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Die
Erfindung betrifft ein Scanmikroskop gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs
1 sowie ein Verfahren zum Scannen eines Objekts gemäß dem Oberbegriff
des Anspruchs 8.
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In
der Scanmikroskopie wird ein Objekt mit einem Lichtstrahl beleuchtet,
um das von dem Objekt daraufhin emittierte Reflexions- oder Fluoreszenzlicht
zu beobachten, wobei zur Beleuchtung üblicherweise Laserstrahlen
eingesetzt werden. Dabei wird ein Objekt mittels eines fein fokussierten
Lichtstrahls abgetastet. Der Fokus des Beleuchtungslichtstrahles wird
mit Hilfe einer steuerbaren Strahlablenkeinrichtung, die im Allgemeinen
zwei verkippbare Spiegel aufweist, in einer Objektebene bewegt.
Dabei stehen die Ablenkachsen meist senkrecht aufeinander, so dass
ein Spiegel den einfallenden Strahl in x-, und der andere den Strahl
in y-Richtung ablenkt. Die Verkippung der Spiegel wird beispielsweise
mit Hilfe von Galvanometer-Stellelementen
erreicht.
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Bei
der derzeit meist verwendeten Galvanometer-Technologie sind die
maximal erzielbaren Scanraten auf Grund der Massenträgheit der
bewegten mechanischen Komponenten auf einige hundert Hz für nichtresonante
Galvanometer und einige kHz für resonante
Galvanometer beschränkt.
Dies hat letztendlich relativ lange Messzeiten für jede Probe zur Folge.
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Des
weiteren weisen die Galvanometer in der Regel eine Länge von
mehreren Zentimetern auf, wobei die meist runden Spiegel einen Durchmesser von
ca. einem Zentimeter aufweisen. Für eine Strahlablenkung um zwei
Achsen sind mindestens zwei Galvanometerspiegel hintereinander oder
kardanisch ineinander verschachtelt erforderlich. Dieser Galvanometer-Aufbau
erfordert viel Platz im Mikroskop. Es wurde daher auch bereits vorgeschlagen, zum
Scannen eines Objektes eine Strahlablenkeinrichtung mit Mikrospiegeln
zu verwenden, was die Scangeschwindigkeit und die Abtastqualität deutlich erhöht.
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In
der
DE 196 54 210
C2 wurde darüber
hinaus eine besondere Ausbildung der Scaneinheit vorgeschlagen,
mit deren Hilfe ein einfallender Strahl durch Drehung von Spiegeln
in x- und y-Richtung abgelenkt und über das zu untersuchende Objekt
geführt
werden kann. Dabei wird die Scaneinheit durch drei drehbare Spiegel
gebildet. Der erste und der zweite Spiegel sind dabei in einer festen
Winkelposition zueinander angeordnet und werden gemeinsam gedreht
Der dritte Spiegel ist unabhängig
von dem ersten und zweiten Spiegel drehbar. Mit dieser Anordnung
ist es möglich,
eine hohe Bildrate zu gewährleisten,
wobei gleichzeitig gravierende Abbildungsfehler vermieden werden.
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Aus
US 5,184,012 A ist
ein optischer Spanapparat bekannt. Das Problem der unterschiedlichen Pupillenlagen
wird durch Verschieben der Strahlablenkeinrichtung selbst gelöst. Dies
ist technisch sehr aufwendig und birgt bei der Realisierung die
Gefahr von Dejustierungen.
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Speziell
in der konfokalen Scanmikroskopie wird das zu untersuchende Objekt
mit dem Fokus eines Lichtstrahles in drei Dimensionen abgetastet. Dabei
umfasst ein konfokales Scanmikroskop im Allgemeinen eine Lichtquelle,
eine Fokussieroptik, mit der das Licht der Quelle auf eine Lochblende – die sogenannte
Anregungsblende – fokussiert
wird, einen Strahlteiler, eine Strahlablenkeinrichtung zur Strahlsteuerung,
eine Mikroskopoptik, eine Detektionsblende und die Detektoren zum
Nachweis des Detektions- bzw. Fluoreszenzlichtes. Das Beleuchtungslicht
wird über
einen Strahlteiler eingekoppelt. Das von dem Objekt kommende Fluoreszenz-
oder Reflexionslicht gelangt über
die Strahlablenkeinrichtung zurück
zum Strahlteiler, passiert diesen, um anschließend auf die Detektionsblende
fokussiert zu werden, hinter der sich die Detektoren, meist Photomultiplier,
befinden. Detektionslicht, das nicht direkt aus der Fokusregion
stammt, nimmt einen anderen Lichtweg und passiert die Detektionsblende
nicht, sodass man eine Punktinformation erhält, die durch sequentielles
Abtasten des Objekts zu einem dreidimensionalen Bild führt.
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Meist
wird ein dreidimensionales Bild durch schichtweise Bilddatennahme
erzielt. Dabei erfolgt die Abtastung des Objekts in axialer Richtung (z-Richtung) meist durch
das sogenannte Objektscanning, bei dem das Objekt mit Hilfe des
Objekttisches in z-Richtung bewegt wird. Allerdings kann dies auch
dadurch erreicht werden, dass das Objektiv in axialer Richtung verschoben
wird, was mit einer Verschiebung des Fokus des Beleuchtungsstrahls einher
geht.
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Das
bei Beleuchtung von dem Objekt ausgesendete Reflexions- oder Fluoreszenzlicht
gelangt über
einen Strahlteiler durch ein Detektionspinhole auf einen Detektor.
Die Leistung des vom Objekt kommenden Lichtes wird in Abhängigkeit
von der Position des Abtaststrahles bevorzugt in festen Zeitabständen gemessen.
Damit lässt
sich das Objekt Rasterpunkt für
Rasterpunkt in drei Dimensionen abtasten und zu jedem Abtastpunkt
ein Messwert ermitteln, der repräsentativ
für diesen
Objektpunkt ist.
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Mit
den bei Scanmikroskopen üblicherweise als
Beleuchtungsquellen eingesetzten Lasern kann das Objekt zur Erzielung
des gewünschten
Ergebnisses optimal beleuchtet werden. Ein wichtiger Punkt bei der
Qualität
eines Scanmikroskops ist die genaue Abbildung des Drehpunktes der
Strahlablenkeinrichtung in die Pupille des eingesetzten Objektivs.
Bei Strahlablenkeinrichtungen, die aufgrund ihrer Geometrie mehr
als einen Drehpunkt aufweisen, sollte die Anpassung der Abbildung
bezogen auf die Bildqualität
optimal einstellbar sein. Da allerdings die Lage der Pupille zum
einen wesentlich von dem verwendeten Objektiv und zum andern von
der Wellenlänge
des Beleuchtungsstrahls abhängt,
bieten die bekannten Mikroskope im Hinblick auf dieses Problem keine
befriedigende Lösung
an.
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Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Scanmikroskop und ein
Verfahren zum Scannen eines Objektes vorzuschlagen, bei dem eine
verbesserte und zuverlässigere
Anpassung der Abbildung des Beleuchtungsstrahl-Drehpunktes der Strahlablenkeinrichtung
in die axiale Lage der Pupille für
verschiedene Objektive und Beleuchtungswellenlängen möglich ist.
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Erfindungsgemäß wird diese
Aufgabe durch ein Scanmikroskop mit den Merkmalen gemäß Anspruch
1 sowie ein Verfahren mit den Merkmalen gemäß Anspruch 8 gelöst. Weitere
Vorteile und vorteilhafte Ausführungsformen
der Erfindung sind Gegenstand der untergeordneten Ansprüche.
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Das
erfindungsgemäße Scanmikroskop weist
somit eine Beleuchtungsquelle auf, mit der die im Scanmikroskop
erforderliche Beleuchtungsstrahlung erzeugt wird. Vorteilhafterweise
wird zur Erzeugung des Beleuchtungsstrahls ein Laser verwendet. Mit
der im Scanmikroskop vorhandenen Strahlablenkeinrichtung ist es
möglich,
den Beleuchtungsstrahl zeilenweise, d. h. also in x- und y-Richtung
abzulenken, so dass das zu untersuchende Objekt abgetastet werden
kann. Diese Strahlablenkeinrichtung definiert an den Ablenkpunkten
einen Beleuchtungsstrahl-Drehpunkt. Zur Beeinflussung der Abbildung dieses
Beleuchtungsstrahl-Drehpunktes wird nun eine Einrichtung zum axialen
Verschieben eines Bildes dieses Beleuchtungsstrahl-Drehpunktes in die Pupille
des Objektives vorgesehen. Mit dem Einsatz der erfindungsgemäßen Einrichtung
zum axialen Verschieben ist es möglich,
die Lage des Bildes des Beleuchtungsstrahl-Drehpunktes an das jeweils
verwendete Objektiv und die jeweils verwendete Wellenlänge des
Beleuchtungsstrahls anzupassen. Diese Anpassung führt zu einer
im Wesentlichen senkrechten Abbildung des Beleuchtungslichtstrahles
durch das Objektiv auf das Objekt; denn durch die Abbildung des
Beleuchtungsstrahl-Drehpunktes
in die Pupille des Objektives ist gewährleistet, dass auch beim zeilenweisen
Abtasten der Beleuchtungsstrahl in jedem Punkt im Wesentlichen senkrecht
auf das Objekt gerichtet wird. Darüber hinaus ist es mit dem erfindungsgemäßen Mikroskop
möglich,
unterschiedliche Beleuchtungswellenlängen zu verwenden. Denn die eingangs
bereits beschriebene unterschiedliche Lage der Pupille für unterschiedliche
Beleuchtungsstrahlwellenlängen
kann mit dem erfindungsgemäßen Scanmikroskop
kompensiert werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist die Einrichtung zum Verschieben des Bildes des
Beleuchtungsstrahl-Drehpunktes an die Strahlablenkeinrichtung selbst
gekoppelt. Vorteilhafterweise ist die Strahlablenkeinrichtung hierzu
zu einem Modul zusammen gefasst, das mit Hilfe einer manuell einstellbaren
Mechanik ausgestattet ist oder motorisch axial so in seiner Position
verändert
werden kann, dass das Bild des Beleuchtungsstrahl-Drehpunktes in
der Pupille des Objektives gelegt werden kann.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
können
aber auch im Mikroskop vorhandene Linsen, die vor dem Objektiv angeordnet
sind und die die Fokuslänge ändern, mit
einem Mechanismus versehen sein, der ihre axiale Lage verändert. Auch
damit kann die jeweilige Linse oder auch ein ganzes Linsensystem
so positioniert werden, dass das Bild des Beleuchtungsstrahl-Drehpunktes
in der Pupille des Objektivs abgebildet wird. Dabei werden die Eigenschaften
des jeweils eingesetzten Objektivs und der jeweils verwendeten Wellenlänge des
Beleuchtungsstrahls berücksichtigt.
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In
einer weiteren Ausführungsform
ist die gesamte Scaneinheit, die im Wesentlichen das Beleuchtungs-
und Detektionspinhole, den Hauptstrahlteiler, die Strahlablenkeinrichtung,
den Detektor und einige Optiken zur Formung und Führung der Lichtstrahlen
beinhaltet, derart verschiebbar, dass das Bild des Beleuchtungsstrahl-Drehpunktes
in die Pupille des Objektivs (oder zumindest in die Nähe der Pupille)
abgebildet wird.
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Um
diesen Einstellvorgang komfortabel und einfach durchführen zu
können,
ist es erforderlich, dass für
die jeweils eingesetzten Objektive und für die im Mikroskop zum Einsatz
kommenden Beleuchtungswellenlängen
die Lage der Pupillen jeweils bekannt ist. Diese können beispielsweise
in einem vorhergehenden Arbeitsschritt für die verschiedenen verwendeten
Objektive und Wellenlängen
bestimmt werden und in einer Speichereinheit im Mikroskop abgelegt
werden. Vorteilhafterweise wird allerdings auf die Herstellerangaben zurückgegriffen
werden. Damit ist es möglich,
den Einstellvorgang der axialen Verschiebung zu automatisieren.
Für die
automatische Einstellung muss hierzu lediglich das verwendete Objektiv
und die eingesetzte Beleuchtungsstrahlwellenlänge bekannt sein. Aus den für die spezielle
Kombination Objektiv und Beleuchtungsstrahlwellenlänge hinterlegten
Daten lässt
sich dann die jeweils erforderliche Position der Strahlablenkeinrichtung,
der Scaneinheit oder der axial verschiebbaren Linse ermitteln. Durch
einen Vergleich der aktuellen Position mit der Sollposition wird
dann ein Verschiebeweg ermittelt, und dann die Einrichtung zum axialen
Verschieben so angesteuert, dass die gewünschte Verschiebung erfolgt.
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Mit
dem erfindungsgemäßen Scanmikroskop und
dem erfindungsgemäßen Verfahren
zum Scannen eines Objektes kann damit ein Beitrag zur Automatisierung
des Einstellvorgangs geleistet werden, was zum einen die Fehlerquote
reduziert und zum anderen die Rüstzeit
bis zur Betriebsbereitschaft des Mikroskops abkürzt.
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Weitere
Vorteile und vorteilhafte Ausführungsformen
der Erfindung ergeben sich aus den nachfolgenden Figuren sowie deren
Beschreibung, wobei bei der Darstellung der Figuren zu Gunsten der Übersichtlichkeit
auf eine maßstabsgetreue
Wiedergabe verzichtet wurde.
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Es
zeigen im Einzelnen:
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1.
in einer schematischen Darstellung ein herkömmliches Scanmikroskop,
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2 prinzipieller
Aufbau eines Scanmikroskops mit axialer Verschiebeeinrichtung.
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1 zeigt
in einer schematischen Darstellung ein herkömmliches konfokales Scan-Mikroskop mit
einer Beleuchtungsquelle 10 in Form eines Lasers zur Erzeugung
eines Beleuchtungslichtstrahls 14 zur Beleuchtung eins
Objektes 12. Im Strahlengang nach der Beleuchtungsquelle 10 ist
eine Optik 16 angeordnet, mit der das Licht der Lichtquelle 10 auf
eine Beleuchtungsblende 18 fokussiert wird. Nach der Beleuchtungsblende 18 gelangt
der Beleuchtungslichtstrahl 14 auf einen Strahlteiler 20, welcher
den Beleuchtungslichtstrahl 14 durch eine Optik 22 auf
eine Strahlablenkeinrichtung 24 richtet.
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Nach
der Strahlablenkeinrichtung 24 sind Optiken 25 und 26 angeordnet.
Der Beleuchtungslichtstrahl 14 gelangt dann durch das Objektiv 30 auf die
Probe 12. Die axiale Lage der Pupille 28 liegt
in diesem Beispiel oberhalb des Objektivs und ist mit zwei Pfeilen
angedeutet.
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Zum
Nachweis des Detektions- bzw. Fluoreszenzlichts dient ein nach einer
Detektionsblende 19 angeordneter Detektor 21.
Zwischen den Optiken 25 und 26 ist die Zwischenbildebene 23 gebildet.
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In 2 ist
nun der prinzipielle Aufbau eines erfindungsgemäßen Scanmikroskops gezeigt.
Dabei geht wieder von einer Beleuchtungsquelle 10 ein Beleuchtungslichtstrahl 14 aus,
der über
einen Umlenkspiegel 27 einer Strahlablenkeinrichtung 32 zugeführt wird.
Die Strahlablenkeinrichtung 32 ist dabei in der Lage, eine
zeilenweise Bewegung des Beleuchtungslichtstrahles 14 zu
verursachen, so dass mit dieser Bewegung eine zeilenweise Abtastung
des Objektes 12 durchgeführt werden kann. Die Lage der Pupille 28 wird
durch das jeweils verwendete Objektiv 30 sowie die Wellenlänge des
eingesetzten Beleuchtungsstrahles 14 bestimmt. In der Strahlablenkeinrichtung 32 wird über die
Spiegelkombination 33, 34, 35 ein Beleuchtungsstrahl-Drehpunkt
definiert, der in die Pupille 28 abgebildet werden muss.
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In
der vorliegenden Ausführungsform
der Erfindung kann dies dadurch erreicht werden, dass die Strahlablenkeinrichtung
32 mit
einer Einrichtung zum axialen Verschieben des Bildes des Beleuchtungsstrahl-Drehpunktes
in die Pupille
28 (oder zumindest in die Nähe der Pupille)
gekoppelt ist, wobei die Strahlablenkeinrichtung
32 beispielsweise
als Modul
38 zusammen gefasst ist. Diese Einrichtung kann insbesondere
so an die Strahlablenkeinrichtung
32 gekoppelt sein, dass
das gesamte Modul
38 in axialer Bewegungsrichtung
36 verschoben
werden kann. Grundsätzlich
kann die Strahlablenkeinrichtung
32 dabei entsprechend
der in der
DE 196
54 210 C2 ausgeführt
sein.
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Zur
Ermittlung des in axialer Bewegungsrichtung
36 erforderlichen
Verschiebeweges muss die Lage der Pupille
28 bekannt sein.
Diese kann beispielsweise für
unterschiedliche Objektive
30 vorab ermittelt und gespeichert
werden. Für
die unterschiedlichen Objektive werden die ermittelten Pupillenlagen
28 bevorzugt
in einem dem Mikroskop zugeordneten Speicher, etwa in Form einer
Tabelle abgelegt. Um unterschiedliche Objektive im Mikroskop verwenden
zu können,
ist es bereits bekannt, die Objektive auf einer drehbaren Scheibe,
einem sog. Revolver, anzuordnen und das jeweils gewünschte Objektiv
in eine Arbeitsposition in den Strahlengang einzudrehen. Wie aus
den
DE 32 02 461 C1 bereits
bekannt, können
die Objektive dabei mit einer Codierung versehen werden, um die
Art des Objektives zu ermitteln. Sofern nun in der Tabelle bereits
hinterlegt ist, welche Pupille dem jeweiligen Objektiv zugeordnet
ist, ist es möglich
einfach durch das Eindrehen des Objektives in den Strahlengang und
die automatische Erkennung dieses Objektives die jeweilige Lage
der Pupille
28 zuzuordnen.
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Wird
in dieser oder einer weiteren Tabelle darüber hinaus die Lage der Pupille
für jedes
Objektiv noch in Abhängigkeit
von der Beleuchtungswellenlänge
abgelegt, so ist es auf einfache Weise möglich, den Einstellvorgang
im Hinblick auf die Pupillenlage zu automatisieren. Die einzige
Eingabe, die vom Benutzer dann noch gefordert werden muss, ist die
Eingabe der verwendeten Beleuchtungswellenlängen. Damit kann mit dem erfindungsgemäßen Scanmikroskop
in Abhängigkeit
von dem jeweils verwendeten Objektiv und der jeweils verwendeten
Beleuchtungswellenlänge
der erforderliche Verschiebeweg in axialer Richtung bestimmt werden.
Hierzu kann insbesondere die aktuelle Position des zu verschiebenden Elementes,
also beispielsweise der Strahlablenkeinrichtung 32, ermittelt
werden. Dabei wird zunächst die
aktuelle Lage der Strahlablenkeinrichtung 32 bestimmt,
oder aus einem Speicherbereich ausgelesen. Anschließend wird
die Sollposition der Strahlablenkeinrichtung ermittelt, wobei das
jeweils verwendete Objektiv 30 sowie die verwendete Beleuchtungswellenlänge zugrunde
gelegt wird. Aus der Differenz zwischen diesem Soll- und Ist-Wert
ergibt sich der axial erforderliche Verschiebeweg der Strahlablenkeinrichtung 32 in
Bewegungsrichtung 36.
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In
der Praxis hat sich gezeigt, dass hierbei Verschiebungen von bis
zu 30 mm erforderlich sind. Die Einrichtung zum axialen Verschieben
der Strahlablenkeinrichtung 32 muss also in der Lage sein, über diesen
Bereich eine exakte Verschiebung der Strahlablenkeinrichtung 32 zu
gewährleisten.
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In
einer alternativen Ausführungsform
der Erfindung ist es selbstverständlich
auch möglich, eine
der Linsen 25 oder 26 oder ein entsprechendes Linsensystem
so in axialer Richtung zu verschieben, dass das Bild des Beleuchtungsstrahl-Drehpunktes in
die Pupille des Objektives abgebildet wird. Bei dieser Verschiebung
wird ebenso, wie bei der oben beschriebenen Verschiebung der Strahlablenkeinrichtung 32,
die Pupillenlage entsprechend dem verwendeten Objektiv 30 und
entsprechend der eingesetzten Wellenlänge des Beleuchtungslichtstrahls 14 zugrunde
gelegt.. Dabei wird die zu verschiebende Linse 26, 26 oder
die Linsenkombination mit der Verschiebeeinrichtung beispielsweise über ein
Gehäuse oder
einen Träger
der Linse gekoppelt.
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Selbstverständlich ist
es auch möglich
in ähnlicher
Weise eine Verschiebung der gesamten Scaneinheit 15 zur
Anpassung der Abbildung des Beleuchtungsstrahl-Drehpunktes in oder
in die Nähe der
axialen Lage der Pupille 28 auszuführen.
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Mit
der nun insbesondere anhand der Figuren beschriebenen erfindungsgemäßen Anordnung ist
es möglich,
die wandernde Pupillenlage, die sich insbesondere bei der wechselnden
Benutzung von verschiedenen Objektiven unterschiedlicher Vergrößerung ergibt,
zu kompensieren. Die Einrichtung zum axialen Verschieben kann so
ausgeführt
sein, dass ein schrittweises Verschieben oder ein kontinuierliches
Verschieben der Strahlablenkeinrichtung 32, der Scaneinheit 15 bzw.
der Spiegel 25, 26 möglich ist.
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Darüber hinaus
ist es selbstverständlich auch
möglich,
zusätzlich
zu der Einrichtung zum Verschieben Vorrichtungen zum Korrigieren
der Bildgröße einzusetzen.
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Die
Erfindung wurde in bezug auf eine besondere Ausführungsform beschreiben. Es
ist jedoch selbstverständlich,
dass Änderungen
und Abwandlungen durchgeführt
werden können,
ohne dabei den Schutzbereich der nachstehenden Ansprüche zu verlassen.
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- 10
- Beleuchtungsquelle
- 12
- Objekt
- 14
- Beleuchtungslichtstrahl
- 15
- Scaneinheit
- 16
- Optik
- 18
- Beleuchtungsblende
- 19
- Detektionsblende
- 20
- Strahlteiler
- 21
- Detektor
- 22
- Optik
- 23
- Zwischenbildebene
- 24
- Strahlablenkeinrichtung
- 25
- Optik
- 26
- Optik
- 27
- Umlenkspiegel
- 28
- Pupille
- 30
- Objektiv
- 32
- Strahlablenkeinrichtung
- 33
- Spiegel
- 34
- Spiegel
- 35
- Spiegel
- 36
- Bewegungsrichtung
- 38
- Modul