JP2006030988A - レーザ走査型顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】１台の走査型顕微鏡において、特性の異なった複数のスキャナを使用可能とする。
【解決手段】顕微鏡、特にレーザ走査型顕微鏡であって、対物レンズＯの瞳Ｐに配置されており、少なくとも１個の反射する第１の部分と少なくとも１つの通過させる第２の部分とからなり、反射する部分は照明光を結合する役目をし、また通過させる部分は検出する方向への検出光の通路の役目をする、あるいは通過させる部分は照明光を結合する役目をし、反射する部分は検出光を分離する役目をするようなビームスプリッタＳＴを通る試料ＰＲの照明と第１のスキャン装置ＳＣとを備え、その際に検出光路に少なくとも照明および検出用のもう１つのスキャン装置を挿入するための手段を備える。
【選択図】図１

Description

ＤＥ １０２５７２３７ Ａ１にはビームスプリッタ特にラインスキャナについて記載している。
ラインスキャナの場合、試料に線状の焦点（たとえばＸ軸に沿って）が当てられ、試料はこの線と垂直のＹ軸方向に移動する。そのために光源を光学系によって顕微鏡装置の中間像面に線状に合焦させる。たとえば円柱レンズを用いて中間像においてＹ方向に焦点を合わせることにより、試料上にＸ方向に沿って回折限界による線状の強度分布が生じる。さらなる光学系により光は顕微鏡装置の瞳に結像する。その際に顕微鏡装置の瞳面に線状の焦点が生じる。瞳面とスキャナは互いに、また対物レンズの後方の焦点面に対して、共役の顕微鏡瞳面であり、したがってスキャナは線状で回折限界により合焦した強度分布をそれに対して垂直に（試料のＹ方向に）動かすことができる。試料への結像はスキャン光学系、鏡筒レンズ、対物レンズにより行われる。中継光学系は顕微鏡装置の共役瞳面を作る。試料の相互作用の性質の故に、たとえば蛍光励起あるいはルミネセンス励起の場合に、試料から放出される光は空間的コヒーレンスが少ない。すなわち試料において励起された各点が隣の点とは本質的に独立して点光源としてあらゆる方向に放射する。光学系（たとえば顕微鏡の対物レンズ）は鏡筒レンズＴＬと共に顕微鏡装置の中間像面ＺＢに個々の点光源を結像する。その際に瞳Ｐは本質的にインコヒーレントな、様々な拡散方向を持つ波面により均等に照射される（波線で示した光路）。瞳には検出光から励起光を分離する素子がある。光路はＤＥで記述するように構成されている。
ＤＥ １０２５７２３７Ａ１

図１では、広視野の光源ＬＱの光は線状の照明の発生に適した光学系、たとえば円柱レンズＺＬを用いて、顕微鏡対物レンズＯの瞳Ｐに共役な平面上に線状に合焦する。公開されているＤＥ １０２５７２３７Ａ１に記載されているように、これには細い線状の伝送領域を有するビームスプリッタＳＴが組み込まれており、それを通って線が伝送光学系Ｌ１、Ｌ２、スキャン光学系ＳＯ、鏡筒レンズＴＬ、対物レンズＯを経由して試料ＰＲに結像する。瞳ＰにはスキャナＳＣが配置されており、このスキャナは線を試料上で線の延びる方向とは垂直のスキャン方向に迅速に動かす。
試料から来る光（破線で示す）は、細い伝送領域に至るまで検出方向に反射するビームスプリッタにより、交換可能なフィルタＦならびに検出光学系ＰＯを通って検出器ＤＥ１の方向に偏向される。検出器にはスリットダイヤフラムを配置しておくこともできる。

図２では、例として図１に示した要素に追加して結合ポート光源ＬＱ１およびＬＱ２が表示されている。これらの光源はまた分岐してそれぞれに波長と強度を適切に設定した個別の光源として使うこともできる。
ＤＥ…に記載のように色収差のないビームスプリッタを用いることにより、ＬＱ１およびＬＱ２の両方の光源に同じ波長を使うことができ、割当てによって１個の同じ光源を形成することができる、という利点がある。中間像ＺＢとＺＢ１は互いに共役な平面である。さらに顕微鏡装置の瞳面Ｐは互いに共役な平面である。各共役平面はそれぞれの間にある光学系（中継光学系として働く、光路は単純化して描かれている）の作用によって作られる。

ＬＱ２は、たとえばポイントスキャナである。ポイントスキャナの照明光は目的とする操作（たとえばアンケージング）のために試料の特定の場所に当てることができる利点がある。
ＬＱ２の照明光は別のスキャン光学系ＳＯ２およびスキャナＳＣ１（Ｘ／Ｙスキャナが好適である）を通ったあと、通常の２色性のカラースプリッタＦＴ１を経由してラインスキャナの検出光路に挿入され、スプリッタＳＴの反射領域を通って試料ＰＲの方向に向かう。
ビームスプリッタＳＴの反射領域をもうひとつのスキャン光路の構成に使える利点がある。
試料から来る光は一方では検出器ＤＥ１に、また他方ではカラースプリッタＦＴ１の設計によってもうひとつのカラースプリッタＦＴ２を通って第２の検出器ＤＥ２の方向に向かう。
たとえば試料から来る光はＬＱ１によって励起された蛍光により、そのようにＦＴ１が設計されている場合は検出器ＤＥ１に到達し、一方でポイントスキャナＬＱ２の反射光は検出器ＤＥ２に到達する。
さらにまたＬＱ１およびＬＱ２により励起された様々な波長の蛍光は別々の検出器ＤＥ１とＤＥ２に到達できる。

スキャナＳＣ１により動かされた光がここでさらにスキャナ１により動かされるので、スキャナＳＣ１を、スキャナＳＣの動きを補償するように、またさらに線照明のための相対位置を実現するように、操作する必要がある。
これはスキャナＳＣ１がスキャナＳＣ２に比べてゆっくり動く場合は容易に実現できる。
ＬＱ２によって励起された蛍光はまたライン検出器ＤＥ１に導くことができる。
スキャナ２の位置に従って蛍光スポットはライン検出器ＤＥ１の上に逸れて移動する。つまり光はその場合スキャナ２の前でＤＥ１の方向に分離される。

図３には、結合部ＫＳ１があり、これは切り離したモジュールでも良く、鏡筒レンズと対物レンズの付いた顕微鏡スタンドＳと第１のスキャンユニットＳＣ１と第２のスキャンユニットＳＣ２との間にある。
ＳＣ１はすでに述べたラインスキャナを含んでいても良く、またＳＣ２はスポットスキャンおよび操作あるいはそのいずれかのためのポイントスキャナを含んでいても良い。
ＳＣ１とＳＣ２はインタフェースのところでＫＳ１に結合できる。
さらにＫＳ１ではいくつかの互いに共役な中間像ＺＢが利用できる（光学系Ｌ１、Ｌ２を経由して）。
それぞれの共役な平面はその間にある光学系の作用により形成される（光路は単純化してある）。

ビームスプリッタＳＴと同様に構成されている（ＤＥ…）ビームスプリッタＳＴ１において、伝送領域を通って線が試料上に結像される。ここでビームスプリッタＳＴ１は顕微鏡装置の瞳面に配置されている。
たとえば蛍光のようにＳＣ１によって試料で励起された光はＳＴ１において下方に反射され、その光の一部分を通すように構成されているＦＴ３を通って、また何度も偏向するリフレクタＲＦを経由してＳＴ１の他の側に到達する。この光はＳＴ１によりＳＴを通って検出器ＤＥ１の方向に偏向される。
ラインスキャナにより励起され、ＳＴ１で側方に反射される蛍光が全幅で再びＤＥ１の方向の光路に向けられる利点がある。
ＦＴ３を通してもうひとつのスキャナＳＣ２を利用することができ、その際にＦＴ３、これは交換可能であってもよい、の設計に対応して様々な波長の蛍光がＤＥ１および／またはＤＥ２に到達できる。使用法は上記と同様である。
図２とは違ってここではスキャナ１と２は互いに独立して動作することができる利点がある。

図４では、光は図３のようにリフレクタＲＦによってビームスプリッタＳＴ１の裏側に偏向されるのではなく、スキャナＳＣ３３の裏側に偏向される。ＳＣ３３はここでは表側および裏側に金属被膜を付けたミラーであり、その裏側で試料から来るラインスキャナ（ＬＱ１はスキャナのミラーの表側に上から到達する）で励起された試料光（スキャンした）を検出器ＤＥ１に導く。ここではＦＴ３は検出器ＤＥ１に向けられた光を通し、ＤＥ２に向けられた光だけを反射するように構成されている。これによってまたしてもラインスキャナとポイントスキャナにより励起された様々な蛍光を同時に検出できる利点がある。

図５では、図４のようにラインスキャナで励起された光はスキャンされず、ＦＴ１を通って直接に平面型検出器（ＣＣＤマトリックス、ゲーテッドカメラ）に到達する。つまり試料から来る線状の光分布はこれによって試料像を描く受像面の上をスキャン方向に移動する。

いずれの配置においても原理的に縦続（追加のカラースプリッタＦＴを共通の光路に配置する）によって追加のスキャン装置を利用することができる。スキャン装置は像を造る任意の装置で良い。例では既に述べたポイントスキャナであるが、これは共振ポイントスキャナ、ニプコフスキャナ、ラインスキャナ、マルチポイントスキャナでも良い。さらにこれはまた広視野ベースの顕微鏡システムであってもよい。その場合の利点はインタフェースとして中間像平面を有することである。

広視野の光源ＬＱの光は線状の照明の発生に適した光学系 図１に追加して結合ポート光源ＬＱ１およびＬＱ２が示されている 顕微鏡スタンドＳとラインスキャナとの間に結合部ＫＳ１がある。 光がスキャナＳＣ３３の裏側に偏向される。 ラインスキャナで励起された光はスキャンされず、ＦＴ１を通って直接に平面型検出器（ＣＣＤマトリックス、ゲーテッドカメラ）に到達する。

符号の説明

ＴＬ 鏡筒レンズ
ＺＢ 中間像面
ＺＬ 円柱レンズ
Ｐ 瞳
Ｏ 対物レンズ
ＰＲ 試料
Ｆ フィルタ
ＳＴ 無色収差カラースプリッタ
ＬＱ 光源
ＳＣ Ｐ／スキャナ
ＤＥ１ 検出器
Ｓ スタンド
ＫＳ 結合部

Claims (4)

1. 顕微鏡、特にレーザ走査型顕微鏡であって、
   対物レンズの瞳に配置されており、少なくとも１個の反射する第１の部分と少なくとも１個の通過させる第２の部分とからなり、反射する部分は照明光を結合する役目をし、また通過させる部分は検出する方向への検出光の通路の役目をする、あるいは通過させる部分は照明光を結合する役目をし、反射する部分は検出光を分離する役目をするようなビームスプリッタを通る試料の照明と
   第１のスキャン装置とを備え、その際に検出光の光路に少なくとも照明および検出用のもう１つのスキャン装置を挿入するための手段を備えている顕微鏡。
2. 顕微鏡であって、対物レンズの瞳に配置されており、少なくとも１個の反射する第１の部分と少なくとも１個の通過させる第２の部分とからなり、反射する部分は照明光を結合する役目をし、また通過させる部分は検出する方向への検出光の通路の役目をする、あるいは通過させる部分は照明光を結合する役目をし、反射する部分は検出光を分離する役目をするようなビームスプリッタを通る試料の照明と
   第１のスキャン装置とを備え、その際にビームスプリッタを通して少なくとももう１つのスキャン装置が結合されており、また偏向手段を通して試料光の一部の偏向をビームスプリッタの試料から離反した側に行い、それによって試料光が最初のスキャン装置の検出ユニットの方向に向うように構成されている顕微鏡。
3. 顕微鏡であって、対物レンズの瞳に配置されており、少なくとも１個の反射する第１の部分と少なくとも１個の通過させる第２の部分とからなり、反射する部分は照明光を結合する役目をし、また通過させる部分は検出する方向への検出光の通路の役目をする、あるいは通過させる部分は照明光を結合する役目をし、反射する部分は検出光を分離する役目をするようなビームスプリッタを通る試料の照明と
   少なくとも１個のスキャンミラーを有する第１のスキャン装置とを備え、その際にビームスプリッタを通して少なくとももう１つのスキャン装置が結合されており、偏向手段によって少なくとも試料光の一部がスキャンミラーの金属被膜を施した裏側に偏向されてそこから検出の方向に向うように構成されている顕微鏡。
4. 顕微鏡であって、対物レンズの瞳に配置されており、少なくとも１個の反射する第１の部分と少なくとも１個の通過させる第２の部分とからなり、反射する部分は照明光を結合する役目をし、また通過させる部分は検出する方向への検出光の通路の役目をする、あるいは通過させる部分は照明光を結合する役目をし、反射する部分は検出光を分離する役目をするようなビームスプリッタを通る試料の照明と
   第１のスキャン装置とを備え、ビームスプリッタを通して少なくとももう１つのスキャン装置が結合されており、通過路のないビームスプリッタを通った試料光がスキャナにより検出されるように構成されている顕微鏡。