JP2004341204A - 蛍光顕微鏡 - Google Patents
蛍光顕微鏡 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004341204A JP2004341204A JP2003137483A JP2003137483A JP2004341204A JP 2004341204 A JP2004341204 A JP 2004341204A JP 2003137483 A JP2003137483 A JP 2003137483A JP 2003137483 A JP2003137483 A JP 2003137483A JP 2004341204 A JP2004341204 A JP 2004341204A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- fluorescence
- light
- light beam
- sample
- excitation light
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Abstract
【課題】蛍光を検出する光検出器に到達する不所望な励起光の量を抑えつつも多く量の蛍光が光検出器に到達する蛍光顕微鏡を提供する。
【解決手段】走査型蛍光顕微鏡は、励起光を含む光ビームを射出する光源部1と、光源部1からの光ビームを試料Sに照射する励起光照射光学系と、試料Sから発生した蛍光を含む光ビームを光源部1から試料Sに向かう光ビームから分離する分離光学素子5と、分離光学素子5で分離された蛍光を含む光ビームを二本に分割する光ビーム分割部15と、分割された二本の光ビームからそれぞれ特定の波長範囲内の蛍光を選択して透過する二つの蛍光選択透過部18と23と、蛍光選択透過部18と23を透過した蛍光をそれぞれ検出する二つの光検出器19と24と、分離光学素子5と光ビーム分割部15の間に位置し、それぞれの励起光を選択的に遮断する二つの励起光遮断光学素子13と14とを有している。
【選択図】 図1
【解決手段】走査型蛍光顕微鏡は、励起光を含む光ビームを射出する光源部1と、光源部1からの光ビームを試料Sに照射する励起光照射光学系と、試料Sから発生した蛍光を含む光ビームを光源部1から試料Sに向かう光ビームから分離する分離光学素子5と、分離光学素子5で分離された蛍光を含む光ビームを二本に分割する光ビーム分割部15と、分割された二本の光ビームからそれぞれ特定の波長範囲内の蛍光を選択して透過する二つの蛍光選択透過部18と23と、蛍光選択透過部18と23を透過した蛍光をそれぞれ検出する二つの光検出器19と24と、分離光学素子5と光ビーム分割部15の間に位置し、それぞれの励起光を選択的に遮断する二つの励起光遮断光学素子13と14とを有している。
【選択図】 図1
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛍光顕微鏡に関する。
【0002】
【従来の技術】
蛍光顕微鏡は、一般に、染色された試料に、少なくとも一種類の波長の励起光を含む光ビームを照射して試料を励起し、試料から発生した少なくとも一種類の蛍光を、少なくとも一つの検出器をで検出し、検出された蛍光に基づいて試料の画像(蛍光画像)を取得する。
【0003】
このような蛍光顕微鏡は、例えば特開平11−231222号公報に開示されている。
【0004】
【特許文献1】
特開平11−231222号公報
【0005】
【発明が解決しようとする課題】
蛍光顕微鏡においては、一般に、波長により分光し得るダイクロイックミラーを用いて、試料に照射される励起光から、試料から発生した蛍光が分離される。通常、試料からダイクロイックミラーに到達する光は、試料から発生した蛍光だけでなく、試料で反射した励起光も含まれている。
【0006】
一般に、試料を励起する励起光と、試料から発生する蛍光は、比較的近い波長を有している。励起光と蛍光の分離のためには、ダイクロイックミラーは、特定の波長を境に二値的に変化する透過率特性を有していることが理想的であるが、実際の透過率特性は、比較的急峻に変化していても、その部分はある程度の幅を有している。また、その部分の両端における透過率も0と1ではない。このため、ダイクロイックミラーで分離された光には、蛍光だけでなく、試料で反射された励起光も含まれる。
【0007】
また、蛍光を検出する光検出器の手前には、検出対象の蛍光だけを検出するために、検出対象の蛍光に合った波長帯域の光を選択的に透過するフィルター等の光学要素が配置される。前述したように、ダイクロイックミラーで分離された光には不所望な励起光も含まれるため、このようなフィルター等の光学要素は、単に検出対象の蛍光を透過するだけでなく、不所望な励起光を確実に遮断する機能も要求される。
【0008】
通常、不所望な励起光を遮断することを優先すると、それに伴って光検出器に到達する検出対象の蛍光の量も減ってしまい、反対に、検出対象の蛍光を多く透過することを優先すると、光検出器に到達する不所望な励起光も増えてしまう。
【0009】
このような事情は、複数種類の励起光を含む光ビームを試料に照射して複数種類の蛍光を発生させる場合、更に顕著である。
【0010】
本発明は、このような実状を考慮して成されたものであり、その目的は、蛍光を検出する光検出器に到達する不所望な励起光の量を抑えつつ、多く量の蛍光が光検出器に到達する蛍光顕微鏡を提供することである。
【0011】
【課題を解決するための手段】
本発明は、以下の各項に列記する蛍光顕微鏡を含んでいる。
【0012】
1.本発明の蛍光顕微鏡は、少なくとも一種類の単一波長の励起光を含む光ビームを射出する光源部と、光源部から射出された光ビームを試料に照射して試料から少なくとも一種類の蛍光を発生させる励起光照射光学系と、試料から発生した少なくとも一種類の蛍光を含む光ビームを、光源部から試料に向かう光ビームから分離する分離光学素子と、分離光学素子で分離された少なくとも一種類の蛍光を含む光ビームから特定の波長範囲内の蛍光を選択して透過する少なくとも一つの蛍光選択透過部を含む蛍光選択透過機構と、蛍光選択透過機構を透過した蛍光を検出する少なくとも一つの光検出器を含む蛍光検出部と、分離光学素子と蛍光選択透過部の間の光路上に位置し、光源部から射出された光ビームに含まれる少なくとも一種類の励起光を選択的に遮断する少なくとも一つの励起光遮断光学素子を含む励起光遮断部とを有している。
【0013】
この蛍光顕微鏡においては、不所望な励起光は、それ専用の励起光遮断光学素子によって、良好に遮断される。これにより、蛍光選択透過部に要求される光学的特性が緩和される。このため、蛍光選択透過部は、比較的広い波長範囲の光を透過してもよい。その結果、光検出器に、多くの量の蛍光が到達する。
【0014】
2.本発明の別の蛍光顕微鏡は、第1項の蛍光顕微鏡において、光源部は、複数種類の単一波長の励起光を含む光ビームを射出し、励起光照射光学系は、複数種類の単一波長の励起光を含む光ビームを試料に照射して試料から複数種類の蛍光を発生させ、分離光学素子は、試料から発生した複数種類の蛍光を含む光ビームを光源部から試料に向かう光ビームから分離し、蛍光顕微鏡は更に、分離光学素子で分離された複数種類の蛍光を含む光ビームを、複数種類の蛍光の波長帯域に基づいて複数に分割する光ビーム分割部を有しており、蛍光選択透過機構は、光ビーム分割部で分割された複数の光ビームから、それぞれ、特定の波長範囲内の蛍光を選択して透過する複数の蛍光選択透過部を有しており、蛍光検出部は、複数の蛍光選択透過部を透過した蛍光をそれぞれ検出する複数の光検出器を有しており、励起光遮断部は、光源部から射出された光ビームに含まれる複数種類の励起光をそれぞれ選択的に遮断する複数の励起光遮断光学素子を有している。
【0015】
この蛍光顕微鏡においては、複数種類の励起光を含む光ビームを試料に照射して複数種類の蛍光を発生させる場合においても、不所望な励起光が良好に遮断されつつも、光検出器に多くの量の蛍光が到達する。
【0016】
3.本発明の別の蛍光顕微鏡は、第1項または第2項の蛍光顕微鏡において、励起光遮断光学素子はホログラフィックノッチフィルターである。
【0017】
この蛍光顕微鏡は、不所望な励起光を良好に遮断する好適な励起光遮断光学素子の一態様を与える。
【0018】
4.本発明の別の蛍光顕微鏡は、第1項ないし第3項のいずれかひとつの蛍光顕微鏡において、励起光照射光学系は、励起光を含む光ビームを試料に収束させる対物レンズと、対物レンズにより試料に形成される励起光を含む光ビームのスポットを走査する走査光学系とを含んでいる。
【0019】
この蛍光顕微鏡は、走査型蛍光顕微鏡を提供する。
【0020】
5.本発明の別の蛍光顕微鏡は、第1項ないし第4項のいずれかひとつの蛍光顕微鏡において、蛍光選択透過部は、特定の波長範囲から外れた波長の光を吸収する吸収フィルターである。
【0021】
この蛍光顕微鏡は、蛍光選択透過部の一態様を与える。
【0022】
6.本発明の別の蛍光顕微鏡は、第1項ないし第4項のいずれかひとつの蛍光顕微鏡において、蛍光選択透過部は、入射する光ビームを波長分散させる分散素子と、分散素子により分散された光ビームを収束させる収束レンズと、収束レンズにより収束された光ビームの一部の波長域を通す光学的開口とを有し、収束レンズは入射した光ビームを波長成分に応じて異なる位置に収束させ、光学的開口は特定の波長成分の光を選択的に透過する。
【0023】
この蛍光顕微鏡は、蛍光選択透過部の別の一態様を与える。
【0024】
7.本発明の別の蛍光顕微鏡は、第6項の蛍光顕微鏡において、蛍光選択透過部は光学的開口に対する波長成分の収束位置を決め、分散素子の回転角度を変更可能とし、蛍光顕微鏡は、分散素子の回転角度を変えることにより、光学的開口を透過する光ビームの波長域を可変して、蛍光を細分化した波長帯域毎に検出し得る。
【0025】
この蛍光顕微鏡は、検出対象の蛍光のスペクトルデータを取得可能である。
【0026】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照しながら本発明の実施の形態について説明する。
【0027】
第一実施形態
本実施形態は、走査型蛍光顕微鏡に向けられている。以下、図1と図3〜図8を参照しながら本実施形態について説明する。
【0028】
図1に示されるように、本実施形態の走査型蛍光顕微鏡は、少なくとも一種類の単一波長の励起光を含む光ビームを射出する光源部1を有している。光源部1は、これに限定されないが、例えば、複数の単一波長の光を含む光ビームを発するレーザ光源2と、レーザ光源2から発せられた光ビームの径を拡大するビームエキスパンダ3と、試料Sの励起に必要な特定の波長の光を選択的に透過するレーザーラインフィルター4とを有している。
【0029】
例えば、レーザ光源2は、488nmと568nmと647nmの波長の光を同時発振するクリプトンアルゴンレーザであり、レーザーラインフィルター4は、レーザ光源2から発せられた光のうち、488nmと568nmの波長の光を選択的に透過する。
【0030】
従って、光源部1は、二種類の単一波長の励起光を含む光ビームを射出する。しかし、光源部1は、これに限定されるものではなく、一種類の単一波長の励起光から成る光ビームを射出してもよく、あるいは、三種類以上の単一波長の励起光を含む光ビームを射出してもよい。
【0031】
図1において、走査型蛍光顕微鏡は更に、光源部1から射出された二種類の励起光を含む光ビームを試料Sに照射する励起光照射光学系を有している。励起光照射光学系は、励起光を含む光ビームを試料Sに収束させる対物レンズ11と、励起光を含む光ビームを対物レンズ11に向けて偏向するミラー8と、ミラー8から対物レンズ11に至る間の光路上に配置された瞳投影レンズ9と結像レンズ10とを含んでいる。
【0032】
励起光照射光学系は更に、対物レンズ11により試料Sに形成される励起光を含む光ビームのスポットを二次元的に走査する走査光学系7を有している。走査光学系7は、光源部1とミラー8の間の光路上に配置された、ガルバノメ一夕スキャナ7aとガルバノメ一夕スキャナ7bとで構成されている。
【0033】
二つのガルバノメ一夕スキャナ7aと7bは、それぞれ、方向を変更可能な反射面を有しており、反射面の方向を変更することにより、反射面で反射された光ビームを一方向に沿って(つまり一次元的に)走査する。二つのガルバノメ一夕スキャナ7aと7bは、その反射面で反射された光ビームを互いに直交する方向(X方向とY方向)に走査する。このため、走査光学系7により、試料Sに形成される光ビームのスポットは、二次元的に走査される。
【0034】
試料Sは光ビームの照射に反応して蛍光を発する。試料Sは、照射された光ビームに含まれる励起光の種類に対応した種類の蛍光を発する。本実施形態では、試料Sは二種類の試薬で染色されており、試料Sには二種類の励起光を含む光ビームが照射される。このため、試料Sからは二種類の蛍光が発生する。試料Sから発生する二種類の蛍光は、それぞれ、試料Sに照射される二種類の励起光の波長帯域に対応した波長帯域を有する。
【0035】
走査型蛍光顕微鏡は更に、試料Sから発生した蛍光を含む光ビームを、光源部1から試料Sに向かう光ビームから分離する分離光学素子5を有している。簡単に言えば、分離光学素子5は励起光と蛍光とを分離する。分離光学素子5は、例えば、光源部1と試料Sの間の光路上に位置するダイクロイックミラーで構成される。
【0036】
図1において、走査型蛍光顕微鏡は更に、分離光学素子5で分離された少なくとも一種類の蛍光を含む光ビームから特定の波長範囲内の蛍光を選択して透過する少なくとも一つの蛍光選択透過部を含む蛍光選択透過機構と、蛍光選択透過機構を透過した蛍光を検出する少なくとも一つの光検出器を含む蛍光検出部とを有している。
【0037】
より詳しくは、試料Sからは二種類の蛍光が発生されることに対応して、走査型蛍光顕微鏡は更に、分離光学素子5で分離された蛍光を含む光ビームを、それに含まれる二種類の蛍光の波長帯域に基づいて二本に分割する光ビーム分割部15を有している。蛍光選択透過機構は、光ビーム分割部15で分割された二本の光ビームから、それぞれ、特定の波長範囲内の蛍光を選択して透過する二つの蛍光選択透過部18と23を有している。蛍光検出部は、二つの蛍光選択透過部18と23を透過した蛍光をそれぞれ検出する二つの光検出器19と24を有している。
【0038】
光ビーム分割部15は、これに限定されないが、例えば、ダイクロイックミラーで構成される。二つの蛍光選択透過部18と23は、それぞれ、これに限定されないが、例えば、特定の波長範囲から外れた波長の光を吸収する吸収フィルターで構成される。二つの光検出器19と24は、それぞれ、これに限定されないが、例えば、フォトマルチプライヤ(PMT)で構成される。
【0039】
走査型蛍光顕微鏡は更に、分離光学素子5で分離された蛍光を含む光ビームを光ビーム分割部15に向けて偏向するミラー12と、光ビーム分割部15を透過した光ビームを光検出器24に向けて偏向するミラー20とを有している。
【0040】
走査型蛍光顕微鏡は更に、光ビーム分割部15と蛍光選択透過部18の間の光路上に配置された集光レンズ16およびピンホール17と、ミラー20と蛍光選択透過部23の間の光路上に配置された集光レンズ21およびピンホール22とを有している。
【0041】
ピンホール17とピンホール22は、それぞれ、対物レンズ11により試料Sに形成される励起光を含む光ビームのスポットに対して共焦点の位置関係に配置されている。このため、ピンホール17とピンホール22は、共焦点効果により、試料Sに形成される光ビームのスポットから外れた位置、特に光軸に沿って外れた位置から発生された蛍光を効果的に遮断する。このため、光検出器19と24は、試料Sに形成される光ビームのスポットの位置からの蛍光を選択的に検出し得る。
【0042】
走査型蛍光顕微鏡は更に、光源部1から射出される光ビームに含まれる二種類の励起光をそれぞれ選択的に遮断する励起光遮断光学素子13と励起光遮断光学素子14とを有している。二つの励起光遮断光学素子13と14は共に分離光学素子5と光ビーム分割部15の間の光路上に配置されている。二つの励起光遮断光学素子13と14は、好ましくは、それぞれ、ホログラフィックノッチフィルターで構成される。
【0043】
走査型蛍光顕微鏡においては、光源部1から発せられた励起光を含む光ビームは対物レンズ11により試料Sに収束される。対物レンズ11により試料Sに形成された光ビームのスポットは、走査光学系7により試料Sの表面上あるいは内部を二次元的に走査される。試料Sに照射される光ビームは二種類の励起光を含んでおり、試料Sはそれに対応した二種類の試薬で染色されているため、試料Sからは二種類の蛍光が発生する。
【0044】
試料Sから発生した二種類の蛍光は、それぞれ、光検出器19と光検出器24により検出される。特に、共焦点効果により、光ビームのスポットの位置から発生した蛍光が、光検出器19と光検出器24により選択的に検出される。光検出器19と光検出器24で得られる信号を、走査光学系7を制御する走査信号に同期させて処理することにより、それぞれの蛍光に基づく試料Sの蛍光画像が得られる。
【0045】
前述したように、レーザ光源2は、488nmと568nmと647nmの波長の光を発する。レーザーラインフィルター4は、図3に示される透過率特性を有しており、レーザ光源2で発せられた光のうち、488nmと568nmの光を選択的に透過する。従って、光源部1からは、488nmと568nmの励起光を含む光ビームが射出される。
【0046】
光源部1から射出された488nmと568nmの励起光は試料Sに照射され、試料Sからは、488nmの励起光に対応して、500nm〜540nmの波長帯域の蛍光が発生され、568nmの励起光に対応して、585nm〜650nmの波長帯域の蛍光が発生される。
【0047】
励起光と蛍光とを分離する分離光学素子5を構成するダイクロイックミラーは、例えば図4に示される透過率特性を有しており、光源部1から射出される488nmと568nmの波長の励起光を反射する一方、試料Sから発生される500〜540の波長帯域の蛍光と585nm〜650nmの波長帯域の蛍光を良好に透過する。
【0048】
図4から分かるように、分離光学素子5を構成するダイクロイックミラーは、488nmと568nmの波長の励起光をいくらかは透過する。このため、試料Sで反射された励起光のいくらかは、試料Sから発生された蛍光と一緒に分離光学素子5であるダイクロイックミラーを透過する。
【0049】
励起光遮断光学素子13を構成するホログラフィックノッチフィルターは、図5にHNF13で示される透過率特性を有し、励起光遮断光学素子14を構成するホログラフィックノッチフィルターは、図5にHNF14で示される透過率特性を有している。
【0050】
図5から分かるように、励起光遮断光学素子13を構成するホログラフィックノッチフィルターは、488nmの波長の近傍の帯域において、透過率がほとんど0である。従って、励起光遮断光学素子13を構成するホログラフィックノッチフィルターは、488nmの波長の励起光をほとんど完全に遮断する。
【0051】
同様に、励起光遮断光学素子14を構成するホログラフィックノッチフィルターは、568nmの波長の近傍の帯域において透過率がほとんど0である。従って、励起光遮断光学素子14を構成するホログラフィックノッチフィルターは、568nmの波長の励起光をほとんど完全に遮断する。
【0052】
その結果、光ビーム分割部15に到達した光ビームは、試料Sで反射された488nmと568nmの波長の励起光を殆ど含まない。つまり、光ビーム分割部15に到達した光ビームは、実質的に、検出対象である試料Sから発生された500nm〜540nmの波長帯域の蛍光と585nm〜650nmの波長帯域の蛍光で構成されている。
【0053】
光ビーム分割部15を構成するダイクロイックミラーは、例えば図6に示される透過率特性を有しており、500nm〜540nmの波長帯域の蛍光を良好に反射する一方、585nm〜650nmの波長帯域の蛍光を透過する。
【0054】
蛍光選択透過部18を構成する吸収フィルターは、例えば図7にBA18で示される透過率特性を有し、蛍光選択透過部23を構成する吸収フィルターは、図7にBA23で示される透過率特性を有している。
【0055】
図7から分かるように、励起光遮断光学素子13を構成するホログラフィックノッチフィルターの透過率特性HNF13と励起光遮断光学素子14を構成するホログラフィックノッチフィルターの透過率特性HNF14に対応して、吸収フィルター18と吸収フィルター23は共に比較的広い透過帯域を有している。
【0056】
比較例として、図1の構成から励起光遮断光学素子13と励起光遮断光学素子14とが省かれた構成(すなわち従来の走査型蛍光顕微鏡)において、蛍光選択透過部18を構成する吸収フィルターに要求される透過率特性と、蛍光選択透過部23を構成する吸収フィルターに要求される透過率特性を図8に示す。
【0057】
図1の構成から励起光遮断光学素子13と励起光遮断光学素子14とが省かれた構成においては、蛍光選択透過部18と蛍光選択透過部23に到達した光は、検出対象の蛍光の他に、試料Sで反射された不所望な励起光も含んでいる。このため、蛍光選択透過部18と蛍光選択透過部23は、単にそれぞれの検出対象の蛍光を透過するだけでなく、不所望な励起光を良好に遮断することも要求される。
【0058】
このため、蛍光選択透過部18を構成する吸収フィルターの透過特性は、488nmと568nmの波長の励起光を良好に遮断するように、図8にBA18で示されるように、透過帯域が狭いものにならざるを得ない。同様に、蛍光選択透過部23を構成する吸収フィルターの透過特性は、568nmの波長の励起光を良好に遮断するように、図8にBA23で示されるように、透過帯域が狭いものものにならざるを得ない。
【0059】
その結果、例えば、蛍光選択透過部18は、500nm〜540nmの透過帯域を有する吸収フィルターで構成され、蛍光選択透過部23は、585nm〜650nmの透過帯域を有する吸収フィルターで構成される。図8において、「585nm(蛍光)」は蛍光のピーク波長を示しており、実際の蛍光はこの両側にある帯域を持って広がっている。従って、BA23で示される特性の吸収フィルターであっても、蛍光を検出することは可能である。
【0060】
このような透過帯域の狭い吸収フィルターは、好ましくないことに、検出対象である蛍光をも吸収してしまい、その後方に位置する光検出器19や光検出器24に到達する蛍光の量を減少させてしまう。
【0061】
これに対して、本実施形態の走査型蛍光顕微鏡においては、不所望な488nmと568nmの波長の励起光は、分離光学素子5と光ビーム分割部15の間の光路上に配置された二つの励起光遮断光学素子13と14によって遮断される。このため、蛍光選択透過部18と蛍光選択透過部23に到達した光は、不所望な励起光を殆ど含まない。
【0062】
従って、蛍光選択透過部18と蛍光選択透過部23には、不所望な励起光を良好に遮断することは要求されない。このため、蛍光選択透過部18と蛍光選択透過部23に、透過帯域の広い吸収フィルターを使用することが可能になる。具体的には、本実施形態における吸収フィルター(図7)の励起光遮断レベルは、従来例における吸収フィルター(図8)の励起光遮断レベルに比べて1桁から3桁程度低くてよく、その分、蛍光の透過帯域を広げることができる。これにより、蛍光選択透過部18と蛍光選択透過部23の後方にそれぞれ位置する光検出器19と光検出器24に、より多くの量の蛍光を到達させることができる。
【0063】
その結果、本実施形態の走査型蛍光顕微鏡は、励起光の波長に近い波長の蛍光も検出できる。これにより、例えば、より明るい蛍光画像を得ることができる。
【0064】
第二実施形態
本実施形態は、走査型蛍光顕微鏡に向けられている。以下、図2を参照しながら本実施形態について説明する。
【0065】
図2は、本発明の第二実施形態の走査型蛍光顕微鏡を示している。図2において、図1中の部材と同一の参照符号で指示された部材は同様の部材であり、その詳しい説明は省略する。
【0066】
本実施形態の走査型蛍光顕微鏡は、主に蛍光選択透過機構の構成の点で、第一実施形態の走査型蛍光顕微鏡と相違している。
【0067】
図2に示されるように、本実施形態の走査型蛍光顕微鏡は、分離光学素子5とミラー12の間の光路上に、分離光学素子5で分離された蛍光を含む光ビームを収束させる結像レンズ25と、結像レンズ25の結像位置に配置された共焦点絞り26と、共焦点絞り26を通過し発散光ビームを平行光ビームに変えるレンズ27とを有している。
【0068】
共焦点絞り26は、対物レンズ11により試料Sに形成される励起光を含む光ビームのスポットに対して共焦点の位置関係に配置されている。このため、共焦点絞り26は、共焦点効果により、試料Sに形成される光ビームのスポットから外れた位置、特に光軸に沿って外れた位置から発生された蛍光を効果的に遮断する。これにより、最終的に得られる蛍光画像の分解能の向上に貢献する。
【0069】
本実施形態の走査型蛍光顕微鏡は、光ビーム分割部15から光検出器19に至る光路上に蛍光選択透過部28を有し、光ビーム分割部15からミラー20を経て光検出器24に至る光路上に蛍光選択透過部32を有している。
【0070】
別の観点から、図1に示される第一実施形態の走査型蛍光顕微鏡との相違に注目して述べれば、本実施形態の走査型蛍光顕微鏡は、分離光学素子5とミラー12の間の光路上に結像レンズ25と共焦点絞り26とレンズ27とが追加されており、第一実施形態の走査型蛍光顕微鏡の集光レンズ16とピンホール17と蛍光選択透過部18が蛍光選択透過部28に置き換えられ、集光レンズ21とピンホール22と蛍光選択透過部23が蛍光選択透過部32に置き換えられた構成をしている。
【0071】
蛍光選択透過部28は、入射する光ビームを波長分散させる分散素子(反射回折格子)29と、分散素子29により分散された光ビームを収束させる収束レンズ30と、収束レンズ30により収束された光ビームの一部の波長域を通す光学的開口すなわちスリット31とを有している。
【0072】
同様に、蛍光選択透過部32は、入射する光ビームを波長分散させる分散素子(反射回折格子)33と、分散素子33により分散された光ビームを収束させる収束レンズ34と、収束レンズ34により収束された光ビームの一部の波長域を通す光学的開口すなわちスリット35とを有している。
【0073】
蛍光選択透過部28と蛍光選択透過部32は、例えば、グレーティングガルバノで構成される。蛍光選択透過部28と蛍光選択透過部32は全く同様の機能を有している。このため、以下では、代表的に、蛍光選択透過部28の動作について述べる。
【0074】
蛍光選択透過部28において、分散素子29に入射した光ビームは、波長に従って異なる方向に分散される。つまり、入射光ビームに含まれる光は、波長成分毎に異なる方向に変更される。このため、収束レンズ30に入射した光は、光軸を横切る方向に関して、波長成分に応じて異なる位置に収束される。つまり、収束レンズ30は入射した光ビームを波長成分に応じて異なる位置に収束させる。このため、蛍光選択透過部28に入射した光のうち、特定の波長範囲の光だけがスリット31を通過し得る。つまり、スリット31は特定の波長成分の光だけを選択的に透過する。その結果、スリット31を通過した特定の波長範囲の光だけが光検出器19で検出される。
【0075】
全く同様にして、蛍光選択透過部32に入射した光ビームのうち、特定の波長範囲の光だけが、スリット35を通過して光検出器24で検出される。
【0076】
本実施形態の走査型蛍光顕微鏡においては、二つの励起光遮断光学素子(好ましくはホログラフィックノッチフィルター)13と14によって、蛍光選択透過部28と蛍光選択透過部32に到達する前に、不所望な励起光が除去される。このため、蛍光選択透過部28と蛍光選択透過部32に入射した光は、不所望な励起光を殆ど含まない。このため、スリット31とスリット35は、開口の大きさを比較的大きくすることが可能である。これにより、スリット31とスリット35の後方にそれぞれ位置する光検出器19と光検出器24に、より多くの量の蛍光を到達させることができる。
【0077】
その結果、本実施形態の走査型蛍光顕微鏡は、励起光の波長に近い波長の蛍光も検出できる。これにより、例えば、より明るい蛍光画像を得ることができる。
【0078】
より好ましくは、蛍光選択透過部28は分散素子29の方向を調整可能であり、蛍光選択透過部32は分散素子33の方向を調整可能であるとよい。例えば、蛍光選択透過部28において、分散素子29の方向を変えることにより、蛍光を細分化した波長帯域毎に検出することも可能である。同様に、蛍光選択透過部32において、分散素子33の方向を変えることにより、蛍光を細分化した波長帯域毎に検出することも可能である。
【0079】
つまり、本実施形態の走査型蛍光顕微鏡は、蛍光選択透過部28と蛍光選択透過部32をこの様に構成することにより、検出対象の蛍光のスペクトルデータを取得することも可能である。
【0080】
これまで、図面を参照しながら本発明の実施の形態を述べたが、本発明は、これらの実施の形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において様々な変形や変更が施されてもよい。
【0081】
上述した実施形態では、光源部1は二種類の単一波長の励起光を含む光ビームを射出し、試料Sからは二種類の蛍光が発生されることに対応して、蛍光選択透過機構は二つの蛍光選択透過部を有し、蛍光検出部は二つの光検出器19と24を有し、励起光遮断部は二つの励起光遮断光学素子13と14を有している。
【0082】
しかし、蛍光選択透過部と光検出器と励起光遮断光学素子の個数は、これに限定されるものではなく、光源部1から射出される光ビームに含まれる単一波長の励起光の種類、あるいは、試料Sから発生される蛍光の種類に対応して、適宜変更されてよい。
【0083】
前述したように、光源部1は一種類の単一波長の励起光を含む光ビームを射出してもよい。その場合、蛍光選択透過機構は一つの蛍光選択透過部を有し、蛍光検出部は一つの光検出器を有し、励起光遮断部は一つの励起光遮断光学素子を有していればよい。
【0084】
また、光源部1は三種類以上の単一波長の励起光を含む光ビームを射出してもよい。その場合、蛍光選択透過機構は対応する個数の蛍光選択透過部を有し、蛍光検出部は対応する個数の光検出器を有し、励起光遮断部は対応する個数の励起光遮断光学素子を有しているとよい。
【0085】
結局、光源部1は少なくとも一種類以上の単一波長の励起光を含む光ビームを射出し、それに対応して、蛍光選択透過機構は少なくとも一つの蛍光選択透過部を有し、蛍光検出部は少なくとも一つの光検出器を有し、励起光遮断部は少なくとも一つの励起光遮断光学素子を有していればよい。
【0086】
また、光源部1から射出される光は、レーザー光のようなほぼ単一波長の光が最も好ましいが、レーザー光でなくとも帯域の狭い光であってもよい。帯域の狭い光は、それ自体が光源から射出されるものに限らず、光源から射出された光からフィルター等の波長選択手段によって作られたものであってもよい。
【0087】
【発明の効果】
本発明によれば、蛍光を検出する光検出器に到達する不所望な励起光の量を抑えつつ、多く量の蛍光が光検出器に到達する蛍光顕微鏡が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の第一実施形態の走査型蛍光顕微鏡の構成を概略的に示している。
【図2】本発明の第二実施形態の走査型蛍光顕微鏡の構成を概略的に示している。
【図3】図1と図2に示された光源部内のレーザーラインフィルターの透過率特性を示している。
【図4】図1と図2に示された分離光学素子であるダイクロイックミラーの透過率特性を示している。
【図5】図1と図2に示された励起光遮断素子であるホログラフィックノッチフィルターの透過率特性を示している。
【図6】図1と図2に示された光ビーム分割部であるダイクロイックミラーの透過率特性を示している。
【図7】図1と図2に示された蛍光選択透過部である吸収フィルターの透過率特性を示している。
【図8】図1の構成からホログラフィックノッチフィルターが省かれた構成である従来の走査型蛍光顕微鏡において要求される吸収フィルターの透過率特性を示している。
【符号の説明】
1…光源部、2…レーザ光源、3…ビームエキスパンダ、4…レーザーラインフィルター、5…分離光学素子、7…走査光学系、7a…ガルバノメ一夕スキャナ、7b…ガルバノメ一夕スキャナ、8…ミラー、9…瞳投影レンズ、10…結像レンズ、11…対物レンズ、12…ミラー、13…励起光遮断光学素子、14…励起光遮断光学素子、15…光ビーム分割部、18…蛍光選択透過部、19…光検出器、23…蛍光選択透過部、24…光検出器、28…蛍光選択透過部、32…蛍光選択透過部。
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛍光顕微鏡に関する。
【0002】
【従来の技術】
蛍光顕微鏡は、一般に、染色された試料に、少なくとも一種類の波長の励起光を含む光ビームを照射して試料を励起し、試料から発生した少なくとも一種類の蛍光を、少なくとも一つの検出器をで検出し、検出された蛍光に基づいて試料の画像(蛍光画像)を取得する。
【0003】
このような蛍光顕微鏡は、例えば特開平11−231222号公報に開示されている。
【0004】
【特許文献1】
特開平11−231222号公報
【0005】
【発明が解決しようとする課題】
蛍光顕微鏡においては、一般に、波長により分光し得るダイクロイックミラーを用いて、試料に照射される励起光から、試料から発生した蛍光が分離される。通常、試料からダイクロイックミラーに到達する光は、試料から発生した蛍光だけでなく、試料で反射した励起光も含まれている。
【0006】
一般に、試料を励起する励起光と、試料から発生する蛍光は、比較的近い波長を有している。励起光と蛍光の分離のためには、ダイクロイックミラーは、特定の波長を境に二値的に変化する透過率特性を有していることが理想的であるが、実際の透過率特性は、比較的急峻に変化していても、その部分はある程度の幅を有している。また、その部分の両端における透過率も0と1ではない。このため、ダイクロイックミラーで分離された光には、蛍光だけでなく、試料で反射された励起光も含まれる。
【0007】
また、蛍光を検出する光検出器の手前には、検出対象の蛍光だけを検出するために、検出対象の蛍光に合った波長帯域の光を選択的に透過するフィルター等の光学要素が配置される。前述したように、ダイクロイックミラーで分離された光には不所望な励起光も含まれるため、このようなフィルター等の光学要素は、単に検出対象の蛍光を透過するだけでなく、不所望な励起光を確実に遮断する機能も要求される。
【0008】
通常、不所望な励起光を遮断することを優先すると、それに伴って光検出器に到達する検出対象の蛍光の量も減ってしまい、反対に、検出対象の蛍光を多く透過することを優先すると、光検出器に到達する不所望な励起光も増えてしまう。
【0009】
このような事情は、複数種類の励起光を含む光ビームを試料に照射して複数種類の蛍光を発生させる場合、更に顕著である。
【0010】
本発明は、このような実状を考慮して成されたものであり、その目的は、蛍光を検出する光検出器に到達する不所望な励起光の量を抑えつつ、多く量の蛍光が光検出器に到達する蛍光顕微鏡を提供することである。
【0011】
【課題を解決するための手段】
本発明は、以下の各項に列記する蛍光顕微鏡を含んでいる。
【0012】
1.本発明の蛍光顕微鏡は、少なくとも一種類の単一波長の励起光を含む光ビームを射出する光源部と、光源部から射出された光ビームを試料に照射して試料から少なくとも一種類の蛍光を発生させる励起光照射光学系と、試料から発生した少なくとも一種類の蛍光を含む光ビームを、光源部から試料に向かう光ビームから分離する分離光学素子と、分離光学素子で分離された少なくとも一種類の蛍光を含む光ビームから特定の波長範囲内の蛍光を選択して透過する少なくとも一つの蛍光選択透過部を含む蛍光選択透過機構と、蛍光選択透過機構を透過した蛍光を検出する少なくとも一つの光検出器を含む蛍光検出部と、分離光学素子と蛍光選択透過部の間の光路上に位置し、光源部から射出された光ビームに含まれる少なくとも一種類の励起光を選択的に遮断する少なくとも一つの励起光遮断光学素子を含む励起光遮断部とを有している。
【0013】
この蛍光顕微鏡においては、不所望な励起光は、それ専用の励起光遮断光学素子によって、良好に遮断される。これにより、蛍光選択透過部に要求される光学的特性が緩和される。このため、蛍光選択透過部は、比較的広い波長範囲の光を透過してもよい。その結果、光検出器に、多くの量の蛍光が到達する。
【0014】
2.本発明の別の蛍光顕微鏡は、第1項の蛍光顕微鏡において、光源部は、複数種類の単一波長の励起光を含む光ビームを射出し、励起光照射光学系は、複数種類の単一波長の励起光を含む光ビームを試料に照射して試料から複数種類の蛍光を発生させ、分離光学素子は、試料から発生した複数種類の蛍光を含む光ビームを光源部から試料に向かう光ビームから分離し、蛍光顕微鏡は更に、分離光学素子で分離された複数種類の蛍光を含む光ビームを、複数種類の蛍光の波長帯域に基づいて複数に分割する光ビーム分割部を有しており、蛍光選択透過機構は、光ビーム分割部で分割された複数の光ビームから、それぞれ、特定の波長範囲内の蛍光を選択して透過する複数の蛍光選択透過部を有しており、蛍光検出部は、複数の蛍光選択透過部を透過した蛍光をそれぞれ検出する複数の光検出器を有しており、励起光遮断部は、光源部から射出された光ビームに含まれる複数種類の励起光をそれぞれ選択的に遮断する複数の励起光遮断光学素子を有している。
【0015】
この蛍光顕微鏡においては、複数種類の励起光を含む光ビームを試料に照射して複数種類の蛍光を発生させる場合においても、不所望な励起光が良好に遮断されつつも、光検出器に多くの量の蛍光が到達する。
【0016】
3.本発明の別の蛍光顕微鏡は、第1項または第2項の蛍光顕微鏡において、励起光遮断光学素子はホログラフィックノッチフィルターである。
【0017】
この蛍光顕微鏡は、不所望な励起光を良好に遮断する好適な励起光遮断光学素子の一態様を与える。
【0018】
4.本発明の別の蛍光顕微鏡は、第1項ないし第3項のいずれかひとつの蛍光顕微鏡において、励起光照射光学系は、励起光を含む光ビームを試料に収束させる対物レンズと、対物レンズにより試料に形成される励起光を含む光ビームのスポットを走査する走査光学系とを含んでいる。
【0019】
この蛍光顕微鏡は、走査型蛍光顕微鏡を提供する。
【0020】
5.本発明の別の蛍光顕微鏡は、第1項ないし第4項のいずれかひとつの蛍光顕微鏡において、蛍光選択透過部は、特定の波長範囲から外れた波長の光を吸収する吸収フィルターである。
【0021】
この蛍光顕微鏡は、蛍光選択透過部の一態様を与える。
【0022】
6.本発明の別の蛍光顕微鏡は、第1項ないし第4項のいずれかひとつの蛍光顕微鏡において、蛍光選択透過部は、入射する光ビームを波長分散させる分散素子と、分散素子により分散された光ビームを収束させる収束レンズと、収束レンズにより収束された光ビームの一部の波長域を通す光学的開口とを有し、収束レンズは入射した光ビームを波長成分に応じて異なる位置に収束させ、光学的開口は特定の波長成分の光を選択的に透過する。
【0023】
この蛍光顕微鏡は、蛍光選択透過部の別の一態様を与える。
【0024】
7.本発明の別の蛍光顕微鏡は、第6項の蛍光顕微鏡において、蛍光選択透過部は光学的開口に対する波長成分の収束位置を決め、分散素子の回転角度を変更可能とし、蛍光顕微鏡は、分散素子の回転角度を変えることにより、光学的開口を透過する光ビームの波長域を可変して、蛍光を細分化した波長帯域毎に検出し得る。
【0025】
この蛍光顕微鏡は、検出対象の蛍光のスペクトルデータを取得可能である。
【0026】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照しながら本発明の実施の形態について説明する。
【0027】
第一実施形態
本実施形態は、走査型蛍光顕微鏡に向けられている。以下、図1と図3〜図8を参照しながら本実施形態について説明する。
【0028】
図1に示されるように、本実施形態の走査型蛍光顕微鏡は、少なくとも一種類の単一波長の励起光を含む光ビームを射出する光源部1を有している。光源部1は、これに限定されないが、例えば、複数の単一波長の光を含む光ビームを発するレーザ光源2と、レーザ光源2から発せられた光ビームの径を拡大するビームエキスパンダ3と、試料Sの励起に必要な特定の波長の光を選択的に透過するレーザーラインフィルター4とを有している。
【0029】
例えば、レーザ光源2は、488nmと568nmと647nmの波長の光を同時発振するクリプトンアルゴンレーザであり、レーザーラインフィルター4は、レーザ光源2から発せられた光のうち、488nmと568nmの波長の光を選択的に透過する。
【0030】
従って、光源部1は、二種類の単一波長の励起光を含む光ビームを射出する。しかし、光源部1は、これに限定されるものではなく、一種類の単一波長の励起光から成る光ビームを射出してもよく、あるいは、三種類以上の単一波長の励起光を含む光ビームを射出してもよい。
【0031】
図1において、走査型蛍光顕微鏡は更に、光源部1から射出された二種類の励起光を含む光ビームを試料Sに照射する励起光照射光学系を有している。励起光照射光学系は、励起光を含む光ビームを試料Sに収束させる対物レンズ11と、励起光を含む光ビームを対物レンズ11に向けて偏向するミラー8と、ミラー8から対物レンズ11に至る間の光路上に配置された瞳投影レンズ9と結像レンズ10とを含んでいる。
【0032】
励起光照射光学系は更に、対物レンズ11により試料Sに形成される励起光を含む光ビームのスポットを二次元的に走査する走査光学系7を有している。走査光学系7は、光源部1とミラー8の間の光路上に配置された、ガルバノメ一夕スキャナ7aとガルバノメ一夕スキャナ7bとで構成されている。
【0033】
二つのガルバノメ一夕スキャナ7aと7bは、それぞれ、方向を変更可能な反射面を有しており、反射面の方向を変更することにより、反射面で反射された光ビームを一方向に沿って(つまり一次元的に)走査する。二つのガルバノメ一夕スキャナ7aと7bは、その反射面で反射された光ビームを互いに直交する方向(X方向とY方向)に走査する。このため、走査光学系7により、試料Sに形成される光ビームのスポットは、二次元的に走査される。
【0034】
試料Sは光ビームの照射に反応して蛍光を発する。試料Sは、照射された光ビームに含まれる励起光の種類に対応した種類の蛍光を発する。本実施形態では、試料Sは二種類の試薬で染色されており、試料Sには二種類の励起光を含む光ビームが照射される。このため、試料Sからは二種類の蛍光が発生する。試料Sから発生する二種類の蛍光は、それぞれ、試料Sに照射される二種類の励起光の波長帯域に対応した波長帯域を有する。
【0035】
走査型蛍光顕微鏡は更に、試料Sから発生した蛍光を含む光ビームを、光源部1から試料Sに向かう光ビームから分離する分離光学素子5を有している。簡単に言えば、分離光学素子5は励起光と蛍光とを分離する。分離光学素子5は、例えば、光源部1と試料Sの間の光路上に位置するダイクロイックミラーで構成される。
【0036】
図1において、走査型蛍光顕微鏡は更に、分離光学素子5で分離された少なくとも一種類の蛍光を含む光ビームから特定の波長範囲内の蛍光を選択して透過する少なくとも一つの蛍光選択透過部を含む蛍光選択透過機構と、蛍光選択透過機構を透過した蛍光を検出する少なくとも一つの光検出器を含む蛍光検出部とを有している。
【0037】
より詳しくは、試料Sからは二種類の蛍光が発生されることに対応して、走査型蛍光顕微鏡は更に、分離光学素子5で分離された蛍光を含む光ビームを、それに含まれる二種類の蛍光の波長帯域に基づいて二本に分割する光ビーム分割部15を有している。蛍光選択透過機構は、光ビーム分割部15で分割された二本の光ビームから、それぞれ、特定の波長範囲内の蛍光を選択して透過する二つの蛍光選択透過部18と23を有している。蛍光検出部は、二つの蛍光選択透過部18と23を透過した蛍光をそれぞれ検出する二つの光検出器19と24を有している。
【0038】
光ビーム分割部15は、これに限定されないが、例えば、ダイクロイックミラーで構成される。二つの蛍光選択透過部18と23は、それぞれ、これに限定されないが、例えば、特定の波長範囲から外れた波長の光を吸収する吸収フィルターで構成される。二つの光検出器19と24は、それぞれ、これに限定されないが、例えば、フォトマルチプライヤ(PMT)で構成される。
【0039】
走査型蛍光顕微鏡は更に、分離光学素子5で分離された蛍光を含む光ビームを光ビーム分割部15に向けて偏向するミラー12と、光ビーム分割部15を透過した光ビームを光検出器24に向けて偏向するミラー20とを有している。
【0040】
走査型蛍光顕微鏡は更に、光ビーム分割部15と蛍光選択透過部18の間の光路上に配置された集光レンズ16およびピンホール17と、ミラー20と蛍光選択透過部23の間の光路上に配置された集光レンズ21およびピンホール22とを有している。
【0041】
ピンホール17とピンホール22は、それぞれ、対物レンズ11により試料Sに形成される励起光を含む光ビームのスポットに対して共焦点の位置関係に配置されている。このため、ピンホール17とピンホール22は、共焦点効果により、試料Sに形成される光ビームのスポットから外れた位置、特に光軸に沿って外れた位置から発生された蛍光を効果的に遮断する。このため、光検出器19と24は、試料Sに形成される光ビームのスポットの位置からの蛍光を選択的に検出し得る。
【0042】
走査型蛍光顕微鏡は更に、光源部1から射出される光ビームに含まれる二種類の励起光をそれぞれ選択的に遮断する励起光遮断光学素子13と励起光遮断光学素子14とを有している。二つの励起光遮断光学素子13と14は共に分離光学素子5と光ビーム分割部15の間の光路上に配置されている。二つの励起光遮断光学素子13と14は、好ましくは、それぞれ、ホログラフィックノッチフィルターで構成される。
【0043】
走査型蛍光顕微鏡においては、光源部1から発せられた励起光を含む光ビームは対物レンズ11により試料Sに収束される。対物レンズ11により試料Sに形成された光ビームのスポットは、走査光学系7により試料Sの表面上あるいは内部を二次元的に走査される。試料Sに照射される光ビームは二種類の励起光を含んでおり、試料Sはそれに対応した二種類の試薬で染色されているため、試料Sからは二種類の蛍光が発生する。
【0044】
試料Sから発生した二種類の蛍光は、それぞれ、光検出器19と光検出器24により検出される。特に、共焦点効果により、光ビームのスポットの位置から発生した蛍光が、光検出器19と光検出器24により選択的に検出される。光検出器19と光検出器24で得られる信号を、走査光学系7を制御する走査信号に同期させて処理することにより、それぞれの蛍光に基づく試料Sの蛍光画像が得られる。
【0045】
前述したように、レーザ光源2は、488nmと568nmと647nmの波長の光を発する。レーザーラインフィルター4は、図3に示される透過率特性を有しており、レーザ光源2で発せられた光のうち、488nmと568nmの光を選択的に透過する。従って、光源部1からは、488nmと568nmの励起光を含む光ビームが射出される。
【0046】
光源部1から射出された488nmと568nmの励起光は試料Sに照射され、試料Sからは、488nmの励起光に対応して、500nm〜540nmの波長帯域の蛍光が発生され、568nmの励起光に対応して、585nm〜650nmの波長帯域の蛍光が発生される。
【0047】
励起光と蛍光とを分離する分離光学素子5を構成するダイクロイックミラーは、例えば図4に示される透過率特性を有しており、光源部1から射出される488nmと568nmの波長の励起光を反射する一方、試料Sから発生される500〜540の波長帯域の蛍光と585nm〜650nmの波長帯域の蛍光を良好に透過する。
【0048】
図4から分かるように、分離光学素子5を構成するダイクロイックミラーは、488nmと568nmの波長の励起光をいくらかは透過する。このため、試料Sで反射された励起光のいくらかは、試料Sから発生された蛍光と一緒に分離光学素子5であるダイクロイックミラーを透過する。
【0049】
励起光遮断光学素子13を構成するホログラフィックノッチフィルターは、図5にHNF13で示される透過率特性を有し、励起光遮断光学素子14を構成するホログラフィックノッチフィルターは、図5にHNF14で示される透過率特性を有している。
【0050】
図5から分かるように、励起光遮断光学素子13を構成するホログラフィックノッチフィルターは、488nmの波長の近傍の帯域において、透過率がほとんど0である。従って、励起光遮断光学素子13を構成するホログラフィックノッチフィルターは、488nmの波長の励起光をほとんど完全に遮断する。
【0051】
同様に、励起光遮断光学素子14を構成するホログラフィックノッチフィルターは、568nmの波長の近傍の帯域において透過率がほとんど0である。従って、励起光遮断光学素子14を構成するホログラフィックノッチフィルターは、568nmの波長の励起光をほとんど完全に遮断する。
【0052】
その結果、光ビーム分割部15に到達した光ビームは、試料Sで反射された488nmと568nmの波長の励起光を殆ど含まない。つまり、光ビーム分割部15に到達した光ビームは、実質的に、検出対象である試料Sから発生された500nm〜540nmの波長帯域の蛍光と585nm〜650nmの波長帯域の蛍光で構成されている。
【0053】
光ビーム分割部15を構成するダイクロイックミラーは、例えば図6に示される透過率特性を有しており、500nm〜540nmの波長帯域の蛍光を良好に反射する一方、585nm〜650nmの波長帯域の蛍光を透過する。
【0054】
蛍光選択透過部18を構成する吸収フィルターは、例えば図7にBA18で示される透過率特性を有し、蛍光選択透過部23を構成する吸収フィルターは、図7にBA23で示される透過率特性を有している。
【0055】
図7から分かるように、励起光遮断光学素子13を構成するホログラフィックノッチフィルターの透過率特性HNF13と励起光遮断光学素子14を構成するホログラフィックノッチフィルターの透過率特性HNF14に対応して、吸収フィルター18と吸収フィルター23は共に比較的広い透過帯域を有している。
【0056】
比較例として、図1の構成から励起光遮断光学素子13と励起光遮断光学素子14とが省かれた構成(すなわち従来の走査型蛍光顕微鏡)において、蛍光選択透過部18を構成する吸収フィルターに要求される透過率特性と、蛍光選択透過部23を構成する吸収フィルターに要求される透過率特性を図8に示す。
【0057】
図1の構成から励起光遮断光学素子13と励起光遮断光学素子14とが省かれた構成においては、蛍光選択透過部18と蛍光選択透過部23に到達した光は、検出対象の蛍光の他に、試料Sで反射された不所望な励起光も含んでいる。このため、蛍光選択透過部18と蛍光選択透過部23は、単にそれぞれの検出対象の蛍光を透過するだけでなく、不所望な励起光を良好に遮断することも要求される。
【0058】
このため、蛍光選択透過部18を構成する吸収フィルターの透過特性は、488nmと568nmの波長の励起光を良好に遮断するように、図8にBA18で示されるように、透過帯域が狭いものにならざるを得ない。同様に、蛍光選択透過部23を構成する吸収フィルターの透過特性は、568nmの波長の励起光を良好に遮断するように、図8にBA23で示されるように、透過帯域が狭いものものにならざるを得ない。
【0059】
その結果、例えば、蛍光選択透過部18は、500nm〜540nmの透過帯域を有する吸収フィルターで構成され、蛍光選択透過部23は、585nm〜650nmの透過帯域を有する吸収フィルターで構成される。図8において、「585nm(蛍光)」は蛍光のピーク波長を示しており、実際の蛍光はこの両側にある帯域を持って広がっている。従って、BA23で示される特性の吸収フィルターであっても、蛍光を検出することは可能である。
【0060】
このような透過帯域の狭い吸収フィルターは、好ましくないことに、検出対象である蛍光をも吸収してしまい、その後方に位置する光検出器19や光検出器24に到達する蛍光の量を減少させてしまう。
【0061】
これに対して、本実施形態の走査型蛍光顕微鏡においては、不所望な488nmと568nmの波長の励起光は、分離光学素子5と光ビーム分割部15の間の光路上に配置された二つの励起光遮断光学素子13と14によって遮断される。このため、蛍光選択透過部18と蛍光選択透過部23に到達した光は、不所望な励起光を殆ど含まない。
【0062】
従って、蛍光選択透過部18と蛍光選択透過部23には、不所望な励起光を良好に遮断することは要求されない。このため、蛍光選択透過部18と蛍光選択透過部23に、透過帯域の広い吸収フィルターを使用することが可能になる。具体的には、本実施形態における吸収フィルター(図7)の励起光遮断レベルは、従来例における吸収フィルター(図8)の励起光遮断レベルに比べて1桁から3桁程度低くてよく、その分、蛍光の透過帯域を広げることができる。これにより、蛍光選択透過部18と蛍光選択透過部23の後方にそれぞれ位置する光検出器19と光検出器24に、より多くの量の蛍光を到達させることができる。
【0063】
その結果、本実施形態の走査型蛍光顕微鏡は、励起光の波長に近い波長の蛍光も検出できる。これにより、例えば、より明るい蛍光画像を得ることができる。
【0064】
第二実施形態
本実施形態は、走査型蛍光顕微鏡に向けられている。以下、図2を参照しながら本実施形態について説明する。
【0065】
図2は、本発明の第二実施形態の走査型蛍光顕微鏡を示している。図2において、図1中の部材と同一の参照符号で指示された部材は同様の部材であり、その詳しい説明は省略する。
【0066】
本実施形態の走査型蛍光顕微鏡は、主に蛍光選択透過機構の構成の点で、第一実施形態の走査型蛍光顕微鏡と相違している。
【0067】
図2に示されるように、本実施形態の走査型蛍光顕微鏡は、分離光学素子5とミラー12の間の光路上に、分離光学素子5で分離された蛍光を含む光ビームを収束させる結像レンズ25と、結像レンズ25の結像位置に配置された共焦点絞り26と、共焦点絞り26を通過し発散光ビームを平行光ビームに変えるレンズ27とを有している。
【0068】
共焦点絞り26は、対物レンズ11により試料Sに形成される励起光を含む光ビームのスポットに対して共焦点の位置関係に配置されている。このため、共焦点絞り26は、共焦点効果により、試料Sに形成される光ビームのスポットから外れた位置、特に光軸に沿って外れた位置から発生された蛍光を効果的に遮断する。これにより、最終的に得られる蛍光画像の分解能の向上に貢献する。
【0069】
本実施形態の走査型蛍光顕微鏡は、光ビーム分割部15から光検出器19に至る光路上に蛍光選択透過部28を有し、光ビーム分割部15からミラー20を経て光検出器24に至る光路上に蛍光選択透過部32を有している。
【0070】
別の観点から、図1に示される第一実施形態の走査型蛍光顕微鏡との相違に注目して述べれば、本実施形態の走査型蛍光顕微鏡は、分離光学素子5とミラー12の間の光路上に結像レンズ25と共焦点絞り26とレンズ27とが追加されており、第一実施形態の走査型蛍光顕微鏡の集光レンズ16とピンホール17と蛍光選択透過部18が蛍光選択透過部28に置き換えられ、集光レンズ21とピンホール22と蛍光選択透過部23が蛍光選択透過部32に置き換えられた構成をしている。
【0071】
蛍光選択透過部28は、入射する光ビームを波長分散させる分散素子(反射回折格子)29と、分散素子29により分散された光ビームを収束させる収束レンズ30と、収束レンズ30により収束された光ビームの一部の波長域を通す光学的開口すなわちスリット31とを有している。
【0072】
同様に、蛍光選択透過部32は、入射する光ビームを波長分散させる分散素子(反射回折格子)33と、分散素子33により分散された光ビームを収束させる収束レンズ34と、収束レンズ34により収束された光ビームの一部の波長域を通す光学的開口すなわちスリット35とを有している。
【0073】
蛍光選択透過部28と蛍光選択透過部32は、例えば、グレーティングガルバノで構成される。蛍光選択透過部28と蛍光選択透過部32は全く同様の機能を有している。このため、以下では、代表的に、蛍光選択透過部28の動作について述べる。
【0074】
蛍光選択透過部28において、分散素子29に入射した光ビームは、波長に従って異なる方向に分散される。つまり、入射光ビームに含まれる光は、波長成分毎に異なる方向に変更される。このため、収束レンズ30に入射した光は、光軸を横切る方向に関して、波長成分に応じて異なる位置に収束される。つまり、収束レンズ30は入射した光ビームを波長成分に応じて異なる位置に収束させる。このため、蛍光選択透過部28に入射した光のうち、特定の波長範囲の光だけがスリット31を通過し得る。つまり、スリット31は特定の波長成分の光だけを選択的に透過する。その結果、スリット31を通過した特定の波長範囲の光だけが光検出器19で検出される。
【0075】
全く同様にして、蛍光選択透過部32に入射した光ビームのうち、特定の波長範囲の光だけが、スリット35を通過して光検出器24で検出される。
【0076】
本実施形態の走査型蛍光顕微鏡においては、二つの励起光遮断光学素子(好ましくはホログラフィックノッチフィルター)13と14によって、蛍光選択透過部28と蛍光選択透過部32に到達する前に、不所望な励起光が除去される。このため、蛍光選択透過部28と蛍光選択透過部32に入射した光は、不所望な励起光を殆ど含まない。このため、スリット31とスリット35は、開口の大きさを比較的大きくすることが可能である。これにより、スリット31とスリット35の後方にそれぞれ位置する光検出器19と光検出器24に、より多くの量の蛍光を到達させることができる。
【0077】
その結果、本実施形態の走査型蛍光顕微鏡は、励起光の波長に近い波長の蛍光も検出できる。これにより、例えば、より明るい蛍光画像を得ることができる。
【0078】
より好ましくは、蛍光選択透過部28は分散素子29の方向を調整可能であり、蛍光選択透過部32は分散素子33の方向を調整可能であるとよい。例えば、蛍光選択透過部28において、分散素子29の方向を変えることにより、蛍光を細分化した波長帯域毎に検出することも可能である。同様に、蛍光選択透過部32において、分散素子33の方向を変えることにより、蛍光を細分化した波長帯域毎に検出することも可能である。
【0079】
つまり、本実施形態の走査型蛍光顕微鏡は、蛍光選択透過部28と蛍光選択透過部32をこの様に構成することにより、検出対象の蛍光のスペクトルデータを取得することも可能である。
【0080】
これまで、図面を参照しながら本発明の実施の形態を述べたが、本発明は、これらの実施の形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において様々な変形や変更が施されてもよい。
【0081】
上述した実施形態では、光源部1は二種類の単一波長の励起光を含む光ビームを射出し、試料Sからは二種類の蛍光が発生されることに対応して、蛍光選択透過機構は二つの蛍光選択透過部を有し、蛍光検出部は二つの光検出器19と24を有し、励起光遮断部は二つの励起光遮断光学素子13と14を有している。
【0082】
しかし、蛍光選択透過部と光検出器と励起光遮断光学素子の個数は、これに限定されるものではなく、光源部1から射出される光ビームに含まれる単一波長の励起光の種類、あるいは、試料Sから発生される蛍光の種類に対応して、適宜変更されてよい。
【0083】
前述したように、光源部1は一種類の単一波長の励起光を含む光ビームを射出してもよい。その場合、蛍光選択透過機構は一つの蛍光選択透過部を有し、蛍光検出部は一つの光検出器を有し、励起光遮断部は一つの励起光遮断光学素子を有していればよい。
【0084】
また、光源部1は三種類以上の単一波長の励起光を含む光ビームを射出してもよい。その場合、蛍光選択透過機構は対応する個数の蛍光選択透過部を有し、蛍光検出部は対応する個数の光検出器を有し、励起光遮断部は対応する個数の励起光遮断光学素子を有しているとよい。
【0085】
結局、光源部1は少なくとも一種類以上の単一波長の励起光を含む光ビームを射出し、それに対応して、蛍光選択透過機構は少なくとも一つの蛍光選択透過部を有し、蛍光検出部は少なくとも一つの光検出器を有し、励起光遮断部は少なくとも一つの励起光遮断光学素子を有していればよい。
【0086】
また、光源部1から射出される光は、レーザー光のようなほぼ単一波長の光が最も好ましいが、レーザー光でなくとも帯域の狭い光であってもよい。帯域の狭い光は、それ自体が光源から射出されるものに限らず、光源から射出された光からフィルター等の波長選択手段によって作られたものであってもよい。
【0087】
【発明の効果】
本発明によれば、蛍光を検出する光検出器に到達する不所望な励起光の量を抑えつつ、多く量の蛍光が光検出器に到達する蛍光顕微鏡が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の第一実施形態の走査型蛍光顕微鏡の構成を概略的に示している。
【図2】本発明の第二実施形態の走査型蛍光顕微鏡の構成を概略的に示している。
【図3】図1と図2に示された光源部内のレーザーラインフィルターの透過率特性を示している。
【図4】図1と図2に示された分離光学素子であるダイクロイックミラーの透過率特性を示している。
【図5】図1と図2に示された励起光遮断素子であるホログラフィックノッチフィルターの透過率特性を示している。
【図6】図1と図2に示された光ビーム分割部であるダイクロイックミラーの透過率特性を示している。
【図7】図1と図2に示された蛍光選択透過部である吸収フィルターの透過率特性を示している。
【図8】図1の構成からホログラフィックノッチフィルターが省かれた構成である従来の走査型蛍光顕微鏡において要求される吸収フィルターの透過率特性を示している。
【符号の説明】
1…光源部、2…レーザ光源、3…ビームエキスパンダ、4…レーザーラインフィルター、5…分離光学素子、7…走査光学系、7a…ガルバノメ一夕スキャナ、7b…ガルバノメ一夕スキャナ、8…ミラー、9…瞳投影レンズ、10…結像レンズ、11…対物レンズ、12…ミラー、13…励起光遮断光学素子、14…励起光遮断光学素子、15…光ビーム分割部、18…蛍光選択透過部、19…光検出器、23…蛍光選択透過部、24…光検出器、28…蛍光選択透過部、32…蛍光選択透過部。
Claims (7)
- 光ビームを試料に照射し試料から発する蛍光に基づいて試料を観察する蛍光顕微鏡であって、
少なくとも一種類の単一波長の励起光を含む光ビームを射出する光源部と、
光源部から射出された光ビームを試料に照射して試料から少なくとも一種類の蛍光を発生させる励起光照射光学系と、
試料から発生した少なくとも一種類の蛍光を含む光ビームを、光源部から試料に向かう光ビームから分離する分離光学素子と、
分離光学素子で分離された少なくとも一種類の蛍光を含む光ビームから特定の波長範囲内の蛍光を選択して透過する少なくとも一つの蛍光選択透過部を含む蛍光選択透過機構と、
蛍光選択透過機構を透過した蛍光を検出する少なくとも一つの光検出器を含む蛍光検出部と、
分離光学素子と蛍光選択透過部の間の光路上に位置し、光源部から射出された光ビームに含まれる少なくとも一種類の励起光を選択的に遮断する少なくとも一つの励起光遮断光学素子を含む励起光遮断部とを有している、蛍光顕微鏡。 - 請求項1において、
光源部は、複数種類の単一波長の励起光を含む光ビームを射出し、
励起光照射光学系は、複数種類の単一波長の励起光を含む光ビームを試料に照射して試料から複数種類の蛍光を発生させ、
分離光学素子は、試料から発生した複数種類の蛍光を含む光ビームを光源部から試料に向かう光ビームから分離し、
蛍光顕微鏡は更に、分離光学素子で分離された複数種類の蛍光を含む光ビームを、複数種類の蛍光の波長帯域に基づいて複数に分割する光ビーム分割部を有しており、
蛍光選択透過機構は、光ビーム分割部で分割された複数の光ビームから、それぞれ、特定の波長範囲内の蛍光を選択して透過する複数の蛍光選択透過部を有しており、
蛍光検出部は、複数の蛍光選択透過部を透過した蛍光をそれぞれ検出する複数の光検出器を有しており、
励起光遮断部は、光源部から射出された光ビームに含まれる複数種類の励起光をそれぞれ選択的に遮断する複数の励起光遮断光学素子を有している、蛍光顕微鏡。 - 請求項1または請求項2において、励起光遮断光学素子はホログラフィックノッチフィルターである、蛍光顕微鏡。
- 請求項1ないし請求項3のいずれかひとつにおいて、励起光照射光学系は、励起光を含む光ビームを試料に収束させる対物レンズと、対物レンズにより試料に形成される励起光を含む光ビームのスポットを走査する走査光学系とを含んでいる、蛍光顕微鏡。
- 請求項1ないし請求項4のいずれかひとつにおいて、蛍光選択透過部は、特定の波長範囲から外れた波長の光を吸収する吸収フィルターである、蛍光顕微鏡。
- 請求項1ないし請求項4のいずれかひとつにおいて、蛍光選択透過部は、入射する光ビームを波長分散させる分散素子と、分散素子により分散された光ビームを収束させる収束レンズと、収束レンズにより収束された光ビームの一部の波長域を通す光学的開口とを有し、収束レンズは入射した光ビームを波長成分に応じて異なる位置に収束させ、光学的開口は特定の波長成分の光を選択的に透過する、蛍光顕微鏡。
- 請求項6において、蛍光選択透過部は光学的開口に対する波長成分の収束位置を決め、分散素子の回転角度を変更可能とし、蛍光顕微鏡は、分散素子の回転角度を変えることにより、光学的開口を透過する光ビームの波長域を可変して、蛍光を細分化した波長帯域毎に検出し得る、蛍光顕微鏡。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2003137483A JP2004341204A (ja) | 2003-05-15 | 2003-05-15 | 蛍光顕微鏡 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2003137483A JP2004341204A (ja) | 2003-05-15 | 2003-05-15 | 蛍光顕微鏡 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2004341204A true JP2004341204A (ja) | 2004-12-02 |
JP2004341204A5 JP2004341204A5 (ja) | 2006-06-15 |
Family
ID=33527133
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2003137483A Pending JP2004341204A (ja) | 2003-05-15 | 2003-05-15 | 蛍光顕微鏡 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2004341204A (ja) |
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008139543A (ja) * | 2006-12-01 | 2008-06-19 | Osaka Prefecture Univ | 蛍光顕微鏡 |
WO2010150468A1 (ja) * | 2009-06-25 | 2010-12-29 | 株式会社 日立ハイテクノロジーズ | 蛍光分析装置および蛍光検出装置 |
US8471218B2 (en) | 2009-09-10 | 2013-06-25 | Olympus Corporation | Detecting device and optical apparatus including the detecting device |
JP2014167647A (ja) * | 2014-05-02 | 2014-09-11 | Nikon Corp | レーザ励起蛍光顕微鏡 |
JP2015525343A (ja) * | 2012-05-30 | 2015-09-03 | アイリス インターナショナル インコーポレイテッド | フローサイトメータ |
JP2016029504A (ja) * | 2015-11-12 | 2016-03-03 | 株式会社ニコン | レーザ励起蛍光顕微鏡 |
JP2017003864A (ja) * | 2015-06-12 | 2017-01-05 | オリンパス株式会社 | 顕微鏡システム |
US9746412B2 (en) | 2012-05-30 | 2017-08-29 | Iris International, Inc. | Flow cytometer |
-
2003
- 2003-05-15 JP JP2003137483A patent/JP2004341204A/ja active Pending
Cited By (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008139543A (ja) * | 2006-12-01 | 2008-06-19 | Osaka Prefecture Univ | 蛍光顕微鏡 |
WO2010150468A1 (ja) * | 2009-06-25 | 2010-12-29 | 株式会社 日立ハイテクノロジーズ | 蛍光分析装置および蛍光検出装置 |
JP2011027706A (ja) * | 2009-06-25 | 2011-02-10 | Hitachi High-Technologies Corp | 蛍光分析装置および蛍光検出装置 |
US8680484B2 (en) | 2009-06-25 | 2014-03-25 | Hitachi High-Technologies Corporation | Fluorescence analyzing apparatus and fluorescence detecting apparatus |
US8471218B2 (en) | 2009-09-10 | 2013-06-25 | Olympus Corporation | Detecting device and optical apparatus including the detecting device |
JP2015525343A (ja) * | 2012-05-30 | 2015-09-03 | アイリス インターナショナル インコーポレイテッド | フローサイトメータ |
US9746412B2 (en) | 2012-05-30 | 2017-08-29 | Iris International, Inc. | Flow cytometer |
US10126227B2 (en) | 2012-05-30 | 2018-11-13 | Iris International, Inc. | Flow cytometer |
US10209174B2 (en) | 2012-05-30 | 2019-02-19 | Iris International, Inc. | Flow cytometer |
US10330582B2 (en) | 2012-05-30 | 2019-06-25 | Iris International, Inc. | Flow cytometer |
US11255772B2 (en) | 2012-05-30 | 2022-02-22 | Iris International, Inc. | Flow cytometer |
US11703443B2 (en) | 2012-05-30 | 2023-07-18 | Iris International, Inc. | Flow cytometer |
JP2014167647A (ja) * | 2014-05-02 | 2014-09-11 | Nikon Corp | レーザ励起蛍光顕微鏡 |
JP2017003864A (ja) * | 2015-06-12 | 2017-01-05 | オリンパス株式会社 | 顕微鏡システム |
JP2016029504A (ja) * | 2015-11-12 | 2016-03-03 | 株式会社ニコン | レーザ励起蛍光顕微鏡 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US6229635B1 (en) | Light sensing device | |
EP1131662B1 (en) | Scanning confocal optical microscope system | |
JP5913964B2 (ja) | 分光検出装置、及び、それを備えた共焦点顕微鏡 | |
JP3568626B2 (ja) | 走査型光学顕微鏡 | |
US8203784B2 (en) | Multispectral lighting apparatus | |
JPH09502269A (ja) | 光束の少なくとも2つのスペクトル範囲を選択、検知する装置 | |
JP4920918B2 (ja) | 位相フィルタ、光学装置及びラスタ顕微鏡 | |
JP5861895B2 (ja) | 分光器及び顕微分光システム | |
JP2007506955A (ja) | エバネッセント波照明を備えた走査顕微鏡 | |
JP4434882B2 (ja) | レーザ走査型蛍光観察装置 | |
EP3951468A1 (en) | Confocal microscope unit and confocal microscope | |
JP4711649B2 (ja) | ラスタ顕微鏡 | |
JP2004341204A (ja) | 蛍光顕微鏡 | |
JP2007500368A (ja) | 走査型顕微鏡 | |
JP2001235684A (ja) | 共焦点走査型顕微鏡 | |
JP2003185927A (ja) | 走査型レーザー顕微鏡 | |
JP2001242383A (ja) | 顕微鏡 | |
JP2001255463A (ja) | 走査型光学装置 | |
JP2007304103A (ja) | 分光器およびこれを用いた共焦点光学系、走査型光学顕微鏡 | |
JP6035735B2 (ja) | 共焦点光スキャナおよび共焦点顕微鏡 | |
JP2011058953A (ja) | 検出装置、それを備えた光学装置 | |
JP4567324B2 (ja) | レーザー走査型共焦点顕微鏡 | |
JP2006010406A (ja) | 蛍光検出装置 | |
JP7351323B2 (ja) | 共焦点スキャナ、共焦点スキャナシステム、及び共焦点顕微鏡システム | |
JPH09184985A (ja) | 走査型光学顕微鏡 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060426 |
|
A621 | Written request for application examination |
Effective date: 20060426 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Effective date: 20090707 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20091104 |