JP7344281B2 - 共焦点顕微鏡ユニット及び共焦点顕微鏡 - Google Patents

Description

本開示は、共焦点顕微鏡を構成する共焦点顕微鏡ユニット及び共焦点顕微鏡に関する。

従来から、観察対象の標本の光学断層像を高解像度で得ることが可能な共焦点顕微鏡が知られている。例えば、下記特許文献１には、顕微鏡に接続される顕微鏡接続ポートと、標本に光を照射する刺激ユニットと、標本から発せられる光を検出する観察ユニットと、顕微鏡と刺激ユニット及び観察ユニットとを光学的に接続する光路を合成する光路合成部とを備える顕微鏡接続ユニットが開示されている。この顕微鏡接続ユニットは、複数の光源から発せられた光を導く光学系、それに応じて発生した蛍光を複数波長ごとに検出するためのダイクロイックミラー、共焦点ピンホール、及び光電子増倍管を、同一の観察ユニット内に有している。このような構成では、複数の波長の励起光を用いてそれに応じて生じる蛍光を検出することにより、同一の装置で複数波長領域でのイメージングが実現される。

また、異なる波長の励起光を用いて蛍光サンプルを画像化する装置としては、下記特許文献２に記載のレーザスキャナ装置も知られている。このレーザスキャナ装置によれば、サンプルに集光される波長の異なる２つのレーザビームが空間的に分離され、それらのレーザビームによって誘起された２つの発光ビームも空間的に分離されて２つの検出器に向けて導光される。

特開２０１１－９０２４８号公報 特開２００９－１０４１３６号公報

蛍光物質が発する蛍光の波長分布は、一般的に広いため、複数の蛍光物質を含んだサンプルを観察する場合、それぞれの蛍光物質から発せられる蛍光の波長分布が重複することがある。このようなサンプルから発せられる蛍光を同時に検出する際に、目的とした蛍光物質からの蛍光だけでなく、他の蛍光物質からの蛍光も同じ検出器で検出してしまう問題がある。一般的に、このような問題をブリードスルー（Bleed Through）という。

引用文献２に記載のレーザスキャナ装置では、ウェッジ形状のダイクロイックミラーを用いて複数の蛍光を空間的に分離させて検出することで、ブリードスルーを低減しているが、スキャンミラーを用いた共焦点顕微鏡には応用が難しい。

実施形態は、かかる課題に鑑みてなされたものであり、簡易な構成により複数波長領域でのブリードスルーの少ない蛍光イメージングを可能にする共焦点顕微鏡ユニットを提供することを課題とする。

本開示の一形態に係る共焦点顕微鏡ユニットは、顕微鏡光学系を有する顕微鏡の接続ポートに取り付けられることにより、共焦点顕微鏡を構成する共焦点顕微鏡ユニットであって、第１の励起光を出力する光源、第１の励起光に応じて観察対象の試料から生じる第１の蛍光の光束を制限する第１の絞り部材、及び、第１の絞り部材を通過した第１の蛍光を検出する第１の光検出器を有する第１のサブユニットと、第２の励起光を出力する光源、第２の励起光に応じて試料から生じる第２の蛍光の光束を制限する第２の絞り部材、及び、第２の絞り部材を通過した第２の蛍光を検出する第２の光検出器を有する第２のサブユニットと、第１及び第２のサブユニットから出力された励起光を、顕微鏡光学系を経由して試料上を走査させ、励起光に応じて試料から生じる蛍光を第１及び第２のサブユニットに向けて導くスキャンミラーと、接続ポートに取り付け可能に構成され、スキャンミラー、第１のサブユニット、及び第２のサブユニットが固定されたメイン筐体と、を備え、第１のサブユニット及び第２のサブユニットは、スキャンミラーへの第１の励起光の入射角が、スキャンミラーへの第２の励起光の入射角に対して所定の角度ずれるように、メイン筐体内に配置される。

上記一形態によれば、第１のサブユニットから出力された第１の励起光がスキャンミラーを経由して試料上に走査され、それに応じて試料上から生じた第１の蛍光がスキャンミラーを経由して第１のサブユニット内に入射し、第１のサブユニット内の第１の絞り部材にその像が結ばれて第１の光検出器で検出される。加えて、第２のサブユニットから出力された第２の励起光がスキャンミラーを経由して試料上に走査され、それに応じて試料上から生じた第２の蛍光がスキャンミラーを経由して第２のサブユニット内に入射し、第２のサブユニット内の第２の絞り部材にその像が結ばれて第２の光検出器で検出される。ここで、これらのスキャンミラー、第１及び第２のサブユニットは、メイン筐体に固定されており、第１及び第２のサブユニットからスキャンミラーへの第１及び第２の励起光の入射角が互いに所定の角度ずらされているので、試料上に走査される第１及び第２の励起光のスポットを分離することができ、その結果、第１及び第２のサブユニットに導かれる第１及び第２の蛍光のビームを互いに分離することができる。これにより、ブリードスルーを低減した状態で複数の蛍光像の観察が可能にされる。加えて、スキャンミラーにより試料をスキャンする構成を採用することにより、全体の装置構成を簡素化することができる。

あるいは、本開示の他の形態は、上述の共焦点顕微鏡ユニットと、顕微鏡光学系及び共焦点顕微鏡ユニットが取り付けられる接続ポートを有する顕微鏡を備える共焦点顕微鏡である。このような共焦点顕微鏡によれば、所望の励起波長及び蛍光波長における共焦点イメージングを容易に行うことができる。

本開示の一側面によれば、簡易な構成によりブリードスルーを低減した状態で複数蛍光による蛍光イメージングを実現することができる。

第１実施形態にかかる共焦点顕微鏡１０１の概略構成図である。 共焦点顕微鏡１０１により形成される試料Ｍ上の第１の励起光のスポットのエアリディスクの範囲Ｓ_１及び第２の励起光のスポットのエアリディスクの範囲Ｓ_２の分布を示す図である。 共焦点顕微鏡１０１により試料Ｍ上に照射される第１の励起光及び第２の励起光のそれぞれのＸ軸方向に沿った一次元の光強度分布を示すグラフである。 第２実施形態にかかる共焦点顕微鏡ユニット１Ｂの概略構成図である。 第３及び第４のサブユニット６ｃ，６ｄの配置をＹ軸方向にシフトさせるための構造の一例を示す透視図である。 共焦点顕微鏡ユニット１Ｂにおけるスキャンミラー４に入射する励起光ビームの光束の軌跡を示す図である。 共焦点顕微鏡ユニット１Ｂにより形成される試料Ｍ上の励起光のスポットのエアリディスクの範囲の分布を示す図である。 第３実施形態にかかる共焦点顕微鏡ユニット１Ｃの概略構成図である。

以下、添付図面を参照して、本開示の実施形態について詳細に説明する。なお、説明において、同一要素又は同一機能を有する要素には、同一符号を用いることとし、重複する説明は省略する。

［第１実施形態］

図１は、第１実施形態にかかる共焦点顕微鏡１０１の概略構成図である。図１に示す共焦点顕微鏡１０１は、観察対象の試料Ｍの光学断層像の構築を可能とする画像を取得する共焦点顕微鏡を構成し、共焦点顕微鏡ユニット１Ａが顕微鏡５０の外部ユニット接続用の接続ポートＰ１に接続されて構成される。第１実施形態にかかる共焦点顕微鏡ユニット１Ａは、顕微鏡５０内の結像レンズ５１、対物レンズ５２等の顕微鏡光学系を経由して、顕微鏡５０のステージ上等に配置された試料Ｍに励起光を照射し、その励起光に応じて試料Ｍから生じた蛍光を、顕微鏡５０の顕微鏡光学系を経由して結像および受光（検出）して光学的断層像を生成して出力する装置である。

詳細には、共焦点顕微鏡ユニット１Ａは、メイン筐体２と、メイン筐体２の一部を構成し、顕微鏡５０の接続ポートＰ１に着脱可能に接続される鏡筒３と、メイン筐体２内に固定されたスキャンミラー４、固定ミラー５、第１～第２のサブユニット６ａ～６ｂと、鏡筒３内に固定されたスキャンレンズ７とを含んで構成される。以下、共焦点顕微鏡ユニット１Ａの各構成要素について詳細に説明する。

鏡筒３内のスキャンレンズ７は、スキャンミラー４の反射面を対物レンズ５２の瞳位置にリレーすると同時に、顕微鏡５０の顕微鏡光学系の１次結像面にスポットを結ぶ機能を有する光学素子である。これにより、スキャンミラー４と対物レンズ５２の射出瞳は共役関係つまり結像関係となる。スキャンレンズ７は、スキャンミラー４によって走査された励起光を顕微鏡光学系に導光することにより試料Ｍに照射させ、それに応じて試料Ｍから生じた蛍光をスキャンミラー４に導光する。

メイン筐体２内のスキャンミラー４は、例えば、反射板を２軸で傾動可能に構成されたＭＥＭＳ（Micro Electro Mechanical System）ミラー等の光走査素子である。スキャンミラー４は、反射角度を連続的に変更することにより、第１～第２のサブユニット６ａ～６ｂから出力された励起光を試料Ｍ上に走査させ、その励起光に応じて生じる蛍光を、第１～第２のサブユニット６ａ～６ｂに向けて導く役割を有する。

固定ミラー５は、メイン筐体２内に固定された光反射素子であり、第１～第２のサブユニット６ａ～６ｂから出力された励起光をスキャンミラー４に向けて反射させ、スキャンミラー４で反射された蛍光を励起光と同軸で第１～第２のサブユニット６ａ～６ｂに向けて反射する。

第１のサブユニット６ａは、ベース板８ａと、ベース板８ａ上に配置されたダイクロイックミラー（第１の光学ミラー）９ａ、光源１０ａ、コリメートレンズ１５ａ、ダイクロイックミラー１１ａ、バリアフィルタ１６ａ、集光レンズ１７ａ、ピンホール板（第１の絞り部材）１２ａ、及び光検出器（第１の光検出器）１３ａとを有する。

ダイクロイックミラー９ａは、固定ミラー５の蛍光の反射方向に固定され、第１のサブユニット６ａが照射する波長λ_１の第１の励起光及びそれに応じて試料Ｍから生じる波長範囲Δλ_１の第１の蛍光を反射し、第１の励起光及び第１の蛍光よりも長波長の光を透過させる性質を有するビームスプリッタである。ダイクロイックミラー１１ａは、ダイクロイックミラー９ａの第１の蛍光の反射方向に設けられ、波長範囲Δλ_１の第１の蛍光を透過し、波長範囲Δλ_１より短い波長λ_１の第１の励起光を反射させる性質を有するビームスプリッタである。光源１０ａは、波長λ_１の第１の励起光（例えば、レーザ光）を出力する発光素子（例えば、レーザダイオード）であり、第１の励起光がダイクロイックミラー１１ａによって第１の蛍光と同軸でダイクロイックミラー９ａに向けて反射されるように配置される。コリメートレンズ１５ａは、光源１０ａから出力された第１の励起光を平行光に変換する。

バリアフィルタ１６ａは、ダイクロイックミラー１１ａに隣接して設けられ、ダイクロイックミラー１１ａによって透過された第１の蛍光以外のノイズ光をカットするフィルタ部材である。集光レンズ１７ａは、バリアフィルタ１６ａを透過した第１の蛍光をピンホール板１２ａのピンホールに集光する。ピンホール板１２ａは、そのピンホール位置が試料Ｍの第１の励起光のスポットの共役位置に一致するように配置され、第１の蛍光の光束を制限する絞り部材であり、光源１０ａ等とともに共焦点光学系を構成する。このピンホール板１２ａは、ピンホールの径を外部から調整可能にされ、光検出器１３ａによって検出される画像の解像度と画像の信号強度を変更可能とする。

光検出器１３ａは、その検出面がピンホール板１２ａに対向して配置され、ピンホール板１２ａを通過した第１の蛍光を受光および検出する。なお、光検出器１３ａは、光電子増倍管、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、ＭＰＰＣ（Multi-Pixel Photon Counter）、ＨＰＤ（Hybrid Photo Detector）、或いはエリアイメージセンサ等である。

第２のサブユニット６ｂは、第１のサブユニット６ａと同様な構成要素を有する。

すなわち、第２のサブユニット６ｂは、ベース板８ｂと、ダイクロイックミラー（第２の光学ミラー）９ｂ、光源１０ｂ、コリメートレンズ１５ｂ、ダイクロイックミラー１１ｂ、バリアフィルタ１６ｂ、集光レンズ１７ｂ、ピンホール板（第２の絞り部材）１２ｂ、及び光検出器（第２の光検出器）１３ｂとを有する。

ダイクロイックミラー９ｂは、第２のサブユニット６ｂが照射する波長λ_２（＞λ_１）の第２の励起光及びそれに応じて試料Ｍから生じる波長範囲Δλ_２の第２の蛍光を反射し、第２の励起光及び第２の蛍光よりも長波長の光を透過させる性質を有する。なお、このダイクロイックミラー９ｂは、波長選択性を有さない単なる反射ミラーに置換されてもよい。ダイクロイックミラー１１ｂは、波長範囲Δλ_２の第２の蛍光を透過し、波長範囲Δλ_２より短い波長λ_２の第２の励起光を反射させる性質を有する。光源１０ｂは、波長λ_２の第２の励起光を出力する発光素子である。コリメートレンズ１５ｂは、光源１０ｂから出力された第２の励起光を平行光に変換する。

バリアフィルタ１６ｂは、ダイクロイックミラー１１ｂに隣接して設けられ、第２の蛍光以外のノイズ光をカットするフィルタ部材である。集光レンズ１７ｂは、バリアフィルタ１６ｂを透過した第２の蛍光をピンホール板１２ｂのピンホールに集光する。ピンホール板１２ｂは、そのピンホール位置が試料Ｍの第２の励起光のスポットの共役位置に一致するように配置され、第２の蛍光の光束を制限する絞り部材である。

光検出器１３ｂは、その検出面がピンホール板１２ｂに対向して配置され、ピンホール板１２ｂを通過した第２の蛍光を受光および検出する。なお、光検出器１３ｂは、光電子増倍管、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、ＭＰＰＣ（Multi-Pixel Photon Counter）、ＨＰＤ（Hybrid Photo Detector）、或いはエリアイメージセンサ等である。

上記構成の第１～第２のサブユニット６ａ～６ｂの配置について説明する。以下の説明では、スキャンレンズ７の光軸に沿った方向にＺ軸をとり、Ｚ軸に垂直で、かつサブユニット６ａ，６ｂのベース板８ａ，８ｂに沿った方向にＸ軸をとり、Ｚ軸及びＸ軸に垂直な方向にＹ軸をとるものとする。

第１及び第２のサブユニット６ａ，６ｂは、スキャンミラー４及び固定ミラー５による第１及び第２の蛍光の導光方向（Ｚ軸方向）に沿って、この順番で固定ミラー５から離れる方向に並ぶように、かつ、第１及び第２の蛍光の光路上にダイクロイックミラー９ａ，９ｂが位置するように、メイン筐体２を構成するベース板１４上に固定されている。詳細には、第２のサブユニット６ｂは、第１のサブユニット６ａに対して、ダイクロイックミラー９ａ，９ｂの中心位置を基準にして、第１の蛍光の導光方向に略垂直な方向（Ｘ軸方向）にシフトするように、配置されている。さらに、ダイクロイックミラー９ａは、反射する第１の励起光が固定ミラー５を経由してスキャンミラー４の反射面の中心に入射するように、その設置角が設定されている。同様に、ダイクロイックミラー９ｂは、反射する第２の励起光がダイクロイックミラー９ａ及び固定ミラー５を経由してスキャンミラー４の反射面の中心に入射するように、その設置角が設定されている。このように配置されることにより、第１の励起光のスキャンミラー４への入射角が、第２の励起光のスキャンミラー４への入射角に対して所定の角度θ_Ｓずれるように設定される。

上記の第１及び第２のサブユニット６ａ，６ｂのＸ軸方向のシフト量、及び、２つのダイクロイックミラー９ａ，９ｂの設置角は、次の条件を満たすように設定される。つまり、上記の所定の角度θ_Ｓが、試料Ｍ上に入射する第１の励起光のスポットのエアリディスクが、試料Ｍ上に入射する第２の励起光のスポットのエアリディスクに重ならないような角度となるように設定される。一般に、エアリディスクの径φは、入射する励起光の波長をλと仮定し、対物レンズ５２の開口数をＮＡと仮定すると、下記式（１）；
φ＝１．２２×λ／ＮＡ …（１）
により計算される。そのため、２つの励起光のスポットが重ならないようにするための試料Ｍ上の第１及び第２の励起光のスポット間のずらし量Δｄの最小値Δｄ_ｍｉｎは、下記式（２）；
Δｄ_ｍｉｎ＝φ_１／２＋φ_２／２，
φ_１＝１．２２×λ_１／ＮＡ，
φ_２＝１．２２×λ_２／ＮＡ …（２）
で計算できる。

ここで、スキャンミラー４と対物レンズ５２の射出瞳は共役の関係にあるので、スキャンミラー４の反射面の中心に入射する第１及び第２の励起光のそれぞれの光束は対物レンズ５２の射出瞳中心に入射する。その際に、対物レンズ５２への入射角は、スキャンレンズ７の結像倍率に従って変わる。対物レンズ５２はテレセントリックレンズであるため、試料Ｍ上においては第１及び第２の励起光の主光線が対物レンズ５２の光軸に平行な方向（Ｚ軸方向）となり、射出瞳への入射角に応じて２つの励起光のスポットの位置が試料Ｍ上でシフトする。この２つの励起光のスポットが試料Ｍ上で重ならないようにするために、スキャンミラー４への入射角のずれの角度θ_Ｓが、下記式（３）によって計算される角度θ_Ｓｍｉｎ以上となるように設定される。
θ_Ｓｍｉｎ＝ａｒｃｔａｎ（Δｄ_ｍｉｎ／ｆ）／ｍａｇｓ …（３）
で計算される。なお、ｍａｇｓはスキャンレンズ７の倍率、ｆは対物レンズ５２の焦点距離である。

また、各サブユニット６ａ，６ｂのピンホール板１２ａ、１２ｂのピンホールの径は、下記式（４）及び下記式（５）により計算されるエアリユニット（ＡＵ_１，ＡＵ_２）の値より小さく設定される。このように設定することで、蛍光像における波長間のクロストークを有効に防ぐことができる。
ＡＵ_１＝ｍａｇ_ｔ×φ_１ …（４）
ＡＵ_２＝ｍａｇ_ｔ×φ_２ …（５）
ここで、ｍａｇ_ｔは、蛍光を観察するための光学系のトータルの倍率を示す。

図２には、共焦点顕微鏡１０１により形成される試料Ｍ上の第１の励起光のスポットのエアリディスクの範囲Ｓ_１及び第２の励起光のスポットのエアリディスクの範囲Ｓ_２の分布を示し、図３には、共焦点顕微鏡１０１により試料Ｍ上に照射される第１の励起光及び第２の励起光のそれぞれのＸ軸方向に沿った一次元の光強度分布を示している。このように、試料Ｍ上に結ばれる第１及び第２の励起光のスポットの範囲Ｓ_１，Ｓ_２が互いに重ならないようにされることで、試料Ｍ上における２つの励起光の強度分布が分離され、その結果、２つの励起光によって生じる２つの波長域の蛍光像間の干渉が低減されることになる。

以上説明した共焦点顕微鏡ユニット１Ａによれば、第１のサブユニット６ａから出力された第１の励起光がスキャンミラー４を経由して試料Ｍ上に走査され、それに応じて試料Ｍ上から生じた第１の蛍光がスキャンミラー４を経由して第１のサブユニット６ａ内に入射し、第１のサブユニット６ａ内のピンホール板１２ａにその像が結ばれて光検出器１３ａで検出される。加えて、第２のサブユニット６ｂから出力された第２の励起光がスキャンミラー４を経由して試料Ｍ上に走査され、それに応じて試料Ｍ上から生じた第２の蛍光がスキャンミラー４を経由して第２のサブユニット６ｂ内に入射し、第２のサブユニット６ｂ内のピンホール板１２ｂにその像が結ばれて光検出器１３ｂで検出される。ここで、これらのスキャンミラー４、第１及び第２のサブユニット６ａ，６ｂは、メイン筐体２に固定されており、第１及び第２のサブユニット６ａ，６ｂからスキャンミラー４への第１及び第２の励起光の入射角が互いに所定の角度θ_Ｓずらされているので、試料Ｍ上に走査される第１及び第２の励起光のスポットを分離することができ、その結果、第１及び第２のサブユニット６ａ，６ｂに導かれる第１及び第２の蛍光のビームを互いに分離することができる。これにより、ブリードスルーを低減した状態で複数の蛍光像の観察が可能にされる。加えて、スキャンミラー４により試料Ｍをスキャンする構成を採用することにより、全体の装置構成を簡素化することができる。

あるいは、共焦点顕微鏡１０１は、上述の共焦点顕微鏡ユニット１Ａと、顕微鏡光学系及び共焦点顕微鏡ユニット１Ａが取り付けられる接続ポートＰ１を有する顕微鏡５０を備える共焦点顕微鏡である。このような共焦点顕微鏡１０１によれば、一般的な光学顕微鏡である顕微鏡５０を用いて、共焦点イメージングを容易に行うことができる。

上記実施形態にかかる共焦点顕微鏡ユニット１Ａにおいては、ダイクロイックミラー９ａ，９ｂが、スキャンミラー４への第１及び第２の励起光の入射角のずれが所定の角度θ_Ｓとなるように、メイン筐体２内に配置されている。このような構成により、試料Ｍ上に走査される第１及び第２の励起光のスポットを分離することができ、その結果、第１及び第２のサブユニット６ａ，６ｂに導かれる第１及び第２の蛍光のビームを互いに分離することができる。これにより、ブリードスルーを低減した状態で複数の蛍光像の観察が可能にされる。

また、共焦点顕微鏡ユニット１Ａにおいては、所定の角度θ_Ｓが試料Ｍ上において第１の励起光のエアリディスクと第２の励起光のエアリディスクとが分離されるような角度に設定されている。このような角度設定により、試料Ｍ上に走査される第１及び第２の励起光のスポットを完全に分離することができる。その結果、第１及び第２のサブユニット６ａ，６ｂに導かれる第１及び第２の蛍光のビームを互いに完全に分離することができる。これにより、ブリードスルーを低減した状態で複数の蛍光像の観察が可能にされる。

上記実施形態においては、スキャンミラー４はＭＥＭＳミラーが採用されている。このような構成により、ユニットの小型化を容易に実現することができる。

また、共焦点顕微鏡ユニット１Ａにおいては、第１のサブユニット６ａと第２のサブユニット６ｂとは、スキャンミラー４による蛍光の導光方向に沿って順に並んだ状態でメイン筐体２に固定されている。このような構成により、第２のサブユニット６ｂから照射された第２の励起光を、第１のサブユニット６ａを経由して顕微鏡５０側の試料Ｍに向けて照射することができるとともに、それに応じて試料Ｍから生じる第２の蛍光を、第１のサブユニット６ａを経由して第２のサブユニット６ｂ内に導入することできる。その結果、複数波長領域での共焦点イメージングを実現するユニットの小型化が可能となる。

［第２実施形態］
図４は、第２実施形態にかかる共焦点顕微鏡ユニット１Ｂの概略構成図である。図４に示す共焦点顕微鏡ユニット１Ｂは、４つのサブユニットを有する点が第１実施形態の共焦点顕微鏡ユニット１Ａと異なる。以下、共焦点顕微鏡ユニット１Ｂの構成について、第１実施形態との相違点を中心に説明する。

すなわち、共焦点顕微鏡ユニット１Ｂは、メイン筐体２内に第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄを備えている。

第３のサブユニット６ｃは、ベース板８ｃと、ダイクロイックミラー（第３の光学ミラー）９ｃ、光源１０ｃ、コリメートレンズ１５ｃ、ダイクロイックミラー１１ｃ、バリアフィルタ１６ｃ、集光レンズ１７ｃ、ピンホール板（第３の絞り部材）１２ｃ、及び光検出器（第３の光検出器）１３ｃとを有する。

ダイクロイックミラー９ｃは、第３のサブユニット６ｃが照射する波長λ_３（＞λ_２）の第３の励起光及びそれに応じて試料Ｍから生じる波長範囲Δλ_３の第３の蛍光を反射し、第３の励起光及び第３の蛍光よりも長波長の光を透過させる性質を有する。ダイクロイックミラー１１ｃは、波長範囲Δλ_３の第３の蛍光を透過し、波長範囲Δλ_３より短い波長λ_３の第３の励起光を反射させる性質を有する。光源１０ｃは、波長λ_３の第３の励起光を出力する発光素子である。コリメートレンズ１５ｃは、光源１０ｃから出力された第３の励起光を平行光に変換する。

バリアフィルタ１６ｃは、ダイクロイックミラー１１ｃに隣接して設けられ、第３の蛍光以外のノイズ光をカットするフィルタ部材である。集光レンズ１７ｃは、バリアフィルタ１６ｃを透過した第３の蛍光をピンホール板１２ｃのピンホールに集光する。ピンホール板１２ｃは、そのピンホール位置が試料Ｍの第３の励起光のスポットの共役位置に一致するように配置され、第３の蛍光の光束を制限する絞り部材である。

光検出器１３ｃは、その検出面がピンホール板１２ｃに対向して配置され、ピンホール板１２ｃを通過した第３の蛍光を受光および検出する。なお、光検出器１３ｃは、光電子増倍管、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、ＭＰＰＣ（Multi-Pixel Photon Counter）、ＨＰＤ（Hybrid Photo Detector）、或いはエリアイメージセンサ等である。

第４のサブユニット６ｄは、ベース板８ｄと、全反射ミラー（第４の光学ミラー）９ｄ、光源１０ｄ、コリメートレンズ１５ｄ、ダイクロイックミラー１１ｄ、バリアフィルタ１６ｄ、集光レンズ１７ｄ、ピンホール板（第４の絞り部材）１２ｄ、及び光検出器（第４の光検出器）１３ｄとを有する。

全反射ミラー９ｄは、第４のサブユニット６ｄが照射する波長λ_４（＞λ_３）の第４の励起光及びそれに応じて試料Ｍから生じる波長範囲Δλ_４の第４の蛍光を反射する。ダイクロイックミラー１１ｄは、波長範囲Δλ_４の第４の蛍光を透過し、波長範囲Δλ_４より短い波長λ_４の第４の励起光を反射させる性質を有する。光源１０ｄは、波長λ_４の第４の励起光を出力する発光素子である。コリメートレンズ１５ｄは、光源１０ｄから出力された第４の励起光を平行光に変換する。

バリアフィルタ１６ｄは、ダイクロイックミラー１１ｄに隣接して設けられ、第４の蛍光以外のノイズ光をカットするフィルタ部材である。集光レンズ１７ｄは、バリアフィルタ１６ｄを透過した第４の蛍光をピンホール板１２ｄのピンホールに集光する。ピンホール板１２ｄは、そのピンホール位置が試料Ｍの第４の励起光のスポットの共役位置に一致するように配置され、第４の蛍光の光束を制限する絞り部材である。

光検出器１３ｄは、その検出面がピンホール板１２ｄに対向して配置され、ピンホール板１２ｄを通過した第４の蛍光を受光および検出する。なお、光検出器１３ｄは、光電子増倍管、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、ＭＰＰＣ（Multi-Pixel Photon Counter）、ＨＰＤ（Hybrid Photo Detector）、或いはエリアイメージセンサ等である。

第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄは、スキャンミラー４及び固定ミラー５による第１～第４の蛍光の導光方向（Ｚ軸方向）に沿って、この順番で固定ミラー５から離れる方向に並ぶように、かつ、第１～第４の蛍光の光路上にダイクロイックミラー９ａ～９ｃ及び全反射ミラー９ｄが位置するように、メイン筐体２内に固定される。詳細には、第４のサブユニット６ｄは、第３のサブユニット６ｃに対して、ダイクロイックミラー９ｃ及び全反射ミラー９ｄの中心位置を基準に、Ｘ軸方向にシフトするように配置されている。また、第３及び第４のサブユニット６ｃ，６ｄは、第１及び第２のサブユニット６ａ，６ｂに対して、ダイクロイックミラー９ａ～９ｃ及び全反射ミラー９ｄの中心位置を基準に、Ｙ軸方向にシフトするようにも配置されている。さらに、ダイクロイックミラー９ａ～９ｃ及び全反射ミラー９ｄは、それぞれが反射する第１～第４の励起光がスキャンミラー４の反射面の中心に入射するように、それぞれの設置角が設定されている。このように配置されることにより、隣接する２つのサブユニットからスキャンミラー４に入射する２つの蛍光の入射角が、互いに所定の角度θ_Ｓ以上ずれるように設定される。

図５は、第３及び第４のサブユニット６ｃ，６ｄの配置をＹ軸方向にシフトさせるための構造を、鏡筒３側から見た透視図である。このように、本実施形態では、メイン筐体２のベース板１４上に平板状のスペーサ２１を配置し、そのスペーサ２１上に第３及び第４のサブユニット６ｃ，６ｄを搭載する構造を採用する。このような構造により、第３及び第４のサブユニット６ｃ，６ｄを第１及び第２のサブユニット６ａ，６ｂに対してＹ軸方向に所望の幅だけシフトさせて配置することができる。

図６には、共焦点顕微鏡ユニット１Ｂにおける第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄからスキャンミラー４に入射する第１～第４の励起光ビームの光束Ｂ_１～Ｂ_４の軌跡を示し、図７には、共焦点顕微鏡ユニット１Ｂにより形成される試料Ｍ上の第１～第４の励起光のスポットのエアリディスクの範囲Ｓ_１～Ｓ_４の分布を示している。図６には、各励起光ビームの光束Ｂ_１～Ｂ_４の外縁を実線で示し、各励起光ビームの光束Ｂ_１～Ｂ_４の中心ＢＣ_１～ＢＣ_４を一点鎖線で示している。共焦点顕微鏡ユニット１Ｂによれば、第１～第４の励起光ビームがスキャンミラー４の入射面ＲＦの中心に入射するように設定され、第１～第４の励起光ビームが互いに入射角が２次元方向にずれるように設定される。また、互いの入射角のずれが所定の角度θ_Ｓ以上とされることにより、試料Ｍ上に結ばれる第１～第４の励起光のスポットのエアリディスクの範囲Ｓ_１～Ｓ_４が互いに重ならないように設定される。

上記の第２実施形態に係る共焦点顕微鏡ユニット１Ｂによれば、試料Ｍ上に走査される第１～第４の励起光のスポットを分離することができ、その結果、第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄに導かれる第１～第４の蛍光のビームを互いに分離することができる。これにより、４種類の励起波長を用いてもブリードスルーを低減した状態で蛍光像の観察が可能にされる。

［第３実施形態］
図８は、第３実施形態にかかる共焦点顕微鏡ユニット１Ｃの概略構成図である。図８に示す共焦点顕微鏡ユニット１Ｃは、２つのサブユニット６ａ，６ｂのベース板８ａ，８ｂ上におけるダイクロイックミラー９ａ，９ｂの配置が同一である点で第１実施形態の共焦点顕微鏡ユニット１Ａと異なる。以下、共焦点顕微鏡ユニット１Ｃの構成について、第１実施形態との相違点を中心に説明する。

第１のサブユニット６ａ内のベース板８ａ上におけるダイクロイックミラー９ａ以外の要素、すなわち、光源１０ａ、コリメートレンズ１５ａ、ダイクロイックミラー１１ａ、バリアフィルタ１６ａ、集光レンズ１７ａ、ピンホール板１２ａ、及び光検出器１３ａを含む要素のダイクロイックミラー９ａを基準にした配置が、第２のサブユニット６ｂ内のベース板８ｂ上におけるダイクロイックミラー９ｂ以外の要素、すなわち、光源１０ｂ、コリメートレンズ１５ｂ、ダイクロイックミラー１１ｂ、バリアフィルタ１６ｂ、集光レンズ１７ｂ、ピンホール板１２ｂ、及び光検出器１３ｂを含む要素のダイクロイックミラー９ｂを基準にした配置と異なるように調整されている。この調整は、例えば、第１のサブユニット６ａ内のダイクロイックミラー９ａ以外の要素、あるいは、第２のサブユニット６ｂ内のダイクロイックミラー９ｂ以外の要素が、ベース板８ａ，８ｂ上で一体的にその姿勢及びその位置を変更可能にされることで実現される。

詳細には、第１及び第２のサブユニット６ａ，６ｂの上記構成により、第１のサブユニット６ａ内におけるダイクロイックミラー９ａに対する第１の励起光の入射角・入射位置、及び、第２のサブユニット６ｂ内におけるダイクロイックミラー９ｂに対する第２の励起光の入射角・入射位置が、第１の励起光のスキャンミラー４への入射角と第２の励起光のスキャンミラー４への入射角とが所定の角度θ_Ｓずれるように、設定される。

上記の第２実施形態に係る共焦点顕微鏡ユニット１Ｃによれば、第１及び第２のサブユニット６ａ，６ｂにおける第１及び第２のダイクロイックミラー９ａ，９ｂに対する励起光の入射角を設定することにより、試料Ｍ上に走査される第１及び第２の励起光のスポットを分離することができ、その結果、第１及び第２のサブユニット６ａ，６ｂに導かれる第１及び第２の蛍光のビームを互いに分離することができる。これにより、ブリードスルーを低減した状態で２つの蛍光波長における蛍光像の観察が可能にされる。

以上、本開示の種々の実施形態について説明したが、本開示は上記実施形態に限定されるものではなく、各請求項に記載した要旨を変更しない範囲で変形し、又は他のものに適用したものであってもよい。

上記実施形態は、共焦点光学系を構成するために絞り部材としてピンホール板を用いているが、絞り部材は光束を制限する光学素子であればよく、例えば、虹彩絞りやファイバコアなどであってもよい。ファイバ出力タイプの光源を用いる場合、ファイバコア端面の位置を絞り位置（光束が制限される位置）とすればよい。

また、上記実施形態は、固体レーザやダイオードレーザなどのレーザ光源を用いることもできる。この場合、これらのレーザ光源のビームウェストの位置を絞り位置（光束が制限される位置）とすればよく、光源自体が絞り部材の役割を果たすことになる。

上記第１～第３実施形態においては、扱う励起光及び蛍光の波長範囲が短い順番でスキャンミラー４側から離れる方向に複数のサブユニットが配置されていたが、波長範囲が長い順番で配置されてもよい。ただし、この場合、ダイクロイックミラー９ａ～９ｃの特性は、各サブユニット６ａ～６ｃのそれぞれで扱う比較的長波長の励起光及び蛍光を反射し、他のサブユニットで扱う比較的短波長の励起光及び蛍光を透過するような特性に設定される。

上記第２実施形態においては、全てのサブユニット６ａ～６ｄのうちの２つのサブユニット間で試料Ｍ上に結ばれる励起光のスポットが重ならないように構成されていたが、隣り合うサブユニット間でスポットが重ならないように構成されていればよい。例えば、第１のサブユニット６ａと第２のサブユニット６ｂとの間、第２のサブユニット６ｂと第３のサブユニット６ｃとの間、及び第３のサブユニット６ｃと第４のサブユニット６ｄとの間で、励起光のスポットが重ならないように構成されていればよい。これに対して、第１のサブユニット６ａと第３のサブユニット６ｃとの間、あるいは、第２のサブユニット６ｂと第４のサブユニット６ｄとの間では、励起光のスポットが重なっていてもよい。この場合であっても、ダイクロイックミラーによって、一方のサブユニットの観察対象の蛍光と他方のサブユニットの観察対象の蛍光とを容易に分離することができる。具体的な構成としては、第２の実施形態にかかる共焦点顕微鏡ユニット１Ｂにおいては、第３及び第４のサブユニット６ｃ，６ｄは、第１及び第２のサブユニット６ａ，６ｂに対してＹ軸方向にずらすことなく配置されていてもよい。このような構成でも、波長領域の近い２つの励起光のスポットを試料Ｍ上で分離することができるので、検出される複数の波長範囲の蛍光ビームが互いに影響しあうことを防ぐことができ、ブリードスルーを低減した状態で複数の蛍光像の観察が可能にされる。

上記実施形態においては、第１のサブユニットは、第１の励起光及び第１の蛍光を反射し、第２の励起光及び第２の蛍光を透過する第１の光学ミラーを有し、第２のサブユニットは、第２の励起光及び第２の蛍光を反射する第２の光学ミラーを有し、第１の光学ミラー及び第２の光学ミラーが、スキャンミラーへの第１の励起光の入射角が、スキャンミラーへの第２の励起光の入射角に対して所定の角度ずれるように、メイン筐体内に配置されてもよい。これにより、第１及び第２の光学ミラーのメイン筐体内での配置を設定することにより、試料上に走査される第１及び第２の励起光のスポットを分離することができ、その結果、第１及び第２のサブユニットに導かれる第１及び第２の蛍光のビームを互いに分離することができる。これにより、ブリードスルーを低減した状態で複数の蛍光像の観察が可能にされる。

また、第１のサブユニットは、第１の励起光及び第１の蛍光を反射し、第２の励起光及び第２の蛍光を透過する第１の光学ミラーを有し、第２のサブユニットは、第２の励起光及び第２の蛍光を反射する第２の光学ミラーを有し、第１のサブユニット及び第２のサブユニットは、第１の光学ミラーへの第１の励起光の入射角と、第２の光学ミラーへの第２の励起光の入射角とが、スキャンミラーへの第１の励起光の入射角が、スキャンミラーへの第２の励起光の入射角に対して所定の角度ずれるように、設定されてもよい。この場合、第１及び第２のサブユニットにおける第１及び第２の光学ミラーに対する励起光の入射角を設定することにより、試料上に走査される第１及び第２の励起光のスポットを分離することができ、その結果、第１及び第２のサブユニットに導かれる第１及び第２の蛍光のビームを互いに分離することができる。これにより、ブリードスルーを低減した状態で複数の蛍光像の観察が可能にされる。

さらに、上記の所定の角度は、試料上において、第１の励起光のエアリディスクと第２の励起光のエアリディスクとが分離されるような角度である、ことが好適である。このような角度にすれば、試料上に走査される第１及び第２の励起光のスポットを完全に分離することができ、その結果、第１及び第２のサブユニットに導かれる第１及び第２の蛍光のビームを互いに完全に分離することができる。これにより、ブリードスルーがない状態で複数の蛍光像の観察が可能にされる。

上記実施形態においては、スキャンミラーはＭＥＭＳミラーであってもよい。この場合、装置の小型化を容易に実現することができる。

また、第１のサブユニットと第２のサブユニットとは、スキャンミラーによる蛍光の導光方向に沿って、第１のサブユニットおよび第２のサブユニットの順で並んだ状態でメイン筐体に固定されてもよい。かかる構成によれば、第２のサブユニットから照射された第２の励起光を、第１のサブユニットを経由して顕微鏡側の試料に向けて照射することができるとともに、それに応じて試料から生じる第２の蛍光を、第１のサブユニットを経由して第２のサブユニット内に導入することできる。その結果、複数波長領域でのイメージングを実現する装置の小型化が可能となる。

実施形態は、共焦点顕微鏡を構成する共焦点顕微鏡ユニット及び共焦点顕微鏡を使用用途とし、簡易な構成によりブリードスルーを低減した状態で複数蛍光による蛍光イメージングを実現できるものである。

Ｍ…試料、Ｐ１…接続ポート、θ_Ｓ…所定の角度、１０ａ～１０ｄ…光源、１２ａ～１２ｄ…ピンホール板（絞り部材）、１３ａ～１３ｄ…光検出器、６ａ～６ｄ…第１～第４のサブユニット、９ａ～９ｃ…ダイクロイックミラー（第１～第３の光学ミラー）、９ｄ…全反射ミラー（第４の光学ミラー）、１Ａ，１Ｂ，１Ｃ…共焦点顕微鏡ユニット、２…メイン筐体、３…鏡筒、４…スキャンミラー、７…スキャンレンズ、５０…顕微鏡、１０１…共焦点顕微鏡。

Claims (6)

1. 顕微鏡光学系を有する顕微鏡の接続ポートに取り付けられることにより、共焦点顕微鏡を構成する共焦点顕微鏡ユニットであって、
   第１の励起光を出力する光源、前記第１の励起光に応じて観察対象の試料から生じる第１の蛍光の光束を制限する第１の絞り部材、及び、前記第１の絞り部材を通過した第１の蛍光を検出する第１の光検出器を有する第１のサブユニットと、
   第２の励起光を出力する光源、前記第２の励起光に応じて前記試料から生じる第２の蛍光の光束を制限する第２の絞り部材、及び、前記第２の絞り部材を通過した第２の蛍光を検出する第２の光検出器を有する第２のサブユニットと、
   前記第１及び第２のサブユニットから出力された励起光を、前記顕微鏡光学系を経由して前記試料上を走査させ、前記励起光に応じて前記試料から生じる蛍光を前記第１及び第２のサブユニットに向けて導くスキャンミラーと、
   前記接続ポートに取り付け可能に構成され、前記スキャンミラー、前記第１のサブユニット、及び前記第２のサブユニットが固定されたメイン筐体と、
   を備え、
   前記第１のサブユニット及び前記第２のサブユニットは、前記スキャンミラーへの前記第１の励起光の入射角が、前記スキャンミラーへの第２の励起光の入射角に対して所定の角度ずれるように、前記メイン筐体内に配置され、
   前記第１のサブユニットは、前記第１の励起光及び前記第１の蛍光を反射し、前記第２の励起光及び前記第２の蛍光を透過する第１の光学ミラーを有し、
   前記第２のサブユニットは、前記第２の励起光及び前記第２の蛍光を反射する第２の光学ミラーを有し、
   前記第１の光学ミラー及び前記第２の光学ミラーが、前記スキャンミラーへの前記第１の励起光の入射角が、前記スキャンミラーへの第２の励起光の入射角に対して所定の角度ずれるように、前記メイン筐体内に配置される、
   共焦点顕微鏡ユニット。
2. 顕微鏡光学系を有する顕微鏡の接続ポートに取り付けられることにより、共焦点顕微鏡を構成する共焦点顕微鏡ユニットであって、
   第１の励起光を出力する光源、前記第１の励起光に応じて観察対象の試料から生じる第１の蛍光の光束を制限する第１の絞り部材、及び、前記第１の絞り部材を通過した第１の蛍光を検出する第１の光検出器を有する第１のサブユニットと、
   第２の励起光を出力する光源、前記第２の励起光に応じて前記試料から生じる第２の蛍光の光束を制限する第２の絞り部材、及び、前記第２の絞り部材を通過した第２の蛍光を検出する第２の光検出器を有する第２のサブユニットと、
   前記第１及び第２のサブユニットから出力された励起光を、前記顕微鏡光学系を経由して前記試料上を走査させ、前記励起光に応じて前記試料から生じる蛍光を前記第１及び第２のサブユニットに向けて導くスキャンミラーと、
   前記接続ポートに取り付け可能に構成され、前記スキャンミラー、前記第１のサブユニット、及び前記第２のサブユニットが固定されたメイン筐体と、
   を備え、
   前記第１のサブユニット及び前記第２のサブユニットは、前記スキャンミラーへの前記第１の励起光の入射角が、前記スキャンミラーへの第２の励起光の入射角に対して所定の角度ずれるように、前記メイン筐体内に配置され、
   前記第１のサブユニットは、前記第１の励起光及び前記第１の蛍光を反射し、前記第２の励起光及び前記第２の蛍光を透過する第１の光学ミラーを有し、
   前記第２のサブユニットは、前記第２の励起光及び前記第２の蛍光を反射する第２の光学ミラーを有し、
   前記第１のサブユニット及び前記第２のサブユニットは、前記第１の光学ミラーへの前記第１の励起光の入射角と、前記第２の光学ミラーへの第２の励起光の入射角とが、前記スキャンミラーへの前記第１の励起光の入射角が前記スキャンミラーへの第２の励起光の入射角に対して所定の角度ずれるように、設定される、
   共焦点顕微鏡ユニット。
3. 前記所定の角度は、前記試料上において、前記第１の励起光のエアリディスクと前記第２の励起光のエアリディスクとが分離されるような角度である、
   請求項１又は２に記載の共焦点顕微鏡ユニット。
4. 前記スキャンミラーはＭＥＭＳミラーである、
   請求項１～３のいずれか１項に記載の共焦点顕微鏡ユニット。
5. 前記第１のサブユニットと前記第２のサブユニットとは、前記スキャンミラーによる前記蛍光の導光方向に沿って、前記第１のサブユニットおよび前記第２のサブユニットの順で並んだ状態で前記メイン筐体に固定されている、
   請求項１～４のいずれか１項に記載の共焦点顕微鏡ユニット。
6. 請求項１～５のいずれか１項に記載の共焦点顕微鏡ユニットと、
   前記顕微鏡光学系及び前記共焦点顕微鏡ユニットが取り付けられる接続ポートを有する顕微鏡を備える、共焦点顕微鏡。

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