JP2015522850A - 光学顕微鏡およびその制御方法 - Google Patents

Abstract

種々の実施形態にしたがって、光学顕微鏡を提供する。当該光学顕微鏡は、撮像すべきサンプル上に照射パターンを向けるための走査装置であって、サンプルの複数の区画を順次１つずつ覆うように照射パターンをシフトさせるために移動可能であって、サンプルの各区画に対して、当該区画を照射するために照射パターンを向け、照射パターンにより照射されたサンプルの区画からの戻り光を受光する、走査装置と、サンプルの区画に対応するサンプル上の焦点面内で、照射パターンの光強度分布を、時間の関数として変調する変調装置と、各区画からの戻り光を検出器に光学的に結合させる検出装置であって、それぞれの戻り光を、検出器の個々の部分に順次光学的に結合させて、検出器上にサンプルの画像を形成し、検出器の各部分はサンプルの各区画に対応する、検出装置とを備える。

Description

本出願は、２０１２年７月５日に出願された米国仮出願第６１／６６８，０８４号の優先権の利益を主張する。その内容の全体はすべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

種々の実施形態は、光学顕微鏡およびその光学顕微鏡を制御する方法に関する。

レーザ走査型共焦点顕微鏡法は、医用分野および工業検査用に確立された光学撮像方法である。この方法は、光学切片、ハイコントラスト、深さ方向分解撮像、および回折限界空間分解能を提供し得る。通常、共焦点顕微鏡は、画像形成をポイント・ツー・ポイント走査に依存する。２次元撮像のためには、一般的に密結合された２つの検流計を用いて照射ポイントをサンプル内にシフトさせる。ほとんどの検流計の最大共振周波数が数キロヘルツであるところ、共焦点顕微鏡の画像取得速度は、通常、５１２×５１２画素の標準画像サイズで毎秒数フレームより小さい。

しかしながら、用途によっては、より高い撮像速度が要求される。例えば、内因性ニューロン信号を可視化するために、光学的撮像が用いられてきた。この場合、ミリ秒単位の時間分解能（または毎秒約１０００フレームのフレーム速度）が望まれる。ポイントスキャニング型共焦点顕微鏡を用いた場合、高速セルプロセスにおける顕微鏡的証拠を得るためには、空間解像度に関して妥協するか、制限された走査視野を受け入れるか、あるいは感度（低い信号対雑音比）を犠牲にするかしなければならない。

上記問題点を解決するための唯一の方法は、同時に複数の位置を照射して、画像を並列に取得することである。その結果、長い画素滞留時間と短いフレーム取得時間との理想的なコンビネーションが得られ、速いフレーム速度と良好な感度が得られる。このことは、共焦点開口の調整ができないこと、統計学的不均等性を避けるためすべての位置を複数回照射する必要があること、およびフレーム電荷結合素子（ＣＣＤ）の読出しに同期する必要があることと結びつくが、長い間、既存のスピニングディスク型共焦点顕微鏡の利点であった。このような同期化により、理論上のフレーム取得速度は、例えば、毎秒３００フレームから通常毎秒５０フレームへと劇的に低下する。このようなフレーム取得速度は、スパイク頻度解析等の特定の生理学的事象には不十分である。

ライン走査型共焦点顕微鏡法は、速い走査速度および高い画質を得るための代替的アプローチを提供する。この方法は、ラインカメラと、並列照射／取得モードとを用いて実現される。ライン走査型共焦点顕微鏡は、ｘ方向のラインに沿ってサンプルを照射し、このラインを、走査ミラーを用いてｙ方向に走査する。ラインカメラは、毎秒７０，０００ラインまでの読出し速度を可能とするので、５１２×５１２画素のフレームであれば、高感度のための長い画素滞留時間をもって、毎秒１４０フレーム取得できる。

図１に、従来のライン走査型共焦点システム１００の概略図を示す。このライン走査型共焦点システム１００は、近赤外光１０４を供給する近赤外（ＮＩＲ）光源１０２を備え、この近赤外光１０４は、５０ｍｍの焦点距離を有するコリメータ（ＣＯ）１０６、近赤外光１０４を一次元に集光するシリンドリカルレンズ（ＣＬ）１０８、ビームスプリッタ（ＢＳ）１１０、スリット１１２、８０ｍｍの焦点距離を有する球面レンズ（Ｌ１）１１４、近赤外光１０４の機械的振動および無慣性走査を可能にする音響光学偏向器（ＡＯＤ）１１６、６０ｍｍの焦点距離を有する球面レンズ（Ｌ２）１１８、１２０ｍｍの焦点距離を有する球面レンズ（Ｌ３）１２０、ダイクロイックミラー（ＤＭ）１２２、および対物レンズ１２４を順次通過してサンプル１５０に到達する。

そして、サンプル１５０からの光は、対物レンズ１２４、ＤＭ１２２，Ｌ３ １２０、Ｌ２ １１８、ＡＯＤ１１６、Ｌ１ １１４、スリット１１２を順次通過し、ＢＳ１１０で光路変更されて、６０ｍｍの焦点距離を有する球面レンズ（Ｌ４）１２６、１００ｍｍの焦点距離を有する球面レンズ（Ｌ５）１２８、およびフィルタ１３０を通過して、線形電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ１３２に到達する。線形ＣＣＤカメラ１３２は、サンプル１５０の一次元画像を、ＣＣＤカメラ１３２の同一領域上に捉えるラインカメラである。

ライン走査型共焦点顕微鏡法は、焦点がずれた光を遮るためにスリット開口に依存する。しかしながら、このようなスリットのバックグラウンド除去効率は、ポイント走査型焦点顕微鏡におけるピンホールのそれよりも劣る。また、利用可能なラインカメラは、比較的高い読出しノイズレベルを有する。したがって、ライン走査型共焦点顕微鏡により達成できる信号対雑音比および信号対バックグラウンド比は、生体内の厚い生体組織を撮像するのには不十分である。

したがって、信号対雑音比および信号対バックグラウンド比が改善された光学顕微鏡法が求められている。

一実施形態によれば、光学顕微鏡が提供される。当該光学顕微鏡は、撮像すべきサンプル上に照射パターンを向けるための走査装置であって、サンプルの複数の区画を順次１つずつ覆うように照射パターンをシフトさせるために移動可能であり、サンプルの各区画に対して、当該区画を照射するために照射パターンを向け、照射パターンにより照射されたサンプルの区画からの戻り光を受光する走査装置と、サンプルの区画に対応する、サンプル上の焦点面内で、照射パターンの光強度分布を、時間の関数として変調する変調装置と、各区画からの戻り光を検出器に光学的に結合させる検出装置であって、それぞれの戻り光を、検出器の個々の部分に順次光学的に結合させて、検出器上にサンプルの画像を形成し、検出器の各部分が上記サンプルの各区画に対応する、検出装置とを備えてもよい。

一実施形態によれば、光学顕微鏡を制御する方法が提供される。当該方法は、照射パターンを撮像すべきサンプルに向け、サンプルの複数の区画を順次１つずつ覆うように照射パターンをシフトさせ、サンプルの各区画に対して、当該区画を照射するために照射パターンを向け、照射パターンにより照射されたサンプルの区画からの戻り光を受光し、サンプルの区画に対応する、サンプル上の焦点面内で、照射パターンの光強度分布を、時間の関数として変調し、それぞれの戻り光を、検出器の個々の部分に順次光学的に結合させて、検出器上にサンプルの画像を形成し、検出器の各部分がサンプルの各区画に対応してもよい。

図面において、同様の参照符号は異なる図面の全体にわたって同様の部分を指すものとする。図面は必ずしも正確な縮尺ではなく、本発明の原理を説明することに強調が置かれている。以下の説明において、本発明の種々の実施形態を以下の図面を参照して述べる。

図１は、従来のライン走査型共焦点システムの概略図を示す。 図２Ａは、種々の実施形態に係る光学顕微鏡の概略構成図を示す。 図２Ｂは、種々の実施形態に係る光学顕微鏡制御方法のフローチャートを示す。 図３は、種々の実施形態に係る光学顕微鏡の概略図を示す。 図４は、種々の実施形態に係る光学顕微鏡の概略図を示す。 図５は種々の実施形態に係る変調装置の概略図を示す。 図６は種々の実施形態に係る空間偏光子の概略図を示す。

以下の詳細な説明は、本発明が実施される特定の詳細および実施形態を図示により示す添付図面に言及する。これらの実施形態は、当業者が本発明を実施できる程度に詳細に記載されている。他の実施形態も可能であり、本発明の主題から逸脱することなく、構造的、論理的、および電気的な変更が可能である。各種の実施形態は必ずしも相互に排他的でなく、いくつかの実施形態を１つ以上の他の実施形態と組み合わせて新たな実施形態を形成し得る。

上記方法または装置のうちのいずれかに関連して記述された実施形態は、他の方法または装置にも類似的に有効である。同様に、ある方法に関連して記述された実施形態は、ある装置にも類似的に有効であり、その逆も同様である。

ある実施形態に関連して記述された特徴は、他の実施形態における同一または同様の特徴に対応して適用可能である。ある実施形態に関連して記述された特徴は、他の実施形態において明示的に記述されていなくても、他の実施形態に対応して適応可能である。さらに、ある実施形態の特徴に関連して記述された追加および／または組合せおよび／または代替案は、他の実施形態の同一または同様の特徴に対応して適用可能である。

種々の実施形態の文脈において、１つの特徴または素子に関して使用される冠詞「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、複数の特徴または素子の１つ以上への言及を含む。

種々の実施形態の文脈において、「少なくとも実質的に」という表現は、「厳密に」と、妥当な変動幅とを含む。

種々の実施形態の文脈において、数値に付された「約」または「略」という用語は、厳密な数値と、妥当な誤差範囲とを含む。

ここで、用語「および／または」、関連する列挙項目の１つ以上のあらゆる組み合わせを含む。

ここで、「ＡまたはＢのうちの少なくとも１つ」という形式の表現は、Ａ、またはＢ、またはＡとＢの両方、を含む。同様に、「ＡまたはＢまたはＣのうち少なくとも１つ」という形式の表現、またはさらなる列挙項目を含む、は関連する列挙項目の１つ以上のあらゆる組み合わせを含む。

種々の実施形態は、光学顕微鏡法、例えば、光学切片の取得が可能な超高速光学顕微鏡法または光学切片の取得が可能なレーザ走査型顕微鏡法に関する。

種々の実施形態は、二次元または三次元の光学的に区分された画像を超高速で取得するための光学顕微鏡を提供してもよい。この光学顕微鏡は、照明スキャナとしての一次元走査装置を用いて又は介してサンプルを照射することにより、サンプル上に走査照射パターンを形成してもよい。サンプルからの放射は、上記照明スキャナによりデスキャンされ、照射パターンに適合する検出開口を通過してもよい。他の一次元走査装置を検出スキャナとして使用してもよく、この他の一次元走査装置は、検出開口を通過した放出光子を、撮像されているサンプルに対応する画像形成のための二次元イメージセンサに向けてもよい。

種々の実施形態は、超高速画像取得（毎秒１，０００フレーム以上）、良好なコントラストおよびバックグラウンド除去、および優れた感度を特徴とし、性能面では既存の技術には匹敵するものがない、光学顕微鏡法の設計を提供してもよい。

従来のラインスキャン型共焦点顕微鏡法（例えば、図１）では、信号対雑音比や信号対バックグラウンド比は生体内の厚い生体組織を撮像するのには不十分であった。これに対して、種々の実施形態は、二次元イメージセンサを用いることにより改善された信号対雑音比と、焦点変調を含むことにより改善された信号対バックグラウンド比とを有する高速光学顕微鏡法を提供してもよい。

種々の実施形態の光学顕微鏡は、生細胞の撮像、小動物の撮像、臨床診断、サンプルの工業検査等、様々な用途に用いられるが、これら用途に限定されるものではない

図２Ａは、種々の実施形態に係る光学顕微鏡２００の概略構成図を示す。光学顕微鏡２００は、撮像すべきサンプル上に照射パターンを向けるための走査装置２０２を備える。走査装置２０２は、サンプルの複数の区画を順次１つずつ覆うように照射パターンをシフトさせるために移動可能である。走査装置２０２は、サンプルの各区画に対して、当該区画を照射するために照射パターンを向け、照射パターンにより照射されたサンプルの当該区画からの戻り光を受光する。また、光学顕微鏡２００は、サンプルの各区画に対応する、サンプル上の焦点面内で、照射パターンの光強度分布を時間の関数として変調する変調装置２０３と、各区画からの戻り光を検出器に光学的に結合させる検出装置２０４を備える。検出装置２０４は、それぞれの戻り光を、検出器のそれぞれの部分に順次光学的に結合させ、これにより検出器上にサンプルの画像を形成する。検出器の各部分は、サンプルの各区画に対応する。２０６として示す線は、走査装置２０２、変調装置２０３、および検出装置２０４の関係を示し、光学的結合および／または機械的結合を含んでもよい。

言い換えれば、光学顕微鏡２００は、照射パターン（例えば、光照射パターン）または光信号をサンプルの第１区画に向けて、照射パターンにより照射されたサンプルの第１区画からの第１の戻り光を受光する走査装置２０２を備えてもよい。サンプルの区画に対応する、サンプル上の焦点面内または上に形成された照射パターンの光強度分布を、例えば変調装置２０３を介して、時間の関数（例えば、時間の周期的関数）として、変調してもよい。これは、照射パターンをサンプルの区画上の焦点領域付近で強度変調するということを意味してもよい。光学顕微鏡２００は、サンプルの第１区画の画像を検出器の第１部分上に生成するように、第１の戻り光を受光する検出装置２０４をさらに備えてもよい。

続いて、走査装置２０２は、その光強度分布が変調された照射パターンをサンプルの第２区画上に向け、第２区画を照射して、照射パターンにより照射されたサンプルの第２区画からの第２の戻り光を受光するように、移動してもよい。検出装置２０４は、検出器の第２部分上にサンプルの第２区画の画像を生成するように第２の戻り光を受光してもよい。これは、サンプルの連続する区画に対して繰り返されてもよい。サンプルを区画毎に、例えば、第１区画の次は第２区画というように撮像することにより、光学顕微鏡２００は、一度に一区画を撮像するというサンプルの光学的区分けを可能にする。種々の実施形態において、光学顕微鏡２００は、光学的区分け機能を有する超高速光学顕微鏡でもよい。

種々の実施形態において、走査装置２０２は、サンプルの視野全体を順次覆うように照射パターンをシフトさせてもよい。

種々の実施形態において、変調装置２０３は、サンプルの焦点面外の励起光強度が少なくとも実質的に一定であることを確保しつつ、焦点面内における照射パターンの入射光強度分布を、時間の周期的関数として選択的に変調してもよい。

種々の実施形態において、それぞれの戻り光を受光する検出器の部分の並び順は、照射パターンにより照射されているサンプルの区画の並び順に対応してもよい。

種々の実施形態において、検出器の各部分の相対的な位置は、サンプルの各区画の相対的な位置に対応してもよい。

種々の実施形態の文脈において、サンプルの一区画上に向けられる照射パターンおよび対応する戻り光は、少なくとも実質的に同一の光学路または光路をたどる。

種々の実施形態の文脈において、１つの戻り光は、サンプルの１つの区画から、照射パターン、例えば、その光強度分布がサンプルの当該区画に対応するサンプル上の１つの焦点面内または上で変調された照射パターン、によるサンプルの当該区画の照射に応じて、誘導されてもよい。

種々の実施形態の文脈において、それぞれの戻り光のいずれか１つ又は各々は、サンプルにより反射された照射パターン光または励起光の一部を含んでもよい。種々の実施形態の文脈において、それぞれの戻り光のいずれか１つ又は各々は、サンプルから出射された蛍光または蛍光性の光を含んでもよい。

種々の実施形態の文脈において、走査装置２０２は、サンプルの区画を順次１つずつ覆うように照射パターンをシフトさせるための、可動式ミラー、または反射器、または導光器であってもよい。

種々の実施形態の文脈において、走査装置２０２は、光学顕微鏡２００の照射光路内に又は沿って設けられてもよい。走査装置２０２は、光学顕微鏡２００の検出光路の一部分の中に設けられてもよい。検出装置２０４は、光学顕微鏡２００の検出光路内に又は沿って設けられてもよい。

種々の実施形態の文脈において、検出装置２０４は、走査装置２０２の動作または走査動作に同期してもよい。限定されない例として、走査装置２０２の動作は、検出装置２０４により供給されるトリガー信号（例えば、フレームトリガー）に同期してもよい。

種々の実施形態において、照射パターンは、スポット、画素、またはラインのうちの少なくとも１つを１つ以上含んでもよい。例えば、照射パターンは、サンプルの視野内の複数の回折限界スポットまたは画素の１つ以上を含んでもよい。限定されない例として、照射パターンが１つのラインを含む場合は、走査装置２０２はサンプルのライン走査を行ってもよい。つまり、サンプルは、ライン単位で一度に１ラインずつ走査されてもよい。種々の実施形態において、走査装置２０２は、例えば、光を一次元状（例えば、ライン状）に配向する一次元走査装置であってもよい。

種々の実施形態において、検出装置２０４は、検出器を備えてもよい。この検出器は移動可能であってもよい。これは、検出器が、検出器のそれぞれの部分がそれぞれの戻り光を受光するように移動されるということを意味してもよい。

種々の実施形態において、走査装置２０２の動作または走査動作は、上記検出器に同期してもよい。種々の実施形態において、検出器の移動は、走査装置２０２の動作に同期してもよい。これは、検出器が走査装置２０２の動作に同期して移動されるということを意味してもよい。限定されない例として、検出器の動作および走査装置２０２の動作は、検出器から供給されるトリガー信号（例えば、フレームトリガー）に同期してもよい。

種々の実施形態の文脈において、上記検出器は、一次元（１Ｄ）検出器であるライン検出器またはセンサとは対照的に、二次元（２Ｄ）検出器であってもよい。

種々の実施形態の文脈において、上記検出器は、イメージセンサであってもよい。

種々の実施形態の文脈において、上記検出器は、カメラであっても又はカメラを含んでもよく、このカメラは、その個々の部分でそれぞれの戻り光を受光して、サンプルの二次元（２Ｄ）画像を生成可能でもよい。限定されない例として、上記カメラは、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ、または相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）カメラであってもよい。

種々の実施形態において、検出装置２０４は、それぞれの戻り光を受光するための他の走査装置を備えてもよい。この他の走査装置は、それぞれの戻り光を検出器のそれぞれの部分に向けてサンプルの画像を生成するように移動可能でもよい。それぞれの戻り光は、この他の走査装置により、検出器のそれぞれの部分に１つずつ向けられてもよい。

種々の実施形態において、上記他の走査装置の動作または走査動作は、走査装置２０２の動作または走査動作に同期してもよい。これは、走査装置２０２と他の走査装置が同期して移動するということを意味してもよい。

種々の実施形態において、走査装置２０２および上記他の走査装置のそれぞれの動作は、検出装置２０４または上記検出器に同期してもよい。限定されない例として、走査装置２０２および他の走査装置のそれぞれの動作または走査動作は、検出装置２０４または検出器より供給されるトリガー信号（例えば、フレームトリガー）に同期してもよい。

種々の実施形態の文脈において、上記他の走査装置は、それぞれの戻り光を検出器のそれぞれの部分に向けるための可動式ミラー、または反射器、または導光器であってもよい。

種々の実施形態において、上記他の走査装置は、それぞれの戻り光を検出器のそれぞれの部分に１ラインずつ向けるように構成されてもよい。種々の実施形態において、上記他の走査装置は、例えば、光を一次元状（例えば、ライン状）に配向する一次元走査装置であってもよい。

種々の実施形態において、光学顕微鏡２００は、スキャナまたはダブルスキャナ‐ライン走査型顕微鏡、例えば、スキャナまたはダブルスキャナ‐ライン走査型共焦点顕微鏡であってもよい。種々の実施形態において、変調装置２０３を照射パターンの光強度分布を変調するように構成することで、光学顕微鏡２００をスキャナまたはダブルスキャナ‐ライン走査型焦点変調顕微鏡（ＦＭＭ）としてもよい。

種々の実施形態において、検出装置２０４は、それぞれの戻り光を検出器のそれぞれの部分に集束させる検出器レンズをさらに備えてもよい。

種々の実施形態において、光学顕微鏡２００は、走査装置２０２と検出装置２０４との間に配置された、少なくとも、照射パターンにより照射されないサンプルの部分から発生する光を遮るための検出開口をさらに備えてもよい。これは、それぞれの戻り光に存在するサンプルからの焦点がずれた光を、検出装置２０４に到達する前に遮光または除去するということを意味してもよい。種々の実施形態において、この検出開口は、スリットであっても、スリットを含んでもよい。

種々の実施形態において、光学顕微鏡２００は、それぞれの戻り光をフィルタリングするためのフィルタ（例えば、エミッションフィルタ）をさらに備えてもよい。このフィルタは、サンプルから反射された任意の入射光を除去してもよい。

種々の実施形態において、光学顕微鏡２００は、照射パターンを、サンプルの区画に対応するサンプル上の焦点面上に向ける又は集束させるための集束光学系（または集束アセンブリ）をさらに備えてもよい。これは、この集束光学系は照射パターンをサンプルの選択された焦点面に集束させるということを意味してもよい。集束光学系は、集束レンズ、コリメートレンズ、または対物レンズのうちの少なくとも１つを含んでもよい。

種々の実施形態において、光学顕微鏡２００は、光を受光し、その光を入射光点の配列（例えば、点配列）に整形して照射パターンを形成する整形光学系をさらに含んでもよい。種々の実施形態において、この入射光点の配列は、一列の配列でもよい。種々の実施形態において、上記整形光学系は、マイクロレンズアレイまたは複数の回折デバイスを含んでもよい。種々の実施形態において、入射光点の配列を用いることにより、検出開口は、入射光点の配列に対応する複数の開口部を有してもよい。

種々の実施形態において、光学顕微鏡２００は、光を受光し、その光をライン状（またはライン形）に整形して照射パターンを形成する整形光学系をさらに含んでもよい。種々の実施形態において、この整形光学系は、ライン形成レンズ、例えばシリンドリカルレンズ、を含んでもよい。

種々の実施形態において、光学顕微鏡２００は、上記整形光学系と走査装置２０２との間に配置された入射開口をさらに備えてもよい。この入射開口はスリットであっても、スリットを含んでもよい。

種々の実施形態において、光学顕微鏡２００は、上記入射開口と走査装置２０２との間に配置された、照射パターンをコリメートされた（平行な）形状にするためのレンズをさらに備えてもよい。

種々の実施形態において、光学顕微鏡２００は、走査装置２０２と検出装置２０４との間に配置された、それぞれの戻り光を検出装置２０４の方へ向けるための導光器をさらに備えてもよい。この導光器は、ビームスプリッタまたはダイクロイックミラーでもよい。

種々の実施形態の文脈において、ビームスプリッタとは、光束を２つに、つまり、反射光と透過光とに分割する光学装置を意味してもよい。ビームスプリッタは、反射光に対する透過光の任意の分割比を有し、例えば、約３０：７０から約７０：３０までの間、例えば、約３０：７０、約４０：６０、約５０：５０、約６０：４０、または約７０：３０、の反射光：透過光比を有してもよい。

種々の実施形態の文脈において、ダイクロイックミラーは、小さい範囲の色（つまり、波長）の光を選択的に透過し、その他の色を反射してもよい。

種々の実施形態において、変調装置２０３は、時間的位相変調器、および当該時間的位相変調器に光学的に結合された空間的位相変調器を備えてもよい。時間的位相変調器は、光を受光し、その光を２つの直交偏光成分に分解した後、２つの直交偏光成分（例えば、Ε_ＸおよびΕ_Ｙ）間に位相差を導入する。空間的位相変調器は、２つの直交偏光成分を空間的に分離した後、２つの直交偏光成分を１つの偏光状態または方向に変換する。これは、空間的位相変調器が受光した２つの直交偏光成分は、それらの間に位相差を有するということを意味してもよい。

種々の実施形態において、上記位相差を、例えば時間の関数として、２つの直交偏光成分の間に定期的に導入してもよい。種々の実施形態において、時間的位相変調器は、２つの直交偏光成分のうちの１つの上に可変位相シフト（例えば、０からπ）を導入するように構成されてもよい。種々の実施形態において、上記可変位相シフトは、２つの直交偏光成分のうちの１つのみに導入されてもよい。

種々の実施形態において、上記空間的位相変調器は、２つの直交偏光成分を１つの偏光状態に変換してもよい。

種々の実施形態の文脈において、上記時間的位相変調器は、光を２つの直交偏光成分に分解するように構成された２分の１波長板と、２つの直交偏光成分の間に位相差を導入するように構成された電気光学変調器とを備えてもよい。

種々の実施形態の文脈において、２分の１波長板は、直線偏光光の偏光状態または方向を変更またはシフトさせる光学装置である。

種々の実施形態の文脈において、電気光学変調器（ＥＯＭ）は、光線を変調するために電気光学効果を発揮する信号制御素子を使用する光学装置であって、この素子は、電気光学効果による電界に応じてその光学的性質が変化するものである。

種々の実施形態の文脈において、上記空間的位相変調器は、２つの直交偏光成分を空間的に分離するように構成された空間偏光子と、２つの直交偏光成分を１つの偏光状態に変換するように構成された偏光分析器とを備えてもよい。

種々の実施形態において、上記空間偏光子は、２つの直交偏光成分のうちの一方を選択的に遮断するための第１の領域または帯域と、２つの直交偏光成分のうちの他方を選択的に遮断するための第２の領域または帯域とを備えてもよい。種々の実施形態において、第１の領域および第２の領域は、横並びに隣接して配置してもよい。種々の実施形態において、第１の領域は、第２の領域の周囲に配置されてもよい。種々の実施形態において、上記空間偏光子は、二分割され、空間偏光子のそれぞれ半分を第１の領域および第２の領域と定義してもよい。

種々の実施形態において、検出装置２０４は、照射パターンにより照射されたサンプルのそれぞれの区画に対応した、サンプルの光学的区分画像を生成するように構成されたプロセッサを含んでもよく、このプロセッサは、それぞれの光学的区分画像を生成するために、検出器により生成された画像（または生画像）を復調するように構成されてもよい。種々の実施形態において、上記プロセッサは、それぞれの戻り光の各々からのＡＣ成分（例えば、変調成分）の振幅を検索するように構成されてもよい。種々の実施形態において、上記プロセッサは、検出器により取り込まれた生画像を復調することによりサンプルの光学的区分画像を生成するための画像処理アルゴリズムを備えてもよい。

種々の実施形態において、光学顕微鏡２００は、照射パターンのための光を供給するように構成された光源アセンブリをさらに備えてもよい。種々の実施形態において、この光源からの光は、例えば調整されることなく、照射パターンとして直接供給されてもよい。

種々の実施形態において、上記光源は、照射パターンを線状または線形に供給するように構成されてもよい。上記光源は、照射パターンを線状に供給するスリット状光源であってもよい。

種々の実施形態の文脈において、上記光源は、１つ以上のレーザを備えてもよい。したがって、種々の実施形態において、光学顕微鏡２００は、光学的区分け機能を有するレーザ走査顕微鏡であってもよい。

種々の実施形態の文脈において、入射光として用いられる光は、約４００ｎｍから約７００ｎｍの範囲の波長、例えば、約４００ｎｍから約５００ｎｍの波長、約４８０ｎｍから約７００ｎｍの波長、または約４８０ｎｍから約５５０ｎｍの波長、を有してもよい。

種々の実施形態において、検出装置２０４は、サンプルのそれぞれの区画における１つの画素を、検出器のそれぞれの部分における複数の画素に光学的に結合させるよう構成されてもよい。種々の実施形態において、検出装置２０４は、サンプルの視野における各画素からの戻り光を、検出器における多くの画素に順次結合させるよう構成されてもよく、照射パターンにおける入射光強度は、数サイクル毎に変化させてもよい。

種々の実施形態において、照射パターンにより覆われる画素の数は、少なくとも実質的に、撮像すべきサンプルの視野における画素の合計数の平方根に対応（または近似）してもよい。

種々の実施形態の文脈において、走査装置２０２と上記他の走査装置のうちの少なくとも１つは共振型スキャナであってもよい。

種々の実施形態の文脈において、走査装置２０２と上記他の走査装置のうちの少なくとも１つは共振型ガルバノメータであってもよい。この共振型ガルバノメータは、光を反射するミラーまたは他の反射器を備えてもよい。

種々の実施形態の文脈において、走査装置２０２と上記他の走査装置のうちの少なくとも１つは音響光学変調器（ＡＯＤ）であってもよい。しかしながら、広いスペクトルを有する蛍光の走査にＡＯＤを用いることには課題があるかもしれない。

種々の実施形態の文脈において、走査装置２０２と上記他の走査装置のうちの少なくとも１つは、走査を実行するために、サンプルの区画を順次１つずつ覆うように照射パターンをシフトさせるために、数Ｈｚ程度から数千Ｈｚ程度の範囲の動作周波数を有してもよい。限定されない例として、この動作周波数は、約１Ｈｚから約１０ｋＨｚの間、例えば、約１Ｈｚから約５ｋＨｚの間、約１Ｈｚから約１ｋＨｚの間、約１ｋＨｚから約１０ｋＨｚの間、約５ｋＨｚから約１０ｋＨｚの間、又は約２ｋＨｚから約５ｋＨｚの間、であってもよい。

図２Ｂは、種々の実施形態に係る、光学顕微鏡制御方法のフローチャート２２０を示す。

２２２において、照射パターンを撮像すべきサンプルに向ける。

２２４において、サンプルの区画を順次１つずつ覆うように照射パターンをシフトさせる。ここで、サンプルの各区画に対して、当該区画を照射するために照射パターンを向けて、照射パターンにより照射されたサンプルの当該区画からの戻り光を受光する。

２２６において、サンプルの上記区画に対応する、サンプル上の焦点面内における照射パターンの光強度分布を、時間の関数（例えば、時間の周期的関数）として変調する。

２２８において、それぞれの戻り光を、検出器のそれぞれの部分に順次光学的に結合して、検出器上にサンプルの画像を生成する。ここで、検出器の各部分はサンプルの各区画に対応する。

種々の実施形態において、照射パターンは、スポット、画素、またはラインのうちの少なくとも１つを１つ以上含んでもよい。限定されない例として、種々の実施形態では、２２２において、サンプルの連続するラインを１つずつ撮像してもよい。

種々の実施形態において、それぞれの戻り光を検出するために検出器を備えてもよい。この検出器は、それぞれの戻り光を検出するために移動されてもよい。種々の実施形態において、検出器は、サンプルの二次元画像を生成するために、そのそれぞれの部分でそれぞれの戻り光を受光可能なカメラであってもよい。

種々の実施形態では、２２２において、照射パターンは走査装置を用いてシフトされてもよく、走査装置の動作は上記検出器に同期してもよい。この走査装置は、区画を照射するために区画へ照射パターンを向け、照射パターンにより照射されたサンプルの区画からの戻り光を受光するために用いられてもよい。走査装置は移動可能であってもよい。

種々の実施形態において、それぞれの戻り光は上記検出器のそれぞれの部分に向けられて、サンプルの画像を生成してもよい。例えば、それぞれの戻り光を検出器のそれぞれの部分に向けてサンプルの画像を生成するために、他の走査装置を用いてもよい。この他の走査装置は、移動可能であってもよい。

種々の実施形態において、上記方法は、少なくとも、照射パターンにより照射されないサンプルの部分からの光を遮光することをさらに含んでもよい。

種々の実施形態において、例えば、サンプルから反射された任意の入射光を除去するために、それぞれの戻り光をフィルタリングしてもよい。

種々の実施形態において、照射パターンは、サンプルの区画を照射するために、区画に向けられて集束されてもよい。これは、例えば、集束レンズ、コリメートレンズ、または対物レンズのうちの少なくとも１つを含む集束光学系を用いることで達成してもよい。

種々の実施形態において、光を受光し入射光点の配列に整形して、照射パターンを形成してもよい。これは、例えば、マイクロレンズアレイまたは回折デバイスを含む整形光学系を用いることにより実現してもよい。

種々の実施形態において、光を受光しライン状に整形して、照射パターンを形成してもよい。これは、例えば、シリンドリカルレンズ等のライン形成レンズを含む整形光学系を用いることにより実現してもよい。

種々の実施形態において、導光器を用いて、それぞれの戻り光を検出装置に向けてもよい。この導光器は、ビームスプリッタまたはダイクロイックミラーでもよい。

種々の実施形態において、照射パターンの光強度分布を変調するために、光を受光し、この光を２つの直交偏光成分に分解した後、２つの直交偏光成分の間に位相差を導入してもよい。そして、２つの直交偏光成分を空間的に分離した後、２つの直交偏光成分を１つの偏光状態に変換してもよい。空間的に分離される２つの直交偏光成分は、それらの間に位相差を有してもよい。

種々の実施形態において、光を２つの直交偏光成分に分解し、その後２つの直交偏光成分の間に位相差を導入するに際し、２つの直交偏光成分への光の分解には２分の１波長板を用い、２つの直交偏光成分間への位相差の導入には電気光学変調器を用いてもよい。

種々の実施形態において、２つの直交偏光成分を空間的に分離し、その後２つの直交偏光成分を１つの偏光状態に変換するに際し、２つの直交偏光成分の空間的分離には空間偏光子を用い、２つの直交偏光成分の１つの偏光状態への変換には偏光分析器を用いてもよい。

種々の実施形態において、２つの直交偏光成分を空間的に分離するに際し、２つの直交偏光成分のうちの一方を空間偏光子の第１の領域にて選択的に遮断し、２つの直交偏光成分のうちの他方を空間偏光子の第２の領域にて選択的に遮断してもよい。

種々の実施形態において、検出器により生成された画像（例えば、生画像）を復調して、照射パターンにより照射されたサンプルのそれぞれの区画に対応する、サンプルの光学的区分画像を生成してもよい。種々の実施形態において、上記画像を復調するために、上記方法は、それぞれの戻り光の各々からのＡＣ成分（例えば、変調成分）の振幅を検索することを含んでもよい。

種々の実施形態において、上記方法は、照射パターンのための光を供給することをさらに含んでもよい。種々の実施形態において、この光を供給するために、１つ以上のレーザを備えてもよい。

種々の実施形態において、２２８において、サンプルのそれぞれの区画における１つの画素を、検出器のそれぞれの部分における複数の画素と光学的に結合させてもよい。

種々の実施形態において、照射パターンにより覆われる画素の数は、少なくとも実質的に、撮像すべきサンプルの視野における画素の合計数の平方根に一致（または近似）してもよい。

上述の方法は、一連のステップまたは事象として例示し説明したが、このようなステップまたは事象のいかなる順序も限定的ではないことを理解されたい。例えば、いくつかのステップは異なる順序で、および／または、例示されたものとは別の他のステップまたは事象、および／または、本明細書に記載された他のステップまたは事象と同時に行われてもよい。また、例示されたすべてのステップが、本明細書に記載された１つ以上の局面または実施形態を実施するために必要というわけではない。また、本明細書に記載された１つ以上のステップを、１つ以上の別々の行為および／または段階において行ってもよい。

種々の実施形態は、改善された撮像速度（毎秒１０００フレーム以上）、優れた画質、および格別な感度を兼ね備えた光学顕微鏡を提供してもよい。

図３は、種々の実施形態に係る光学顕微鏡３００の概略図を示し、二次元（２Ｄ）イメージセンサを有するダブルスキャナ‐ライン走査型共焦点顕微鏡を示す。光学顕微鏡３００は、超高速ライン走査型顕微鏡であってもよい。

光学顕微鏡３００は、サンプル３２０を撮像するために、例えばレーザ３０２である光源または光源アセンブリを備えてもよく、レーザ３０２は、励起ビームとして作用する光信号または光（例えば、波長λ＝４８８ｎｍ）３０３を出射する。光３０３は、シリンドリカルレンズ（ＣＬ）３０４を通過し、シリンドリカルレンズ３０４は、光３０３を一次元に集光し、光３０３を１つのラインに集束して、照射パターン３５０である入射光を形成する。照射パターン３５０は、スリット３０６である開口を通過する。言い換えれば、シリンドリカルレンズ（ＣＬ）３０４を透過した後、光３０３は、ライン形状を有する照射パターン３５０に形成され、これによりサンプル３２０を撮像するための照射ラインパターンを提供する。入射光３５０として提供された照射ラインパターン３５０は、破線矢印３６０で示すように、照射光路内に又は沿って設けられた、一連のレンズを含む光学系を介して、サンプル３２０へと送られる。

レンズ（Ｌ１）３０８は、スリット３０６から出射される照射パターン３５０を受光するためにスリット３０６の後に配置され、レンズ（Ｌ１）３０８は照射パターン３５０をコリメートする。そして、照射パターン３５０はビームスプリッタ（ＢＳ）３１０を通過し、ビームスプリッタ３１０は、照射パターン３５０のうち一定量の光を照射光路３６０に沿って透過させる。限定されない例として、ビームスプリッタ（ＢＳ）３１０は、ビームスプリッタ（ＢＳ）３１０により反射される光とビームスプリッタ（ＢＳ）３１０を透過する光との比率として、５０：５０の比率を有してもよい。

照明スキャナとして作用する走査装置または一次元スキャナ（Ｓ１）３１２は、照射パターン３５０をサンプル３２０に向けるために、照射光路３６０に沿ってビームスプリッタ（ＢＳ）３１０の後に設けられてもよい。レンズ（Ｌ２）３１４およびレンズ（Ｌ３）３１６である一組のレンズは、走査装置（Ｓ１）３１２により向けられた照射パターン３５０を受光するために設けられてもよい。レンズ（Ｌ２）３１４は照射パターン３５０を集束し、その後レンズ（Ｌ３）３１６は照射パターン３５０をコリメートしてもよい。そして、照射パターン３５０は、照射パターン３５０をサンプル３２０上に集束するための対物レンズ３１８によって受光されてもよい。レンズ（Ｌ２）３１４、レンズ（Ｌ３）３１６、または対物レンズ３１８のうち少なくとも１つは、集束光学系または集束アセンブリの一部を形成してもよい。この集束光学系は、サンプルの一区画に対応する一焦点面上に照射パターン３５０を向けて、集束してもよい。

サンプル３２０から発生する戻り光は、照射パターン３５０と、少なくとも実質的に同じ光路をたどる。この戻り光は、対物レンズ３１８、レンズ（Ｌ３）３１６、レンズ（Ｌ２）３１４を通過し、走査装置（Ｓ１）３１２に受光されてもよい。言い換えれば、サンプル３２０からの発光を含んだ戻り光は、同じ照明スキャナ（Ｓ１）３１２によりデスキャンされてもよい。したがって、破線矢印３６２で示すように、走査装置（Ｓ１）３１２、レンズ（Ｌ２）３１４、レンズ（Ｌ３）３１６、および対物レンズ３１８は、１つの検出光路内に又は沿って配置されてもよい。

種々の実施形態において、走査装置（Ｓ１）３１２は、サンプル３２０の走査を実行するために、サンプルの複数の区画を順次１つずつ覆うように照射パターン３５０をシフトさせるために使用されてもよい。例えば、走査装置（Ｓ１）３１２は、矢印３７０で示すような走査動作をするように移動されてもよい。走査装置（Ｓ１）３１２は、サンプル３２０の１つの区画に向けて又は区画上に照射パターン３５０を導く使用されてもよく、サンプル３２０の当該区画を照射するように区画上に照射ラインパターンを与えて、その後サンプル３２０の当該区画から発生する戻り光を受光してもよい。次に、走査装置（Ｓ１）３１２は、照射パターン３５０をサンプル３２０の別の区画に向けて又は区画上に向け、当該別の区画を照射するように区画上に照射ラインパターンを与えて、その後当該別の区画から発生する戻り光を受光してもよい。この走査ステップは、走査装置（Ｓ１）３１２が、サンプル３２０を撮像するために、照射パターン３５０をサンプル３２０の連続する又は個々の区画に向けて又は区画上に導いて、その後サンプル３２０のそれぞれの区画から発生する戻り光を受光するように、繰り返してもよい。

限定されない例として、走査装置（Ｓ１）３１２は、両方向矢印３８０で示すように、照射パターン３５０を直交方向にシフトするために用いられてもよい。例えば、走査装置（Ｓ１）３１２は、実線３５０ａで示すように、サンプル３２０の第１区画３２０ａを照射するように第１区画３２０ａに向けて又は第１区画３２０ａ上に照射パターンを導き、その後、サンプル３２０の第１区画３２０ａから発生した戻り光３５２ａを受光してもよい。照射パターン３５０ａおよび戻り光３５２ａは、少なくとも実質的に同じ光路をたどる。

そして、走査装置（Ｓ１）３１２は、照射パターンを、サンプル３２０の第２区画３２０ｂを照射するために、破線３５０ｂで示すように、サンプル３２０の第２区画３２０ｂに向けて又は第２区画３２０ｂ上に導き、その後サンプル３２０の第２区画３２０ｂから発生する戻り光３５２ｂを受光するように、移動または傾斜されてもよい。照射パターン３５０ｂおよび戻り光３５２ｂは、少なくとも実質的に同じ光路をたどる。

各戻り光３５２ａ、３５２ｂは、走査装置（Ｓ１）３１２により、検出光路３６２内に又は沿って配置されるビームスプリッタ（ＢＳ）３１０に向けられてもよい。ビームスプリッタ（ＢＳ）３１０は、各戻り光３５２ａ、３５２ｂの一定量を、検出光路３６２に沿って、例えば二次元（２Ｄ）イメージセンサ３３２である検出器へ向けて透過させてもよい。イメージセンサ３３２は、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラまたは相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）カメラでもよい。

任意の発光フィルタ（Ｆ１）３２２を、検出光路３６２内に又は沿って配置し、励起光、例えば、サンプル３２０により反射され、走査装置（Ｓ１）３１２およびビームスプリッタ（ＢＳ）３１０によりイメージセンサ３３２へ向けられた照射パターン３５０の一部を抑制してもよい。レンズ（Ｌ４）３２４を設けて、各戻り光３５２ａ、３５２ｂを集束させ、スリット３２６である検出開口を通過させるようにしてもよい。スリット３２６は、サンプル３２０から発生した各戻り光３５２ａ、３５２ｂの一部として存在する焦点からずれた光を遮光してもよい。焦点からずれた光は、照射パターン３５０により照射されないサンプルの部分から発生してもよい。

検出スキャナとして作用する他の走査装置または一次元スキャナ（Ｓ２）３２８を設けて、各戻り光３５２ａ、３５２ｂを受光し、各戻り光３５２ａ、３５２ｂの、イメージセンサ３３２の連続する又は各々の部分への走査を実行してサンプル３２０の画像を生成してもよい。例えば、走査装置（Ｓ２）３２８は、矢印３７２で示す走査動作内で移動してもよい。レンズ（例えば、検出器レンズ）またはレンズシステム（Ｌ５）３３０を設けて、サンプル３２０から発生した放出光子を含む各戻り光３５２ａ、３５２ｂをイメージセンサ３３２上に集束してもよい。３３４で示すラインは、放出光子の線形分布を示し、両方向矢印３８２で示すように、検出スキャナ（Ｓ２）３２８により直交方向に移動される。追加的に又は代替案として、イメージセンサ３３２を移動させてもよい。走査装置（Ｓ２）３２８およびイメージセンサ３３２は、検出装置の一部を構成してもよい。

限定されない例として、走査装置（Ｓ２）３２８は、サンプル３２０の第１区画３２０ａからの戻り光３５２ａを、例えばライン３３４に対応するイメージセンサ３３２の第１の部分に向けてもよい。続いて、走査装置（Ｓ１）３１２がサンプル３２０の第２区画３２０ｂを照射して第２区画３２０ｂからの戻り光を受光した時、走査装置（Ｓ２）３２８は、受光した戻り光３５２ｂを方向３８２に沿ってサンプル３２０の第２区画３２０ｂに対応するイメージセンサ３３２の第２の部分に向けるように、移動してもよい。その結果、サンプル３２０のそれぞれの区画からのそれぞれの戻り光を、これら区画に対応するイメージセンサのそれぞれの部分に向けて、サンプル３２０の画像を生成してもよい。

なお、レンズＬ１ ３０８、Ｌ２ ３１４、Ｌ３ ３１６、Ｌ４ ３２４、およびＬ５ ３３０のいずれか又は各々は、球面レンズまたは色消しレンズであってもよい。レンズＬ１ ３０８、Ｌ２ ３１４、Ｌ３ ３１６、Ｌ４ ３２４、およびＬ５ ３３０のいずれか又は各々の焦点距離は、数センチメートル、例えば、約１ｃｍから約１０ｃｍの間、例えば、約１ｃｍから約５ｃｍの間、約５ｃｍから約１０ｃｍの間、または約３ｃｍから約６ｃｍの間、でよい。

種々の実施形態において、走査装置（Ｓ１）３１２および走査装置（Ｓ２）３２８のいずれか又は各々は、共振スキャナ、例えば、走査作用を有する光を反射するためのミラーまたは反射器を有する共振型ガルバノメータ、であってもよい。種々の実施形態において、走査装置（Ｓ１）３１２および走査装置（Ｓ２）３２８のいずれか又は各々による走査は、数Ｈｚ程度から数千Ｈｚ程度の範囲の周波数、例えば、約１Ｈｚから約１０ｋＨｚの間の周波数、で実行されてもよい。

種々の実施形態において、走査装置（Ｓ１）３１２、（Ｓ２）３２８は、イメージセンサ３３２のトリガー信号（例えば、フレームトリガー）に同期してもよい。種々の実施形態において、二次元画像の１フレームを、走査装置（Ｓ１）３１２および走査装置（Ｓ２）３２８の１／２走査期間（往復走査の場合）または１走査期間（片道走査の場合）において直接生成してもよい。種々の実施形態において、走査装置（Ｓ１）３１２を例に挙げると、走査装置（Ｓ１）３１２を前後に移動または回動させて、照射パターンまたは励起ビームをサンプル３２０横切るように走査させてもよい。片道走査においては、照射パターンまたは励起ビームが例えば左から右にシフトされた時、サンプル３２０からの信号または戻り光を集光してもよい。ただし、フライバック（右から左）中は集光しない。往復走査においては、信号または戻り光を両方向に沿って又は内で集光してもよい。

種々の実施形態において、イメージセンサ３３２は、毎秒５，０００フレーム（１０２４×１０２４画素）を超える速度をサポートしてもよく、これは、走査装置（Ｓ１）３１２または走査装置（Ｓ２）３２８のうち少なくとも１つの速度に、少なくとも実質的に一致する。さらに、２Ｄイメージセンサ３３２は、その性能が自身の雑音レベルによる影響を受ける従来の１Ｄ同等物とは対照的に、超低雑音センサであってもよい。

なお、種々の実施形態において、ビームスプリッタ（ＢＳ）３１０は、蛍光撮像のためのダイクロイックミラー（ＤＭ）で置き換えてもよい。

図３に示す光学顕微鏡３００の上記文脈における構成は、改善されたバックグラウンド除去のための焦点変調と容易に組み合わせることができ、その一例を図４に示す。

図４は、種々の実施形態に係る光学顕微鏡（例えば、焦点変調光学顕微鏡）４００の概略図を示し、ダブルスキャナ‐ライン走査型焦点変調顕微鏡（ＦＭＭ）を示す。焦点変調光学顕微鏡４００は、図３に示す光学顕微鏡３００と同一または同等の素子または構成要素を備えてもよい。したがって、同一の参照番号が付された素子については、図３に示す光学顕微鏡３００の説明で述べられたものとし、その説明を省略する。

光学顕微鏡４００において、空間的‐時間的位相変調器（または、変調装置）４０２を、励起光路（照射光路）３６０内に又は沿って設けてもよく、これにより励起光がサンプル３２０内または上における焦線付近で強度変調される。種々の実施形態において、空間的‐時間的位相変調器４０２は、サンプルの区画に対応する、サンプルの焦点面内における照射パターン３５０の光強度分布を、時間の周期的関数として変調してもよい。空間的‐時間的位相変調器４０２は、２分の１波長板（ＨＷＰ）４１２および電気光学変調器（ＥＯＭ）４１４を含む時間的位相変調器４０４を備えてもよい。電気光学変調器（ＥＯＭ）４１４は、ＥＯＭドライバ４１６により駆動されてもよい。空間的‐時間的位相変調器４０２は、空間的変調器（ＳＰ）４１８および偏光分析器（ＰＡ）４２０を含む空間的位相変調器４０６をさらに備えてもよい。空間的変調器（ＳＰ）４１８および偏光分析器（ＰＡ）４２０は隣接して配置されてもよい。空間的‐時間的位相変調器４０２では、２つの直交偏光ビームが時間的位相変調器４０４によって別々に変調されてもよい。これら２つのビームは、空間的位相変調器４０６の開口形成光学系（例えば、空間的変調器（ＳＰ）４１８および偏光分析器（ＰＡ）４２０を含む又はこれらから成る光学系）に入射する前に空間的に重ねられてもよく、その後、励起ビームが所望の特性で時空間的に変調されてもよい。

空間的‐時間的位相変調器４０２の原理または動作の限定されない一例を、図５を参照して説明する。図５は、上述したような単一電気光学変調器（ＥＯＭ）および偏光光学素子を含む、電気光学変調器（ＥＯＭ）に基づく空間的‐時間的位相変調器を示す。明瞭さのために、図５には、シリンドリカルレンズ（ＣＬ）３０４、スリット３０６、およびレンズ（Ｌ１）３０８は示していない。

レーザ３０２からのレーザ出力または光３０３は、直線偏光にされてもよい。２分の１波長板（ＨＷＰ）４１２は、光３０３の電界（Ｅフィールド）の偏光を回転させ、Ｙ軸に対して略４５°の角度を形成するために用いられてもよい。例えば、図５に示すように、光３０３のＥフィールド５００は、２分の１波長板（ＨＷＰ）４１２を通過した後、Ｙ軸５１０およびＸ軸５１２に対して少なくとも実質的に４５°に配向されてもよい。その結果、Ｅフィールド５００は、同じ電力を有する２つの直交偏光成分、Ε_Ｙ５０２およびΕ_Ｘ５０４、に分解されてもよい。

ＥＯＭ４１４は、偏光依存型装置であってもよい。ＥＯＭ４１４は、Ε_Ｘ５０４に対しては実質的に位相シフトを与えず、Ε_Ｙ５０２に対して可変位相シフトを与えてもよい。ＥＯＭドライバ４１６によりＥＯＭ４１４に対して変調信号を供給し、Ε_Ｘ５０４とΕ_Ｙ５０２の間に周期的位相遅延（例えば、０からτの間）を導入してもよい。その結果、Ε_Ｙ５０２としての、変調されたＥフィールドまたはビーム、およびΕ_Ｘ５０４としての、変調されていないＥフィールドまたはビームを提供してもよい。

その後、空間偏光子４１８は、上記変調されたビームおよび変調されていないビームを空間的に分離するように、Ε_Ｘ５０４またはΕ_Ｙ５０２を選択的に遮断してもよい。例えば、Ε_Ｘ５０４またはΕ_Ｙ５０２のどちらかをそれぞれ選択的に遮断するために、空間偏光子４１８の異なる領域または帯域（ゾーン）を指定または限定してもよい。

空間偏光子４１８の限定されない一例は、図６に示すように、２ゾーン空間偏光子であってもよい。空間偏光子４１８は、２つの帯域または領域、すなわち第１領域（左領域）６００および第２領域（右領域）６１０に分割されてもよい。

第１領域６００を示すライン６０２および第２領域６１０を示すライン６１２は、通過可能な偏光光成分のそれぞれの偏光方向を表す。空間偏光子４１８は、それぞれの偏光方向が互いに直交するよう配向された２つの偏光光成分を、第１の偏光光成分が第１領域６００を通過することを選択的に許可し、他の偏光光成分が第２領域６１０を通過することを選択的に許可することによって、空間的に分離してもよい。例えば、空間偏光子４１８は、ライン６０２をＸ軸５１２（図５）と一致させて、水平に偏光された光、Ε_Ｘ５０４、を通過させる一方、ライン６１２をＹ軸５１０（図５）と一致させて、垂直に偏光された光、Ε_Ｙ５０２、を通過させるように配置されてもよい。第１領域６００と第２領域６１０とを分離するラインまたは境界線６２０を、照射スリット３０６と平行に又は一列に配置してもよい。

図５を参照して、偏光分析器（ＰＡ）４２０は、その偏光方向がＸ軸５１２に対して４５度（４５°）である線形偏光器であってもよい。偏光分析器（ＰＡ）４２０は、Ε_Ｘ５０４およびΕ_Ｙ５０２がサンプル３２０上の対物レンズ（例えば、図４の３１８）の焦点に導かれた時に互いに干渉するように、Ε_Ｘ５０４およびΕ_Ｙ５０２を同じ偏光状態または方向に変換するために用いられてもよい。その結果、焦線の強度が定期的に変調されてもよい。

焦点変調により、イメージセンサ（例えば、図４の３３２）からの未処理の２Ｄ画像が、走査方向（例えば、図４の３８２）に沿って空間的に変調されてもよい。未処理の２Ｄ画像は、例えばプロセッサによって復調されてもよく、これにより、照射パターン３５０により照射されたサンプルのそれぞれの区画に対応する、サンプルの光学的区分画像（例えば、ＦＭＭ画像）を生成してもよい。例えば、未処理の２Ｄ画像は、焦線に沿って２つの画像に分離されてもよく、これら二つの画像は、それぞれ、最大励起パワー（例えば、Ε_Ｘ５０４とΕ_Ｙ５０２とが少なくとも実質的に建設的に干渉する時）および最小励起パワー（例えば、Ε_Ｘ５０４とΕ_Ｙ５０２とが少なくとも実質的に破壊的に干渉する時）に対応する。例えば散乱やクロストークによるバックグラウンドの大部分は、これら２つの画像間の差分画像から除去される。

種々の実施形態において、上記ＦＭＭ画像は、検出された信号（例えば、戻り光）におけるＡＣ成分の振幅を検索することにより形成されてもよい。これは、ＦＭＭ画像が、ＡＣ成分である変調された戻り光の振幅（または強度）を検索することにより形成されることを意味してもよい。ＦＭＭラインを生成するために、照射パターンによる励起ラインをサンプルの区画内に形成してもよい。サンプルの区画に対応する照射ライン領域からの出射光または戻り光の少なくとも２つのラインを、一方は焦点強度が最大に達したときに、他方は焦点強度が最小に達したときに、集光してもよい。これら２つのライン間の差がＦＭＭラインとなる。複数のＦＭＭラインを、励起ラインが焦点面において走査されるときに連続して又は順次取得し、これらＦＭＭラインを結合させてＦＭＭ画像を形成してもよい。

なお、光学顕微鏡３００（図３）および４００（図４）を、ラインを用いた照射パターンを用いて説明したが、他の照射パターン、例えば、点の配列（例えば、入射光点の配列）を照射ラインの代わりに用いてもよい。点の配列は、マイクロレンズアレイまたは回折素子を用いて生成してもよい。限定されない例として、シリンドリカルレンズ３０４（図３および４）をマイクロレンズアレイと置き換えてもよい。照射パターンとして点の配列を用いる実施形態では、検出スリット３２６（図３および図４）を、点配列の照射パターンと少なくとも実質的に一致する開口と置き換えてもよい。例えば、スリット３２６を、点配列に対応する複数の開口部を有する開口と置き換えてもよい。

本発明について、主に特定の実施形態を参照しながら記載および説明してきたが、本技術分野の当業者であれば、下記の請求項によって規定される本発明の本質および技術分野から逸脱することなく、設計および詳細について多数の変更が実施可能であることが理解できるであろう。したがって、本発明の範囲は添付の請求項によって決定され、文言上の意味の範囲内、または請求項に等価な事項の範囲内における変更は、すべてが包含されることを意図するものである。

Claims (46)

1. 撮像すべきサンプル上に照射パターンを向けるための走査装置であって、前記サンプルの複数の区画を順次１つずつ覆うように前記照射パターンをシフトさせるために移動可能であり、前記サンプルの各区画に対して、当該区画を照射するために前記照射パターンを向け、前記照射パターンにより照射された前記サンプルの前記区画からの戻り光を受光する走査装置と、
   前記サンプルの前記区画に対応する、前記サンプル上の焦点面内で、前記照射パターンの光強度分布を、時間の関数として変調する変調装置と、
   各区画からの前記戻り光を検出器に光学的に結合させる検出装置であって、前記それぞれの戻り光を、前記検出器の個々の部分に順次光学的に結合させて、前記検出器上に前記サンプルの画像を形成し、前記検出器の各部分は前記サンプルの各区画に対応する、検出装置とを備える、光学顕微鏡。
2. 前記照射パターンは、スポット、画素、またはラインのうちの少なくとも１つを１つ以上含む、請求項１に記載の光学顕微鏡。
3. 前記検出装置は前記検出器を備える、請求項１または２に記載の光学顕微鏡。
4. 前記検出器は移動可能である、請求項３に記載の光学顕微鏡。
5. 前記走査装置の動作を前記検出器に同期させる、請求項３または４に記載の光学顕微鏡。
6. 前記検出器は、その個々の部分で前記それぞれの戻り光を受光して前記サンプルの二次元画像を生成するカメラを備える、請求項３〜５のいずれか一項に記載の光学顕微鏡。
7. 前記検出装置は、前記それぞれの戻り光を受光するための他の走査装置を備え、当該他の走査装置は、前記それぞれの戻り光を前記検出器の前記それぞれの部分に向けて、前記サンプルの前記画像を生成するために、移動可能である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の光学顕微鏡。
8. 前記走査装置と前記検出装置との間に配置され、少なくとも、前記照射パターンにより照射されない前記サンプルの部分から発生する光を遮光するための検出開口をさらに備える、請求項１〜７のいずれか一項に記載の光学顕微鏡。
9. 前記それぞれの戻り光をフィルタリングするためのフィルタをさらに備える、請求項１〜８のいずれか一項に記載の光学顕微鏡。
10. 前記照射パターンを、前記サンプルの前記区画に対応する前記サンプル上の前記焦点面上に向けて、かつ集束させるための集束光学系をさらに備える、請求項１〜９のいずれか一項に記載の光学顕微鏡。
11. 光を受光し、当該光を入射光点の配列に整形して前記照射パターンを形成するための整形光学系をさらに備える、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の光学顕微鏡。
12. 光を受光し、当該光をライン状に整形して前記照射パターンを形成するための整形光学系をさらに備える、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の光学顕微鏡。
13. 前記走査装置と前記検出装置との間に配置され、前記それぞれの戻り光を前記検出装置へと導くための導光器をさらに備える、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の光学顕微鏡。
14. 前記変調装置は、
    光を受光し、当該光を２つの直交偏光成分に分解した後、当該２つの直交偏光成分の間に位相差を導入する時間的位相変調器と、
    前記２つの直交偏光成分を受光するために前記時間的位相変調器に光学的に結合し、前記２つの直交偏光成分を空間的に分離した後、前記２つの直交偏光成分を１つの偏光状態に変換する、空間的位相変調器とを備える、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の光学顕微鏡。
15. 前記時間的位相変調器は、
    前記光を前記２つの直交偏光成分に分解する２分の１波長板と、
    前記２つの直交偏光成分の間に位相差を導入する電気光学変調器とを備える、請求項１４に記載の光学顕微鏡。
16. 前記空間的位相変調器は、
    前記２つの直交偏光成分を空間的に分離する空間偏光子と、
    前記２つの直交偏光成分を前記１つの偏光状態に変換する偏光分析器とを備える、請求項１４または１５に記載の光学顕微鏡。
17. 前記空間偏光子は、
    前記２つの直交偏光成分のうちの一方を選択的に遮断するための第１の領域と、
    前記２つの直交偏光成分のうちの他方を選択的に遮断するための第２の領域とを備える、請求項１６に記載の光学顕微鏡。
18. 前記検出装置は、前記照射パターンにより照射された前記サンプルの前記それぞれの区画に対応した、前記サンプルの個々の光学的区分画像を生成するプロセッサであって、前記それぞれの光学的区分画像を生成するために、前記検出器により生成された前記画像を復調するプロセッサ、を備える、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の光学顕微鏡。
19. 前記画像を復調するために、前記プロセッサは、前記それぞれの戻り光の各々からのＡＣ成分の振幅を検索する、請求項１８に記載の光学顕微鏡。
20. 前記照射パターンのための光を供給する光源アセンブリをさらに備える、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の光学顕微鏡。
21. 前記光源アセンブリは、１つ以上のレーザを備える、請求項２０に記載の光学顕微鏡。
22. 前記検出装置は、前記サンプルの前記それぞれの区画における１つの画素を、前記検出器の前記それぞれの部分における複数画素に光学的に結合させる、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の光学顕微鏡。
23. 前記照射パターンにより覆われる画素の数は、少なくとも実質的に、前記撮像すべきサンプルの視野における画素の合計数の平方根に一致する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の光学顕微鏡。
24. 光学顕微鏡を制御する方法であって、
    照射パターンを撮像すべきサンプルに向け、
    前記サンプルの複数の区画を順次１つずつ覆うように前記照射パターンをシフトさせて、前記サンプルの各区画に対して、当該区画を照射するために前記照射パターンを向け、前記照射パターンにより照射された前記サンプルの前記区画からの戻り光を受光し、
    前記サンプルの前記区画に対応する前記サンプル上の焦点面内で、前記照射パターンの光強度分布を、時間の関数として変調し、
    それぞれの前記戻り光を、検出器の個々の部分に順次光学的に結合させて、前記検出器上に前記サンプルの画像を形成し、前記検出器の各部分は前記サンプルの各区画に対応する、方法。
25. 前記照射パターンは、スポット、画素、またはラインのうちの少なくとも１つを１つ以上含む、請求項２４記載の方法。
26. さらに、前記それぞれの戻り光を検出するための前記検出器を設ける、請求項２４または２５に記載の方法。
27. さらに、前記検出器を移動させる、請求項２６に記載の方法。
28. 前記サンプルの区画を順次１つずつ覆うように前記照射パターンをシフトさせることは、走査装置を用いて前記照射パターンをシフトさせることを含み、
    前記走査装置の動作を前記検出器に同期させることをさらに含む、請求項２６または２７に記載の方法。
29. 前記検出器を設けることは、その個々の部分で前記それぞれの戻り光を受光して前記サンプルの二次元画像を生成可能なカメラを設けることを含む、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
30. さらに、前記それぞれの戻り光を前記検出器の前記それぞれの部分に向けて、前記サンプルの前記画像を生成する、請求項２４〜２９のいずれか一項に記載の方法。
31. さらに、少なくとも、前記照射パターンにより照射されない前記サンプルの部分から発生する光を遮光する、請求項２４〜３０のいずれか一項に記載の方法。
32. さらに、前記それぞれの戻り光をフィルタリングする、請求項２４〜３１のいずれか一項に記載の方法。
33. さらに、前記照射パターンを、前記サンプルの前記区画に対応する前記サンプル上の前記焦点面上に向けて集束させる、請求項２４〜３２のいずれか一項に記載の方法。
34. さらに、光を受光し、当該光を入射光点の配列に整形して前記照射パターンを形成する、請求項２４〜３３のいずれか一項に記載の方法。
35. さらに、光を受光し、当該光をライン状に整形して前記照射パターンを形成する、請求項２４〜３３のいずれか一項に記載の方法。
36. さらに、前記それぞれの戻り光を、導光器を用いて検出装置に導く、請求項２４〜３５のいずれか一項に記載の方法。
37. 前記照射パターンの光強度分布を変調することは、
    光を受光し、当該光を２つの直交偏光成分に分解した後、当該２つの直交偏光成分の間に位相差を導入することと、
    前記２つの直交偏光成分を空間的に分離した後、前記２つの直交偏光成分を１つの偏光状態に変換することとを含む、請求項２４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
38. 前記光を２つの直交偏光成分に分解した後当該２つの直交偏光成分の間に位相差を導入することは、
    前記光を前記２つの直交偏光成分に分解する２分の１波長板を備えることと、
    前記２つの直交偏光成分の間に位相差を導入する電気光学変調器を備えることとを含む、請求項３７に記載の方法。
39. 前記２つの直交偏光成分を空間的に分離した後、前記２つの直交偏光成分を１つの偏光状態に変換することは、
    前記２つの直交偏光成分を空間的に分離する空間偏光子を備えることと、
    前記２つの直交偏光成分を前記１つの偏光状態に変換する偏光分析器を備えることとを含む、請求項３７または３８に記載の方法。
40. 前記２つの直交偏光成分を空間的に分離することは、
    前記空間偏光子の第１の領域にて前記２つの直交偏光成分のうちの一方を選択的に遮断することと、
    前記空間偏光子の第２の領域にて前記２つの直交偏光成分のうちの他方を選択的に遮断することとを含む、請求項３９に記載の方法。
41. 前記検出器により生成された画像を復調して、前記照射パターンにより照射された前記サンプルの前記それぞれの区画に対応した、前記サンプルの個々の光学的区分画像を生成することをさらに含む、請求項２４〜４０のいずれか一項に記載の方法。
42. 前記画像を復調することは、前記それぞれの戻り光の各々からのＡＣ成分の振幅を検索することを含む、請求項４１に記載の方法。
43. さらに、前記照射パターンのための光を供給する、請求項２４〜４２のいずれか一項に記載の方法。
44. 光を供給することは、当該光を供給する１つ以上のレーザを備えることを含む、請求項４３に記載の方法。
45. 前記それぞれの戻り光を前記検出器の個々の部分に順次光学的に結合することは、前記サンプルの前記それぞれの区画における１つの画素を、前記検出器の前記それぞれの部分における複数画素に光学的に結合させることを含む、請求項２４〜４４のいずれか一項に記載の方法。
46. 前記照射パターンにより覆われる画素の数は、少なくとも実質的に、前記撮像すべきサンプルの視野における画素の合計数の平方根に一致する、請求項２４〜４５のいずれか一項に記載の方法。