-
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Ermittlung des Farblängsfehlers eines Scanmikroskops.
-
Weiterhin betrifft die Erfindung ein Scanmikroskop mit einer Strahlablenkeinrichtung zum Abscannen einer Probe, die Referenzstrukturen aufweist, in zumindest axialer Richtung (z-Richtung) entlang verschiedener Scanpositionen, mit einem Beleuchtungslichtstrahl, der zumindest eine Beleuchtungswellenlänge aufweist, mit zumindest einem Detektor zum Detektieren des von der Probe ausgehenden Detektionslichtes in Abhängigkeit von der Scanposition bei einer Detektionswellenlänge oder in einem spektralen Detektionsbereich und zum Detektieren des von der Probe ausgehenden Detektionslichtes in Abhängigkeit von der Scanposition bei zumindest einer weiteren Detektionswellenlänge oder in zumindest einem weiteren spektralen Detektionsbereich.
-
In der Scanmikroskopie wird eine Probe mit einem Lichtstrahl beleuchtet, um das von der Probe emittierte Reflexions- oder Fluoreszenzlicht zu beobachten. Der Fokus eines Beleuchtungslichtstrahles wird mit Hilfe einer steuerbaren Strahlablenkeinrichtung, im Allgemeinen durch Verkippen zweier Spiegel, in einer Objektebene bewegt, wobei die Ablenkachsen meist senkrecht aufeinander stehen, so dass ein Spiegel in x-, der andere in y-Richtung ablenkt. Die Verkippung der Spiegel wird beispielsweise mit Hilfe von Galvanometer-Stellelementen bewerkstelligt. Die Leistung des vom Objekt kommenden Lichtes wird in Abhängigkeit von der Position des Abtaststrahles gemessen. Üblicherweise werden die Stellelemente mit Sensoren zur Ermittlung der aktuellen Spiegelstellung ausgerüstet.
-
Speziell in der konfokalen Scanmikroskopie wird ein Objekt mit dem Fokus eines Lichtstrahles in drei Dimensionen abgetastet.
-
Ein konfokales Rastermikroskop umfasst im allgemeinen eine Lichtquelle, eine Fokussieroptik, mit der das Licht der Quelle auf eine Lochblende - die sog. Anregungsblende - fokussiert wird, einen Strahlteiler, eine Strahlablenkeinrichtung zur Strahlsteuerung, eine Mikroskopoptik, eine Detektionsblende und die Detektoren zum Nachweis des Detektions- bzw. Fluoreszenzlichtes. Das Beleuchtungslicht wird über einen Strahlteiler eingekoppelt. Das vom Objekt kommende Fluoreszenz- oder Reflexionslicht gelangt über die Strahlablenkeinrichtung zurück zum Strahlteiler, passiert diesen, um anschließend auf die Detektionsblende fokussiert zu werden, hinter der sich die Detektoren befinden. Detektionslicht, das nicht direkt aus der Fokusregion stammt, nimmt einen anderen Lichtweg und passiert die Detektionsblende nicht, so dass man eine Punktinformation erhält, die durch sequentielles Abtasten des Objekts zu einem dreidimensionalen Bild führt. Meist wird ein dreidimensionales Bild durch schichtweise Bilddatennahme erzielt, wobei die Bahn des Abtastlichtstrahles auf bzw. in dem Objekt idealerweise einen Mäander beschreibt. (Abtasten einer Zeile in x-Richtung bei konstanter y-Position, anschließend x-Abtastung anhalten und per y-Verstellung auf die nächste abzutastende Zeile schwenken und dann bei konstanter y-Position diese Zeile in negative x-Richtung abtasten u.s.w.).
-
Zur Untersuchung von biologischen Proben ist es seit langem üblich, die Probe mit optischen Markern, insbesondere mit Fluoreszenzfarbstoffen zu präparieren. Oft werden, beispielsweise im Bereich der Genuntersuchungen, mehrere unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe in die Probe eingebracht, die sich spezifisch an bestimmten Probenbestandteilen anlagern. Aus den Fluoreszenzeigenschaften der präparierten Probe können beispielsweise Rückschlüsse auf die Beschaffenheit, die Zusammensetzung der Probe oder auf Konzentrationen bestimmter Stoffe innerhalb der Probe gezogen werden. Zur simultanen Beleuchtung mit Licht mehrerer Wellenlängen werden meist mehrere Laser eingesetzt. Aus der
EP 0 495 930 B1 : „Konfokales Mikroskopsystem für Mehrfarbenfluoreszenz“ ist eine Anordnung mit einem einzelnen mehrere Laserlinien emittierenden Laser bekannt. In der Praxis werden hierfür in der Regel Mischgaslaser, insbesondere ArKr-Laser, eingesetzt. Zur Detektion sind in der Regel mehrere Detektoren für Detektionslicht unterschiedlicher Wellenlängen vorgesehen. Eine besonders flexible Anordnung zur simultanen Mehrfarbdetektion von Detektionslicht mehrerer Wellenlängen ist in der deutschen Offenlegungsschrift
DE 199 02 625 A1 „Vorrichtung zur gleichzeitigen Detektion mehrerer Spektralbereiche eines Laserstrahls“ offenbart.
-
Neben der simultanen Mehrfarbdetektion spielt auch die sequentielle Detektion von Bilddaten bei unterschiedlichen Wellenlängen eine wichtige Rolle in der Mikroskopie. Hierbei werden die Bilddaten der Bilder unterschiedlicher Detektionslichtwellenlängen zeitlich nacheinander gewonnen. Die Abbilder können dem Benutzer in Form mehrerer Einzeldarstellungen, wobei jede Einzeldarstellung einer Detektionslichtwellenlänge oder einem Detektionslichtwellenlängenbereich zugeordnet ist, angezeigt werden. Auch die Anzeige einer Überlagerungsdarstellung der Einzeldarstellungen ist üblich; hierbei ist ganz wichtig, dass zu denselben Punkten der Probe gehörende Bildinformationen der Einzeldarstellungen exakt einander zugeordnet werden.
-
Die bekannten Mikroskope haben bei der Mehrfarbdetektion auf Grund von Farbfehlern der Optiken insbesondere auf Grund des Farblängsfehlers den Nachteil, dass bei den verschiedenen Detektionswellenlängen ungewollt Bilddaten aus unterschiedlichen Probenbereichen z.B. aus unterschiedlich tiefen Probenschnittebenen gewonnen werden. Dies führt zu nicht vergleichbaren Darstellungen bzw. Abbildungen und zeigt sich besonders nachteilig in der Überlagerungsdarstellung.
-
Ein Rastermikroskop, dass die geschilderten Nachteile teilweise vermeidet, ist in der Deutschen Offenlegungsschrift
DE 100 18 256 A1 offenbart. Das Rastermikroskop ist dadurch gekennzeichnet, dass insbesondere die optischen Eigenschaften der im Strahlengang angeordneten Komponenten derart aufeinander abgestimmt sind, dass die kumulierten Abbildungsfehler bezüglich der optischen Achse und/oder mindestens einer Fläche im Objektbereich zumindest in der Größenordnung des theoretisch erreichbaren Auflösungsvermögens sind. Diese Lösung erfordert sehr aufwendige und sehr teure Optiken und ist nicht für das gesamte mögliche Detektionsspektrum gleichzeitig realisierbar.
-
Eine Schwierigkeit liegt darin, den Farblängsfehler der im Strahlengang des Scanmikroskops angeordneten Komponenten zunächst zu ermitteln, um festzustellen, welche Korrekturen bzw. Kompensationen nötig sind.
-
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde ein Verfahren anzugeben, dass zuverlässig und effizient die Ermittlung des Farblängsfehler eines Scanmikroskops ermöglicht.
-
Die objektive Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, dass durch folgende Schritte gekennzeichnet ist:
- • Abscannen einer Probe, die Referenzstrukturen aufweist, in zumindest axialer Richtung (z-Richtung) entlang verschiedener Scanpositionen, mit einem Beleuchtungslichtstrahl, der zumindest eine Beleuchtungswellenlänge aufweist,
- • Detektieren des von der Probe ausgehenden Detektionslichtes in Abhängigkeit von der Scanposition bei einer Detektionswellenlänge oder in einem spektralen Detektionsbereich,
- • Ermitteln der Scanpositionen, an denen das Detektionslicht in Bezug auf die Detektionswellenlänge oder den spektralen Detektionsbereich des Detektionslichtes Leistungsextrema aufweist,
- • Detektieren des von der Probe ausgehenden Detektionslichtes in Abhängigkeit von der Scanposition bei zumindest einer weiteren Detektionswellenlänge oder in zumindest einem weiteren spektralen Detektionsbereich,
- • Ermitteln der weiteren Scanpositionen, an denen das Detektionslicht in Bezug auf die weitere Detektionswellenlänge oder den weiteren spektralen Detektionsbereich des Detektionslichtes Leistungsextrema aufweist und
- • Errechnen des Farblängsfehlers aus den ermittelten Scanpositionen.
-
Es ist außerdem eine Aufgabe der Erfindung ein Scanmikroskop anzugeben, das zuverlässig und effizient die Ermittlung des Farblängsfehler der im Strahlengang des Scanmikroskops angeordneten optischen Komponenten erlaubt.
-
Diese Aufgabe wird durch ein Scanmikroskop gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Verarbeitungsmodul zum Ermitteln der Scanpositionen, an denen das Detektionslicht in Bezug auf die Detektionswellenlänge oder den spektralen Detektionsbereich des Detektionslichtes Leistungsextrema aufweist und zum Ermitteln der weiteren Scanpositionen, an denen das Detektionslicht in Bezug auf die weitere Detektionswellenlänge oder den weiteren spektralen Detektionsbereichen des Detektionslichtes Leistungsextrema aufweist, vorgesehen ist und dass der Farblängsfehler des Scanmikroskops aus den ermittelten Scanpositionen und den ermittelten weiteren Scanpositionen errechenbar ist.
-
Die Referenzstrukturen sind vorzugsweise in der Größenordnung des Auflösungsvermögens des Scanmikroskops. Es kann sich vorteilhafter Weise um mehrfach gefärbte Beads handeln. Die Probe kann in einer bevorzugten Ausgestaltung mit mehreren Fluoreszenzfarbstoffen markiert sein oder in einer anderen bevorzugten Variante z.B. Glutaraldehyd-fixierte Proteine oder andere Farbsubstanzen, die zumindest ein nahezu weißes Detektionslicht emittieren, beinhalten. Die Bestimmung der Leistungsmaxima auch bei nicht aufgelösten Strukturen eignet sich vorteilhaft zum lückenlosen Darstellen der Abhängigkeit des Farblängsfehlers von der Wellenlänge des Detektionslichtes.
-
Vorteilhafter Weise lässt sich durch mehrmaliges Durchführen des Verfahrens bei unterschiedlichen Beleuchtungswellenlängen und Vergleich der Ergebnisse feststellen, ob sich in Bezug auf die durchzuführende Probenuntersuchung der Farblängsfehler eher bei der Beleuchtung mit mehreren Beleuchtungswellenlängen oder bei der Detektion bei verschiedenen Detektionswellenlängen negativ auswirkt.
-
In einer einfachen Variante wird die Leistung des von der Probe ausgehenden Detektionslichtes bei einer Detektionswellenlänge und bei einer weiteren Detektionswellenlänge in Abhängigkeit von der Z-Position gemessen. Die Leistungsextrema spiegeln sich in der Regel in Leistungsmaxima in einer z(λ)-Darstellung wieder. In einer bevorzugten Ausführung wird für jede Scanposition ein Spektrum des Detektionslichtes aufgenommen.
-
Das Detektieren des von der Probe ausgehenden Detektionslichtes bei einer Detektionswellenlänge oder in einem spektralen Detektionsbereich und das Detektieren des von der Probe ausgehenden Detektionslichtes in Abhängigkeit von der Scanposition bei einer weiteren Detektionswellenlänge oder in einem weiteren spektralen Detektionsbereich erfolgt vorzugsweise simultan. Hierzu beinhaltet der Detektor vorteilhafter Weise einen Multibanddetektor oder ein Spektrometer. Die Detektion kann, insbesondere bei leblosen Proben, auch sequentiell erfolgen.
-
Der errechnete Farblängsfehler ist vorzugsweise in einem Speichermodul zusammen mit Informationen über die dazugehörige Konfiguration des Scanmikroskops, die beispielsweise das verwendete Objektiv vermerken, ablegbar und ist insbesondere nach einem Objektivwechsel oder dem Wechsel einer anderen optischen Komponente sofort abrufbar, ohne dass erneut eine Messung durchgeführt werden muss.
-
In einer bevorzugten Ausgestaltung ist das Scanmikroskop als konfokales Scanmikroskop ausgebildet.
-
In der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben. Dabei zeigen:
- 1 die Leistungsverteilung I(z) für eine Detektionswellenlänge und eine weitere Detektionswellenlänge,
- 2 den Verlauf der Scanpositionen, an denen das Detektionslicht ein Leistungsmaximum aufweist in Abhängigkeit von der Detektionswellenlänge, und
- 3 ein erfindungsgemäßes Scanmikroskop.
-
1 zeigt die Leistungsverteilung I1(z) für eine Detektionswellenlänge und die Leistungsverteilung I2(z) für eine weitere Detektionswellenlänge. Die Leistungsverteilung I1(z) weist ein Leistungsmaximum bei Z1,max auf. Die Leistungsverteilung I2(z) weist ein Leistungsmaximum bei Z2,max auf. Aus der Differenz von Z1,max und Z2,max lässt sich der Farblängsfehler in Bezug auf die Detektionswellenlänge und die weitere Detektionswellenlänge errechnen.
-
2 zeigt den Verlauf der Scanpositionen, an denen das Detektionslicht ein Leistungsmaximum aufweist in Abhängigkeit von der Detektionswellenlänge. Der Verlauf wurde mit Hilfe einer Probe aufgenommen, die nahezu weiß emittierende Referenzstrukturen auf der Basis von Glutaraldehyd-fixierten Proteinen beinhaltet. Für jede Scanposition wurde die Leistung des Detektionslichtes in Abhängigkeit von der Detektionswellenlänge für ein ganzes Spektrum von Detektionswellenlängen gemessen und die Detektionswellenlänge ermittelt.
-
3 zeigt schematisch ein konfokales Scanmikroskop. Der von einem Beleuchtungssystem 1 kommende Beleuchtungslichtstrahl 3 wird von einem Strahlteiler 5 zur Strahlablenkeinrichtung 7 reflektiert, das einen kardanisch aufgehängten Scanspiegel 9 beinhaltet, der den Strahl durch die Mikroskopoptik 13 hindurch über bzw. durch die Probe 15 führt. Der Beleuchtungslichtstrahl 3 wird bei nicht transparenten Proben 15 über die Objektoberfläche geführt. Bei biologischen Proben 15 (Präparaten) oder transparenten Objekten kann der Beleuchtungslichtstrahl 3 auch durch die Probe 15 geführt werden. Dies bedeutet, dass verschiedene Fokusebenen der Probe nacheinander durch den Beleuchtungslichtstrahl 3 abgetastet werden. Die nachträgliche Zusammensetzung ergibt dann ein dreidimensionales Bild der Probe. Der vom Beleuchtungssystem 1 kommende Beleuchtungslichtstrahl 3 ist in der Abbildung als durchgezogene Linie dargestellt. Das vom der Probe 15 ausgehende Detektionslicht 17 gelangt durch die Mikroskopoptik 13 und über die Strahlablenkeinrichtung 7 zum Strahlteiler 5, passiert diesen und trifft auf Detektor 19, der als Multibanddetektor ausgeführt ist. Das von der Probe 15 ausgehende Detektionslicht 17 ist in der Abbildung als gestrichelte Linie dargestellt. Im Detektor 19, der als Multibanddetektor zum Detektieren des von der Probe ausgehenden Detektionslichtes in Abhängigkeit von der Scanposition bei zumindest einer weiteren Detektionswellenlänge oder in zumindest einem weiteren spektralen Detektionsbereich ausgeführt ist, werden elektrische, zur Leistung des von der Probe ausgehenden Detektionslichtes 17 proportionale Detektionssignale 21 erzeugt und an die Verarbeitungseinheit 23 weitergegeben. Die in der Strahlablenkeinrichtung 7 mit Hilfe eines induktiv oder kapazitiv arbeitenden Positionssenors 11 erfassten Positionssignale 25 werden ebenfalls an die Verarbeitungseinheit 23 übergeben. Es ist für einen Fachmann selbstverständlich, dass die Position des Scanspiegels 9 auch über die Verstellsignale ermittelt werden kann. Zum Abscannen der Probe in z-Richtung ist eine Piezo-Verschiebeinrichtung 26, vorgesehen, mit der die Probe relativ zur Mikroskopoptik 13 verschiebbar ist. Die jeweils eingestellte z-Position wird ebenfalls an die Verarbeitungseinheit 23 übergeben. Die eingehenden Analogsignale werden in der Verarbeitungseinheit 23 zunächst digitalisiert. Die Positions- und Detektionssignale werden in der Verarbeitungseinheit 23 in Abhängigkeit einander zugeordnet und zu einem Abbild 31 zusammengesetzt, das auf dem Display 29 angezeigt wird.
-
In einem Verarbeitungsmodul 27 werden die Scanpositionen ermittelt, an denen das Detektionslicht 17 in Bezug auf eine vorgegebene Detektionswellenlänge und eine weitere Detektionswellenlänge des Detektionslichtes Leistungsextrema aufweist. Das Verarbeitungsmodul 27 errechnet aus den ermittelten Scanpositionen und den ermittelten weiteren Scanpositionen den Farblängsfehler des Scanmikroskops in Bezug auf die Detektionswellenlänge und eine weitere Detektionswellenlänge.
-
Der ermittelte Farblängsfehlers kann dann beispielsweise bei der Zuordnung Positions- und Detektionssignale berücksichtigt werden. Es ist auch möglich den ermittelten Farblängsfehler durch Einführen geeigneter optischer Komponenten in den Strahlengang zu kompensieren. Dies erfolgt vorzugsweise automatisch.
-
Die Erfindung wurde in Bezug auf eine besondere Ausführungsform beschrieben. Es ist jedoch selbstverständlich, dass Änderungen und Abwandlungen durchgeführt werden können, ohne dabei den Schutzbereich der nachstehenden Ansprüche zu verlassen.
-
Bezugszeichenliste
-
- 1
- Beleuchtungssystem
- 3
- Beleuchtungslichtstrahl
- 5
- Strahlteiler
- 7
- Strahlablenkeinrichtung
- 9
- Scanspiegel
- 11
- Positionssenor
- 13
- Mikroskopoptik
- 15
- Probe
- 17
- Detektionslicht
- 19
- Detektor
- 21
- Detektionssignale
- 23
- Verarbeitungseinheit
- 25
- Positionssignale
- 26
- Piezo-Verschiebeinrichtung
- 27
- Verarbeitungsmodul
- 29
- Display
- 31
- Abbild
