiegelschieber umfasst.
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In einer anderen bevorzugten Ausgestaltung beinhaltet
der Spektraldetektor einen Zeilendetektor. In dem Fall erfolgt beim
Kalibrieren ein Zuordnen von Wellenlängen des Referenzlichtes zu
den einzelnen Kanälen
des Detektors. Zeilendetektoren können Zeilen-Photomultiplier,
Fotodiodenzeilen, usw. sein.
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In einer besonders vorteilhaften
Ausgestaltung beinhaltet das Scanmikroskop einen Zeilenscanner und
der Spektraldetektor eine CCD-Zeile oder ein zweidimensionales CCD-Array.
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In einer ganz besonders bevorzugen
Ausgestaltung ist das Scanmikroskop ein konfokales Scanmikroskop.
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In der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand
schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend
beschrieben, wobei gleich wirkende Bauteile mit denselben Bezugszeichen
versehen sind. Dabei zeigen:
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1 Ein
erfindungsgemäße Vorrichtung,
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2 eine
Ausführungsvariante
mit einem Multibanddetektor.
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1 zeigt
schematisch eine erfindungsgemäße Vorrichtung
zum Kalibrieren 1 mit einem Scanmikroskop 3, das
als konfokales Scanmikroskop ausgeführt ist.
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Der besseren Illustration halber
wird zunächst
die Standard-Funktionsweise des Scanmikroskops 3 und seiner
Bauteile erläutert:
Der von einer Lichtquelle 5, die als Mehrlinienlaser ausgeführt ist, kommende
Beleuchtungslichtstrahl 7 wird mit Hilfe der Optik 9 auf
die Beleuchtungslochblende 11 fokussiert. Nach Passieren
der Beleuchtungslochblende 11 wird der Beleuchtungslichtstrahl 7 von
einen Strahlteiler 13 zu einem kardanisch aufgehängten Scanspiegel 15,
der den Beleuchtungslichtstrahl 7 durch die Scanoptik 17,
die Tubusoptik 19 und das Objektiv 21 hindurch über bzw.
durch eine in dieser Zeichnung nicht gezeigten Probe führt. Die
Probe ist mit mehreren Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Der Beleuchtungslichtstrahl 7 wird
bei nicht transparenten Proben über
die Probenoberfläche
geführt.
Bei biologischen Proben (Präparaten)
oder transparenten Proben kann der Beleuchtungslichtstrahl 7 auch durch
die Probe geführt
werden. Der von der Probe ausgehende Detektionslichtstrahl 23 gelangt
durch das Objektiv 21, die Tubusoptik 19 und die
Scanoptik 17 hindurch und über den Scanspiegel 15 zum Strahlteiler 13,
passiert diesen und trifft nach Passieren der Detektionsblende 25 auf
einen Spektraldetektor 27, der als Multibanddetektor 29 ausgeführt ist und
der elektrische, zur Leistung des in die verschiedenen Detektionskanäle aufgespaltenen Detektionslichts
proportionale elektrische Detektionssignale erzeugt. Diese werden
an ein Verarbeitungsmodul 31 weitergeleitet, das die Detektionssignale
aufbereitet und den Detektionssignalen aus der Stellung der Spiegelschieber
und auf der Basis einer zuvor erfolgten Kalibrierung, die in einem
Speichermodul 37 abgelegt ist, Detektionswellenlängenbereiche
zuordnet, was anhand von 2 noch
genauer erläutert
wird,. Die Darstellung erfolgt schließlich mit Hilfe eines PC 33
auf einem Monitor 35 beispielsweise in Form von mehreren
unterschiedlich farbigen Abbildungen der Probe.
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Zum Kalibrieren wird die Haltevorrichtung, die
als Hülse 39 ausgeführt ist,
passgenau auf das Objektiv 21 aufgesteckt, wobei zwei Anschlagelemente 41, 43 eine
exakte Justierung gewährleisten. In
die Hülse 39 ist
eine Scheibe 45 eingelassen, die eine erste SMA-Lichtleistfaserkupplung 47 trägt. Auf die
erste Lichtleistfaserkupplung 47 ist ein erster SMA-Lichtleitfaserstecker 49 aufgesteckt,
der am Ende einer Lichtleitfaser 51 befestigt ist. Die
Haltevorrichtung ist so konzipiert und bemessen, dass das Austrittsende
der Lichtleitfaser 51 im Fokalbereich des Objektivs 21 befindet.
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Am anderen Ende der Lichtleitfaser 51 ist
ein weiterer SMA-Lichtleitfaserstecker 53 befestigt.
Dieser steckt auf einer weiteren SMA-Lichtleistfaserkupplung 55,
die am Gehäuse
einer Referenzlichtquelle 57, die als Quecksilber-Argon-Spektrallampe 59 ausgeführt ist,
befestigt ist. Die Referenzlichtquelle 57 umfasst eine
Einkoppeloptik 61 mit der das von ihr erzeugte Referenzlicht
in die Lichtleitfaser 51 einkoppelbar ist.
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Das divergent aus der Lichtleitfaser
austretende Referenzlicht wird von dem Objektiv zu einem parallelen
Strahl gebündelt
und folgt dem Weg zum Multibanddetektor, den im Normalbetrieb der
Detektionslichtstrahl 23 nimmt.
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Da die Wellenlängen, die das Referenzlicht aufweist,
hinreichend genau bekannt sind, ist eine weitgehend exakte Zuordnung,
welche Einstellung des Multibanddetektors zu welchem Wellenlängenbereich
gehört,
möglich.
Die gewonnenen Zuordnungsdaten werden als Kalibrationsdaten in dem Speichermodul 37 abgelegt.
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Es wäre erfindungsgemäß auch möglich als Referenzlichtquelle
die Lichtquelle 5 zu verwenden. In der Regel weisen jedoch
selbst Mischgaslaser weniger Linien auf, so dass eine vollständige Kalibrierung
schwieriger wäre.
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2 illustriert
den Vorgang des Kalibrierens bei einem Multibanddetektor 29.
Im Standardbetrieb des Multibanddetektors 29 trifft der
Detektionslichtstrahl auf ein Prisma 65 und wird räumlich spektral
aufgespalten. Der resultierende Lichtfächer wird mit der Fokussieroptik 67 fokussiert
und trifft anschließend
auf eine Spiegelblendenanordnung 69, 71. Ein Teil
des aufgespaltenen Lichtfächers
des Detektionslichtes, der nur Licht eines vorgewählten Spektralbereichs
umfasst, passiert die Spiegelblendenanordnungen 69, 71 und
wird von dem Detektor 73, der als Photomultiplier ausgeführt ist,
detektiert. Ein anderer Teil des aufgespaltenen Lichtfächers wird
an der Spiegelblendenanordnung 71 reflektiert und gelangt
zu einem weiteren Detektor 75, der ebenfalls als Photomultiplier
ausgeführt
ist. Die Spiegelblendenanordnungen sind. in den durch die Doppelpfeile
illustrierten Richtungen verschiebbar, so dass die spektralen Detektionsbereiche
des den Detektoren 73, 75 zugeführten Lichtes
kontinuierlich einstellbar sind. Es ist möglich, jedoch der Übersichtlichkeit
halber nicht dargestellt, noch weitere Detektoren einzubauen und
weiteren Spiegelblenden zuzuordnen. In den Detektoren 73, 75 werden
elektrische, in der Amplitude zur Leistung des von der Probe ausgehenden
Detektionslichtes des jeweiligen Spektralbereichs proportionale
Detektionssignale erzeugt.
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Beim Kalibriervorgang wird das auf
den Multibanddetektor 29 treffende Referenzlicht von dem Prisma 65 räumlich spektral
aufgespalten. Exemplarisch sind vier Teilstrahlen 77, 79, 81, 83 dargestellt. In
der gezeigten Stellung des Spiegelschiebers 71 kann der
zweite Teilstrahl 79 gerade noch passieren und trifft auf
den Detektor 73. Da die Wellenlänge des zweiten Teilstrahles 79 bekannt
ist, kann zugeordnet werden, wo in der gezeigten Stellung der von
dem Detektor 73 detektierte Detektionsbereich endet und wo
der von dem weiteren Detektor 75 detektierte Detektionsbereich
beginnt. Die gewonnenen Zuordnungsdaten werden als Kalibrationsdaten
in dem Speichermodul 37 des Verarbeitungsmoduls 31 abgelegt.
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Die Spaltblendenanordnungen werden
von zwei Stellmotoren 85, 87 angetrieben, deren
Stellung von dem Verarbeitungsmodul 31 auslesbar ist.
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Die Erfindung wurde in Bezug auf
eine besondere Ausführungsform
beschrieben. Es ist jedoch selbstverständlich, dass Änderungen
und Abwandlungen durchgeführt
werden können,
ohne dabei den Schutzbereich der nachstehenden Ansprüche zu verlassen.
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- 1
- Vorrichtung
zum Kalibrieren
- 3
- Scanmikroskop
- 5
- Lichtquelle
- 7
- Beleuchtungslichtstrahl
- 9
- Optik
- 11
- Beleuchtungslochblende
- 13
- Strahlteiler
- 15
- Scanspiegel
- 17
- Scanoptik
- 19
- Tubusoptik
- 21
- Objektiv
- 23
- Detektionslichtstrahl
- 25
- Detektionsblende
- 27
- Spektraldetektor
- 29
- Multibanddetektor
- 31
- Verarbeitungsmodul
- 33
- PC
- 35
- Monitor
- 37
- Speichermodul
- 39
- Hülse
- 41
- Anschlagelement
- 43
- Anschlagelement
- 45
- Scheibe
- 47
- erste
SMA-Lichtleistfaserkupplung
- 49
- erster
SMA-Lichtleitfaserstecker
- 51
- Lichtleitfaser
- 53
- weiterer
SMA-Lichtleitfaserstecker
- 55
- weitere
SMA-Lichtleistfaserkupplung
- 57
- Referenzlichtquelle
- 59
- Quecksilber-Argon-Spektrallampe
- 61
- Einkoppeloptik
- 63
- Referenzlicht
- 65
- Prisma
- 67
- Fokussieroptik
- 69
- Spiegelblendenanordnung
- 71
- Spiegelblendenanordnung
- 73
- Detektor
- 75
- weiterer
Detektor
- 77
- erster
Teilstrahl
- 79
- zweiter
Teilstrahl
- 81
- dritter
Teilstrahl
- 83
- vierter
Teilstrahl
- 85
- Stellmotor
- 87
- Stellmotor