JPH10206742A - レーザ走査顕微鏡 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 標本画像を観察・記録しながら標本の所望の
位置にレーザ光を照射し、標本の動的特性などを調査す
る。 【解決手段】 第１の走査光学系１とは別に、第２のレ
ーザ光源２から出力されたコヒーレント光を第２の走査
光学系３により標本１１０上の任意の位置に照射し、か
つ第１のレーザ光源１００から出力されたコヒーレント
光を第１の走査光学系１により標本１１０上で走査さ
せ、その蛍光を光電変換素子１１５によって計測する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、レーザ光源から出
力されたコヒーレント光で標本面上を走査したときの標
本からの透過光や反射光又は標本に発生する蛍光を検出
するレーザ走査顕微鏡に関する。

【０００２】

【従来の技術】図１６は走査型レーザ顕微鏡の構成図で
ある。この走査型レーザ顕微鏡は、コヒーレント光を発
するレーザ光源１００と、このレーザ光源１００からの
光束を対物レンズ１０７の像面に走査させる走査光学ユ
ニット１０２と、前記光束を像面に集光させる対物レン
ズ１０７とを有している。

【０００３】すなわち、レーザ光源１００から発せられ
たコヒーレント光（レーザ光）は、ダイクロイックミラ
ー１０１を透過して走査光学ユニット１０２に入射す
る。この走査光学ユニット１０２は、互いに直交方向に
走査する各走査ミラー１０２ａ、１０２ｂを有するもの
で、これら走査ミラー１０２ａ、１０２ｂによってコヒ
ーレント光を偏向する。

【０００４】この偏向されたコヒーレント光は、リレー
レンズ１０３を透過した後、ミラー１０４によって光路
の向きを変え、ダイクロイックミラー１０５を透過し、
結像レンズ１０６により対物レンズ１０７の瞳径を満足
するものとなる。

【０００５】すなわち、結像レンズ１０６を透過した光
は、ダイクロイックミラー１０８、対物レンズ１０７に
至り、さらに対物レンズ１０７を透過した光は、ステー
ジ１０９上に載置された標本１１０の断面１１１に集光
される。

【０００６】このように標本１１０に光が照射される
と、この光により蛍光指示薬が励起され、蛍光が発せら
れる。例えば、蛍光指示薬にカルシウンイオン指示薬の
fluo-3を使い、レーザ波長４８８ｎｍ（例えばアルゴン
レーザなど）を用いると、fluo-3は蛍光波長５３０ｎｍ
の光を発する。

【０００７】この標本１１０からの蛍光は、先の光路と
は逆方向に、対物レンズ１０７、ダイクロイックミラー
１０８、結像レンズ１０６、ダイクロイックミラー１０
５、ミラー１０４、リレーレンズ１０３、各走査ミラー
１０２ｂ、１０２ａを通ってダイクロイックミラー１０
１に到達し、このダイクロイックミラー１０１で反射し
て測光フィルタ１１２に入射する。

【０００８】この測光フィルタ１１２に入射した光は、
標本１１０からの蛍光波長のみが選択され、その光がレ
ンズ１１３によってピンホール１１４面に結像される。
このピンホール１１４を貫けた蛍光は、光電変換素子１
１５によって計測される。

【０００９】ここで、上記ダイクロイックミラー１０１
の特性は、標本１１０を染色する蛍光色素の励起波長
（レーザ波長）及び蛍光波長によって決定される。例え
ば、上記の通り蛍光指示薬にカルシウムイオン指示薬の
fluo-3を使い、レーザ波長４８８ｎｍ（例えばアルゴン
レーザなど）を用いると、fluo-3は蛍光波長５３０ｎｍ
の光を発するので、ダイクロイックミラー１０１は例え
ば波長５０５ｎｍ以上の光を反射する特性となる。

【００１０】このような標本１１０の観察において、コ
ヒーレント光が走査光学ユニット１０２の各走査ミラー
１０２ａ、１０２ｂで偏向し、対物レンズ１０７を通過
し、照明することによって標本１１０の断面１１１上の
結像位置の蛍光を逐次測定でき、走査範囲内の標本像を
構築できる。

【００１１】又、ステージ１０９又は対物レンズ１０７
を昇降させることによって、標本１１０の断面１１１と
は異なる断面像を取得できるので、標本像の３次元構築
も可能である。

【００１２】一方、レーザ光源１００をＵＶ（紫外線）
パルスレーザとし、かつ走査光学ユニット１０２の各走
査ミラー１０２ａ、１０２ｂを任意の向きで停止させる
と、標本１１０の所望の位置にＵＶパルスレーザを照射
することができる。

【００１３】例えば、ケージド試薬を用いる場合、ＵＶ
パルスレーザを照射することによってケージド基に囲わ
れている物質が放出され、細胞のある特定部位に特異現
象を引き起こさせることができる。

【００１４】標本１１０の全体照明は、光源１１６、レ
ンズ１１７、励起フィルタ１１８及びダイクロイックミ
ラー１０８を有する照明光学系によって行われ、標本１
１０から発せられる蛍光は、ダイクロイックミラー１０
５で反射し、測光フィルタ１１９で蛍光波長が選択さ
れ、蛍光像としてＣＣＤカメラ等の撮像素子１２０によ
り取得される。

【００１５】以上のように、標本１１０の所望の位置に
レーザ光を瞬間的に照射して（ＵＶパルスレーザを照射
して）、この影響によって起こる標本１１０の動的特性
を調査する場合、標本像の時系列的記録が必要になる。
このような場合に一般的によく使われるのがＣＣＤカメ
ラを用いて画像を取得する方法である。

【００１６】しかしながら、ＣＣＤカメラによる画像取
得の方法では、コンフォーカルでの画像ではないので、
コンフォーカル画像と比較して焦点深度の深い画像とな
り、このためにケージド基を解除したことによる特異反
応が標本１１０のどのくらいの深さのところで起こって
いるのか分からない。

【００１７】従って、標本像もコンフォーカルレーザ顕
微鏡として標本画像を観察・記録しながら、標本１１０
の所望の位置にレーザ光を瞬間的に照射して、標本１１
０の動的特性を調査することが望ましい。

【００１８】又、研究用途によっては、標本１１０にレ
ーザ光を照射する部位と観察したい断面とが同一平面上
にあるとは限らず、ある断層の一部にレーザ光を照射
し、それとは異なる断層の画像を取得したい場合があ
る。例えば、動脈において、その外郭の交換神経に刺激
を与えたとき、その内側の平滑筋や内皮細胞にどのよう
な反応が生じるかを調査する場合などである。従って、
このような場合、レーザ光を照射する部位と、画像を取
得する断面とが標本１１０内で選択できることが望まし
い。

【００１９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、標本画像を
観察・記録しながら標本の所望の位置にレーザ光を照射
し、標本の動的特性などを調査できるレーザ走査顕微鏡
を提供することを目的とする。又、本発明は、レーザ光
を照射する部位と画像を取得する断面とが標本内で選択
できるレーザ走査顕微鏡を提供することを目的とする。

【００２０】

【課題を解決するための手段】請求項１によれば、レー
ザ光源から出力されたコヒーレント光を標本面上に走査
したときの標本からの透過光、反射光又は標本に発生す
る蛍光を検出するレーザ走査顕微鏡において、レーザ光
源から出力されたコヒーレント光をそれぞれ個別に標本
面上に対して走査する複数の走査光学系を備えたレーザ
走査顕微鏡である。

【００２１】請求項２によれば、請求項１記載のレーザ
走査顕微鏡において、複数の走査光学系により走査され
た各コヒーレント光を１つの対物レンズを通して標本面
上で走査させる。

【００２２】請求項３によれば、請求項１記載のレーザ
走査顕微鏡において、複数の走査光学系を走査制御する
１つの制御系を備えた。請求項４によれば、請求項１、
２又は３記載のレーザ走査顕微鏡において、標本に照射
されるコヒーレント光の集光位置をコヒーレント光の光
軸方向にシフトさせる光学調整機構を備えた。

【００２３】請求項５によれば、請求項１、２、３又は
４記載のレーザ走査顕微鏡において、標本に照射される
コヒーレント光の集光位置に一致させて位置確認用の光
を標本に照射する位置確認用光学系を備えた。

【００２４】請求項６によれば、近赤外域の波長のサブ
ピコ秒の単色コヒーレント光パルスを発するレーザ光源
と、このレーザ光源から発せられたレーザ光を標本面上
に集光させる対物レンズ系とを含むレーザ走査顕微鏡に
おいて、レーザ光源からの光束を所望の大きさに変える
少なくとも一つの光束変換光学系と、光路を２つに分割
或いは光路を切り換える光路分割手段とを備えていて、
光路分割手段を通った第１の光路上には、対物レンズ系
の像面に集光し走査させる第１の走査光学系と、標本面
上に集光された集光スポットにより励起されて発する蛍
光を検出する検出光学系とを具備し、光路分割手段を通
った第２の光路上には、対物レンズ系の像面に集光し走
査させる第２の走査光学系と、集光スポットを対物レン
ズ系に入射させる光路結合手段とを具備していて、対物
レンズ系を第１及び第２の光路で共用するレーザ走査顕
微鏡である。

【００２５】

【発明の実施の形態】

(1) 次に本発明の第１の実施の形態について説明する。
なお、図１６と同一部分には同一符号を付してその詳し
い説明は省略する。図１は本発明に係るレーザ走査顕微
鏡の構成図である。

【００２６】このレーザ走査顕微鏡は、第１のレーザ光
源１００から出力されたコヒーレント光で標本１１０面
上を走査する観察用の第１の走査光学系１と、第２のレ
ーザ光源２から出力されたコヒーレント光を標本１１０
の任意の位置に照射してケージドを解除させる（標本１
１０に化学反応を起こさせる）ための第２の走査光学系
３とを備えている。

【００２７】このうち観察用の第１の走査光学系１は、
ダイクロイックミラー１０１、走査光学ユニット１０
２、リレーレンズ１０３、ミラー１０４、結像レンズ１
０６、対物レンズ１０７が配置されている。

【００２８】第２の走査光学系３は、第２のレーザ光源
２から出力されるコヒーレント光の光路上に、互いに直
交方向に走査する各走査ミラー４ａ、４ｂを備えた走査
光学ユニット４、リレーレンズ５、ミラー６、結像レン
ズ７、対物レンズ８を配置した構成となっている。

【００２９】又、第１の走査光学系１におけるダイクロ
イックミラー１０１の分岐光路上には、検出光学系９が
配置されている。この検出光学系９は、第１の走査光学
系１によりコヒーレント光で標本１１０面上を走査した
ときの標本１１０に発生する蛍光を検出する機能と、第
２の走査光学系３によりコヒーレント光で標本１１０面
上を走査したときの標本１１０からの透過光を検出する
機能を有している。

【００３０】この検出光学系９は、ダイクロイックミラ
ー１０１の分岐光路上に、測光フィルタ１１２、レンズ
１１３、ピンホール１１４及び光電変換素子１１５を配
置した構成となっている。

【００３１】上記ダイクロイックミラー１０１の特性
は、標本１１０を染色する蛍光色素の励起波長（レーザ
波長）及び蛍光波長によって決定される。例えば、上記
の通り蛍光指示薬にカルシウムイオン指示薬のfluo-3を
使い、レーザ波長４８８ｎｍ（例えばアルゴンレーザな
ど）を用いると、fluo-3は蛍光波長５３０ｎｍの光を発
するので、ダイクロイックミラー１０１は、例えば波長
５０５ｎｍ以上の光を反射する特性となる。

【００３２】なお、第１のレーザ光源１００にＩＲパル
スレーザを用いて２光子吸収による画像を取得すること
ができる。このとき、２光子吸収現象は結像位置でのみ
発生するので、ピンホール１１４は理論的には不要とな
る。又、ダイクロイックミラー１０１は、ＩＲレーザを
透過し、可視蛍光を反射して光電変換素子１１５に導く
ための短波長反射の特性を持つものとなる。

【００３３】次に上記の如く構成されたレーザ走査顕微
鏡の作用について説明する。この例で第２の走査光学系
３は、標本１１０の任意の位置にコヒーレント光を照射
するために用いられる。

【００３４】すなわち、第２のレーザ光源２から発せら
れたコヒーレント光は、走査光学ユニット４に入射す
る。この走査光学ユニット４は、各走査ミラー４ａ、４
ｂによってコヒーレント光を任意に偏向する。

【００３５】この任意に偏向されたコヒーレント光は、
リレーレンズ５を透過した後、ミラー６によって光路の
向きを変え、結像レンズ７を透過し、対物レンズ８に導
かれる。

【００３６】この対物レンズ８を透過した光は、ステー
ジ１０９上に載置された標本１１０の断面１１１に集光
される。なお、用途に応じて、各走査ミラー４ａ、４ｂ
によってある範囲を走査してもよく、又静止させてスポ
ット的に照射させてもよい。さらに、各走査ミラー４
ａ、４ｂを瞬間的にスキップ作動させることで瞬時に複
数の任意の位置にスポット的に照射させてもよい。

【００３７】一方、第１のレーザ光源１００から発せら
れたコヒーレント光は、ダイクロイックミラー１０１を
透過して走査光学ユニット１０２に入射する。この走査
光学ユニット１０２は、各走査ミラー１０２ａ、１０２
ｂによってコヒーレント光を偏向する。

【００３８】この偏向されたコヒーレント光は、リレー
レンズ１０３を透過した後、ミラー１０４によって光路
の向きを変え、結像レンズ１０６により対物レンズ１０
７の瞳径を満足するものとなる。

【００３９】そして、結像レンズ１０６を透過した光
は、対物レンズ１０７に至り、さらにこの対物レンズ１
０７を透過した光は、ステージ１０９上に載置された標
本１１０の断面１１１に集光される。

【００４０】このように標本１１０に光が照射される
と、この光により蛍光指示薬が励起され、蛍光が発せら
れる。例えば、蛍光指示薬にカルシウムイオン指示薬の
fluo-3を使い、レーザ波長４８８ｎｍ（例えばアルゴン
レーザなど）を用いると、fluo-3は蛍光波長５３０ｎｍ
の光を発する。

【００４１】この標本１１０からの蛍光は、先の光路と
は逆方向に、対物レンズ１０７から結像レンズ１０６、
ミラー１０４、リレーレンズ１０３、各走査ミラー１０
２ｂ、１０２ａを通ってダイクロイックミラー１０１に
到達し、このダイクロイックミラー１０１で反射して測
光フィルタ１１２に入射する。

【００４２】このダイクロイックミラー１０１は、上記
透過率波長特性で説明したように、標本１１０を染色す
る蛍光色素の励起波長及び蛍光波長とレーザ波長に依存
している。

【００４３】この測光フィルタ１１２に入射した光は、
標本１１０からの蛍光波長のみが選択され、その光がレ
ンズ１１３によってピンホール１１４面に結像される。
このピンホール１１４を貫けた蛍光は、光電変換素子１
１５によって計測される。

【００４４】このように上記第１の実施の形態において
は、第１の走査光学系１とは別に、第２のレーザ光源２
から出力されたコヒーレント光を第２の走査光学系３に
より標本１１０上の任意の位置に照射し、かつ第１のレ
ーザ光源１００から出力されたコヒーレント光で第１の
走査光学系１により標本１１０上を走査し、その蛍光を
光電変換素子１１５によって計測するようにしたので、
例えば第１の走査光学系により標本画像を観察・記録し
ている途中に、第２の走査光学系３によりコヒーレント
光を標本１１０に照射すれば、第２の走査光学系３によ
るコヒーレント光照射によって引き起こされる標本１１
０の動的特性（化学反応）などを調査できる。 (2) 次に本発明の第２の実施の形態について説明する。
なお、図１と同一部分には同一符号を付してその詳しい
説明は省略する。

【００４５】図２は本発明に係るレーザ走査顕微鏡の構
成図である。このレーザ走査顕微鏡は、観察用の第１の
走査光学系１の光路と第２の走査光学系３の光路とを途
中で一致させ、これら第１及び第２の走査光学系１、３
を１つの対物レンズ１０７で共用する構成となってい
る。

【００４６】第２の走査光学系３は、上記第１の実施の
形態と同様に、第２のレーザ光源２から出力されたコヒ
ーレント光を標本１１０の任意の位置に照射する機能を
有している。

【００４７】第１と第２の走査光学系１、３の各光路を
一致させる構成を説明すると、第１の走査光学系１にお
けるリレーレンズ１０３の焦点位置には、ダイクロイッ
クミラー１０が配置されている。又、このダイクロイッ
クミラー１０の配置位置は、第２の走査光学系３におけ
るリレーレンズ５の焦点位置に一致している。

【００４８】このダイクロイックミラー１０は、第１及
び第２のレーザ光源１００，２の出力波長により次のよ
うな特性を有している。通常、ケージド試薬の解除に
は、ＵＶ光が使用される。そこで以下の組み合わせを考
える。 (a) 観察用としては、第１のレーザ光源１００に可視連
続光レーザ（波長４８８ｎｍ）、第２のレーザ光源２と
してＵＶパルスレーザ（波長３５１ｎｍ）の組み合わせ
が考えられる。 (b) 観察用としては、第１のレーザ光源１００に可視連
続レーザ光（波長４８８ｎｍ）、第２のレーザ光源２と
してＩＲパルスレーザ（波長７１０ｎｍ）の組み合わせ
が考えられる。 (c) 観察用としては、第１のレーザ光源１００にＩＲパ
ルスレーザ（波長８５０ｎｍ）、第２のレーザ光源２と
してＩＲパルスレーザ（波長７１０ｎｍ）の組み合わせ
が考えられる。

【００４９】なお、ＩＲパルスレーザは、２光子励起現
象を引き起こすことのできるレーザとする。図３はかか
る条件に適用する各ダイクロイックミラー１０の透過率
波長特性を示す。

【００５０】同図(a) は上記組み合わせ(a) の場合のダ
イクロイックミラー１０の特性を示し、このダイクロイ
ックミラー１０は、可視連続光レーザ（波長４８８ｎ
ｍ）及びその蛍光（波長５３０ｎｍ）を透過し、ＵＶパ
ルスレーザ（波長３５１ｎｍ）を反射する特性を有して
いる。

【００５１】同図(b) は上記組み合わせ(b) の場合のダ
イクロイックミラー１０の特性を示し、上記同様に、ダ
イクロイックミラー１０は、可視連続光レーザ（波長４
８８ｎｍ）及びその蛍光（波長５３０ｎｍ）を透過し、
ＩＲパルスレーザ（波長７１０ｎｍ）を反射する特性を
有している。

【００５２】同図(c) は上記組み合わせ(c) の場合のダ
イクロイックミラー１０の特性を示し、このダイクロイ
ックミラー１０は、ＩＲパルスレーザ（波長８５０ｎ
ｍ）及び波長５３０ｎｍの蛍光を透過し、ＩＲパルスレ
ーザ（波長７１０ｎｍ）を反射する特性を有している。

【００５３】次に上記の如く構成されたレーザ走査顕微
鏡の作用について説明する。第２の走査光学系３は、標
本１１０の任意の位置にコヒーレント光を照射するため
に用いる。

【００５４】すなわち、第２のレーザ光源２から発せら
れたコヒーレント光は、走査光学ユニット４の各走査ミ
ラー４ａ、４ｂによって任意に偏向され、リレーレンズ
５を透過してダイクロイックミラー１０に入射し、ここ
で光路が変更され、結像レンズ１０６により対物レンズ
１０７の瞳径を満足するものとなる。

【００５５】この結像レンズ１０６を透過した光は、対
物レンズ１０７に至り、この対物レンズ１０７を透過
し、ステージ１０９上に載置された標本１１０の断面１
１１に集光される。

【００５６】なお、上記同様に用途に応じて、各走査ミ
ラー４ａ、４ｂによってある範囲を走査してもよく、又
静止させてスポット的に照射させてもよい。さらに、各
走査ミラー４ａ、４ｂを瞬間的にスキップ作動させるこ
とで瞬時に複数の任意の位置にスポット的に照射させて
もよい。

【００５７】一方、レーザ光源１００から発せられたコ
ヒーレント光は、ダイクロイックミラー１０１を透過
し、走査光学ユニット１０２の各走査ミラー１０２ａ、
１０２ｂによって偏向される。

【００５８】この偏向されたコヒーレント光は、リレー
レンズ１０３を透過した後、ミラー１０４によって光路
の向きを変え、ダイクロイックミラー１０を透過し、結
像レンズ１０６により対物レンズ１０７の瞳径を満足す
るものとなる。

【００５９】この結像レンズ１０６を透過した光は、対
物レンズ１０７に至り、この対物レンズ１０７を透過
し、ステージ１０９上に載置された標本１１０の断面１
１１に集光される。

【００６０】このように標本１１０に光が照射される
と、この光により蛍光指示薬が励起され、蛍光が発せら
れる。この標本１１０からの蛍光は、先の光路とは逆方
向に、対物レンズ１０７から結像レンズ１０６、ダイク
ロイックミラー１０、ミラー１０４、リレーレンズ１０
３、各走査ミラー１０２ｂ、１０２ａを通ってダイクロ
イックミラー１０１に到達し、このダイクロイックミラ
ー１０１で反射して測光フィルタ１１２に入射する。

【００６１】この測光フィルタ１１２に入射した光は、
標本１１０からの蛍光波長のみが選択され、その光がレ
ンズ１１３によってピンホール１１４面に結像される。
このピンホール１１４を貫けた蛍光は、光電変換素子１
１５によって計測される。

【００６２】なお、第１のレーザ光源１００にＩＲパル
スレーザを用いると、２光子吸収により蛍光画像を取得
することができ、このとき２光子吸収現象は結像位置で
のみ発生するので、ピンホール１１４は理論的には不要
となる。又、ダイクロイックミラー１０１は、ＩＲレー
ザを透過し、可視蛍光を反射して光電変換素子１１５に
導くための短波長反射の特性を持つものとなる。

【００６３】このように上記第２の実施の形態において
は、第１の走査光学系１に対して第２の走査光学系３を
ダイクロイックミラー１０によって結合し、これら第１
及び第２の走査光学系１、３を１つの対物レンズ１０７
により共用する構成としても、上記第１の実施の形態と
同様の効果を奏することは言うまでもない。 (3) 次に本発明の第３の実施の形態について説明する。
なお、図２と同一部分には同一符号を付してその詳しい
説明は省略する。

【００６４】図４は本発明に係るレーザ走査顕微鏡の構
成図である。このレーザ走査顕微鏡は、第２の走査光学
系３にも観察用の検出光学系１１を設け、かつ第１及び
第２の走査光学系１、３を１つのコントロールユニット
１２により走査制御する構成となっている。

【００６５】このうち観察用の検出光学系１１は、第２
のレーザ光源２から出力されたコヒーレント光で標本１
１０面上を走査したときの標本１１０に発生する蛍光、
又は標本１１０からの反射光を検出する機能を有してい
る。

【００６６】この検出光学系１１は、第２のレーザ光源
２と走査光学ユニット４との間の光路上に、ダイクロイ
ックミラー１３を配置し、このダイクロイックミラー１
３の反射光路上に、標本１１０からの蛍光波長のみを選
択する測光フィルタ１４、レンズ１５、ピンホール１６
及び光電変換素子１７を配置した構成となっている。

【００６７】一方、コントロールユニット１２は、第１
及び第２の走査光学系１、３の各走査光学ユニット１０
２、４の走査動作を制御するとともに各光電変換素子１
１５、１７の動作を制御し、これら光電変換素子１１
５、１７からそれぞれ出力される各電気信号を取り込
み、コンピュータ１８に対して例えば画像の重ね合わせ
処理や画像を並べたりする処理等の画像処理の指令を発
する機能を有している。

【００６８】コンピュータ１８は、画像処理した結果を
モニタテレビジョン１９に映し出す機能を有している。
次に上記の如く構成されたレーザ走査顕微鏡の作用につ
いて説明する。

【００６９】第１のレーザ光源１００から発せられたコ
ヒーレント光は、ダイクロイックミラー１０１を透過
し、走査光学ユニット１０２の各走査ミラー１０２ａ、
１０２ｂによって偏向され、リレーレンズ１０３を通過
した後、ミラー１０４によって光路の向きを変え、ダイ
クロイックミラー１０、結像レンズ１０６、対物レンズ
１０７を透過し、標本１１０の断面１１１に集光され
る。

【００７０】この標本１１０からの蛍光は、先の光路と
は逆方向に、対物レンズ１０７から結像レンズ１０６、
ダイクロイックミラー１０、ミラー１０４、リレーレン
ズ１０３、走査光学ユニット１０２を通ってダイクロイ
ックミラー１０１に到達し、ここで反射して測光フィル
タ１１２に入射する。

【００７１】この測光フィルタ１１２に入射した光は、
標本１１０からの蛍光波長のみが選択され、ピンホール
１１４を貫けて光電変換素子１１５によって計測され
る。一方、第２のレーザ光源２から発せられたコヒーレ
ント光は、走査光学ユニット４の各走査ミラー４ａ、４
ｂによって任意に偏向され、リレーレンズ５を透過して
ダイクロイックミラー１０で反射され、結像レンズ１０
６、対物レンズ１０７を透過し、標本１１０の断面１１
１に集光される。

【００７２】この標本１１０の反射光又は蛍光は、対物
レンズ１０７から結像レンズ１０６、ダイクロイックミ
ラー１０、リレーレンズ５、走査光学ユニット４を通っ
てダイクロイックミラー１３に到達する。なお、ダイク
ロイックミラー１３は、標本１１０からの反射光を検出
するときハーフミラーに代える。

【００７３】そして、測光フィルタ１４を取り外すこと
により標本１１０からの反射光、又は測光フィルタ１４
を透過させて蛍光波長のみを選択た蛍光は、その光をレ
ンズ１５によってピンホール１６面に結像する。光電変
換素子１７は、このピンホール１６を貫けた蛍光を計測
する。

【００７４】一方、コントロールユニット１２は、各光
電変換素子１１５、１７からそれぞれ出力される各電気
信号を取り込み、コンピュータ１８に対して例えば画像
の重ね合わせ処理や画像を並べたりする処理等の画像処
理の指令を発する。

【００７５】このコンピュータ１８は、各光電変換素子
１１５、１７からそれぞれ出力される各電気信号に基づ
いてそれぞれ画像を求め、これら画像の重ね合わせ処理
や画像を並べたりする処理等の画像処理を実行し、その
画像処理結果をモニタテレビジョン１９に映し出す。

【００７６】このように上記第３の実施の形態において
は、上記第２の実施の形態と同様な効果を奏することが
できるとともに、１つのコントロールユニット１２によ
って第１及び第２の走査光学ユニット１０２、４を走査
制御するので、第１の走査光学ユニット１０２の光電変
換素子１１５及び第２の走査光学ユニット４の光電変換
素子１７からそれぞれ得られる各画像を重ね合わせた
り、並べたりしてモニタテレビジョン１９上に表示でき
る。

【００７７】又、第１及び第２の走査光学ユニット１０
２、４により走査したときの２つの画像を同時にモニタ
テレビジョン１９上に表示でき、例えば第１の走査光学
ユニット１０２の走査により得られる画像内で、第２の
走査光学ユニット４の走査による画像を得ることもでき
る。

【００７８】なお、第１のレーザ光源１００と第２のレ
ーザ光源２との各出力波長が同一であれば、ダイクロイ
ックミラー１０は、ハーフミラーに代えてもよい。 (4) 次に本発明の第４の実施の形態について説明する。
なお、図２と同一部分には同一符号を付してその詳しい
説明は省略する。

【００７９】図５は本発明に係るレーザ走査顕微鏡の構
成図である。第２のレーザ光源２と走査光学ユニット４
との間の光路上には、標本１１０に照射されるコヒーレ
ント光の集光位置を、このコヒーレント光の光軸方向に
シフトさせる光学調整機構２０が配置されている。

【００８０】具体的に光学調整機構２０は、第１のレー
ザ光源２から出力されたコヒーレント光の光束を任意の
出射角度を持つように変換出力するもので、固定レンズ
２１と光軸方向に移動自在な可動レンズ２２とから構成
されている。

【００８１】すなわち、固定レンズ２１により集光され
た光を、例えば位置２３ｂに配置された可動レンズ２２
に入射することによって、この可動レンズ２２から出射
される光に任意の出射角度が持たれるようになる。例え
ば、可動レンズ２２が位置２３ｂに配置された場合、可
動レンズ２２から出射される光が平行光になるように設
定されている。

【００８２】このように光学調整機構２０から出射され
るコヒーレント光の光束が任意の出射角度を持つように
変換すると、標本１１０におけるコヒーレント光の集光
位置がその光軸方向にシフトするものとなっている。

【００８３】例えば、図６に示すように可動レンズ２２
を位置２３ａ側に移動すると、コヒーレント光の集光位
置は図７に示すように標本断面２４ａ側にシフトし、反
対に可動レンズ２２を位置２３ｃ側に移動すると、コヒ
ーレント光の集光位置は標本断面２４ｃ側にシフトす
る。そして、可動レンズ２２を位置２３ｂ付近に移動す
ると、コヒーレント光の集光位置は標本断面２４ｂ近傍
にシフトするものとなっている。

【００８４】なお、光学調整機構２０における可動レン
ズ２２が位置２３ｂに配置されたとき、２つのレーザ光
源２、１００の各集光位置が例えば同一断面２４ｂにな
るように、光学素子すなわちリレーレンズ５とリレーレ
ンズ１０３とは同一のものを使用し、結像レンズ１０６
とリレーレンズ５及びリレーレンズ１０３との距離を等
しくする。

【００８５】次に上記の如く構成されたレーザ走査顕微
鏡の作用について説明する。レーザ光源１００から発せ
られたコヒーレント光は、ダイクロイックミラー１０１
を透過し、走査光学ユニット１０２の各走査ミラー１０
２ａ、１０２ｂによって偏向され、リレーレンズ１０３
を透過した後、ミラー１０４によって光路の向きを変
え、ダイクロイックミラー１０、結像レンズ１０６、対
物レンズ１０７を透過し、標本１１０の断面２４に集光
される。

【００８６】この標本１１０からの蛍光は、先の光路と
は逆方向に、対物レンズ１０７から結像レンズ１０６、
ダイクロイックミラー１０、ミラー１０４、リレーレン
ズ１０３、走査光学ユニット１０２を通ってダイクロイ
ックミラー１０１に到達し、ここで反射して測光フィル
タ１１２に入射する。

【００８７】この測光フィルタ１１２に入射した光は、
標本１１０からの蛍光波長のみが選択され、ピンホール
１１４を貫けて光電変換素子１１５によって計測され
る。一方、第２のレーザ光源２から発せられたコヒーレ
ント光は、光学調整機構２０に入射する。

【００８８】この光学調整機構２０は、第２のレーザ光
源２から出力されたコヒーレント光の光束を、固定レン
ズ２１及び可動レンズ２２の配置位置２３ａ〜２３ｃに
応じて任意の出射角度を持つように変換出力する。

【００８９】この光学調整機構２０から任意の出射角度
で変換出力されたコヒーレント光は、走査光学ユニット
４の各走査ミラー４ａ、４ｂによって任意に偏向され、
リレーレンズ５を透過してダイクロイックミラー１０で
反射され、結像レンズ１０６、対物レンズ１０７を透過
し、標本１１０の断面１１１に集光される。

【００９０】なお、用途に応じて、各走査ミラー４ａ、
４ｂによって標本１１０上のある範囲を走査してもよい
し、静止させてスポット的に照射させてもよい。さら
に、各走査ミラー４ａ、４ｂを瞬間的にスキップ作動さ
せることで瞬時に複数の任意の位置にスポット的に照射
させることもできる。

【００９１】ここで、上記光学調整機構２０における可
動レンズ２２が各位置２３ａ〜２３ｃの範囲で可動する
ことで、標本１１０におけるコヒーレント光の集光位置
は、その光軸方向にシフトする。

【００９２】例えば、図６に示すように可動レンズ２２
を位置２３ａ側に移動すると、コヒーレント光の集光位
置は図７に示すように標本断面２４ａ側にシフトし、反
対に可動レンズ２２を位置２３ｃ側に移動すると、コヒ
ーレント光の集光位置は標本断面２４ｃ側にシフトす
る。そして、可動レンズ２２を位置２３ｂ付近に移動す
ると、コヒーレント光の集光位置は標本断面２４ｂ近傍
にシフトする。

【００９３】このように上記第４の実施の形態において
は、第２のレーザ光源２から出力されたコヒーレント光
の光束を任意の出射角度を持つように変換出力し、標本
１１０におけるコヒーレント光の集光位置をその光軸方
向にシフトさせる光学調整機構２０を設けたので、標本
１１０にレーザ光を照射する部位と観察したい断面とが
同一平面上にあるとは限らない場合、すなわち断層の一
部にレーザ光を照射し、それとは異なる断層の画像を取
得したい場合、例えば動脈において、その外郭の交換神
経に刺激を与えたとき、その内側の平滑筋や内皮細胞に
どのような反応が生じるかを調査する場合などがある
が、このような場合でも光学調整機構２０の可動レンズ
２２を移動させることにより、観察したい断面とレーザ
光を照射する断層とが同一平面上になくても対応でき、
上記第１の実施の形態の効果の如く、第１の走査光学系
により標本画像を観察・記録している途中に、第２の走
査光学系によりコヒーレント光を標本１１０に照射すれ
ば、第２の走査光学系によるコヒーレント光照射によっ
て引き起こされる標本１１０の動的特性（化学反応）等
を調査できる。

【００９４】なお、可動レンズ２２の移動量に対して集
光位置２４ａ〜２４ｃの位置関係を予め調査しておけ
ば、ステージ１０９の移動量に対して可動レンズ２２の
移動量を相関付けることができ、ステージ１０９が昇降
しても、可動レンズ２２を調整することで標本１１０の
任意の位置にコヒーレント光を照射できる。すなわち、
第１の走査光学系１によって標本１１０の任意の平面の
断層像の取得を行いながら、第２の走査光学系３によっ
て任意の部位にコヒーレント光を照射できる。 (5) 次に本発明の第５の実施の形態について説明する。
なお、図２と同一部分には同一符号を付してその詳しい
説明は省略する。

【００９５】図８は本発明に係るレーザ走査顕微鏡の構
成図である。標本１１０の任意の位置にコヒーレント光
を照射する第２の走査光学系３の光路上には、ダイクロ
イックミラー２５を介して位置確認用のポインタレーザ
光源２６が設けられている。

【００９６】このポインタレーザ光源２６は、標本１１
０に照射したときに標本１１０に変化を与えない波長、
例えば波長６５０ｎｍのポインタ用のレーザ光を出力す
る機能を有している。

【００９７】このポインタレーザ光源２６を用いたとき
に、標本１１０からの反射光により位置確認する場合の
各ダイクロイックミラー２７、２８の各特性は次の通り
となる。

【００９８】上記第２の実施の形態で説明したように、
ケージド試薬の解除には、通常、ＵＶ光が使用される。
そこで以下の組み合わせを考える。 (a) 観察用としては、第１のレーザ光源１００に可視連
続光レーザ（波長４８８ｎｍ）、第２のレーザ光源２と
してＵＶパルスレーザ（波長３５１ｎｍ）の組み合わせ
が考えられる。 (b) 観察用としては、第１のレーザ光源１００に可視連
続レーザ光（波長４８８ｎｍ）、第２のレーザ光源２と
してＩＲパルスレーザ（波長７１０ｎｍ）の組み合わせ
が考えられる。 (c) 観察用としては、第１のレーザ光源１００にＩＲパ
ルスレーザ（波長８５０ｎｍ）、第２のレーザ光源２と
してＩＲパルスレーザ（波長７１０ｎｍ）の組み合わせ
でが考えられる。

【００９９】なお、ＩＲパルスレーザは、２光子励起現
象を引き起こすことのできるレーザとする。図９はかか
る条件に適用する各ダイクロイックミラー２７、２８の
透過率波長特性を示す。

【０１００】同図(a) は上記組み合わせ(a) の場合のダ
イクロイックミラー２８の特性を示し、このダイクロイ
ックミラー２８は、可視連続光レーザ（波長４８８ｎ
ｍ）及びその蛍光（波長５３０ｎｍ）を透過し、ＵＶパ
ルスレーザ（波長３５１ｎｍ）を反射する特性を有して
いる。そして、ダイクロイックミラー２８は、波長６５
０ｎｍに対して透過率５０％程度に設定されている。

【０１０１】同図(b) は上記組み合わせ(b) の場合のダ
イクロイックミラー２８の特性を示し、上記同様に、ダ
イクロイックミラー２８は、可視連続光レーザ（波長４
８８ｎｍ）及びその蛍光（波長５３０ｎｍ）を透過し、
ＩＲパルスレーザ（波長７１０ｎｍ）を反射する特性を
有している。

【０１０２】同図(c) は上記組み合わせ(c) の場合のダ
イクロイックミラー２８の特性を示し、このダイクロイ
ックミラー２８は、ＩＲパルスレーザ（波長８５０ｎ
ｍ）及び波長５３０ｎｍの蛍光を透過し、ＩＲパルスレ
ーザ（波長７１０ｎｍ）を反射する特性を有している。
そして、ダイクロイックミラー２７は、波長６５０ｎｍ
に対して透過率が極力小さく設定されている。

【０１０３】なお、レーザ光源２が本来の目的以外の波
長、例えばポインタレーザ光源２６と同じ波長のレーザ
光を出力できるような多波長出射のものであれば、レー
ザ光源２の出射端に励起フィルタを設けることによっ
て、ポインタレーザ光源２６及びダイクロイックミラー
２５は不要となり、それでも同一の効果は得られる。

【０１０４】次に上記の如く構成されたレーザ走査顕微
鏡の作用について説明する。先ず、第１の走査光学系１
により標本１１０の画像が取られる。すなわち、第１の
レーザ光源１００から発せられたコヒーレント光は、ダ
イクロイックミラー２７を透過し、走査光学ユニット１
０２の各走査ミラー１０２ａ、１０２ｂによって偏向さ
れる。

【０１０５】この偏向されたコヒーレント光は、リレー
レンズ１０３を透過した後、ミラー１０４によって光路
の向きを変え、ダイクロイックミラー２８を透過し、結
像レンズ１０６により対物レンズ１０７の瞳径を満足す
るものとなる。

【０１０６】この結像レンズ１０６を透過した光は、対
物レンズ１０７に至り、この対物レンズ１０７を透過
し、ステージ１０９上に載置された標本１１０の断面１
１１に集光される。

【０１０７】このように標本１１０に光が照射される
と、この光により蛍光指示薬が励起され、蛍光が発せら
れる。この標本１１０からの蛍光は、先の光路とは逆方
向に、対物レンズ１０７から結像レンズ１０６、ダイク
ロイックミラー２８、ミラー１０４、リレーレンズ１０
３、各走査ミラー１０２ｂ、１０２ａを通ってダイクロ
イックミラー２７に到達し、このダイクロイックミラー
２７で反射して測光フィルタ１１２に入射する。

【０１０８】この測光フィルタ１１２に入射した光は、
標本１１０からの蛍光波長のみが選択され、その光がレ
ンズ１１３によってピンホール１１４面に結像される。
このピンホール１１４を貫けた蛍光は、光電変換素子１
１５によって計測される。

【０１０９】この光電変換素子１１５から出力される電
気信号は、例えば画像処理装置に送られ、ここで画像処
理されて標本１１０の画像としてモニタテレビジョンに
映し出される。

【０１１０】次に第２のレーザ光源２をオフした状態
で、ポインタレーザ光源２６からコヒーレント光を出力
させる。このポインタレーザ光源２６から発せられたコ
ヒーレント光は、ダイクロイックミラー２５により第２
の走査光学系３の光軸と同軸に入り、走査光学ユニット
４の各走査ミラー４ａ、４ｂによって任意に偏向され、
リレーレンズ５を透過してダイクロイックミラー２８に
入射して光路の向きを変え、結像レンズ１０６、対物レ
ンズ１０７を透過し、標本１１０の断面１１１に集光さ
れる。

【０１１１】この標本１１０の反射光又は蛍光は、対物
レンズ１０７から結像レンズ１０６、ダイクロイックミ
ラー２８、ミラー１０４、リレーレンズ１０３、走査ユ
ニット１０２を通ってダイクロイックミラー２７に到達
する。

【０１１２】そして、測光フィルタ１１２を取り外すこ
とにより標本１１０からの反射光、又は測光フィルタ１
１２を透過させて蛍光波長のみを選択た蛍光は、レンズ
１１３によってピンホール１１４面に結像される。この
ピンホール１１４を貫けた蛍光は、光電変換素子１１５
によって取得される。

【０１１３】この光電変換素子１１５から出力される電
気信号は、上記同様に画像処理装置に送られ、ここで画
像処理されて標本１１０の画像としてモニタテレビジョ
ンに映し出される。

【０１１４】従って、位置確認用のコヒーレント光の集
光された画像は、モニタテレビジョンの画面上に第１の
走査光学系１によって得られた標本１１０の画像の上に
重ねて映し出される。

【０１１５】ここで、レーザ光源１００とポインタレー
ザ光源２６とが同一波長であれば、パルス光照射位置の
み輝度が高くなって画像として現れる。又、これらレー
ザ光源１００、２６が異なる波長であれば、レーザ光源
１００から出力されるコヒーレント光によって得られる
蛍光標本全体画像と異なる波長で検出できるようにダイ
クロイックミラー２７と測光フィルタ１１２との間にさ
らにダイクロイックミラー、測光フィルタ、レンズ、ピ
ンホール、光電変換素子を設け、ポインタレーザ光源２
６から出力されるコヒーレント光によって得られる像だ
けを検出できるようにポインタレーザ光源２６、ダイク
ロイックミラー、測光フィルタの波長を選択すればよ
い。

【０１１６】この位置確認用のコヒーレント光の集光位
置は、第２のレーザ光源２を動作させたときの集光位置
と同一になっている。従って、モニタテレビジョンに映
し出される画面を観察しながら第２の走査光学系３を移
動させ、位置確認用のコヒーレント光の集光位置が標本
１１０に例えば化学反応を起こさせたい部位に一致する
ように移動させる。

【０１１７】そうして、位置確認用のコヒーレント光の
集光位置が標本１１０に化学反応を起こさせたい部位に
一致した後、第２のレーザ光源２からコヒーレント光が
出力される。

【０１１８】この第２のレーザ光源２から発せられたコ
ヒーレント光は、走査光学ユニット４の各走査ミラー４
ａ、４ｂによって任意に偏向され、リレーレンズ５を透
過してダイクロイックミラー２８で反射され、結像レン
ズ１０６により対物レンズ１０７の瞳径を満足するもの
となる。

【０１１９】この結像レンズ１０６を透過した光は、対
物レンズ１０７に至り、この対物レンズ１０７を透過
し、ステージ１０９上に載置された標本１１０の断面１
１１に集光される。

【０１２０】このとき、第１の走査光学系１は、上記同
様に標本１１０の断面１１１の画像を検出し、モニタテ
レビジョンに映し出すので、第２の走査光学系３により
標本１１０にコヒーレント光を照射したときの動的特性
が観察できる。

【０１２１】このように上記第５の実施の形態において
は、標本１１０の任意の位置にコヒーレント光を照射す
る第２の走査光学系３の光路上に、ダイクロイックミラ
ー２５を介してポインタレーザ光源２６を設けたので、
標本１１０にコヒーレント光を照射して例えば化学反応
を起こさせる前に、コヒーレント光を照射する部位を標
本１１０の全体像の中から位置合わせの確認ができる。

【０１２２】なお、ポインタレーザ光源２６は、上記第
５の実施の形態に限らず、上記第１〜４の実施の形態に
おける第２の走査光学系３に設け、標本１１０にコヒー
レント光を照射して例えば化学反応を起こさせる部位の
確認ができる。

【０１２３】又、図１０は工業用のレーザ加工に適用し
た場合のレーザ走査顕微鏡の構成図である。第２のレー
ザ光源２ａは、例えばＣＯ₂ などのガスレーザ発振装置
が用いられ、標本に代わって被加工物１１ａがステージ
１０９上に載置されている。

【０１２４】この場合、ダイクロイックミラー２５や走
査光学ユニット４、リレーレンズ５、ダイクロイックミ
ラー２８、結像レンズ１０６、対物レンズ１０７は、レ
ーザ光源２ａのレーザ出力に耐えられるものが用いられ
る。

【０１２５】このような構成であれば、被加工物にコヒ
ーレント光を照射してレーザ加工する前に、このレーザ
加工する部分を被加工物の全体像の中から位置合わせ確
認できる。 (6) 次に本発明の第６の実施の形態について説明する。
なお、図１と同一部分には同一符号を付してその詳しい
説明は省略する。

【０１２６】図１１は本発明に係るレーザ走査顕微鏡の
構成図である。第２のレーザ光源２と第２の走査光学ユ
ニット４との間の光路上には、標本１１０に照射される
コヒーレント光の集光位置をこのコヒーレント光の光軸
方向にシフトさせる光学調整機構２０が配置されてい
る。

【０１２７】この光学調整機構２０は、第２のレーザ光
源２から出力されたコヒーレント光の光束を任意の出射
角度を持つように変換出力するもので、例えば、可動レ
ンズ２２を位置２３ａ側に移動すると、コヒーレント光
の集光位置は標本断面２９ａ側にシフトし、反対に可動
レンズ２２を位置２３ｃ側に移動すると、コヒーレント
光の集光位置は標本断面２９ｃ側にシフトする。そし
て、可動レンズ２２を位置２３ｂ付近に移動すると、コ
ヒーレント光の集光位置は標本断面２９ｂ近傍にシフト
するものとなっている。

【０１２８】次に上記の如く構成されたレーザ走査顕微
鏡の作用について説明する。なお、第１の走査光学系１
の作用は上記第１の実施の形態と同様なのでその説明は
省略し、光学調整機構２０の作用について説明する。

【０１２９】第２のレーザ光源２から発せられたコヒー
レント光は、光学調整機構２０に入射する。この光学調
整機構２０は、第２のレーザ光源２から出力されたコヒ
ーレント光の光束を、固定レンズ２１及び可動レンズ２
２の配置位置２３ａ〜２３ｃに応じて任意の出射角度を
持つように変換出力する。

【０１３０】この光学調整機構２０から任意の出射角度
で変換出力されたコヒーレント光は、走査光学ユニット
４の各走査ミラー４ａ、４ｂによって任意に偏向され、
リレーレンズ５からミラー６で光路の向きを変え、結像
レンズ７、対物レンズ８を透過し、標本１１０の断面２
９ａ〜２９ｃに集光される。

【０１３１】なお、用途に応じて、各走査ミラー４ａ、
４ｂによって標本１１０上のある範囲を走査してもよい
し、静止させてスポット的に照射させてもよい。さら
に、各走査ミラー４ａ、４ｂを瞬間的にスキップ作動さ
せることで瞬時に複数の任意の位置にスポット的に照射
させることもできる。

【０１３２】ここで、上記光学調整機構２０における可
動レンズ２２が各位置２３ａ〜２３ｃの範囲で可動する
ことで、標本１１０におけるコヒーレント光の集光位置
は、その光軸方向にシフトする。

【０１３３】例えば、可動レンズ２２を位置２３ａ側に
移動すると、コヒーレント光の集光位置は標本断面２９
ａ側にシフトし、反対に可動レンズ２２を位置２３ｃ側
に移動すると、コヒーレント光の集光位置は標本断面２
９ｃ側にシフトする。そして、可動レンズ２２を位置２
３ｂ付近に移動すると、コヒーレント光の集光位置は標
本断面２９ｂ近傍にシフトする。

【０１３４】このように上記第６の実施の形態において
は、レーザ光源２から出力されたコヒーレント光の光束
を任意の出射角度を持つように変換出力し、標本１１０
におけるコヒーレント光の集光位置をその光軸方向にシ
フトさせる光学調整機構２０を設けたので、上記第４の
実施の形態と同様に、標本１１０にレーザ光を照射する
部位と観察したい断面とが同一平面上にあるとは限らな
い場合、すなわち、ある断層の一部にレーザ光を照射
し、それとは異なる断層の画像を取得したい場合、例え
ば動脈において、その外郭の交換神経に刺激を与えたと
き、その内側の平滑筋や内皮細胞にどのような反応が生
じるかを調査する場合などがあるが、このような場合で
も光学調整機構２０の可動レンズ２２を移動させること
により、観察したい断面とレーザ光を照射する断層とが
同一平面上になくても対応でき、上記第１の実施の形態
の効果の如く、第１の走査光学系により標本画像を観察
・記録している途中に、第２の走査光学系によりコヒー
レント光を標本１１０に照射すれば、第２の走査光学系
によるコヒーレント光照射によって引き起こされる標本
１１０の動的特性（化学反応）等を調査できる。

【０１３５】なお、上記第１乃至第６の実施の形態は、
次の通り変形してもよい。例えば、上記図５に示す第４
の実施の形態に対し、上記第５の実施の形態のポインタ
レーザ光源２６を付加してもよい。

【０１３６】この場合のレーザ照射位置確認方法は、可
動レンズ２２を位置２３ｂに配置し、レーザ光を照射し
たい断層像と観察したい断層像とを記録する。ここで、
２つの断層の距離を計測する。

【０１３７】可動レンズ２２の移動量と対物レンズ１０
７出射後の結像位置が予め相関づけられていると、可動
レンズ２２の移動量が決まる。例えば、図７に示す断層
２４ｃにレーザ光を照射し、断層２４ｂの画像を取得し
ようとする場合、可動レンズ２２は位置２３ｃにあれば
よい。このとき断層２４ｃにレーザ光が結像するかどう
か確認するためには、ステージ１０９を断層２４ｂと２
４ｃの差分だけ上方向に移動させれば、ポインタレーザ
光源２６から出力されたコヒーレント光による標本１１
０の蛍光又は反射光が光電変換素子１１５により確認で
きる。この確認後は、ステージ１０９を元の位置に戻し
て測定を開始すればよい。

【０１３８】又、レーザ光源及びその走査光学系は、２
系統に限らず、複数系統備えるようにしてもよい。これ
により、例えば標本１１０の任意の位置の観察・記録
と、標本１１０の任意の位置における動的特性などを調
査とが複数箇所で行うことができる。 (7) 次に本発明の第７の実施の形態について説明する。

【０１３９】図１２は本発明に係るレーザ走査顕微鏡の
構成図である。同図において、３０は近赤外域の波長の
サブピコ秒の単色コヒーレント光パルスを発するレーザ
光源、３１は光束をコリメートする光束変換光学系、３
２は対物レンズ系、３３は標本面である。

【０１４０】又、３４は近赤外の波長域でも比較的短波
長（例えば７００ｍｍ辺り）を反射し、比較的長波長
（例えば８５０ｍｍ辺り）を透過するダイクロイックミ
ラー、３５は直進する光束、３６は直角に曲げられた光
束、３７は近赤外を透過し可視光を反射するダイクロイ
ックミラー、３８及び３９は一対のガルバノミラー、４
０は瞳投影レンズ、４１は対物レンズ系３２の像位置、
４２は結像レンズ、４３は対物レンズ、４４は検出光学
系、４５は検出光学系４４の検出器、４６は近赤外の波
長域でも比較的長波長（例えば８５０ｍｍ辺り）と可視
光を反射し，近赤外の波長域中比較的短波長（例えば７
００ｍｍ辺り）を透過するダイクロイックミラー、４７
は検出光学系４４のピンホール、４８はコンデンサーレ
ンズ、４９は近赤外カットフィルタである。

【０１４１】図１３(a)(b)は、それぞれ図１２の領域
Ａ、Ｂ及びＣにおける置き換え可能な他の光学系を示す
部分構成図である。同図(a) において５５は瞳リレー光
学系であり、同図(b) において３６は第２の近赤外レー
ザ光をコリメートした光束である。

【０１４２】又、５０、５１は光束を偏向するための近
接配置された２枚のガルバノミラー、５２は瞳投影レン
ズ、５３は対物レンズ系３２の像位置、５４は検出器で
ある。

【０１４３】次に上記の如く構成されたレーザ走査顕微
鏡の作用について説明する。近赤外域の波長のサブピコ
秒の単色コヒーレント光パルスを発するレーザ光源３０
からの光束は、光束変換光学系３１に導入され、所望の
大きさのコリメート光に変換される。

【０１４４】そのコリメート光は、近赤外の波長域でも
比較的短波長（例えば７００ｎｍ辺り）を反射し比較的
長波長（例えば８５０ｎｍ辺り）を透過するダイクロイ
ックミラー３４により直進する光束３５と直角に曲げら
れた光束３６の２光束に分けられる。

【０１４５】直進する光束３５は近赤外光を透過し可視
光を反射するダイクロイックミラー３７を透過し、近接
して配置された２枚のガルバノミラー３８、３９により
偏向させられた光束は瞳投影レンズ４０によって、結像
レンズ４２と対物レンズ４３よりなる対物レンズ系３２
の像位置４１に集光される。

【０１４６】この時、瞳投影レンズ４０により、近接し
て配置された２枚のガルバノミラー３８、３９の中間点
が対物レンズ系３２の瞳位置近傍に投影されていること
は云うまでもない。

【０１４７】対物レンズ系３２の像位置４１に集光さ
れ、ラスタースキャンされたスポットは対物レンズ系３
２により標本面３３に投影され、標本面上を微小スポッ
トとなりラスタースキャンする。

【０１４８】標本面３３で２光子（或いはそれ以上の多
光子）吸収により励起され発生した蛍光が、光路を逆進
し、ダイクロイックミラー３７で反射され検出光学系４
４に導入される。

【０１４９】この時、検出光学系４４の集光位置にピン
ホール４７を配し、所謂共焦点系とすることにより、更
に光軸方向の分解能を向上させることができ、また光学
系等からフレアなどの余分な光を除去できるため、コン
トラストも向上する。ピンホール４７は常に光路中にあ
っても構わないし、光路中に出し入れ自由でも構わな
い。また、その径は、対物レンズや使用波長に応じて可
変にすることが望ましい。

【０１５０】また、標本面３３から発した蛍光は、標本
面を挟んで対物レンズと逆側に配置されたコンデンサレ
ンズ４８と近赤外カットフィルタ４９を介し、検出器５
４で検出しても良い。検出された蛍光信号は検出器５４
により電気信号に変換され、図示しない信号処理系を経
てモニタ上に画像として表示される。

【０１５１】一方、ダイクロイックミラー３４により直
角に曲げられた光束３６は近接して配置された２枚のガ
ルバノミラー５０、５１により互いに直交する方向に偏
向される。これらのガルバノミラー５０、５１により偏
向させられた光束は瞳投影レンズ５２によって、結像レ
ンズ４２と対物レンズ４３よりなる対物レンズ系３２の
像位置５３に集光される。

【０１５２】この時、瞳投影レンズ５２により、近接し
て配置された２枚のガルバノミラー５０、５１の中間点
が対物レンズ系３２の瞳位置近傍に投影されていること
は云うまでもない。

【０１５３】２枚のガルバノミラー５０、５１により対
物レンズ系３２の像位置５３の任意の位置に集光された
スポットは像位置５３と結像レンズ４２の間に配された
近赤外の波長域でも比較的長波長（例えば８５０ｎｍ辺
り）と可視光を反射し、近赤外の波長域中比較的短波長
（例えば７００ｎｍ辺り）を透過するダイクロイックミ
ラー４６で対物レンズ系３２に導入され、標本面３３上
の任意の位置に微小スポットとして投影され、２光子
（或いはそれ以上の多光子）吸収による化学反応を起こ
す。

【０１５４】上記構成のように、近接して配置された２
枚のガルバノミラー（スキャナ）５０、５１で走査する
場合は、瞳位置はそれらの中央付近が望ましいが、どち
らかのスキャナ上にあっても良い。又、領域Ａを図１３
(a) に示すようなスキャナー間にリレー光学系５５を配
置したものに置き換えた走査光学系であっても良い。

【０１５５】又、領域Ｂを図１３(b) に示すように先に
ダイクロイックミラー３４で分割し、それらを別々の光
束変換光学系３１で所望の大きさのコリメート光３５、
３６にするような構成に置き換えても構わない。

【０１５６】なお、図１４(a)(b)及び(c) は、図１２に
示されているダイクロイックミラー３４、３７及び４６
の分光特性の一例を示す波長と透過率の関係図である。
具体的には、近赤外レーザ光の波長を７００ｎｍに設定
し、標本面上の任意の位置で２光子吸収によるケージド
試薬の解除を行わせ、次に近赤外レーザの波長を８５０
ｎｍに設定し２光子吸収による蛍光イメージングを行
う。 (8) 次に本発明の第８の実施の形態について説明する。

【０１５７】図１５は本発明に係るレーザ走査顕微鏡の
部分構成図である。なお、全体的な構成は上記第７の実
施の形態等と同じであり、走査光学系のみが異なるた
め、その部分のみ図示する。

【０１５８】５６は瞳リレー光学系であり、５７は共振
ガルバノミラーである。以下、作用について説明する。
ダイクロイックミラー３７を透過した近赤外光束は、共
振ガルバノミラー５７によりＸ方向（モニタ上で横方
向）に高速に偏向される。

【０１５９】偏向された光束は、瞳リレー光学系５６に
よりリレーされ、近接して配置された２枚のガルバノミ
ラー３８、３９によりＸ、Ｙ両方に偏向される。Ｘ、Ｙ
両方に偏向された光束は、瞳投影レンズ４０によって、
結像レンズ４２と対物レンズ４３よりなる対物レンズ系
３２の像位置４１に集光される。

【０１６０】この時、共振ガルバノミラー５７の位置は
瞳リレー光学系５６により近接して配置された２枚のガ
ルバノミラー３８、３９の中間点に投影され、更にこの
位置が瞳投影レンズ４０により、対物レンズ系３２の瞳
位置近傍に投影されていることは云うまでもない。

【０１６１】ここで、２光子（或いはそれ以上の多光
子）吸収により励起され発生した蛍光を画像として高速
に捉える時は、共振ガルバノミラー５７とＹ方向のガル
バノミラー３９を用いて走査し、Ｘ方向のガルバノミラ
ー３８は固定しておく。これにより、遅くともビデオレ
ート以上の速さで画像を得ることができる。

【０１６２】他方、画像が暗く低速で走査したい場合、
或いは標本面上の任意の位置で２光子（或いはそれ以上
の多光子）吸収による化学反応を起こさせたい場合は、
共振ガルバノミラー５７は固定し、Ｘ、Ｙ両方向のガル
バノミラー３８、３９で走査する。

【０１６３】本実施の形態では高速スキャナとして共振
ガルバノミラーを挙げているが、音響光学素子（ＡＯ
Ｄ）やポリゴンミラーを用いても良い。但し、これらの
高速スキャナのうち、音響光学素子は波長依存性がある
ため試料に照射された光の波長と、蛍光のように試料か
ら発する光の波長とが異なるような場合には波長依存性
に起因する問題を考慮しなければならない。また、ポリ
ゴンミラーは走査方向において、走査幅や走査中心を制
御できないためランダム走査の用途には使用できない。
何れの場合もこれらの高速スキャナは任意の偏向方向に
スキャナを制御することが不可能であるため、ランダム
スキャンの用途には使えない。

【０１６４】本実施の形態の構成を採れば、用いるスキ
ャナを切り換えるだけで、高速のイメージングと低速の
イメージング或いはランダムアクセスを行うことができ
る。尚、３次元像の構築や３次元内でのランダムアクセ
スにはステージ上下或いは対物レンズ上下による光軸方
向の走査（Ｚ走査）を併用することは云うまでもない。
また、低速イメージングやランダムアクセスには、既知
の手法であるが、光束スキャンによる走査ではなく、ス
テージ或いは対物レンズのスキャンによる走査という手
法もあることを付記しておく。

【０１６５】上記何れの実施の形態も、これらの構成に
限定されるものではなく、複数のレーザと走査光学系等
の様々な組み合わせで構成できることは云うまでもな
い。また、一般のレーザ走査顕微鏡と同様、複数の検出
器で検出された信号を画像処理し、特殊な効果を得るこ
とができることも云うまでもない。

【０１６６】

【発明の効果】本発明の請求項１〜５によれば、標本画
像を観察・記録しながら標本の所望の位置にレーザ光を
照射し、標本の動的特性などを調査できるレーザ走査顕
微鏡を提供できる。

【０１６７】又、本発明の請求項４、５によれば、レー
ザ光を照射する部位と画像を取得する断面とが標本内で
選択できるレーザ走査顕微鏡を提供できる。又、本発明
の請求項６によれば、複数のレーザや走査光学系等を組
み合わせることにより、実用上有効なシステムを構築す
ることが可能で、又高速イメージグと３次元ランダムア
クセスも簡単な切り換えで可能となり、かつ検出器のレ
イアウトの自由度の大きな多光子吸収レーザ走査顕微鏡
を提供できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に係るレーザ走査顕微鏡の第１の実施の
形態を示す構成図。

【図２】本発明に係るレーザ走査顕微鏡の第２の実施の
形態を示す構成図。

【図３】同顕微鏡に用いられるダイクロイックミラーの
透過率波長特性を示す図。

【図４】本発明に係るレーザ走査顕微鏡の第３の実施の
形態を示す構成図。

【図５】本発明に係るレーザ走査顕微鏡の第４の実施の
形態を示す構成図。

【図６】同顕微鏡に用いられる光学調整機構の具体的な
構成図。

【図７】同光学調整機構による結像面のシフトを示す模
式図。

【図８】本発明に係るレーザ走査顕微鏡の第５の実施の
形態を示す構成図。

【図９】同顕微鏡に用いられるダイクロイックミラーの
透過率波長特性を示す図。

【図１０】同顕微鏡をレーザ加工に適用した場合の構成
図。

【図１１】本発明に係るレーザ走査顕微鏡の第６の実施
の形態を示す構成図。

【図１２】本発明に係るレーザ走査顕微鏡の第７の実施
の形態を示す構成図。

【図１３】同顕微鏡における各領域に置き換え可能な光
学系を示す図。

【図１４】同顕微鏡に用いられるダイクロイックミラー
の透過率波長特性を示す図。

【図１５】本発明に係るレーザ走査顕微鏡の第８の実施
の形態を示す構成図。

【図１６】従来のレーザ走査顕微鏡の構成図。

【符号の説明】

１…第１の走査光学系、 ２，２ａ…第２のレーザ光源、 ３…第２の走査光学系、 ４…走査光学ユニット、 ５…リレーレンズ、 ６…ミラー、 ７…結像レンズ、 ８…対物レンズ、 ９…検出光学系、 １０…ダイクロイックミラー、 １１…検出光学系、 １２…コントロールユニット、 １３…ダイクロイックミラー、 １４…測光フィルタ、 １５…レンズ、 １６…ピンホール、 １７…光電変換素子、 １８…コンピュータ、 １９…モニタテレビジョン、 ２０…光学調整機構、 ２１…固定レンズ、 ２２…可動レンズ、 ２５…ダイクロイックミラー、 ２６…ポインタレーザ光源、 ２７，２８…ダイクロイックミラー、 ３０…レーザ光源、 ３１…光束変換光学系、 ３２…対物レンズ系、 ３３…標本面、 ３４，３７…ダイクロイックミラー、 ３８，３９…ガルバノミラー、 ４０…瞳投影レンズ、 ４２…結像レンズ、 ４３…対物レンズ、 ４４…検出光学系、 ４５…検出器、 ４６…ダイクロイックミラー、 ４７…ピンホール、 ４８…コンデンサレンズ、 ４９…赤外カットフィルタ、 ５０，５１…ガルバノミラー、 ５２…瞳投影レンズ、 ５４…検出器、 ５５…リレー光学系、 ５６…瞳リレー光学系、 ５７…共振ガルバノミラー、 １００…第１のレーザ光源、 １１０…標本、 １０１…ダイクロイックミラー、 １０２…走査光学ユニット、 １０２ａ，１０２ｂ…走査ミラー、 １０３…リレーレンズ、 １０４…ミラー、 １０５…ダイクロイックミラー、 １０６…結像レンズ、 １０７…対物レンズ、 １０８…ダイクロイックミラー、 １０９…ステージ、 １１０…標本、 １１３…レンズ、 １１４…ピンホール、 １１２…測光フィルタ、 １１５…光電変換素子。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 レーザ光源から出力されたコヒーレント
   光を標本面上に走査したときの前記標本からの透過光、
   反射光又は前記標本に発生する蛍光を検出するレーザ走
   査顕微鏡において、 前記レーザ光源から出力されたコヒーレント光をそれぞ
   れ個別に標本面上に対して走査する複数の走査光学系、 を具備したことを特徴とするレーザ走査顕微鏡。
2. 【請求項２】 前記複数の走査光学系により走査された
   前記各コヒーレント光を１つの対物レンズを通して前記
   標本面上で走査させることを特徴とする請求項１記載の
   レーザ走査顕微鏡。
3. 【請求項３】 前記複数の走査光学系を走査制御する１
   つの制御系を備えたことを特徴とする請求項１記載のレ
   ーザ走査顕微鏡。
4. 【請求項４】 前記標本に照射される前記コヒーレント
   光の集光位置を前記コヒーレント光の光軸方向にシフト
   させる光学調整機構を備えたことを特徴とする請求項
   １、２又は３記載のレーザ走査顕微鏡。
5. 【請求項５】 前記標本に照射される前記コヒーレント
   光の集光位置に一致させて位置確認用の光を前記標本に
   照射する位置確認用光学系を備えたことを特徴とする請
   求項１、２、３又は４記載のレーザ走査顕微鏡。
6. 【請求項６】 近赤外域の波長のサブピコ秒の単色コヒ
   ーレント光パルスを発するレーザ光源と、このレーザ光
   源から発せられたレーザ光を標本面上に集光させる対物
   レンズ系とを含むレーザ走査顕微鏡において、 前記レーザ光源からの光束を所望の大きさに変える少な
   くとも一つの光束変換光学系と、光路を２つに分割或い
   は光路を切り換える光路分割手段とを備えていて、前記
   光路分割手段を通った第１の光路上には、前記対物レン
   ズ系の像面に集光し走査させる第１の走査光学系と、前
   記標本面上に集光された集光スポットにより励起されて
   発する蛍光を検出する検出光学系とを具備し、前記光路
   分割手段を通った第２の光路上には、前記対物レンズ系
   の像面に集光し走査させる第２の走査光学系と、前記集
   光スポットを前記対物レンズ系に入射させる光路結合手
   段とを具備していて、前記対物レンズ系を前記第１及び
   第２の光路で共用するようにしたことを特徴とするレー
   ザ走査顕微鏡。