WO2020196783A1 - 共焦点顕微鏡ユニット及び共焦点顕微鏡 - Google Patents

共焦点顕微鏡ユニット及び共焦点顕微鏡 Download PDF

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fluorescence
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confocal microscope
mirror
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慈郎 山下
康行 田邊
俊輔 松田
寺田　浩敏
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浜松ホトニクス株式会社
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Definitions

  • the present disclosure relates to a confocal microscope unit and a confocal microscope that constitute a confocal microscope.
  • a confocal microscope capable of obtaining an optical tomographic image of an observation target specimen with high resolution.
  • a microscope connection port connected to a microscope, a stimulation unit that irradiates a sample with light, an observation unit that detects light emitted from the sample, a microscope, a stimulation unit, and an observation unit are described.
  • a microscope connection unit including an optical path synthesizer that synthesizes optical paths that are optically connected is disclosed.
  • This microscope connection unit uses the same optical system that guides light emitted from multiple light sources, a dichroic mirror for detecting the fluorescence generated in response to each of multiple wavelengths, a confocal pinhole, and a photomultiplier tube. It is held in the observation unit of. In such a configuration, by using excitation light of a plurality of wavelengths and detecting the fluorescence generated accordingly, imaging in a plurality of wavelength regions can be realized with the same device.
  • the positions of the light source that outputs the excitation light and the diaphragm member that limits the fluorescence light beam are coupled to the dichroic mirror that separates the excitation light and the fluorescence. It was necessary to install it in a position, and it took time and effort to adjust the optical of this conjugate position.
  • the embodiment has been made in view of such a problem, and by providing the dichroic mirror with a unit in which the positions of the light source for outputting the excitation light and the diaphragm member for limiting the luminous flux of fluorescence are set at the conjugate positions.
  • An object of the present invention is to provide a confocal microscope unit capable of easily performing confocal imaging at a plurality of wavelengths.
  • the cofocal microscope unit is a cofocal microscope unit that constitutes a cofocal microscope by being attached to a connection port of a microscope having a microscope optical system, and outputs a first excitation light.
  • a light source a first aperture member that limits the light beam of the first fluorescence generated from the sample to be observed in response to the first excitation light, and a first aperture member that detects the first fluorescence that has passed through the first aperture member.
  • a scan lens that guides the formed fluorescence to the scan mirror, and a main housing that is configured to be attached to a connection port and has the scan mirror, scan lens, first subsystem, and second subsystem fixed
  • the first subsystem has a first beam splitter that reflects the first excitation light and the first fluorescence and transmits the second excitation light and the second fluorescence.
  • the first excitation light output from the first subunit is reflected on the first beam splitter and then scanned onto the sample via the scan mirror and scan lens, and accordingly.
  • the first fluorescence generated from the sample passes through the scan lens and the scan mirror, and then reflects into the first beam splitter to enter the first subunit, and the first in the first subunit.
  • the image is tied to the diaphragm member of No. 1 and detected by the first light detector.
  • the second excitation light output from the second subunit passes through the first beam splitter in the first subunit and then is scanned onto the sample via the scan mirror and scan lens.
  • the second fluorescence generated from the sample passes through the first beam splitter via the scan lens and the scan mirror and then enters the second subunit, and then enters the second subunit.
  • the image is formed on the second diaphragm member of the above and is detected by the second photodetector.
  • the optical system of the light source and the diaphragm member in units of the first and second subunits are used. It is possible to set the positional relationship of. As a result, it is possible to improve the accuracy of imaging in a plurality of wavelength regions while facilitating the setting work.
  • another embodiment of the present disclosure is a confocal microscope comprising the above-mentioned confocal microscope unit and a microscope having a microscope optical system and a connection port to which the confocal microscope unit is attached. According to such a confocal microscope, confocal imaging at a desired excitation wavelength and fluorescence wavelength can be easily performed.
  • FIG. 1 is a schematic configuration diagram of a confocal microscope A according to an embodiment.
  • the confocal microscope A shown in FIG. 1 constitutes a confocal microscope that acquires an image that enables the construction of an optical tomographic image of the sample M to be observed, and the confocal microscope unit 1 is for connecting an external unit of the microscope 50. It is configured to be connected to the connection port P1.
  • the confocal microscope unit 1 irradiates a sample M arranged on a stage of the microscope 50 or the like with excitation light via a microscope optical system such as an imaging lens 51 and an objective lens 52 in the microscope 50.
  • This is an apparatus that receives (detects) fluorescence generated from sample M in response to excitation light via the microscope optical system of the microscope 50 to generate and output an optical tomographic image.
  • the confocal microscope unit 1 constitutes the main housing 2, a part of the main housing 2, and has a lens barrel 3 detachably connected to the connection port P1 of the microscope 50, and the main housing 2.
  • the scan mirror 4 fixed inside, the fixed mirror 5, the first to fourth subunits 6a to 6d, and the scan lens 7 fixed inside the lens barrel 3 are included.
  • each component of the confocal microscope unit 1 will be described in detail.
  • the scan lens 7 in the lens barrel 3 is an optical element having a function of relaying the reflecting surface of the scan mirror 4 to the pupil position of the objective lens 52 and at the same time forming a spot on the primary imaging surface of the microscope optical system of the microscope 50. is there.
  • the scan lens 7 irradiates the sample M with the excitation light scanned by the scan mirror 4 by guiding the excitation light to the microscope optical system, and guides the fluorescence generated from the sample M to the scan mirror 4 accordingly.
  • the scan mirror 4 in the main housing 2 is, for example, an optical scanning element such as a MEMS (Micro Electro Mechanical System) mirror configured so that the reflector can be tilted in two axes.
  • the scan mirror 4 scans the excitation light output from the first to fourth subunits 6a to 6d on the sample M by continuously changing the reflection angle, and emits fluorescence generated in response to the excitation light. , It has a role of guiding toward the first to fourth subunits 6a to 6d.
  • the fixed mirror 5 is a light reflecting element fixed in the main housing 2, and reflects the excitation light output from the first to fourth subsystems 6a to 6d toward the scan mirror 4 to reflect the excitation light toward the scan mirror 4.
  • the fluorescence reflected by is reflected toward the first to fourth subsystems 6a to 6d coaxially with the excitation light.
  • the first subsystem 6a includes a base plate 8a, a dichroic mirror (first beam splitter) 9a arranged on the base plate 8a, a light source 10a, a dichroic mirror 11a, and a pinhole plate (first diaphragm member) 12a. , A photodetector (first photodetector) 13a.
  • the dichroic mirror 9a is fixed in the fluorescence reflection direction of the fixed mirror 5, and the first excitation light of the wavelength ⁇ 1 irradiated by the first subsystem 6a and the first excitation light of the wavelength range ⁇ 1 generated from the sample M accordingly.
  • the dichroic mirror 11a is arranged in the reflection direction of the first fluorescent dichroic mirrors 9a, it passes through the first fluorescence wavelength range [Delta] [lambda] 1, reflects the first excitation light of a shorter wavelength lambda 1 than the wavelength range [Delta] [lambda] 1 It is a beam splitter that has the property of causing.
  • the light source 10a is a light emitting element (for example, a laser diode) that outputs a first excitation light (for example, laser light) having a wavelength ⁇ 1 , and the first excitation light is coaxial with the first fluorescence by the dichroic mirror 11a. It is arranged so as to be reflected toward the dichroic mirror 9a.
  • the pinhole plate 12a is a diaphragm member whose pinhole position coincides with the conjugate position of the spot of the first excitation light of the sample M and limits the light flux of the first fluorescence, and together with the light source 10a and the like. It constitutes a cofocal optical system.
  • the pinhole plate 12a has a pinhole diameter that can be adjusted from the outside, and the resolution of the image detected by the photodetector 13a and the signal intensity of the image can be changed.
  • the photodetector 13a is arranged with its detection surface facing the pinhole plate 12a, and receives and detects the first fluorescence that has passed through the pinhole plate 12a.
  • the photodetector 13a is a photomultiplier tube, a photodiode, an avalanche photodiode, an MPPC (Multi-Pixel Photon Counter), an HPD (Hybrid Photo Detector), an area image sensor, or the like.
  • the second to fourth subunits 6b to 6d also have the same configuration as the first subunit 6a.
  • the second subsystem 6b includes a base plate 8b, a dichroic mirror (second beam splitter) 9b, a light source 10b, a dichroic mirror 11b, a pinhole plate (second diaphragm member) 12b, and a photodetector (second beam splitter). 2 Photodetector) 13b.
  • the dichroic mirror 9b reflects the second excitation light of the wavelength ⁇ 2 (> ⁇ 1 ) irradiated by the second subunit 6b and the second fluorescence of the wavelength range ⁇ 2 generated from the sample M accordingly, and the second It has the property of transmitting light having a wavelength longer than that of the second excitation light and the second fluorescence.
  • the dichroic mirror 11b passes through a second fluorescence wavelength range [Delta] [lambda] 2, has a property of reflecting the second excitation light of a shorter wavelength lambda 2 from the wavelength range [Delta] [lambda] 2.
  • the light source 10b is a light emitting element that outputs a second excitation light having a wavelength of ⁇ 2 .
  • the pinhole plate 12b is a diaphragm member whose pinhole position is arranged so as to coincide with the conjugate position of the second excitation light spot of the sample M and limits the light flux of the second fluorescence.
  • the photodetector 13b has its detection surface opposed to the pinhole plate 12b and receives and detects the second fluorescence that has passed through the pinhole plate 12b.
  • the photodetector 13b is a photomultiplier tube, a photodiode, an avalanche photodiode, an MPPC (Multi-Pixel Photon Counter), an HPD (Hybrid Photo Detector), an area image sensor, or the like.
  • the third subsystem 6c includes a base plate 8c, a dichroic mirror (third beam splitter) 9c, a light source 10c, a dichroic mirror 11c, a pinhole plate (third diaphragm member) 12c, and a photodetector (third diaphragm member). It has a photodetector) 13c.
  • the dichroic mirror 9c reflects the third excitation light of the wavelength ⁇ 3 (> ⁇ 2 ) irradiated by the third subsystem 6c and the third fluorescence of the wavelength range ⁇ 3 generated from the sample M accordingly. It has the property of transmitting light having a wavelength longer than that of the excitation light of No. 3 and the third fluorescence.
  • the dichroic mirror 11c is transmitted through the third fluorescence having a wavelength range [Delta] [lambda] 3, has the property of reflecting the third pumping light having a wavelength shorter lambda 3 than the wavelength range [Delta] [lambda] 3.
  • the light source 10c is a light emitting element that outputs a third excitation light having a wavelength of ⁇ 3 .
  • the pinhole plate 12c is a diaphragm member whose pinhole position is arranged so as to coincide with the conjugate position of the third excitation light spot of the sample M and limits the light flux of the third fluorescence.
  • the photodetector 13c is arranged with its detection surface facing the pinhole plate 12c, and receives and detects the third fluorescence that has passed through the pinhole plate 12c.
  • the photodetector 13c is a photomultiplier tube, a photodiode, an avalanche photodiode, an MPPC (Multi-Pixel Photon Counter), an HPD (Hybrid Photo Detector), an area image sensor, or the like.
  • the fourth subsystem 6d includes a base plate 8d, a total reflection mirror 9d, a light source 10d, a dichroic mirror 11d, a pinhole plate (fourth aperture member) 12d, and a photodetector (fourth photodetector) 13d.
  • the total reflection mirror 9c reflects the fourth excitation light of the wavelength ⁇ 4 (> ⁇ 3 ) irradiated by the fourth subunit 6d and the fourth fluorescence of the wavelength range ⁇ 4 generated from the sample M accordingly.
  • the dichroic mirror 11d is transmitted through the fourth fluorescence wavelength range [Delta] [lambda] 4, have the property of reflecting the fourth pumping light wavelength shorter lambda 4 than the wavelength range [Delta] [lambda] 4.
  • the light source 10d is a light emitting element that outputs a fourth excitation light having a wavelength of ⁇ 4 .
  • the pinhole plate 12d is a diaphragm member whose pinhole position is arranged so as to coincide with the conjugate position of the fourth excitation light spot of the sample M and limits the luminous flux of the fourth fluorescence.
  • the photodetector 13d is arranged with its detection surface facing the pinhole plate 12d, and receives and detects the fourth fluorescence that has passed through the pinhole plate 12d.
  • the photodetector 13d is a photomultiplier tube, a photodiode, an avalanche photodiode, an MPPC (Multi-Pixel Photon Counter), an HPD (Hybrid Photo Detector), an area image sensor, or the like.
  • the first to fourth subsystems 6a to 6d are arranged in this order in the direction away from the fixed mirror 5 along the light guide direction of the first to fourth fluorescence by the scan mirror 4 and the fixed mirror 5. Moreover, the dichroic mirrors 9a to 9c and the total reflection mirror 9d are fixed in the main housing 2 so as to be located on the first to fourth fluorescent optical paths. Specifically, the second to fourth subunits 6b to 6d are based on the center positions of the dichroic mirrors 9a to 9c and the total reflection mirror 9d with respect to the first to third subunits 6a to 6c, respectively. Therefore, they are arranged so as to shift by a predetermined distance d in a direction perpendicular to the light guide direction of the second to fourth fluorescence.
  • This predetermined distance d is set to be substantially equal to the shift amount ⁇ in the direction perpendicular to the optical path caused by the refraction of fluorescence in each of the dichroic mirrors 9a to 9c in the optical path of fluorescence transmitted by the dichroic mirrors 9a to 9c. ..
  • the thicknesses of the mirror members constituting the dichroic mirrors 9a to 9c are set to be the same, the shift amounts generated by the dichroic mirrors 9a to 9c are substantially the same, and accordingly, the first to fourth The shift distance d between two adjacent subunits among the subunits 6a to 6d of the above is also set to be the same.
  • the shift distance d is appropriately set according to the thickness and the refractive index of the mirror members constituting the dichroic mirrors 9a to 9c. Specifically, when the mirror member has a thickness t and a refractive index n, the incident angle of the fluorescence incident on the mirror member is ⁇ , and the refraction angle inside the mirror member is ⁇ , the shift amount ⁇ of the fluorescence by the mirror member is , As shown in FIG. At this time, since the shift amount ⁇ can be obtained by the following equation (1), the shift distance (predetermined distance) d may be set according to the shift amount ⁇ . There is a relationship of the following equation (2) between the incident angle ⁇ and the refraction angle ⁇ .
  • FIG. 3 shows an example of the positioning structure of the first to fourth subunits 6a to 6d.
  • the components of the first to third subunits 6a to 6d are not shown.
  • two protrusions (first to fourth positioning portions) 15a corresponding to the first to fourth subunits 6a to 6d are respectively.
  • To 15d are provided, and the holes 16 formed in the base plates 8a to 8d of the first to fourth subunits 6a to 6d are fitted into the two protrusions 15a to 15d, respectively.
  • the first to fourth subunits 6a to 6d are positioned so as to shift each other by a predetermined distance d.
  • the distance between the two protrusions 15a to 15d on the base plate 14 and the distance between the two holes 16 on the base plates 8a to 8d are all formed to be the same.
  • any subunit can be selected from the first to fourth subunits 6a to 6d and arranged on the base plate 14 in the main housing 2.
  • the selected subunits are packed and arranged on the fixed mirror 5 side, and the wavelength of the excitation light to be irradiated is emitted. Are arranged so as to line up from the fixed mirror 5 side in order from the shortest one.
  • the first excitation light output from the first subsystem 6a reflects the dichroic mirror 9a and then passes through the scan mirror 4 and the scan lens 7 to the sample M.
  • the first fluorescence generated from the sample M which is scanned upward, passes through the scan lens 7 and the scan mirror 4 and then reflects off the dichroic mirror 9a to enter the first subsystem 6a.
  • the image is formed on the pinhole plate 12a in the first subsystem 6a and detected by the light detector 13a.
  • the second excitation light output from the second subsystem 6b reflects the dichroic mirror 9b in the second subsystem 6b and then passes through the dichroic mirror 9a in the first subsystem 6a.
  • the dichroic mirror 9a is transmitted through the dichroic mirror 9a via the scan lens 7 and the scan mirror 4.
  • the dichroic mirror 9b is reflected and incident on the second subsystem 6b, and the image is formed on the pinhole plate 12b in the second subsystem 6b and detected by the optical detector 13b.
  • the excitation light emitted from the own unit and the fluorescence generated accordingly reflect the dichroic mirror of the own unit and pass through the dichroic mirror of the other unit.
  • first to fourth subunits 6a to 6d can be adjusted so that the positions of the light source and the pinhole are in a conjugate relationship outside the confocal microscope unit 1, respectively, and the confocal microscope unit 1 After mounting on the device, troublesome optical adjustment is not required, and subunits can be easily added or replaced.
  • FIG. 4 is a graph showing the wavelength distribution characteristics of excitation light and fluorescence handled by the first to fourth subunits 6a to 6d.
  • Wavelength range [Delta] [lambda] 1 of fluorescence generated in response to the excitation light having a wavelength lambda 1 emitted from the first sub-unit 6a is generally a range of wavelength longer than the wavelength lambda 1 and in the vicinity of the wavelength lambda 1 Become.
  • the wavelength ⁇ 2 of the excitation light emitted from the second subunit 6b and the wavelength range ⁇ 2 of the fluorescence generated thereby are in a wavelength range longer than the wavelength ⁇ 1 and the wavelength range ⁇ 1. ..
  • the boundary wavelength ⁇ d1 of the optical division of the dichroic mirror 9a of the first subunit 6a is longer than the wavelength ⁇ 1 and the wavelength range ⁇ 1 , and is longer than the wavelength ⁇ 2 and the wavelength range ⁇ 2. It is set to a value that is a short wavelength. This enables confocal measurement in the wavelength ⁇ 1 and wavelength range ⁇ 1 using the first subunit 6a, and the wavelength ⁇ 2 and wavelength range ⁇ using the second subunit 6b of the same device. Confocal measurement in the range of 2 is possible.
  • the boundary wavelength ⁇ d2 of the optical division of the dichroic mirror 9b of the second subsystem 6b is longer than the wavelength ⁇ 2 and the wavelength range ⁇ 2 , and is longer than the wavelength ⁇ 3 and the wavelength range ⁇ 3. It is set to a value that is a short wavelength, and the boundary wavelength ⁇ d3 of the optical division of the dichroic mirror 9c of the third subsystem 6c is a longer wavelength than the wavelength ⁇ 3 and the wavelength range ⁇ 3 , and the wavelength ⁇ It is set to a value that is shorter than 4 and the wavelength range ⁇ 4 .
  • the scan mirror 4, the scan lens 7, and the first to fourth subunits 6a to 6d are fixed to the main housing 2, and the first to fourth subunits 6a to 6d are arbitrary subunits.
  • such a setting can be performed in units of subunits, and after the first to fourth subunits 6a to 6d are housed in the main housing 2, the scan mirror 4 and the scan lens 7 are adjusted. Highly accurate image detection is possible just by doing so.
  • pinhole plates 12a to 12d of the first to fourth subunits 6a to 6d can be adjusted according to the wavelength of the fluorescence to be observed, the wavelength of the fluorescence to be observed.
  • the resolution of the image and the signal strength of the image can be adjusted accordingly.
  • the thicknesses of the mirror members constituting the first to third dichroic mirrors 9a to 9c are substantially the same. According to such a configuration, the deviation of the optical axis of the excitation light or the fluorescence generated by passing through each of the first to third dichroic mirrors 9a to 9c can be made equal, and the first to fourth dichroic mirrors can be made equivalent.
  • the displacement of the arrangement between the subunits 6a to 6d may be set to the same distance d, and the positioning structure can be simplified. As a result, imaging in a plurality of wavelength regions can be realized while facilitating the setting work of the first to fourth subunits 6a to 6b.
  • the main housing 2 is provided with protrusions 15a to 15d for positioning the first to fourth subunits 6a to 6d, and these protrusions 15a to 15d provide the second to fourth subunits.
  • Each of 6b to 6d is configured to be positioned by shifting each of the first to third subunits 6a to 6c by a predetermined distance d in a direction perpendicular to the light guide direction of fluorescence.
  • the subunit can be positioned with respect to the other subunit in the previous stage according to the deviation of the optical axis of the excitation light or fluorescence caused by passing through the dichroic mirror in the other subunit in the previous stage. As a result, the accuracy of imaging in four wavelength regions can be improved.
  • the shift distance d with respect to the first to third subunits 6a to 6c in the preceding stage of the second to fourth subunits 6b to 6d depends on the shift amount ⁇ of the fluorescent optical path by the dichroic mirrors 9a to 9c. May be set. Further, since this shift amount differs depending on the wavelength of fluorescence, the shift distance d with respect to the subunit in the previous stage may be set to a different value for each subunit. However, when the shift amount ⁇ of the optical path of fluorescence by the dichroic mirrors 9a to 9c is almost the same, the shift distance d of each subunit with respect to the subunit in the previous stage may be the same value.
  • the scan mirror 4 is composed of a MEMS mirror. In the case of such a configuration, the device can be easily miniaturized.
  • a pinhole plate is used as a diaphragm member to form a confocal optical system, but the diaphragm member may be an optical element that limits the luminous flux, for example, a color diaphragm or a fiber core. You may.
  • the position of the end face of the fiber core may be the diaphragm position (the position where the luminous flux is limited).
  • a laser light source such as a solid-state laser or a diode laser can also be used.
  • the position of the beam waist of these laser light sources may be set to the diaphragm position (the position where the luminous flux is limited), and the light source itself plays the role of a diaphragm member.
  • the first to fourth subunits 6a to 6d are arranged in the order of shortening the wavelength range of the excitation light and fluorescence to be handled in the direction away from the scan mirror 4 side, but in the order of the longest wavelength range. It may be arranged.
  • the characteristics of the dichroic mirrors 9a to 9c reflect the relatively long-wavelength excitation light and fluorescence handled by each of the subsystems 6a to 6c, and the relatively short-wavelength excitation light handled by the other subsystems. And the characteristics are set to transmit fluorescence.
  • the main housing has a first positioning unit for positioning the first subunit and a second positioning unit for positioning the second subunit, and the first positioning unit and the first positioning unit and the second positioning unit are provided.
  • the second positioning unit may shift the second subunit with respect to the first subunit by a predetermined distance in the direction intersecting the fluorescence light guide direction. As a result, the horizontal positions of the beams from each subunit can be aligned.
  • this predetermined distance may be set according to the shift amount of the fluorescence optical path in the direction intersecting the fluorescence light guide direction.
  • the second subunit can be positioned with respect to the first subunit according to the deviation of the optical axis of the excitation light or fluorescence caused by passing through the first beam splitter. As a result, the accuracy of imaging in a plurality of wavelength regions can be improved.
  • the scan mirror may be a MEMS mirror.
  • the device can be easily miniaturized.
  • first subunit and the second subunit are arranged in the main housing in the order of the first subunit and the second subunit along the light guide direction of fluorescence by the scan mirror. It may be fixed.
  • the first and second excitation lights emitted from the first and second subunits, respectively are passed through the first beam splitter in the first subunit to the sample on the microscope side.
  • the first and second fluorescence, respectively, generated from the sample can be irradiated towards the first subunit via the first beam splitter in the first subunit. It can be installed in the unit. As a result, it is possible to realize imaging in a plurality of wavelength regions with the same device.
  • a light source that outputs a third excitation light
  • a third aperture member that limits the light flux of the third fluorescence generated from the sample in response to the third excitation light
  • a third aperture member that has passed through the third aperture member. It further comprises a third subunit having a third light detector that detects the fluorescence of the third, the second subunit reflecting the second excitation light and the second fluorescence, the third excitation light and It may have a second beam splitter that transmits a third fluorescence.
  • the second excitation light output from the second subunit reflects the second beam splitter in the second subunit and then the first beam splitter in the first subunit.
  • the third excitation light output from the third subunit passes through the second beam splitter in the second subunit and the first beam splitter in the first subunit before scanning.
  • the third beam generated from the sample is scanned onto the sample via the mirror and the scan lens, and the third beam is transmitted through the scan lens and the scan mirror to the first beam splitter and the second beam splitter. Then, it is incident on the third subunit, and the image is formed on the third diaphragm member in the third subunit and detected by the third optical detector. This makes it possible to realize imaging in three wavelength regions with the same device.
  • the main housing has a second positioning portion for positioning the second subunit and a third positioning portion for positioning the third subunit, and the second positioning portion and the third positioning portion are provided.
  • the unit may position the third subunit by shifting it with respect to the second subunit by a predetermined distance in the direction intersecting the fluorescent light guide direction.
  • the third subunit can be positioned with respect to the second subunit according to the deviation of the optical axis of the excitation light or fluorescence caused by passing through the second beam splitter. As a result, the accuracy of imaging in a plurality of wavelength regions can be improved.
  • the thickness of the first beam splitter and the thickness of the second beam splitter may be the same.
  • the first subunit, the second subunit, and the third subunit are the first subunit, the second subunit, and the third subunit along the light guide direction of fluorescence by the scan mirror.
  • the subunits may be fixed to the main housing in the order of the subunits.
  • the first to third excitation lights emitted from each of the first to third subunits are microscoped via the first and second beam splitters in the first and second subunits. It is possible to irradiate the sample on the side and correspondingly pass the first to third fluorescence generated from the sample via the first and second beam splitters in the first and second subunits. Then, it can be introduced into the first to third subunits. As a result, it is possible to realize imaging in three wavelength regions with the same device.
  • a confocal microscope unit and a confocal microscope constituting the confocal microscope are used, and the positions of the light source that outputs excitation light and the aperture member that limits the light beam of fluorescence are set to the conjugate position with respect to the dichroic mirror.
  • M ... sample, P1 ... connection port, d ... predetermined distance, 10a to 10d ... light source, 12a to 12d ... pinhole plate (aperture member), 13a to 13d ... light detector, 15a to 15d ... protrusion (positioning part) , 6a to 6b ... 1st to 4th subsystems, 9a to 9c ... Dycroic mirrors (1st to 3rd beam splitters), 1 ... Confocal microscope unit, 2 ... Main housing, 3 ... Lens barrel, 4 ... scan mirror, 7 ... scan lens, 50 ... microscope, A ... confocal microscope.

Abstract

実施形態にかかる共焦点顕微鏡ユニット１は、光源１０ａ、ピンホール板１２ａ、及び、光検出器１３ａを有する第１のサブユニット６ａと、光源１０ｂ、ピンホール板１２ｂ、及び、光検出器１３ｂを有する第２のサブユニット６ｂと、励起光を試料Ｍ上で走査させ、試料Ｍから生じる蛍光を第１及び第２のサブユニット６ａ，６ｂに向けて導くスキャンミラー４と、励起光を導光し、蛍光をスキャンミラー４に導光するスキャンレンズ７と、接続ポートＰ１に取り付け可能にされ、スキャンミラー４、スキャンレンズ７、及びサブユニット６ａ，６ｂが固定されたメイン筐体２と、を備え、第１のサブユニット６ａは、自ユニットで扱う励起光及び蛍光を第２のサブユニット６ｂの扱うそれらと分離するダイクロイックミラー９ａを有する。

Description

共焦点顕微鏡ユニット及び共焦点顕微鏡
　本開示は、共焦点顕微鏡を構成する共焦点顕微鏡ユニット及び共焦点顕微鏡に関する。
　従来から、観察対象の標本の光学断層像を高解像度で得ることが可能な共焦点顕微鏡が知られている。例えば、下記特許文献１には、顕微鏡に接続される顕微鏡接続ポートと、標本に光を照射する刺激ユニットと、標本から発せられる光を検出する観察ユニットと、顕微鏡と刺激ユニット及び観察ユニットとを光学的に接続する光路を合成する光路合成部とを備える顕微鏡接続ユニットが開示されている。この顕微鏡接続ユニットは、複数の光源から発せられた光を導く光学系、それに応じて発生した蛍光を複数波長ごとに検出するためのダイクロイックミラー、共焦点ピンホール、及び光電子増倍管を、同一の観察ユニット内に有している。このような構成では、複数の波長の励起光を用いてそれに応じて生じる蛍光を検出することにより、同一の装置で複数波長領域でのイメージングが実現される。
特開２０１１－９０２４８号公報
　上述したような従来のユニットでは、共焦点光学系を構成するにあたり、励起光と蛍光を分離するダイクロイックミラーに対して、励起光を出力する光源や蛍光の光束を制限する絞り部材の位置を共役位置に設置する必要があり、この共役位置の光学調整に手間がかかっていた。
　実施形態は、かかる課題に鑑みてなされたものであり、ダイクロイックミラーに対して、励起光を出力する光源及び蛍光の光束を制限する絞り部材の位置を共役位置に設置したユニットを設けることで、複数波長での共焦点イメージングを容易に行うことができる共焦点顕微鏡ユニットを提供することを課題とする。
　本開示の一形態に係る共焦点顕微鏡ユニットは、顕微鏡光学系を有する顕微鏡の接続ポートに取り付けられることにより、共焦点顕微鏡を構成する共焦点顕微鏡ユニットであって、第１の励起光を出力する光源、第１の励起光に応じて観察対象の試料から生じる第１の蛍光の光束を制限する第１の絞り部材、及び、第１の絞り部材を通過した第１の蛍光を検出する第１の光検出器を有する第１のサブユニットと、第２の励起光を出力する光源、第２の励起光に応じて試料から生じる第２の蛍光の光束を制限する第２の絞り部材、及び、第２の絞り部材を通過した第２の蛍光を検出する第２の光検出器を有する第２のサブユニットと、第１及び第２のサブユニットから出力された励起光を、試料上で走査させ、励起光に応じて試料から生じる蛍光を第１及び第２のサブユニットに向けて導くスキャンミラーと、スキャンミラーによって走査された励起光を顕微鏡光学系に導光し、顕微鏡光学系によって結像された蛍光をスキャンミラーに導光するスキャンレンズと、接続ポートに取り付け可能に構成され、スキャンミラー、スキャンレンズ、第１のサブユニット、及び第２のサブユニットが固定されたメイン筐体と、を備え、第１のサブユニットは、第１の励起光及び第１の蛍光を反射し、第２の励起光及び第２の蛍光を透過する第１のビームスプリッタを有する。
　上記一形態によれば、第１のサブユニットから出力された第１の励起光が、第１のビームスプリッタを反射してからスキャンミラー及びスキャンレンズを経由して試料上に走査され、それに応じて試料上から生じた第１の蛍光がスキャンレンズ及びスキャンミラーを経由してから第１のビームスプリッタを反射することにより第１のサブユニット内に入射し、第１のサブユニット内の第１の絞り部材にその像が結ばれて第１の光検出器で検出される。加えて、第２のサブユニットから出力された第２の励起光が、第１のサブユニット内の第１のビームスプリッタを透過してからスキャンミラー及びスキャンレンズを経由して試料上に走査され、それに応じて試料上から生じた第２の蛍光が、スキャンレンズ及びスキャンミラーを経由して第１のビームスプリッタを透過してから第２のサブユニット内に入射し、第２のサブユニット内の第２の絞り部材にその像が結ばれて第２の光検出器で検出される。ここで、これらのスキャンミラー、スキャンレンズ、第１及び第２のサブユニットはメイン筐体に固定されているので、第１及び第２のサブユニットの単位での光源の光学系と絞り部材との位置関係の設定が可能となる。その結果、設定作業を容易にしつつ複数波長領域でのイメージングの精度を高めることが可能となる。
　あるいは、本開示の他の形態は、上述の共焦点顕微鏡ユニットと、顕微鏡光学系及び共焦点顕微鏡ユニットが取り付けられる接続ポートを有する顕微鏡を備える共焦点顕微鏡である。このような共焦点顕微鏡によれば、所望の励起波長及び蛍光波長における共焦点イメージングを容易に行うことができる。
　本開示の一側面によれば、光源の光学系及び絞り部材の設定を容易にして複数波長領域でのイメージングの精度を高めることができる。
実施形態にかかる共焦点顕微鏡Ａの概略構成図である。 ダイクロイックミラー９ａ～９ｃにおける蛍光の屈折状態を示す平面図である。 図１の共焦点顕微鏡ユニット１の第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄの位置決め構造を示す平面図である。 図１の第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄで扱われる励起光及び蛍光の波長分布特性を示すグラフである。
　以下、添付図面を参照して、本開示の実施形態について詳細に説明する。なお、説明において、同一要素又は同一機能を有する要素には、同一符号を用いることとし、重複する説明は省略する。
　図１は、実施形態にかかる共焦点顕微鏡Ａの概略構成図である。図１に示す共焦点顕微鏡Ａは、観察対象の試料Ｍの光学断層像の構築を可能とする画像を取得する共焦点顕微鏡を構成し、共焦点顕微鏡ユニット１が顕微鏡５０の外部ユニット接続用の接続ポートＰ１に接続されて構成される。この共焦点顕微鏡ユニット１は、顕微鏡５０内の結像レンズ５１、対物レンズ５２等の顕微鏡光学系を経由して、顕微鏡５０のステージ上等に配置された試料Ｍに励起光を照射し、その励起光に応じて試料Ｍから生じた蛍光を、顕微鏡５０の顕微鏡光学系を経由して受光（検出）して光学的断層像を生成して出力する装置である。
　詳細には、共焦点顕微鏡ユニット１は、メイン筐体２と、メイン筐体２の一部を構成し、顕微鏡５０の接続ポートＰ１に着脱可能に接続される鏡筒３と、メイン筐体２内に固定されたスキャンミラー４、固定ミラー５、第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄと、鏡筒３内に固定されたスキャンレンズ７とを含んで構成される。以下、共焦点顕微鏡ユニット１の各構成要素について詳細に説明する。
　鏡筒３内のスキャンレンズ７は、スキャンミラー４の反射面を対物レンズ５２の瞳位置にリレーすると同時に、顕微鏡５０の顕微鏡光学系の１次結像面にスポットを結ぶ機能を有する光学素子である。スキャンレンズ７は、スキャンミラー４によって走査された励起光を顕微鏡光学系に導光することにより試料Ｍに照射させ、それに応じて試料Ｍから生じた蛍光をスキャンミラー４に導光する。
　メイン筐体２内のスキャンミラー４は、例えば、反射板を２軸で傾動可能に構成されたＭＥＭＳ（Micro Electro Mechanical System）ミラー等の光走査素子である。スキャンミラー４は、反射角度を連続的に変更することにより、第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄから出力された励起光を試料Ｍ上に走査させ、その励起光に応じて生じる蛍光を、第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄに向けて導く役割を有する。
　固定ミラー５は、メイン筐体２内に固定された光反射素子であり、第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄから出力された励起光をスキャンミラー４に向けて反射させ、スキャンミラー４で反射された蛍光を励起光と同軸で第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄに向けて反射する。
　第１のサブユニット６ａは、ベース板８ａと、ベース板８ａ上に配置されたダイクロイックミラー（第１のビームスプリッタ）９ａ、光源１０ａ、ダイクロイックミラー１１ａ、ピンホール板（第１の絞り部材）１２ａ、光検出器（第１の光検出器）１３ａとを有する。ダイクロイックミラー９ａは、固定ミラー５の蛍光の反射方向に固定され、第１のサブユニット６ａが照射する波長λ１の第１の励起光及びそれに応じて試料Ｍから生じる波長範囲Δλ１の第１の蛍光を反射し、第１の励起光及び第１の蛍光よりも長波長の光を透過させる性質を有するビームスプリッタである。ダイクロイックミラー１１ａは、ダイクロイックミラー９ａの第１の蛍光の反射方向に設けられ、波長範囲Δλ１の第１の蛍光を透過し、波長範囲Δλ１より短い波長λ１の第１の励起光を反射させる性質を有するビームスプリッタである。光源１０ａは、波長λ１の第１の励起光（例えば、レーザ光）を出力する発光素子（例えば、レーザダイオード）であり、第１の励起光がダイクロイックミラー１１ａによって第１の蛍光と同軸でダイクロイックミラー９ａに向けて反射されるように配置される。ピンホール板１２ａは、そのピンホール位置が試料Ｍの第１の励起光のスポットの共役位置に一致するように配置され、第１の蛍光の光束を制限する絞り部材であり、光源１０ａ等とともに共焦点光学系を構成する。このピンホール板１２ａは、ピンホールの径を外部から調整可能にされ、光検出器１３ａによって検出される画像の解像度と画像の信号強度を変更可能とする。光検出器１３ａは、その検出面がピンホール板１２ａに対向して配置され、ピンホール板１２ａを通過した第１の蛍光を受光および検出する。なお、光検出器１３ａは、光電子増倍管、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、ＭＰＰＣ（Multi-Pixel　Photon　Counter）、ＨＰＤ（Hybrid　Photo　Detector）、或いはエリアイメージセンサ等である。
　第２～第４のサブユニット６ｂ～６ｄも、第１のサブユニット６ａと同様な構成を有する。
　すなわち、第２のサブユニット６ｂは、ベース板８ｂと、ダイクロイックミラー（第２のビームスプリッタ）９ｂ、光源１０ｂ、ダイクロイックミラー１１ｂ、ピンホール板（第２の絞り部材）１２ｂ、光検出器（第２の光検出器）１３ｂとを有する。ダイクロイックミラー９ｂは、第２のサブユニット６ｂが照射する波長λ２（＞λ１）の第２の励起光及びそれに応じて試料Ｍから生じる波長範囲Δλ２の第２の蛍光を反射し、第２の励起光及び第２の蛍光よりも長波長の光を透過させる性質を有する。ダイクロイックミラー１１ｂは、波長範囲Δλ２の第２の蛍光を透過し、波長範囲Δλ２より短い波長λ２の第２の励起光を反射させる性質を有する。光源１０ｂは、波長λ２の第２の励起光を出力する発光素子である。ピンホール板１２ｂは、そのピンホール位置が試料Ｍの第２の励起光のスポットの共役位置に一致するように配置され、第２の蛍光の光束を制限する絞り部材である。光検出器１３ｂは、その検出面がピンホール板１２ｂに対向して配置され、ピンホール板１２ｂを通過した第２の蛍光を受光および検出する。なお、光検出器１３ｂは、光電子増倍管、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、ＭＰＰＣ（Multi-Pixel　Photon　Counter）、ＨＰＤ（Hybrid　Photo　Detector）、或いはエリアイメージセンサ等である。
　第３のサブユニット６ｃは、ベース板８ｃと、ダイクロイックミラー（第３のビームスプリッタ）９ｃ、光源１０ｃ、ダイクロイックミラー１１ｃ、ピンホール板（第３の絞り部材）１２ｃ、光検出器（第３の光検出器）１３ｃとを有する。ダイクロイックミラー９ｃは、第３のサブユニット６ｃが照射する波長λ３（＞λ２）の第３の励起光及びそれに応じて試料Ｍから生じる波長範囲Δλ３の第３の蛍光を反射し、第３の励起光及び第３の蛍光よりも長波長の光を透過させる性質を有する。ダイクロイックミラー１１ｃは、波長範囲Δλ３の第３の蛍光を透過し、波長範囲Δλ３より短い波長λ３の第３の励起光を反射させる性質を有する。光源１０ｃは、波長λ３の第３の励起光を出力する発光素子である。ピンホール板１２ｃは、そのピンホール位置が試料Ｍの第３の励起光のスポットの共役位置に一致するように配置され、第３の蛍光の光束を制限する絞り部材である。光検出器１３ｃは、その検出面がピンホール板１２ｃに対向して配置され、ピンホール板１２ｃを通過した第３の蛍光を受光および検出する。なお、光検出器１３ｃは、光電子増倍管、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、ＭＰＰＣ（Multi-Pixel　Photon　Counter）、ＨＰＤ（Hybrid　Photo　Detector）、或いはエリアイメージセンサ等である。
　第４のサブユニット６ｄは、ベース板８ｄと、全反射ミラー９ｄ、光源１０ｄ、ダイクロイックミラー１１ｄ、ピンホール板（第４の絞り部材）１２ｄ、光検出器（第４の光検出器）１３ｄとを有する。全反射ミラー９ｃは、第４のサブユニット６ｄが照射する波長λ４（＞λ３）の第４の励起光及びそれに応じて試料Ｍから生じる波長範囲Δλ４の第４の蛍光を反射する。ダイクロイックミラー１１ｄは、波長範囲Δλ４の第４の蛍光を透過し、波長範囲Δλ４より短い波長λ４の第４の励起光を反射させる性質を有する。光源１０ｄは、波長λ４の第４の励起光を出力する発光素子である。ピンホール板１２ｄは、そのピンホール位置が試料Ｍの第４の励起光のスポットの共役位置に一致するように配置され、第４の蛍光の光束を制限する絞り部材である。光検出器１３ｄは、その検出面がピンホール板１２ｄに対向して配置され、ピンホール板１２ｄを通過した第４の蛍光を受光および検出する。なお、光検出器１３ｄは、光電子増倍管、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、ＭＰＰＣ（Multi-Pixel　Photon　Counter）、ＨＰＤ（Hybrid　Photo　Detector）、或いはエリアイメージセンサ等である。
　上記構成の第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄの位置関係について説明する。
　第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄは、スキャンミラー４及び固定ミラー５による第１～第４の蛍光の導光方向に沿って、この順番で固定ミラー５から離れる方向に並ぶように、かつ、第１～第４の蛍光の光路上にダイクロイックミラー９ａ～９ｃ及び全反射ミラー９ｄが位置するように、メイン筐体２内に固定されている。詳細には、第２～第４のサブユニット６ｂ～６ｄは、それぞれ、第１～第３のサブユニット６ａ～６ｃに対して、ダイクロイックミラー９ａ～９ｃ及び全反射ミラー９ｄの中心位置を基準にして、第２～第４の蛍光の導光方向に垂直な方向に所定距離ｄだけシフトするように、配置されている。
　この所定距離ｄは、ダイクロイックミラー９ａ～９ｃによって透過される蛍光の光路において、それぞれのダイクロイックミラー９ａ～９ｃにおいて蛍光の屈折によって生じる、その光路に垂直な方向のシフト量δに略等しく設定される。本実施形態では、ダイクロイックミラー９ａ～９ｃを構成するミラー部材の厚さは同一に設定されているため、ダイクロイックミラー９ａ～９ｃで生じるシフト量はほぼ同じとなり、それに応じて、第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄのうちの隣り合う２つのサブユニット間のシフト距離ｄも同じに設定される。このシフト距離ｄは、ダイクロイックミラー９ａ～９ｃを構成するミラー部材の厚さ及び屈折率に応じて適切に設定される。詳しくは、ミラー部材が厚さｔ、屈折率ｎであり、ミラー部材に入射する蛍光の入射角をθ、ミラー部材内部への屈折角をφとした場合、ミラー部材による蛍光のシフト量δは、図２のようになる。この時、シフト量δは、下記式（１）のように求めることができるため、このシフト量δに合わせてシフト距離（所定距離）ｄを設定すればよい。なお、入射角θと屈折角φの間には、下記式（２）の関係がある。
δ＝ｔ・sin（θ‐φ）／cosφ　　　　…（１）
φ＝arcsin(sinθ／ｎ)　　　　　　　　…（２）
なお、入射角θを４５度とした場合、ミラー部材の屈折率ｎが１．５であれば、ｄ＝δ＝０．３３ｔとなり、ミラー部材の屈折率ｎが１．４であれば、ｄ＝δ＝０．２９ｔとなる。
　図３には、第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄの位置決め構造の例を示している。図３においては、第１～第３のサブユニット６ａ～６ｄの構成部品の図示は省略されている。このように、メイン筐体２を構成するベース板１４上には、第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄのそれぞれに対応して２つの突起部（第１～第４の位置決め部）１５ａ～１５ｄが設けられており、それぞれの２つの突起部１５ａ～１５ｄに対して第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄのベース板８ａ～８ｄに形成された穴部１６が嵌め込まれることにより、第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄが互いに所定距離ｄだけシフトするように位置決めされる。ここで、ベース板１４上の２つの突起部１５ａ～１５ｄのそれぞれの間隔と、ベース板８ａ～８ｄの２つの穴部１６のそれぞれの間隔とは、全て同一になるように形成されている。このようにすることで、第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄのうちから任意のサブユニットを選択してメイン筐体２内のベース板１４上に配置することができる。ただし、第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄのうちから一部のサブユニットを選択する場合には、選択されたサブユニットは固定ミラー５側に詰めて配置され、照射する励起光の波長が短いものから順に固定ミラー５側から並ぶように配置される。
　以上説明した共焦点顕微鏡ユニット１によれば、第１のサブユニット６ａから出力された第１の励起光が、ダイクロイックミラー９ａを反射してからスキャンミラー４及びスキャンレンズ７を経由して試料Ｍ上に走査され、それに応じて試料Ｍ上から生じた第１の蛍光がスキャンレンズ７及びスキャンミラー４を経由してからダイクロイックミラー９ａを反射することにより第１のサブユニット６ａ内に入射し、第１のサブユニット６ａ内のピンホール板１２ａにその像が結ばれて光検出器１３ａで検出される。加えて、第２のサブユニット６ｂから出力された第２の励起光が、第２のサブユニット６ｂ内のダイクロイックミラー９ｂを反射した後に第１のサブユニット６ａ内のダイクロイックミラー９ａを透過してからスキャンミラー４及びスキャンレンズ７を経由して試料Ｍ上に走査され、それに応じて試料Ｍ上から生じた第２の蛍光が、スキャンレンズ７及びスキャンミラー４を経由してダイクロイックミラー９ａを透過した後にダイクロイックミラー９ｂを反射して第２のサブユニット６ｂ内に入射し、第２のサブユニット６ｂ内のピンホール板１２ｂにその像が結ばれて光検出器１３ｂで検出される。同様に、他の第２及び第３のサブユニット６ｃ，６ｄに関しても、自ユニットから照射された励起光及びそれに応じて生じた蛍光が自ユニットのダイクロイックミラーを反射し他ユニットのダイクロイックミラーを透過するように構成されることで、２つの波長の励起光に応じて生じた蛍光の検出が独立に可能となる。また、第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄはそれぞれ、共焦点顕微鏡ユニット１の外部で、光源やピンホールの位置を共役な関係になるように調整することができ、共焦点顕微鏡ユニット１に搭載後、面倒な光学調整が不要となり、サブユニットの追加や交換が容易に行える。
　図４は、第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄで扱われる励起光及び蛍光の波長分布特性を示すグラフである。第１のサブユニット６ａから照射される波長λ１の励起光に応じて生じる蛍光の波長範囲Δλ１は、一般的には、波長λ１の近傍であって波長λ１より長波長の範囲となる。これに対して、第２のサブユニット６ｂから照射される励起光の波長λ２、及びそれによって生じる蛍光の波長範囲Δλ２は、波長λ１及び波長範囲Δλ１よりも長波長の範囲となる。ここで、第１のサブユニット６ａのダイクロイックミラー９ａの光分割の境界波長λｄ１は、波長λ１及び波長範囲Δλ１よりも長波長であり、かつ、波長λ２及び波長範囲Δλ２よりも短波長となる値に設定されている。これにより、第１のサブユニット６ａを用いた波長λ１及び波長範囲Δλ１の範囲の共焦点計測が可能となり、同一装置の第２のサブユニット６ｂを用いて、波長λ２及び波長範囲Δλ２の範囲の共焦点計測が可能となる。同様に、第２のサブユニット６ｂのダイクロイックミラー９ｂの光分割の境界波長λｄ２は、波長λ２及び波長範囲Δλ２よりも長波長であり、かつ、波長λ３及び波長範囲Δλ３よりも短波長となる値に設定されており、第３のサブユニット６ｃのダイクロイックミラー９ｃの光分割の境界波長λｄ３は、波長λ３及び波長範囲Δλ３よりも長波長であり、かつ、波長λ４及び波長範囲Δλ４よりも短波長となる値に設定されている。これにより、同一の装置の第３のサブユニット６ｃを用いた波長λ３及び波長範囲Δλ３の範囲の共焦点計測が可能となり、同一装置の第４のサブユニット６ｄを用いて、波長λ４及び波長範囲Δλ４の範囲の共焦点計測が可能となる。
　ここで、これらのスキャンミラー４、スキャンレンズ７、第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄはメイン筐体２に固定され、第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄは、任意のサブユニットを選択的にメイン筐体２のベース板１４上に配置可能とされている。このような構成により、第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄの単位での光源１０ａ～１０ｄの光学系とピンホール板１２ａ～１２ｄ及び光検出器１３ａ～１３ｄとの位置関係の設定が可能となる。その結果、設定作業を容易にしつつ複数波長領域でのイメージングの精度を高めることが可能となる。すなわち、共焦点顕微鏡Ａによる観察においては検出器側のピンホールと光源とを共役位置に設定することが測定精度維持のために重要となる。本実施形態によれば、そのような設定がサブユニット単位で実施可能となり、第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄをメイン筐体２に収容した後はスキャンミラー４及びスキャンレンズ７を調整するだけで精度の高い画像検出が可能となる。
　また、各第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄのピンホール板１２ａ～１２ｄは、それらのピンホール径を観察する蛍光の波長に応じて調整可能とされているので、観察する蛍光の波長に応じて画像の解像度と画像の信号強度を調整することができる。
　また、本実施形態では、第１～第３のダイクロイックミラー９ａ～９ｃを構成するミラー部材の厚さが略同一とされている。このような構成によれば、第１～第３のダイクロイックミラー９ａ～９ｃのそれぞれを透過することにより生じる励起光あるいは蛍光の光軸のずれを同等とすることができ、第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄ間の配置のずれを同一の距離ｄに設定すればよく、位置決め構造を単純化することができる。その結果、第１～第４のサブユニット６ａ～６ｂの設定作業を容易にしつつ複数波長領域でのイメージングを実現できる。
　詳細には、メイン筐体２に、第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄを位置決めする突起部１５ａ～１５ｄが設けられ、これらの突起部１５ａ～１５ｄにより、第２～第４のサブユニット６ｂ～６ｄのそれぞれを第１～第３のサブユニット６ａ～６ｃのそれぞれに対して、蛍光の導光方向に垂直な方向に所定距離ｄだけシフトして位置決めするように構成されている。かかる構成を採れば、前段の他サブユニット内のダイクロイックミラーを透過することにより生じる励起光あるいは蛍光の光軸のずれに合わせて、サブユニットを前段の他のサブユニットに対して位置決めできる。その結果、４つの波長領域でのイメージングの精度を向上できる。
　なお、それぞれの第２～第４のサブユニット６ｂ～６ｄの前段の第１～第３のサブユニット６ａ～６ｃに対するシフト距離ｄは、ダイクロイックミラー９ａ～９ｃによる蛍光の光路のシフト量δに応じて設定してもよい。また、このシフト量は蛍光の波長によって異なるため、前段のサブユニットに対するシフト距離ｄは、サブユニット毎に異なる値に設定されもよい。ただし、ダイクロイックミラー９ａ～９ｃによる蛍光の光路のシフト量δがほとんど変わらない場合、前段のサブユニットに対する各サブユニットのシフト距離ｄを同じ値にしてもよい。
　上記実施形態においては、スキャンミラー４はＭＥＭＳミラーで構成されている。このような構成の場合、装置の小型化を容易に実現することができる。
　以上、本開示の種々の実施形態について説明したが、本開示は上記実施形態に限定されるものではなく、各請求項に記載した要旨を変更しない範囲で変形し、又は他のものに適用したものであってもよい。
　上記実施形態は、共焦点光学系を構成するために絞り部材としてピンホール板を用いているが、絞り部材は光束を制限する光学素子であればよく、例えば、色彩絞りやファイバコアなどであってもよい。ファイバ出力タイプの光源を用いる場合、ファイバコア端面の位置を絞り位置（光束が制限される位置）とすればよい。
　また、上記実施形態は、固体レーザやダイオードレーザなどのレーザ光源を用いることもできる。この場合、これらのレーザ光源のビームウェストの位置を絞り位置（光束が制限される位置）とすればよく、光源自体が絞り部材の役割を果たすことになる。
　上記実施形態においては、扱う励起光及び蛍光の波長範囲が短い順番でスキャンミラー４側から離れる方向に第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄが配置されていたが、波長範囲が長い順番で配置されてもよい。ただし、この場合、ダイクロイックミラー９ａ～９ｃの特性は、各サブユニット６ａ～６ｃのそれぞれで扱う比較的長波長の励起光及び蛍光を反射し、他のサブユニットで扱う比較的短波長の励起光及び蛍光を透過するような特性に設定される。
　上記実施形態においては、メイン筐体は、第１のサブユニットを位置決めする第１の位置決め部と、第２のサブユニットを位置決めする第２の位置決め部とを有し、第１の位置決め部及び第２の位置決め部は、第２のサブユニットを第１のサブユニットに対して、蛍光の導光方向に交わる方向に所定距離だけシフトして位置決めしてもよい。これにより、各サブユニットからのビームの水平位置を揃えることができる。
　また、この所定の距離は、蛍光の導光方向に交わる方向における、蛍光の光路のシフト量に合わせて設定されてもよい。この場合、第１のビームスプリッタを透過することにより生じる励起光あるいは蛍光の光軸のずれに合わせて第２のサブユニットを第１のサブユニットに対して位置決めできる。その結果、複数波長領域でのイメージングの精度を向上できる。
　上記実施形態においては、スキャンミラーはＭＥＭＳミラーであってもよい。この場合、装置の小型化を容易に実現することができる。
　また、第１のサブユニットと第２のサブユニットとは、スキャンミラーによる蛍光の導光方向に沿って、第１のサブユニットおよび第２のサブユニットの順で並んだ状態でメイン筐体に固定されてもよい。かかる構成によれば、第１及び第２のサブユニットのそれぞれから照射された第１及び第２の励起光を、第１のサブユニット内の第１のビームスプリッタを経由して顕微鏡側の試料に向けて照射することができるとともに、それに応じて試料から生じる第１及び第２の蛍光のそれぞれを、第１のサブユニット内の第１のビームスプリッタを経由して第１及び第２のサブユニット内に導入することできる。その結果、同一の装置で複数波長領域でのイメージングを実現可能となる。
　またさらに、第３の励起光を出力する光源、第３の励起光に応じて試料から生じる第３の蛍光の光束を制限する第３の絞り部材、及び、第３の絞り部材を通過した第３の蛍光を検出する第３の光検出器を有する第３のサブユニットをさらに備え、第２のサブユニットは、第２の励起光及び第２の蛍光を反射し、第３の励起光及び第３の蛍光を透過する第２のビームスプリッタを有してもよい。かかる構成によれば、第２のサブユニットから出力された第２の励起光が、第２のサブユニット内の第２のビームスプリッタを反射後に第１のサブユニット内の第１のビームスプリッタを透過してからスキャンミラー及びスキャンレンズを経由して試料上に走査され、それに応じて試料上から生じた第２の蛍光が、スキャンレンズ及びスキャンミラーを経由して第１のビームスプリッタを透過した後に第２のビームスプリッタを反射してから第２のサブユニット内に入射し、第２のサブユニット内の第２の絞り部材にその像が結ばれて第２の光検出器で検出される。加えて、第３のサブユニットから出力された第３の励起光が、第２のサブユニット内の第２のビームスプリッタ及び第１のサブユニット内の第１のビームスプリッタを透過してからスキャンミラー及びスキャンレンズを経由して試料上に走査され、それに応じて試料上から生じた第３の蛍光が、スキャンレンズ及びスキャンミラーを経由して第１のビームスプリッタ及び第２のビームスプリッタを透過してから第３のサブユニット内に入射し、第３のサブユニット内の第３の絞り部材にその像が結ばれて第３の光検出器で検出される。これにより、同一の装置で３つの波長領域でのイメージングを実現可能となる。
　さらに、メイン筐体は、第２のサブユニットを位置決めする第２の位置決め部と、第３のサブユニットを位置決めする第３の位置決め部とを有し、第２の位置決め部及び第３の位置決め部は、第３のサブユニットを第２のサブユニットに対して、蛍光の導光方向に交わる方向に所定距離だけシフトして位置決めしてもよい。かかる構成を採れば、第２のビームスプリッタを透過することにより生じる励起光あるいは蛍光の光軸のずれに合わせて第３のサブユニットを第２のサブユニットに対して位置決めできる。その結果、複数の波長領域でのイメージングの精度を向上できる。
　また、第１のビームスプリッタの厚さと、第２のビームスプリッタの厚さは同一であってもよい。かかる構成を採れば、第１及び第２のビームスプリッタのそれぞれを透過することにより生じる励起光あるいは蛍光の光軸のずれを同等とすることができ、第１～第３のサブユニット間の配置の設定を容易にすることができる。その結果、設定作業を容易にしつつ複数波長領域でのイメージングを実現できる。
　さらにまた、第１のサブユニットと第２のサブユニットと第３のサブユニットとは、スキャンミラーによる蛍光の導光方向に沿って、第１のサブユニット、第２のサブユニット、および第３のサブユニットの順で並んだ状態でメイン筐体に固定されてもよい。この場合、第１～第３のサブユニットのそれぞれから照射された第１～第３の励起光を、第１及び第２のサブユニット内の第１及び第２のビームスプリッタを経由して顕微鏡側の試料に向けて照射することができるとともに、それに応じて試料から生じる第１～第３の蛍光のそれぞれを、第１及び第２のサブユニット内の第１及び第２のビームスプリッタを経由して第１～第３のサブユニット内に導入することできる。その結果、同一の装置で３つの波長領域でのイメージングを実現可能となる。
　実施形態は、共焦点顕微鏡を構成する共焦点顕微鏡ユニット及び共焦点顕微鏡を使用用途とし、ダイクロイックミラーに対して、励起光を出力する光源及び蛍光の光束を制限する絞り部材の位置を共役位置に設置したユニットを設けることで、複数波長での共焦点イメージングを容易に行うことができるものである。
　Ｍ…試料、Ｐ１…接続ポート、ｄ…所定距離、１０ａ～１０ｄ…光源、１２ａ～１２ｄ…ピンホール板（絞り部材）、１３ａ～１３ｄ…光検出器、１５ａ～１５ｄ…突起部（位置決め部）、６ａ～６ｂ…第１～第４のサブユニット、９ａ～９ｃ…ダイクロイックミラー（第１～第３のビームスプリッタ）、１…共焦点顕微鏡ユニット、２…メイン筐体、３…鏡筒、４…スキャンミラー、７…スキャンレンズ、５０…顕微鏡、Ａ…共焦点顕微鏡。

Claims (10)

  1. 　顕微鏡光学系を有する顕微鏡の接続ポートに取り付けられることにより、共焦点顕微鏡を構成する共焦点顕微鏡ユニットであって、
    　第１の励起光を出力する光源、前記第１の励起光に応じて観察対象の試料から生じる第１の蛍光の光束を制限する第１の絞り部材、及び、前記第１の絞り部材を通過した第１の蛍光を検出する第１の光検出器を有する第１のサブユニットと、
    　第２の励起光を出力する光源、前記第２の励起光に応じて前記試料から生じる第２の蛍光の光束を制限する第２の絞り部材、及び、前記第２の絞り部材を通過した第２の蛍光を検出する第２の光検出器を有する第２のサブユニットと、
    　前記第１及び第２のサブユニットから出力された励起光を、前記試料上で走査させ、前記励起光に応じて前記試料から生じる蛍光を前記第１及び第２のサブユニットに向けて導くスキャンミラーと、
    　前記スキャンミラーによって走査された前記励起光を前記顕微鏡光学系に導光し、前記顕微鏡光学系によって結像された前記蛍光を前記スキャンミラーに導光するスキャンレンズと、
    　前記接続ポートに取り付け可能に構成され、前記スキャンミラー、前記スキャンレンズ、前記第１のサブユニット、及び前記第２のサブユニットが固定されたメイン筐体と、
    を備え、
    　前記第１のサブユニットは、前記第１の励起光及び前記第１の蛍光を反射し、前記第２の励起光及び前記第２の蛍光を透過する第１のビームスプリッタを有する、
    共焦点顕微鏡ユニット。
  2. 　前記メイン筐体は、前記第１のサブユニットを位置決めする第１の位置決め部と、前記第２のサブユニットを位置決めする第２の位置決め部とを有し、
    　前記第１の位置決め部及び前記第２の位置決め部は、前記第２のサブユニットを前記第１のサブユニットに対して、前記蛍光の導光方向に交わる方向に所定距離だけシフトして位置決めする、
    請求項１に記載の共焦点顕微鏡ユニット。
  3. 　前記所定の距離は、前記蛍光の導光方向に交わる方向における、前記蛍光の光路のシフト量に応じて設定される、
    請求項２に記載の共焦点顕微鏡ユニット。
  4. 　前記スキャンミラーはＭＥＭＳミラーである、
    請求項１～３のいずれか１項に記載の共焦点顕微鏡ユニット。
  5. 　前記第１のサブユニットと前記第２のサブユニットとは、前記スキャンミラーによる前記蛍光の導光方向に沿って、前記第１のサブユニットおよび前記第２のサブユニットの順で並んだ状態で前記メイン筐体に固定されている、
    請求項１～４のいずれか１項に記載の共焦点顕微鏡ユニット。
  6. 　第３の励起光を出力する光源、前記第３の励起光に応じて前記試料から生じる第３の蛍光の光束を制限する第３の絞り部材、及び、前記第３の絞り部材を通過した第３の蛍光を検出する第３の光検出器を有する第３のサブユニットをさらに備え、
    　前記第２のサブユニットは、前記第２の励起光及び前記第２の蛍光を反射し、前記第３の励起光及び前記第３の蛍光を透過する第２のビームスプリッタを有する、
    請求項１～５のいずれか１項に記載の共焦点顕微鏡ユニット。
  7. 　前記メイン筐体は、前記第２のサブユニットを位置決めする第２の位置決め部と、前記第３のサブユニットを位置決めする第３の位置決め部とを有し、
    　前記第２の位置決め部及び前記第３の位置決め部は、前記第３のサブユニットを前記第２のサブユニットに対して、前記蛍光の導光方向に交わる方向に所定距離だけシフトして位置決めする、
    請求項６に記載の共焦点顕微鏡ユニット。
  8. 　前記第１のビームスプリッタの厚さと、前記第２のビームスプリッタの厚さは同一である、
    請求項６～７のいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡ユニット。
  9. 　前記第１のサブユニットと前記第２のサブユニットと前記第３のサブユニットとは、前記スキャンミラーによる前記蛍光の導光方向に沿って、前記第１のサブユニット、前記第２のサブユニット、および前記第３のサブユニットの順で並んだ状態で前記メイン筐体に固定されている、
    請求項６～８のいずれか１項に記載の共焦点顕微鏡ユニット。
  10. 　請求項１～９のいずれか１項に記載の共焦点顕微鏡ユニットと、
    　前記顕微鏡光学系及び前記共焦点顕微鏡ユニットが取り付けられる接続ポートを有する顕微鏡を備える、共焦点顕微鏡。
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