JP2008164719A - 走査型共焦点顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】複数の光源を分けて装置本体部に入射させたり、装置納入後に光源を追加することが容易な走査型共焦点顕微鏡を提供する。
【解決手段】光源部１にはレーザダイオード４、Ａｒレーザ５、固体レーザ６、レーザダイオード７の４台のレーザ光源が搭載されており、これらの光源から発せられたレーザ光はミラー１２、ダイクロイックミラー１３〜１５を介して合成され、ファイバカプラ２によりシングルモードの光ファイバ３に導入される。一方、光源部２１には、レーザダイオード２４とＨｅ−Ｎｅレーザ２５の２台のレーザ光源が搭載されており、同様にミラー２６、ダイクロイックミラー２７を介して合成され、ファイバカプラ２２によりシングルモードの光ファイバ２３に導入される。２本の光ファイバ３、２３の他端は本体側に装備されている光導入口３２、３３に装着される。光導入口３２、３３に導入されたレーザ光は入射切り替え部３４に導入される。
【選択図】 図１

Description

本発明は走査型共焦点顕微鏡に関するものである。

走査型共焦点顕微鏡は、広く使用されており周知のものであるが、その一例が例えば特開２００２−２６７９３３号公報（特許文献１）に記載されている。このような走査型共焦点顕微鏡の概要を以下に示す。

光源から出射された直線偏光のレーザ光は偏波面保存型の光ファイバに導入される。光ファイバの他端は装置本体に備わる光入射口に結合されている。光入射口の光ファイバ端から出射されたレーザ光はビームエキスパンダで拡大され、偏光ビームスプリッタに入射後、２つのガルバノメータ等で構成された走査ユニットに導かれる。走査ユニットで２次元的に走査されたレーザ光（照明光）は対物レンズで標本上に集光される。

標本から反射されたレーザ光（信号光）は照明光と逆の順路を通り、走査ユニットでデスキャニング（走査されていない状態）され偏光ビームスプリッタに入射する。

この前記信号光はλ／４板を２回通過することにより偏光方向が９０°回転されるため偏光ビームスプリッタで反射され、集光レンズに入射する。

集光レンズで集光された信号光は集光レンズの焦点位置に配置された遮光板上の開口を通過し、対物レンズの焦点位置近傍からの光だけとなって光電検出素子で受光される。

光電検出素子からの輝度信号はＡ／Ｄ変換器でデジタル信号に変換される。ＣＰＵでは走査位置に対応したサンプリングクロックでＡ／Ｄ変換器からの輝度データを受け取り、画像を構成する。
特開２００２−２６７９３３号公報

ところで上述の走査型共焦点顕微鏡が蛍光検出を目的として使われた場合、多種類の蛍光試薬・蛋白を観察するために多種類（多波長）のレーザ光源が使われ、そのレーザ光の合成、および励起光（照明光）と蛍光（信号光）分離用のダイクロイックミラーを複数装備し、観察に応じてそれらを切り替える必要がある。

そのため従来の走査型共焦点顕微鏡では光源部で全てのレーザ光を１本の光ファイバに導入し、装置本体にある１個の光入射口に導入していた。

しかしながら本体側の光入射口が１個のみのため、全てのレーザ光を１本の光ファイバに導入させる必要があり、光源部が大型化すると云った問題が生じてしまう。また、装置納入後にレーザ光源を追加する場合には光源部に改造等が必要となる場合もある。

本発明はこのような事情に鑑みてなされたもので、複数の光源を分けて装置本体部に入射させたり、装置納入後に光源を追加することが容易な走査型共焦点顕微鏡を提供することを課題とする。

前記課題を解決するための第１の手段は、照明光学系に対して被検物である試料と共役な位置に置かれ、照明光束を射出する光源と、前記照明光束を反射し前記試料から放出される蛍光を透過するか、又は前記照明光束を透過し前記蛍光を反射する光分離手段と、前記照明光束を、前記試料を２次元走査する走査光に変え、前記蛍光を非走査光に変える走査手段と、前記走査手段と前記試料との間に配置され、前記試料面に後側焦点を有する対物レンズと、前記対物レンズの焦点面と共役な位置に蛍光を集光させる集光レンズと、前記集光レンズの集光面に設けられたピンホール板と、前記ピンホール板のピンホールを通過した蛍光を観察する観察手段とを備えた走査型共焦点顕微鏡であって、前記光源を１個又は複数個有する光源部からの光の入射口を複数個備え、複数の光源部を使用可能としたことを特徴とする走査型共焦点顕微鏡である。

前記課題を解決するための第２の手段は、前記第１の手段であって、前記光の入射口からの光を選択的に分離、合成するための光学部材を有し、切り替え時に生じる前記集光レンズの結像位置ずれを、予め記憶しておいた補正値をもとに、前記集光レンズ位置を自動的に調整することにより補正する機能を有することを特徴とするものである。

前記課題を解決するための第３の手段は、前記第２の手段であって、前記集光レンズを光軸と直交する方向に移動させる手段を備えていることを特徴とするものである。

本発明によれば、複数の光源を分けて装置本体部に入射させたり、装置納入後に光源を追加することが容易な走査型共焦点顕微鏡を提供することができる。

以下、本発明の実施の形態の例を、図を用いて説明する。図１は、本発明の実施の形態である走査型共焦点顕微鏡の光学系の概要を示す図である。光源部１にはレーザダイオード４、Ａｒレーザ５、固体レーザ６、レーザダイオード７の４台のレーザ光源が搭載されており、これらの光源から発せられたレーザ光はミラー１２、ダイクロイックミラー１３〜１５を介して合成され、ファイバカプラ２によりシングルモードの光ファイバ３に導入される。

一方、光源部２１には、レーザダイオード２４とＨｅ−Ｎｅレーザ２５の２台のレーザ光源が搭載されており、同様にミラー２６、ダイクロイックミラー２７を介して合成され、ファイバカプラ２２によりシングルモードの光ファイバ２３に導入される。

２本の光ファイバ３、２３の他端は本体側に装備されている光導入口３２、３３に装着される。光導入口３２、３３に導入されたレーザ光は入射切り替え部３４に導入される。入射切り替え部３４にはミラー３５、ダイクロイックミラー３６、ダミーガラス３７の３枚の光学部材が装着され、電動で切り替えることが可能である。

入射切り替え部３４のダイクロイックミラー３６の分光特性は、光源部１からのレーザ光を透過し、光源部２１からのレーザ光を反射するように作られている。よって、入射切り替え部３４においては、光源部１からのレーザ光のみを使用したい場合は、ダミーガラス３７を光路に挿入し、光源部２１からのレーザ光のみを使用したい場合はミラー３５を光路に挿入し、光源部１、光源部２１からのレーザ光を両方使用したい場合は、ダイクロイックミラー３６を光路に挿入する。ダミーガラス３７は光源部１のみのレーザ光を使う場合、ダイクロイックミラー３６使用時における光軸とを合わせるためにあるものであり、分光特性は有しない。

入射切り替え部３４を通過したレーザ光は、ビームエキスパンダ３８で拡大され、励起光・信号光（蛍光）分離用ダイクロイックミラー部３９で反射される。励起光・信号光（蛍光）分離用ダイクロイックミラー４０、４１の分光特性は励起レーザ光の波長を反射し、他の波長は透過するように作られており、観察する蛍光試薬・蛋白に対応した分光特性のものが複数装着されている。励起光・信号光（蛍光）分離用ダイクロイックミラー４０、４１も入射切り替え部３４のミラー３５、ダイクロイックミラー３６、ダミーガラス３７と同様に、電動で切り替えることが可能である。

励起光・信号光（蛍光）分離用ダイクロイックミラー４０、４１を反射したレーザ光は２つのガルバノメータで構成された走査部４２に導入され、２次元的に走査される。２次元的に走査されたレーザ光は走査光学系４３を通り、対物レンズ４４によって標本４５上に結像される。

標本４５上の照射領域から発した蛍光は対物レンズ４４で集められ、励起光と逆の順路を進み、分離用ダイクロイックミラー４０、４１に入射する。蛍光はダイクロイックミラーを透過し、集光レンズ４６で開口４８を有する遮光板４７上に集光される。遮光板４７上の開口４８を通過した光のみが光検出器４９で検出され、Ａ／Ｄ変換器５１を介してＣＰＵ５２に入力され輝度データとして使われる。ＣＰＵ５２は、この輝度データより２次元画像データを作成し、表示部５３に表示する。

ところで、入射切り替え部３４の光学部材、又は、励起光・信号光（蛍光）分離用ダイクロイックミラー部３９を切り替えるごとに光学部材自身の角度精度、装置の切り替え精度に起因する角度誤差により、集光レンズ４６の焦点位置が遮光板４７上の開口４８中心と一致しなくなると云う問題が生じてしまう。

これを補正するために、本実施の形態の集光レンズ４６は、光軸と直行する方向に電動で移動できる機構を備えている。そのため各ポジションでの集光位置のズレ量を装置出荷前に求め、その補正値をＣＰＵ５２に記憶させておくことで、本体部３１の切り替え可能な光学部材がどのポジションであっても集光レンズ４６の焦点位置が遮光板４７上の開口中心と一致している、すなわち、常に共焦点の関係が成立し、かつ、光量ロスのない共焦点顕微鏡とすることができる。

又、２つの光導入口３２、３３を有するので、例えば、出荷当時には光導入口３２のみを使用するようにしておき、光源の増設が可能になった場合には、光導入口３３を使用することにより、光源部１の改造や、本体部３１の改造をせず、光源の増設を行うことができる。さらに、１つの光源部を大きくしなくても、２つに分けて、２つの光導入口３２、３３から導入するようにすることができる。

本発明の実施の形態である走査型共焦点顕微鏡の光学系の概要を示す図である。

符号の説明

１…光源部、２…ファイバカプラ、３…光ファイバ、４…レーザダイオード、５…Ａｒレーザ、６…固体レーザ、１０…ＮＤフィルタ、１１…シャッタ、１２…ミラー、１３…ダイクロイックミラー、１４…ダイクロイックミラー、１５…ダイクロイックミラー、２１…光源部、２２…ファイバカプラ、２３…光ファイバ、２４…レーザダイオード、レーザ２５…Ｈｅ−Ｎｅレーザ、２６…ミラー、２７…ダイクロイックミラー、３１…本体部、３２…光導入口、３３…光導入口、３４…入射切り替え部、３５…ミラー、３６…ダイクロイックミラー、３７…ダミーガラス、３８…ビームエキスパンダ、３９…分離用ダイクロイックミラー部、４０…分離用ダイクロイックミラー、４１…分離用ダイクロイックミラー、４２…走査部、４３…走査光学系、４４…対物レンズ、４５…標本、４６…集光レンズ、４７…遮光板、４８…開口、４９…光検出器、５１…Ａ／Ｄ変換器、５２…ＣＰＵ、５３…表示部

Claims (3)

1. 照明光学系に対して被検物である試料と共役な位置に置かれ、照明光束を射出する光源と、
   前記照明光束を反射し前記試料から放出される蛍光を透過するか、又は前記照明光束を透過し前記蛍光を反射する光分離手段と、
   前記照明光束を、前記試料を２次元走査する走査光に変え、前記蛍光を非走査光に変える走査手段と、
   前記走査手段と前記試料との間に配置され、前記試料面に後側焦点を有する対物レンズと、
   前記対物レンズの焦点面と共役な位置に蛍光を集光させる集光レンズと、
   前記集光レンズの集光面に設けられたピンホール板と、
   前記ピンホール板のピンホールを通過した蛍光を観察する観察手段とを備えた走査型共焦点顕微鏡であって、
   前記光源を１個又は複数個有する光源部からの光の入射口を複数個備え、複数の光源部を使用可能としたことを特徴とする走査型共焦点顕微鏡。
2. 請求項１に記載の走査型共焦点顕微鏡であって、前記光の入射口からの光を選択的に分離、合成するための光学部材を有し、切り替え時に生じる前記集光レンズの結像位置ずれを、予め記憶しておいた補正値をもとに、前記集光レンズ位置を自動的に調整することにより補正する機能を有することを特徴とする走査型共焦点顕微鏡。
3. 請求項２に記載の走査型共焦点顕微鏡であって、前記集光レンズを光軸と直交する方向に移動させる手段を備えていることを特徴とする走査型共焦点顕微鏡。

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