DE10156506C1

DE10156506C1 - Verfahren zur Erzeugung eines mehrfarbigen Bildes und Mikroskop

Info

Publication number: DE10156506C1
Application number: DE10156506A
Authority: DE
Inventors: Ingo Boehm; Frank Schreiber
Original assignee: Leica Microsystems Heidelberg GmbH; Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2001-11-16
Filing date: 2001-11-16
Publication date: 2003-05-22
Anticipated expiration: 2021-11-17
Also published as: US20040156102A1; US20030095328A1; US6717726B2; US7005622B2

Abstract

Ein Verfahren zur Erzeugung eines mehrfarbigen Bildes einer Probe mit einem Mikroskop ist offenbart. Das Verfahren ist gekennzeichnet durch den Schritt des Ermittelns des Abstandes der Fokalebenen eines ersten Beleuchtungslichtstrahles, der eine erste Wellenlänge aufweist, und eines zweiten Beleuchtungslichtstrahles, der eine zweite Wellenlänge aufweist, den Schritt des Abscannens der Probe mit dem ersten Beleuchtungslichtstrahl und Erzeugen eines ersten Teilbildes, den Schritt des Ausführens einer Relativverschiebung zwischen der Probe und der Fokalebene des Beleuchtungslichtstrahles der zweiten Wellenlänge um den Abstand, den Schritt des Abscannens der Probe mit dem zweiten Beleuchtungslichtstrahl und Erzeugen eines zweiten Teilbildes und den Schritt des Überlagerns des ersten und des zweiten Teilbildes zu dem mehrfarbigen Bild. Weiterhin ist ein Mikroskop offenbart.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erzeugen eines Bildes einer Probe mit einem Mikroskop, bei dem die Probe nacheinander mit einem ersten Beleuchtungslichtstrahl, der eine erste Wellenlänge aufweist, und einem zweiten Beleuchtungslichtstrahl, der eine zweite Wellenlänge aufweist, beleuchtet wird und bei dem zum Ausgleich eines Farblängsfehlers des Mikroskops nach dem Beleuchten mit dem ersten Beleuchtungslichtstrahl und vor dem Beleuchten mit dem zweiten Beleuchtungslichtstrahl eine Relativverschiebung zwischen der Fokalebene des ersten Beleuchtungslichtstrahls und der Probe um den Abstand der zu den beiden Beleuchtungslichtstrahlen gehörenden Fokalebenen ausgeführt wird und somit für jede der beiden Wellenlängen eine jeweils für die Wellenlänge spezifische Abbildung aus ein und derselben Probenebene aufgenommen wird.

Außerdem betrifft die Erfindung ein Mikroskop bei dem eine Probe nacheinander mit einem ersten Beleuchtungslichtstrahl, der eine erste Wellenlänge aufweist, und einem zweiten Beleuchtungslichtstrahl, der eine zweite Wellenlänge aufweist, beleuchtbar ist und bei dem zum Ausgleich eines Farblängsfehlers des Mikroskops ein Mittel zum Ausführen einer Relativbewegung vorgesehen ist mit dem nach dem Beleuchten mit dem ersten Beleuchtungslichtstrahl und vor dem Beleuchten mit dem zweiten Beleuchtungslichtstrahl eine Relativverschiebung zwischen der Fokalebene des ersten Beleuchtungslichtstrahls und der Probe um den Abstand der zu den beiden Beleuchtungslichtstrahlen gehörenden Fokalebenen ausführbar ist und somit für jede der beiden Wellenlängen eine jeweils für die Wellenlänge spezifische Abbildung aus ein und derselben Probenebene aufnehmbar ist.

In der Scanmikroskopie wird eine Probe mit einem Lichtstrahl beleuchtet, um das von der Probe emittierte Reflexions- oder Fluoreszenzlicht zu beobachten. Der Fokus eines Beleuchtungslichtstrahles wird mit Hilfe einer steuerbaren Strahlablenkeinrichtung, im Allgemeinen durch Verkippen zweier Spiegel, in einer Objektebene bewegt, wobei die Ablenkachsen meist senkrecht aufeinander stehen, so dass ein Spiegel in x-, der andere in y-Richtung ablenkt. Die Verkippung der Spiegel wird beispielsweise mit Hilfe von Galvanometer-Stellelementen bewerkstelligt. Die Leistung des vom Objekt kommenden Lichtes wird in Abhängigkeit von der Position des Abtaststrahles gemessen. Üblicherweise werden die Stellelemente mit Sensoren zur Ermittlung der aktuellen Spiegelstellung ausgerüstet.

Speziell in der konfokalen Scanmikroskopie wird ein Objekt mit dem Fokus eines Lichtstrahles in drei Dimensionen abgetastet.

Ein konfokales Rastermikroskop umfasst im allgemeinen eine Lichtquelle, eine Fokussieroptik, mit der das Licht der Quelle auf eine Lochblende - die sog. Anregungsblende - fokussiert wird, einen Strahlteiler, eine Strahlablenkeinrichtung zur Strahlsteuerung, eine Mikroskopoptik, eine Detektionsblende und die Detektoren zum Nachweis des Detektions- bzw. Fluoreszenzlichtes. Das Beleuchtungslicht wird über einen Strahlteiler eingekoppelt. Das vom Objekt kommende Fluoreszenz- oder Reflexionslicht gelangt über die Strahlablenkeinrichtung zurück zum Strahlteiler, passiert diesen, um anschließend auf die Detektionsblende fokussiert zu werden, hinter der sich die Detektoren befinden. Detektionslicht, das nicht direkt aus der Fokusregion stammt, nimmt einen anderen Lichtweg und passiert die Detektionsblende nicht, so dass man eine Punktinformation erhält, die durch sequentielles Abtasten des Objekts zu einem dreidimensionalen Bild führt. Meist wird ein dreidimensionales Bild durch schichtweise Bilddatennahme erzielt, wobei die Bahn des Abtastlichtstrahles auf bzw. in dem Objekt idealer Weise einen Mäander beschreibt. (Abtasten einer Zeile in x-Richtung bei konstanter y-Position, anschließend x-Abtastung anhalten und per y- Verstellung auf die nächste abzutastende Zeile schwenken und dann bei konstanter y-Position diese Zeile in negative x-Richtung abtasten u. s. w.).

Zur Untersuchung von biologischen Proben ist es seit langem üblich, die Probe mit optischen Markern, insbesondere mit Fluoreszenzfarbstoffen zu präparieren. Oft werden, beispielsweise im Bereich der Genuntersuchungen, mehrere unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe in die Probe eingebracht, die sich spezifisch an bestimmten Probenbestandteilen anlagern. Aus den Fluoreszenzeigenschaften der präparierten Probe können beispielsweise Rückschlüsse auf die Beschaffenheit, die Zusammensetzung der Probe oder auf Konzentrationen bestimmter Stoffe innerhalb der Probe gezogen werden. Zur simultanen Beleuchtung mit Licht mehrerer Wellenlängen werden meist mehrere Laser eingesetzt. Aus der EP 0 495 930 B1 "Konfokales Mikroskopsystem für Mehrfarbenfluoreszenz" ist eine Anordnung mit einem einzelnen mehrere Laserlinien emittierenden Laser bekannt. In der Praxis werden hierfür in der Regel Mischgaslaser, insbesondere ArKr-Laser, eingesetzt. Zur Detektion sind in der Regel mehrere Detektoren für Detektionslicht unterschiedlicher Wellenlängen vorgesehen. Eine besonders flexible Anordnung zur simultanen Mehrfarbdetektion von Detektionslicht mehrerer Wellenlängen ist in der deutschen Patentschrift DE 199 02 625 A1 "Vorrichtung zur gleichzeitigen Detektion mehrerer Spektralbereiche eines Laserstrahls" offenbart.

Neben der simultanen Mehrfarbdetektion spielt auch die sequentielle Detektion von Bilddaten bei unterschiedlichen Wellenlängen eine wichtige Rolle in der Mikroskopie. Hierbei werden die Bilddaten der Bilder der unterschiedlichen Detektionslichtwellenlängen zeitlich nacheinander gewonnen. Die Abbilder können dem Benutzer in Form mehrerer Einzeldarstellungen, wobei jede Einzeldarstellung einer Detektionslichtwellenlänge oder einem Detektionslichtwellenlängenbereich zugeordnet ist, angezeigt werden. Auch die Anzeige einer Überlagerungsdarstellung der Einzeldarstellungen ist üblich; hierbei ist ganz wichtig, dass zu denselben Punkten der Probe gehörende Bildinformationen der Einzeldarstellungen exakt einander zugeordnet werden.

Die bekannten Mikroskope haben bei der Mehrfarbdetektion auf Grund von Farbfehlern der Optiken insbesondere auf Grund des Farblängsfehlers den Nachteil, dass bei den verschiedenen Detektionswellenlängen ungewollt Bilddaten aus unterschiedlichen Probenbereichen z. B. aus unterschiedlich tiefen Probenschnittebenen gewonnen werden. Dies führt zu nicht vergleichbaren Darstellungen bzw. Abbildungen und zeigt sich besonders nachteilig in der Überlagerungsdarstellung.

Aus der deutschen Offenlegungsschrift DE 197 02 753 A1 ist eine Anordnung zur Einkopplung von Laserstrahlung in einen Scankopf mit einer mindestens zweidimensional ablenkenden Scaneinheit bekannt, wobei die Strahlung über ein Mikroskopobjektiv auf ein Objekt fokussiert wird. Zur Einkopplung ist mindestens eine Lichtleitfaser, die an den Scankopf angekoppelt ist vorgesehen, wobei dem Faserende am Scankopf eine Kollimationsoptik zur Kollimierung der am Faserende divergent austretenden Strahlung nachgeordnet ist, und wobei für eingekoppelte Strahlung mehrerer Wellenlängen über eine Faser und/oder für unterschiedliche chromatische Fehler eine wellenlängenabhängige Verschiebung der Kollimationsoptik erfolgt.

Aus der DE 692 29 777 T2 ist ein konfokales Abbildungssystem für sichtbares und für UV-Licht bekannt. Das Abbildungssystem zeichnet sich durch ein für sichtbares und für UV-Licht achromatisch korrigiertes Fokussiermittel, das aus einer Scanlinse und einem Objektiv besteht, aus.

Ein Rastermikroskop, dass die geschilderten Nachteile teilweise vermeidet, ist in der Deutschen Offenlegungsschrift DE 100 18 256 A1 offenbart. Das Rastermikroskop ist dadurch gekennzeichnet, dass insbesondere die optischen Eigenschaften der im Strahlengang angeordneten Komponenten derart aufeinander abgestimmt sind, dass die kumulierten Abbildungsfehler bezüglich der optischen Achse und/oder mindestens einer Fläche im Objektbereich zumindest in der Größenordnung des theoretisch erreichbaren Auflösungsvermögens sind. Diese Lösung erfordert sehr aufwendige und sehr teuere Optiken und ist nicht für das gesamte mögliche Detektionsspektrum gleichzeitig realisierbar.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde ein einfaches Verfahren zur Erzeugung eines präzisen, bei unterschiedlichen Beleuchtungslichtwellenlängen aufgenommenen mehrfarbigen Probenbildes anzugeben.

Die objektive Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, das durch folgende Schritte gekennzeichnet ist:

- dass die beiden wellenlängenspezifischen Abbildungen zu einem mehrfarbigen und auf einem Display darstellbaren Überlagerungsbild überlagert werden
- und dass der Abstand der zu den beiden Wellenlängen gehörenden Fokalebenen durch eine Referenzmessung ermittelt wird.

Es ist außerdem eine Aufgabe der Erfindung ein Mikroskop anzugeben, das auf einfache Weise die Erzeugung eines präzisen, bei unterschiedlichen Beleuchtungslichtwellenlängen aufgenommenen mehrfarbigen Probenbildes erlaubt.

Diese Aufgabe wird durch ein Mikroskop gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass

- eine Vorrichtung zur Überlagerung vorgesehen ist, die die beiden wellenlängenspezifischen Abbildungen zu einem mehrfarbigen und auf einem Display darstellbaren Überlagerungsbild überlagert
- und dass ein PC vorgesehen ist, mit dem der Abstand der Fokalebenen ermittelbar ist.

In einer bevorzugten Ausgestaltung wird die Relativverschiebung mit einem verschiebbaren Objektiv ausgeführt. Das erfindungsgemäße Mikroskop ist hierzu vorzugsweise mit einer Objektivrevolverschiebeeinrichtung, wie sie aus der Deutschen Offenlegungsschrift DE 199 24 709 A1 bekannt ist, ausgerüstet. In einer anderen Ausführungsvariante wird die Relativverschiebung mit einer Zoomoptik ausgeführt. Die Relativverschiebung kann auch das Verschieben der Probe beispielsweise mit einem speziellen präzise verfahrbaren Probentisch beinhalten.

Die Teilbilder können eindimensionale, zweidimensionale oder dreidimensionale Teilbilder sein.

Zur Ermittlung des Abstandes wird eine Referenzmessung durchgeführt; dies erfolgt am Besten vor Begin der Datenaufnahme. Diese Vorgehensweise ist besonders genau, da sie alle optischen Elemente des Mikroskops in die Ermittlung einbezieht. Darüber hinaus ist diese Art des Ermittelns unabhängig von der Qualität des Objektivs und darüber hinaus besonders flexibel, da ein Ermitteln für alle Anregungs- und Detektionswellenlängen möglich ist. Ganz besonders vorteilhaft ist es das Ermitteln des Abstandes der Fokalebenen mit Hilfe von Profilschnitten, d. h. aus x-z-Schnitten oder x-y-Schnitten, bei verschiedenen Anregungs- bzw. Detektionswellenlängen zu realisieren. In einer bevorzugen Ausgestaltung erfolgt das Ermitteln des Abstandes automatisch.

In einer anderen Ausführungsvariante erfolgt das Ermitteln des Abstandes der Fokalebenen für verschiedene Randbedingungen herstellerseitig. Die ermittelten Abstände werden in einem Speicher abgelegt und können vom Benutzer abgerufen werden.

In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsvariante ist das Mikroskop ein Scanmikroskop oder ein konfokales Scanmikroskop.

Ein erfindungsgemäßes Mikroskop beinhaltet vorzugsweise eine Vorrichtung zur Überlagerung eines mit dem ersten Beleuchtungslichtstrahl erzeugten ersten Teilbildes mit einem mit dem zweiten Beleuchtungslichtstrahl erzeugten zweiten Teilbild. Diese Vorrichtung kann als spezielle elektronische Logikeinheit oder PC ausgestaltet sein.

Der Abstand der Fokalebenen ist vorzugsweise automatisch ermittelbar. Hierzu werden Profilschnitte, d. h. x-z-Schnitte oder x-y-Schnitte, bei verschiedenen Anregungs- bzw. Detektionswellenlängen automatisch angefertigt und mit Hilfe von Bildverarbeitungssoftware ausgewertet. Die räumliche Position der ersten und/oder der zweiten Fokalebene ist in einem Speichermodul speicherbar und zur Datennahme oder bei einer späteren Bildbearbeitung abrufbar.

In einer bevorzugen Ausgestaltung ist das Mikroskop ein Scanmikroskop oder ein konfokales Scanmikroskop.

In der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben. Dabei zeigen:

Fig. 1 ein erfindungsgemäßes Mikroskop und

Fig. 2 das Abbild eines x-y-Schnittes einer biologischen Probe,

Fig. 3 das Abbild eines x-z-Schnittes durch eine Probe nach dem Stand der Technik und

Fig. 4 das Abbild eines x-z-Schnittes durch eine Probe.

Fig. 1 zeigt schematisch ein Mikroskop 9, das als konfokales Scanmikroskop ausgestaltet ist. Das Mikroskop 9 umfasst als Lichtquelle 11 einen ersten Laser 13, der einen ersten Beleuchtungslichtstrahl 17 emittiert, der eine erste Wellenlänge aufweist, und einem zweiten Laser 15, der einen zweiten Beleuchtungslichtstrahl 19, der eine zweite Wellenlänge aufweist, emittiert. Der erste und der zweite Beleuchtungslichtstrahl 17, 19 werden mit einem dichroitischen Strahlvereiniger 21 vereinigt. Die Leistung des ersten und des zweiten Beleuchtungslichtstrahles 17, 19 ist mit einem akustooptischen Filter 23 (AOTF) individuell und unabhängig voneinander einstellbar. Nach dem Passieren einer Anregungsblende 25 werden die Beleuchtungslichtstrahlen 17, 19 von einem Strahlteiler 27 zum Scanmodul 29 reflektiert, das einen kardanisch aufgehängten Scanspiegel 31 beinhaltet, der den Strahl durch eine Scanoptik 33, eine Tubusoptik 35 und eine Mikroskopoptik 37 hindurch über bzw. durch eine Probe 39 führt. Die Beleuchtungslichtstrahlen 17, 19 werden bei nicht transparenten Proben 39 über die Probenoberfläche geführt. Bei biologischen Proben 39 (Präparaten) oder transparenten Proben 39 können die Beleuchtungslichtstrahlen 17, 19 durch die Probe 39 geführt werden. Dies bedeutet, dass verschiedene Fokusebenen der Probe 39 nacheinander durch die Beleuchtungslichtstrahlen 17, 19 abgetastet werden. Die nachträgliche Zusammensetzung ergibt dann je ein dreidimensionales Bild der Probe 39. Die von der Lichtquelle 11 kommenden Beleuchtungslichtstrahlen 17, 19 sind in der Abbildung als ausgezogene Linie dargestellt. Die Mikroskopoptik 37 fokussiert die Beleuchtungslichtstrahlen 17, 19 auf die Probe 39, wobei der erste Beleuchtungslichtstrahl 17 eine erste Fokalebene 41 und der zweite Beleuchtungslichtstrahl eine zweite Fokalebene 43 definiert, die einen Abstand aufweisen. Das von der Probe 39 ausgehende Detektionslicht 45 gelangt durch die Mikroskopoptik 37, die Tubusoptik 35, die Scanoptik 33 und über das Scanmodul 29 zum Strahlteiler 27, passiert diesen und trifft nach dem Passieren der Detektionsblende 47 auf einen Detektor 49, der als Photomultiplier ausgeführt ist. Das von der Probe 39 ausgehende Detektionslicht 45 ist in der Abbildung mit gestrichelten Linien dargestellt. Im Detektor 49 werden elektrische, zur Leistung des von der Probe 39 ausgehenden Detektionslichtes 45 proportionale Detektionssignale erzeugt und an die Verarbeitungseinheit 51, die als PC 53 ausgeführt ist, weitergegeben. Die Detektionssignale werden in der Verarbeitungseinheit 51 zu einer ersten Abb. 55 und einer zweiten Abb. 57 der Probe 39 zusammengesetzt. Die erste Abb. 55 ergibt sich aus dem Abscannen der Probe 39 ausschließlich mit dem ersten Beleuchtungslichtstrahl 17, der ein erstes Fluorochrom der Probe 39 anregt. Die zweite Abb. 57 ergibt sich aus dem Abscannen der Probe 39 ausschließlich mit dem zweiten Beleuchtungslichtstrahl 19, der ein zweites Fluorochrom der Probe 39 anregt, das ein anderes Emissionsspektrum aufweist, als das erste Fluorochrom. Die Abb. 57, 59 werden auf einem Display 59 dargestellt. Außerdem ist auf dem Display 59 das Überlagerungsbild 61, das der PC 53 aus der ersten Abb. 55 und der zweiten Abb. 57 errechnet. Zwischen dem Abscannen der Probe 39 mit dem ersten Beleuchtungslichtstrahl 17 und dem Abscannen der Probe mit dem zweiten Beleuchtungslichtstrahl 19 wurde die Mikroskopoptik um den zuvor ermittelten Abstand der Fokalebenen 41, 43 verschoben. Zum Verschieben ist ein Mittel 63 zum Ausführen einer Relativverschiebung, das als Piezo-Verschiebeinrichtung 65 ausgeführt ist, vorgesehen, die von dem PC 53 gesteuert wird. Der Abstand der Fokalebenen wird von dem PC 53 durch Aufnahme und Auswertung von Profilschnitten, die jeweils mit dem ersten Beleuchtungslichtstrahl 17 und dem zweiten Beleuchtungslichtstrahl 19 aufgenommen wurden, automatisch ermittelt.

Fig. 2 zeigt einen x-y-Schnitt einer biologischen Probe 39, die mit zwei unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert ist. Der Zellkern 81 ist mit einem ersten Fluoreszenzfarbstoff markiert, der bei einer Wellenlänge von 364 nm eines ersten Beleuchtungslichtstrahles anregbar ist. Der Zellkörper 83 ist mit einem zweiten Fluoreszenzfarbstoff markiert, der bei einer Wellenlänge von 488 nm eines zweiten Beleuchtungslichtstrahles anregbar ist. Der Profilschnitt 85 (x-z-Schnitt) ist in den Fig. 3 und 4 näher erläutert.

Fig. 3 zeigt das Abbild eines Profilschnittes 85, nämlich einen x-z-Schnitt durch die in Fig. 2 bereits gezeigte biologische Probe nach dem Stand der Technik. Die auf die Probe fokussierten Beleuchtungslichtstrahlen definieren zwei Fokalebenen 41, 43, die einen Abstand aufweisen: Der erste Beleuchtungslichtstrahl eine erste Fokalebene 41 und der zweite Beleuchtungslichtstrahl eine zweite Fokalebene 43. Auf Grund des Abstandes der Fokalebenen 41, 43 kommt es in der Abbildung des x-z-Schnittes, in der die Bilddaten, die bei Beleuchtung mit dem ersten Beleuchtungslichtstrahl aufgenommen wurden, mit den Bilddaten, die bei Beleuchtung mit dem zweiten Beleuchtungslichtstrahl aufgenommen wurden, überlagert wurden, zu einem gravierenden Abbildungsfehler. In der Abbildung entspricht die Lage des Zellkerns 81 innerhalb des Zellkörpers 83 nicht den wirklichen Gegebenheiten.

Fig. 4 zeigt das Abbild eines Profilschnittes 85, nämlich einen x-z-Schnitt durch die in Fig. 2 bereits gezeigte biologische Probe, wie es sich nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ergibt. In der Abbildung entspricht die Lage des Zellkerns 81 innerhalb des Zellkörpers 83 nicht den tatsächlichen Gegebenheiten.

Die Erfindung wurde in Bezug auf eine besondere Ausführungsform beschrieben. Es ist jedoch selbstverständlich, dass Änderungen und Abwandlungen durchgeführt werden können, ohne dabei den Schutzbereich der nachstehenden Ansprüche zu verlassen.

Bezugszeichenliste

9

Mikroskop

11

Lichtquelle

13

erster Laser

15

zweiter Laser

17

erster Beleuchtungslichtstrahl

19

zweiter Beleuchtungslichtstrahl

21

Strahlvereiniger

23

akustooptischer Filter

25

Anregungsblende

27

Strahlteiler

29

Scanmodul

31

Scanspiegel

33

Scanoptik

35

Tubusoptik

37

Mikroskopoptik

39

Probe

41

erste Fokalebene

43

zweite Fokalebene

45

Detektionslicht

47

Detektionsblende

49

Detektor

51

Verarbeitungseinheit

53

PC

55

erste Abbildung

57

zweite Abbildung

59

Display

61

Überlagerungsbild

63

Mittel zum Ausführen einer Relativverschiebung

65

Piezo-Verschiebeinrichtung

81

Zellkern

83

Zellkörper

85

Profilschnitt

Claims

1. Verfahren zum Erzeugen eines Bildes einer Probe (39) mit einem Mikroskop (9),

- bei dem die Probe (39) nacheinander mit einem ersten Beleuchtungslichtstrahl (17), der eine erste Wellenlänge aufweist, und einem zweiten Beleuchtungslichtstrahl (19), der eine zweite Wellenlänge aufweist, beleuchtet wird
- und bei dem zum Ausgleich eines Farblängsfehlers des Mikroskops (9) nach dem Beleuchten mit dem ersten Beleuchtungslichtstrahl (17) und vor dem Beleuchten mit dem zweiten Beleuchtungslichtstrahl (19) eine Relativverschiebung zwischen der Fokalebene (41) des ersten Beleuchtungslichtstrahls (17) und der Probe (39) um den Abstand der zu den beiden Beleuchtungslichtstrahlen (17, 19) gehörenden Fokalebenen (41, 43) ausgeführt wird und somit für jede der beiden Wellenlängen eine jeweils für die Wellenlänge spezifische Abbildung (55, 57) aus ein und derselben Probenebene aufgenommen wird,

dadurch gekennzeichnet, dass

- die beiden wellenlängenspezifischen Abbildungen (55, 57) zu einem mehrfarbigen und auf einem Display (59) darstellbaren Überlagerungsbild (61) überlagert werden
- und dass der Abstand der zu den beiden Wellenlängen gehörenden Fokalebenen (41, 43) durch eine Referenzmessung ermittelt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Positionen der beiden Fokalebenen (41, 43) abgespeichert werden.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Relativverschiebung mit einer verschiebbaren Mikroskopoptik (37) oder mit einer Zoomoptik oder durch Verschieben der Probe (39) ausgeführt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die beiden wellenlängenspezifischen Abbildungen (55, 57) zweidimensionale oder dreidimensionale Abbildungen sind.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroskop (9) ein Scanmikroskop oder ein konfokales Scanmikroskop ist.

6. Mikroskop,

- bei dem eine Probe (39) nacheinander mit einem ersten Beleuchtungslichtstrahl (17), der eine erste Wellenlänge aufweist, und einem zweiten Beleuchtungslichtstrahl (19), der eine zweite Wellenlänge aufweist, beleuchtbar ist
- und bei dem zum Ausgleich eines Farblängsfehlers des Mikroskops (9) ein Mittel (63) zum Ausführen einer Relativbewegung vorgesehen ist, mit dem nach dem Beleuchten mit dem ersten Beleuchtungslichtstrahl (17) und vor dem Beleuchten mit dem zweiten Beleuchtungslichtstrahl (19) eine Relativverschiebung zwischen der Fokalebene (41) des ersten Beleuchtungslichtstrahls (17) und der Probe (39) um den Abstand der zu den beiden Beleuchtungslichtstrahlen (17, 19) gehörenden Fokalebenen (41, 43) ausführbar ist und somit für jede der beiden Wellenlängen eine jeweils für die Wellenlänge spezifische Abbildung (55, 57) aus ein und derselben Probenebene aufnehmbar ist,

dadurch gekennzeichnet, dass

- eine Vorrichtung zur Überlagerung vorgesehen ist, die die beiden wellenlängenspezifischen Abbildungen (55, 57) zu einem mehrfarbigen und auf einem Display (59) darstellbaren Überlagerungsbild (61) überlagert.
- und dass ein PC (53) vorgesehen ist, mit dem der Abstand der Fokalebenen (41, 43) ermittelbar ist.

7. Mikroskop nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung zur Überlagerung ein PC (53) oder eine Verarbeitungseinheit (51) ist.

8. Mikroskop nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Abstand automatisch ermittelbar ist.

9. Mikroskop nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die beiden wellenlängenspezifischen Abbildungen (55, 57) zweidimensionale oder dreidimensionale Abbildungen sind.

10. Mikroskop nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass ein Speichermodul vorgesehen ist, in dem die Position der ersten und/oder der zweiten Fokalebene (41, 43) speicherbar ist.

11. Mikroskop nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroskop (9) ein Scanmikroskop oder ein konfokales Scanmikroskop ist.