JP5136294B2 - 共焦点顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は、共焦点蛍光顕微鏡などの共焦点顕微鏡に関する。

共焦点顕微鏡は、光源から射出した照明光束を被検物に向けて集光する照射光学系と、被検物から射出した光を、照射光束の集光点と共役な位置に配置された共焦点絞り（ピンホール部材）を介して検出する検出光学系とを備える（特許文献１などを参照）。

この構成では、被検物から射出した光のうち照明光束の集光点と同じ高さ位置（光軸方向の位置）から射出した光はピンホール部材を通過し、照明光束の集光点とは異なる高さ位置から射出した光の大部分はピンホール部材で阻止されるので、照射光学系の焦点を所望の高さ位置に合わせ、照明光束の光スポットで被検物上を二次元走査しながら前記検出を繰り返せば、その高さ位置における被検物の断面画像を取得することができる。

さらに、被検物に対する集光点の高さ位置を変化させながら断面画像の取得を繰り返し、各高さ位置で取得した断面画像を合成すれば、被検物の三次元画像を取得することもできる。

このような共焦点顕微鏡では、その光学系部分の遮断周波数（以下、「光学的な遮断周波数」と称す。）が高いほど、三次元画像上で観察可能な最小構造の空間周波数（以下、「実効的な遮断周波数」と称す。）も高くなることが一般に知られている。
特開２００７−２７９０８５号公報

しかしながら、共焦点顕微鏡の光学的な遮断周波数は、対物レンズの解像力によってほぼ決まってしまうので、それを高めることは容易ではない。

そこで本発明の目的は、光学的な遮断周波数を高めずとも実効的な遮断周波数を高めることのできる共焦点顕微鏡を提供することにある。

本発明を例示する共焦点顕微鏡の一態様は、レーザ光源から供給されるレーザ光を被検物に向けて集光する照射光学系と、前記レーザ光に応じて前記被検物で生じる射出光を、前記レーザ光の集光点と共役な位置に配置された共焦点絞りを介して検出する検出光学系とを備え、前記照射光学系と前記検出光学系との何れか一方の単独光路における対物レンズ瞳面又はその共役面には、瞳周辺部及び瞳中心部の透過率が他の部分の透過率より高い空間周波数素子が配置されることを特徴とする。

本発明によれば、光学的な遮断周波数を高めずとも実効的な遮断周波数を高めることのできる共焦点顕微鏡が実現する。

以下、本発明の第１実施形態を説明する。本実施形態は、共焦点レーザ蛍光顕微鏡システムの実施形態である。

先ず、本システムの構成を説明する。

図１は、共焦点レーザ蛍光顕微鏡システムの構成図である。図１に示すとおり本システムには、顕微鏡本体１と、顕微鏡本体１に光ファイバ１３で接続されたレーザユニット１２と、顕微鏡本体１に光ファイバ２０で接続された蛍光検出ユニット２とが備えられる。

レーザユニット１２には、互いに異なる波長のレーザ光を発光する第１レーザ光源１２１、第２レーザ光源１２２、第３レーザ光源１２３が備えられる。このレーザユニット１２には、ＡＯＴＦ等の波長可変フィルタ１２Ａとシャッタ１００とが備えられ、波長可変フィルタ１２Ａ及びシャッタ１００の動作の組み合わせにより、使用レーザ光源の変更や、レーザユニット１２から射出するレーザ光のオン／オフ制御を行うことが可能である。

顕微鏡本体１には、コリメートレンズ１４と、空間周波数フィルタ３０と、リレーレンズ１４Ａと、ダイクロイックミラー１５と、１対のガルバノミラーを備えたスキャナ１６と、対物レンズ１７と、リレーレンズ１８Ａと、結像レンズ１８と、共焦点絞り（ピンホール部材）１９と、ステージ１１とが備えられる。このうちコリメートレンズ１４、空間周波数フィルタ３０、リレーレンズ１４Ａ、ダイクロイックミラー１５、スキャナ１６、対物レンズ１７が照射光学系１−１を構成し、対物レンズ１７、スキャナ１６、ダイクロイックミラー１５、リレーレンズ１８Ａ、結像レンズ１８、共焦点絞り１９が検出光学系１−２を構成しており、照射光学系１−１と検出光学系１−２とは、対物レンズ１７、スキャナ１６、ダイクロイックミラー１５を共有している。なお、照射光学系１−１の空間周波数フィルタ３０は、対物レンズ１７の瞳に対して共役関係となる位置に配置されており、検出光学系１−２の共焦点絞り１９は、対物レンズ１７の焦点に対して共役関係となる位置に配置されている。

ステージ１１には、標本１０Ａが支持される。標本１０Ａは、蛍光物質で染色された生体標本であり、その蛍光物質の励起波長は、第１レーザ光源１２１の発光波長と同じである。

蛍光検出ユニット２には、第１ダイクロイックミラー２１と、第２ダイクロイックミラー２２と、第１バリアフィルタ２１１と、第２バリアフィルタ２１２と、第３バリアフィルタ２１３と、第１ＰＭＴ２０１と、第２ＰＭＴ２０２と、第３ＰＭＴ２０３とが備えられる。このうち第１ダイクロイックミラー２１は、標本１０Ａに含まれる蛍光物質の蛍光波長と同じ波長帯域の光を反射し、それ以外の波長帯域の光を透過する特性を有する。また、第１バリアフィルタ２１１は、前記蛍光物質の蛍光波長と同じ波長帯域の光を透過し、それ以外の波長帯域の光を吸収する。そして、第１ＰＭＴ２０１は、ＰＭＴ（光電子増倍管）であり、その検出波長帯域は可視光帯域（例えば、４００ｎｍ〜７００ｎｍ）である。

次に、本システムの動作を説明する。

本実施形態では、レーザユニット１２の使用レーザ光源が第１レーザ光源１２１に設定される。レーザユニット１２から射出したレーザ光（つまり第１レーザ光源１２１が射出するレーザ光）は、光ファイバ１３を介して顕微鏡本体１へ導光され、光ファイバ１３の出射端に点光源（コヒーレント光源）を形成する。この点光源から射出したレーザ光はコリメートレンズ１４、空間周波数フィルタ３０、リレーレンズ１４Ａ、ダイクロイックミラー１５、スキャナ１６、対物レンズ１７を順に介して標本１０Ａ上の１点へ集光し、その集光点の近傍に存在する蛍光物質を励起し、蛍光（インコヒーレント光）を発する。その蛍光は、対物レンズ１７、スキャナ１６、ダイクロイックミラー１５、リレーレンズ１８Ａ、結像レンズ１８を順に介して共焦点絞り１９の開口近傍へ集光する。このうち、前記集光点と同じ高さ位置から射出した蛍光は、共焦点絞り１９の開口を通過し、前記集光点とは異なる高さ位置から射出した蛍光は、共焦点絞り１９の開口を通過しない。共焦点絞り１９を通過した蛍光は、光ファイバ２０の入射端へ入射し、その光ファイバ２０を介して蛍光検出ユニット２へ導かれる。なお、スキャナ１６が駆動されると、レーザ光による光スポットが標本１０Ａ上を二次元走査する。

蛍光検出ユニット２へ入射した蛍光は、第１ダイクロイックミラー２１にて反射し、第１バリアフィルタ２１１を透過し、第１ＰＭＴ２０１へ向かい、第１ＰＭＴにおいて蛍光強度を示す信号へと変換される。第１ＰＭＴ２０１が生成する信号は、不図示のコントロールユニットへ入力される。

不図示のコントロールユニットは、スキャナ１６とレーザユニット１２とを同期制御し、レーザ光による光スポットで標本１０Ａ上を二次元走査しながら第１ＰＭＴ２０１が生成する信号を繰り返し取り込み、それを不図示のフレームメモリへ蓄積する。これによってコントロールユニットは、標本１０Ａのうち前記集光点と同じ高さ位置の断面画像を取得する。さらにコントロールユニットは、このような断面画像の取得を、ステージ１１の高さ位置（又は対物レンズ１７の高さ位置）を変更しながら繰り返すことにより、標本１０Ａの各高さ位置の断面画像を取得し、それを不図示のコンピュータへ送出する。コンピュータは、それら断面画像を合成することにより標本１０Ａの三次元画像を取得すると共に、その三次元画像に対して顕微鏡本体１の全光学系のＯＴＦ（コンピュータが予め記憶している。）に基づくデコンボリューション演算を施す。この演算により、三次元画像に含まれる各空間周波数成分の振幅のバランスが、標本１０Ａに含まれる各空間周波数成分のそれと同等になる。

次に、空間周波数フィルタ３０を詳しく説明する。

図２は、空間周波数フィルタ３０を説明する図である。図２の下部に示すのは、空間周波数フィルタ３０を光軸に沿った方向から見た正面図であり、図２の上部に示すのは、光軸を含む平面で空間周波数フィルタ３０を切断してできる断面図である。

図２に示すとおり空間周波数フィルタ３０は、入射したレーザ光に対して透過性のある円盤状の基板（ガラス基板）３０−１と、基板３０−１の表面に部分的に設けられた斜光膜（クロム膜）３０−２とを有する。

図２において符号ＮＡで示すのは、対物レンズ１７のＮＡに相当する範囲である。図２に示すとおり、空間周波数フィルタ３０の径は、対物レンズ１７の瞳に相当する径よりも若干大きめに設定されており、対物レンズ１７の瞳最周辺部に相当する輪帯領域Ａｐと、対物レンズ１７の瞳中心部に相当する円形領域Ａｃとはそれぞれ遮光膜３０−２の設けられていない開口部となっており、それ以外の領域は遮光膜３０−２の設けられた遮光部となっている。

輪帯領域Ａｐの径方向の幅ｒｐと円形領域Ａｃの半径ｒｃとはほぼ同じ値に設定されている。幅ｒｐ及び半径ｒｃは、それぞれ十分に狭められており、最大でも対物レンズ１７のＮＡの１／４以下に抑えられている。

図３は、顕微鏡本体１の全光学系の光軸方向のＯＴＦ（本実施形態のＯＴＦ）を示す図である（対物レンズ１７の開口数ＮＡ＝０．９の場合。）。図３には比較のため、空間周波数フィルタ３０を含まない場合の同方向のＯＴＦ（従来例のＯＴＦ）を示した。

なお、ＯＴＦは、物体の構造の振幅と像の構造の振幅との比（コントラスト）を空間周波数毎に表すものであって、次式で与えられる。

式中の×印はコンボリューションを意味し、以下の式で定義される。

式中のＰ_ｉｌｌ（ｆ）は照射光学系１−１の瞳関数であり、Ｐ_ｃｏｌ（ｆ）は検出光学系１−２の瞳関数である。本実施形態では、照射光学系１−１の瞳関数は空間周波数フィルタ３０の透過率分布となり、検出光学系１−２の瞳関数は全透過となるが、従来例では、照射光学系１−１の瞳関数及び検出光学系１−２の瞳関数は何れも全透過となる。

図３に示したとおり、顕微鏡本体１の全光学系が解像可能な最高の空間周波数（光学的な遮断周波数）は、本実施形態ではｆ_０、従来例でもｆ_０となり、両者に差異は無い。

しかしながら、遮断周波数ｆ_０の近傍のコントラストに着目すると、従来例よりも本実施形態の方が高まっていることがわかる。

よって、例えばシステムのノイズレベル（顕微鏡本体１から蛍光検出ユニット２に至る信号のノイズレベル）が点線で示したレベル（０．０２程度）であると仮定すると、共焦点顕微鏡が観察可能な最高の空間周波数（実効的な遮断周波数）は、本実施形態ではｆ_１、従来例ではｆ_２となり、前者の方が高まる。つまり、空間周波数フィルタ３０には、実効的な遮断周波数を高める効果がある。

図４は、顕微鏡本体１の全光学系の光軸と垂直な方向のＯＴＦ（本実施形態のＯＴＦ）を示す図である（対物レンズ１７の開口数ＮＡ＝０．９の場合。）。図４には比較のため、空間周波数フィルタ３０を含まない場合の同方向のＯＴＦ（従来例のＯＴＦ）を示した。

図４に示したとおり、光軸と垂直な方向に関しても、実効的な遮断周波数は本実施形態ではｆ_１、従来例ではｆ_２となり、前者の方が高まっていることがわかる。

したがって、本実施形態では、対物レンズ１７の解像力を何ら高めていないにも拘わらず、実効的な遮断周波数を高めることができる。しかも、この効果は光軸方向だけでなく光軸と垂直な方向に亘っても得られる。よって、三次元画像上で観察可能な最小構造の空間周波数は２方向に亘り確実に高められる。

なお、本実施形態では実効的な遮断周波数が従来例よりも高められた代わりに、図３、図４に示したとおり低空間周波数成分の振幅は従来例よりも低くなる傾向にある。しかしながら、各空間周波数成分の振幅は前述したデコンボリューション演算によって完全に補償されるので、何ら問題は無い。

また、本実施形態では、空間周波数フィルタ３０の瞳最周辺部及び瞳中心部と、それ以外の部分とに、開口部と遮光部との組み合わせを適用したが、開口部と減光部との組み合わせなど、他の組み合わせを適用してもよい。少なくとも前者の透過率が相対的に高くなるような組み合わせであれば、ある程度の効果は得られる。但し、最も効果的な組み合わせは、両者の透過率の差異が最大となる組み合わせ、つまり開口部と遮光部との組み合わせである。

また、本実施形態では、空間周波数フィルタ３０の挿入先を照射光学系１−１の単独光路としたが、図５に示すとおり検出光学系１−２の単独光路としても同じ効果が得られる。その場合も空間周波数フィルタ３０の挿入先は、対物レンズ１７の瞳に対して共役関係となる位置（図５ではリレーレンズ１８Ａと結像レンズ１８との間）に配置される。

また、本実施形態では、照射光学系１−１と検出光学系１−２との双方にリレーレンズを配置したが、照射光学系１−１と検出光学系１−２とのうち空間周波数フィルタ３０が挿入されない方の光学系には対物レンズ１７の瞳共役面を設ける必要が無いので、リレーレンズを省略することが可能である。

また、本実施形態では、照射光学系１−１と検出光学系１−２との間で光路の一部を共有させたが、両者の光路を分離してもよい。その場合、照射光学系１−１の対物レンズと検出光学系１−２の対物レンズとが別体となるので、空間周波数フィルタ３０の挿入先を、一方の対物レンズの瞳面へ直接的に配置してもよい。その場合は、照射光学系１−１と検出光学系１−２との双方のリレーレンズを省略することが可能である。

また、本実施形態のシステムでは、レーザ光源及びＰＭＴの個数が複数なので、標本１０Ａの染色に使用された蛍光物質の種類に応じてそれらを使い分けることができるが、使い分けの必要が無ければ、レーザ光源及びＰＭＴの個数を単数としてもよい。

［課題を解決するための手段の補足］
なお、前述した共焦点顕微鏡の一態様においては、
前記空間周波数フィルタの前記瞳周辺部の形状は輪帯であり、該輪帯の径方向の幅は前記対物レンズの開口数の１／４以下であってもよい。

また、前記空間周波数フィルタの前記瞳中心部の形状は円であり、該円の半径は前記対物レンズの開口数の１／４以下であってもよい。

また、前記空間周波数フィルタの前記瞳周辺部の形状は輪帯であり、前記空間周波数フィルタの前記瞳中心部の形状は円であり、前記輪帯の径方向の幅は前記円の半径とほぼ同じであってもよい。

共焦点レーザ蛍光顕微鏡システムの構成図である。 空間周波数フィルタ３０を説明する図である。 顕微鏡本体１の全光学系の光軸方向のＯＴＦ（本実施形態のＯＴＦ）を示す図である（対物レンズ１７の開口数ＮＡ＝０．９の場合。）。 顕微鏡本体１の全光学系の光軸と垂直な方向のＯＴＦ（本実施形態のＯＴＦ）を示す図である（対物レンズ１７の開口数ＮＡ＝０．９の場合。）。 共焦点レーザ蛍光顕微鏡システムの変形例である。

符号の説明

１２…レーザユニット、１３…光ファイバ、１…顕微鏡本体、１４…コリメートレンズ、３０…空間周波数フィルタ、１４Ａ…リレーレンズ、１５…ダイクロイックミラー、１６…スキャナ、１７…対物レンズ、１８Ａ…リレーレンズ、１８…結像レンズ、１９…共焦点絞り、１１…ステージ１１、１０Ａ…標本、２０…光ファイバ、２…蛍光検出ユニット

Claims (5)

1. レーザ光源から供給されるレーザ光を被検物に向けて集光する照射光学系と、
   前記レーザ光に応じて前記被検物で生じる射出光を、前記レーザ光の集光点と共役な位置に配置された共焦点絞りを介して検出する検出光学系とを備え、
   前記照射光学系と前記検出光学系との何れか一方の単独光路における対物レンズ瞳面又はその共役面には、
   瞳周辺部及び瞳中心部の透過率が他の部分の透過率より高い空間周波数素子が配置される
   ことを特徴とする共焦点顕微鏡。
2. 請求項１に記載の共焦点顕微鏡において、
   前記空間周波数素子は、前記照射光学系の単独光路に配置されている
   ことを特徴とする共焦点顕微鏡。
3. 請求項１または請求項２に記載の共焦点顕微鏡において、
   前記空間周波数素子の前記瞳周辺部の形状は輪帯であり、前記空間周波数素子の前記瞳中心部の形状は円であり、
   前記輪帯の径方向の幅は前記円の半径と同じである
   ことを特徴とする共焦点顕微鏡。
4. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡において、
   前記空間周波数素子の前記瞳周辺部の形状は輪帯であり、該輪帯の径方向の幅は前記対物レンズの瞳半径に相当する幅の１／４以下である
   ことを特徴とする共焦点顕微鏡。
5. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡において、
   前記空間周波数素子の前記瞳中心部の形状は円であり、該円の半径は前記対物レンズの瞳半径に相当する幅の１／４以下である
   ことを特徴とする共焦点顕微鏡。

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