JP2005140956A - 焦点検出装置および蛍光顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】 観察対象物からの蛍光による焦点検出を観察対象物の蛍光観察と同時に行える焦点検出装置および蛍光顕微鏡を提供する。
【解決手段】 蛍光顕微鏡２０の対物レンズ２６の光軸２０ａ上に配置され、観察対象物２５に含まれる蛍光物質を励起可能な所定波長域の光を一部透過して一部反射すると共に、蛍光物質から発生する蛍光を一部透過して一部反射する光学手段１５と、焦点検出用の所定波長域の照明光Ｌ１を少なくとも光学手段と対物レンズとを介して観察対象物に導く照明手段(１１〜１４)と、照明光Ｌ１により励起された蛍光物質からの蛍光を少なくとも対物レンズと光学手段とを介して受光し、対物レンズと観察対象物との相対的な位置関係に応じた受光信号を出力する受光手段(１３,１４,１６〜１８)とを備える。
【選択図】 図１

Description

本発明は、観察対象物からの蛍光を取り込んで焦点検出を行う焦点検出装置および蛍光顕微鏡に関する。

周知のように、顕微鏡には、所定の結像面（例えばイメージセンサの撮像面）に観察対象物の鮮明な像を形成するため、オートフォーカス機構が組み込まれている。オートフォーカス機構の中で重要な部分は、光学系により結像される像と所定の結像面との位置ずれ（焦点ずれ）を検出するための焦点検出装置である。焦点検出装置としては、観察対象物の像を画像として取り込み、その画像のコントラストに基づいて焦点検出を行う方式が知られている（例えば特許文献１を参照）。
特許第３２３９３４３号公報

しかしながら、上記した画像コントラスト方式は、観察対象物から発生する光の光量の影響を受けやすい。このため、蛍光観察時のように観察対象物からの光量が少ないと、焦点検出に膨大な時間を要したり、焦点検出が困難になったりする。そこで、本発明者らは、観察対象物からの光量が少なくても良好に焦点検出を行える装置を提案した（特願２００２−１００２４２号）。さらに、この特許出願では、観察対象物からの蛍光による焦点検出と観察対象物の蛍光観察とを別々のタイミングで行うことを提案している。しかし、全体の作業効率を考え、観察対象物を蛍光観察しながら焦点検出を行うことが望まれるようになってきた。

本発明の目的は、観察対象物からの蛍光による焦点検出を観察対象物の蛍光観察と同時に行える焦点検出装置および蛍光顕微鏡を提供することにある。

請求項１に記載の焦点検出装置は、蛍光顕微鏡の対物レンズの光軸上に配置され、観察対象物に含まれる蛍光物質を励起可能な所定波長域の光を一部透過して一部反射すると共に、前記蛍光物質から発生する蛍光を一部透過して一部反射する光学手段と、焦点検出用の前記所定波長域の照明光を少なくとも前記光学手段と前記対物レンズとを介して前記観察対象物に導く照明手段と、前記照明光により励起された前記蛍光物質からの前記蛍光を少なくとも前記対物レンズと前記光学手段とを介して受光し、前記対物レンズと前記観察対象物との相対的な位置関係に応じた受光信号を出力する受光手段とを備えたものである。

請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の焦点検出装置において、前記照明手段は、前記照明光を前記光軸に対して斜め方向から前記観察対象物に導き、前記受光手段は、前記対物レンズの焦点位置と共役な面の後方に配された受光面を有し、該受光面に入射する前記蛍光の光量に応じて前記受光信号を出力するものである。
請求項３に記載の発明は、請求項２に記載の焦点検出装置において、前記焦点位置と共役な面には、受光視野絞りが配置され、前記受光手段は、前記受光視野絞りを介して前記受光面に入射する前記蛍光の光量に応じて前記受光信号を出力するものである。

請求項４に記載の発明は、請求項３に記載の焦点検出装置において、前記照明手段は、前記観察対象物の照明範囲を規定する照明視野絞りを有し、前記照明視野絞りと前記受光視野絞りとは、相似形状である。
請求項５に記載の発明は、請求項１から請求項４の何れか１項に記載の焦点検出装置において、前記光学手段は、１つの光学素子からなり、前記照明手段と前記受光手段とは、前記１つの光学素子を共有している。

請求項６に記載の発明は、蛍光物質で標識された観察対象物の蛍光観察に用いられる蛍光顕微鏡において、対物レンズと、前記対物レンズの光軸上に配置され、前記蛍光物質を励起可能な所定波長域の光を反射して前記蛍光物質から発生する蛍光を透過するダイクロイックミラーと、観察用の前記所定波長域の照明光を少なくとも前記ダイクロイックミラーと前記対物レンズとを介して前記観察対象物に導く観察照明手段と、請求項５に記載の焦点検出装置とを備え、前記焦点検出装置の前記１つの光学素子は、前記対物レンズと前記ダイクロイックミラーとの間に配置されているものである。

請求項７に記載の発明は、請求項６に記載の蛍光顕微鏡において、前記観察照明手段と前記焦点検出装置の前記照明手段とは、前記観察照明手段による前記観察対象物の照明範囲と前記照明手段による前記観察対象物の照明範囲とが重ならないように構成されているものである。

本発明によれば、観察対象物からの蛍光による焦点検出を観察対象物の蛍光観察と同時に行うことができる。

以下、図面を用いて本発明の実施形態を詳細に説明する。
（第１実施形態）
ここでは、図１に示す通り、蛍光顕微鏡２０の観察結像系(２６〜２８)に組み込まれた焦点検出装置１０の例を説明する。蛍光顕微鏡２０は、標本２５の蛍光観察に用いられる顕微鏡である。標本２５（観察対象物）は、例えば、蛍光物質で標識された生物標本（ＤＮＡや蛋白質など）である。標本２５は、不図示のステージ上に載置され、観察結像系(２６〜２８)の光軸２０ａの方向に沿って移動可能である。光軸２０ａの方向を「ｚ方向」とする。なお、図１には、標本２５が観察結像系(２６〜２８)の焦点位置に一致した状態（合焦状態）を例示している。このときの標本２５のＺ位置を「合焦位置」という。

第１実施形態の焦点検出装置１０の説明に先立って、蛍光顕微鏡２０の構成を説明しておく。蛍光顕微鏡２０は、観察結像系(２６〜２８)の他に、２次元撮像素子３０と、観察照明系(３１〜３８)とで構成されている。
観察結像系(２６〜２８)は、無限遠系の対物レンズ２６と、第２対物レンズとして機能する結像レンズ２７と、これら対物レンズ２６,結像レンズ２７の間に配置された波長選択フィルタ２８とで構成されている。波長選択フィルタ２８は、標本２５に含まれる蛍光物質から発生した蛍光（例えば波長520ｎｍ〜600ｎｍの光）を選択的に透過する特性を持つ。観察結像系(２６〜２８)の光軸２０ａは、対物レンズ２６の光軸と一致している。

観察照明系(３１〜３８)は、光軸３０ａに沿って、光源３１と、レンズ３２,３３と、開口絞り３４と、レンズ３５と、照明視野絞り３６と、レンズ３７と、ダイクロイックミラー３８とが順に配置された構成である。また、観察照明系(３１〜３８)は、その光軸３０ａが観察結像系(２６〜２８)の光軸２０ａに対して略直交する向きで、観察結像系(２６〜２８)の対物レンズ２６と波長選択フィルタ２８との間に組み込まれている。このとき、観察照明系(３１〜３８)のうちダイクロイックミラー３８が光軸２０ａ上に配置される。

観察照明系(３１〜３８)の光源３１は、例えば高圧水銀ランプであり、紫外線や可視光線などの観察用の照明光を発生する。照明光は、標本２５に含まれる蛍光物質を励起可能な波長域（例えば505ｎｍ以下）の光である。光源３１からの照明光は、レンズ３２,３３を介した後、開口絞り３４に達する。開口絞り３４は、観察結像系(２６〜２８)の対物レンズ２６の瞳面（像側焦点面）と共役な面に配置されている。開口絞り３４には、円形状の開口３４ａが光軸３０ａに中心を揃えて設けられる。開口３４ａを通過した照明光は、レンズ３５を介した後、照明視野絞り３６に達する。

照明視野絞り３６は、標本２５の合焦位置と共役な面に配置されている。また、照明視野絞り３６には、矩形状の開口３６ａが光軸３０ａに中心を揃えて設けられる。開口３６ａを通過した照明光は、レンズ３７を介した後、ダイクロイックミラー３８に達する。ダイクロイックミラー３８は、例えば波長５０５ｎｍ以下の光を選択的に反射して、波長５０５ｎｍ以上の光を選択的に透過する特性を持つ。つまり、光源３１からの照明光（標本２５の蛍光物質を励起可能な波長域の光）はダイクロイックミラー３８で反射され、標本２５に含まれる蛍光物質から発生した蛍光はダイクロイックミラー３８を透過する。

ここで、上記のように構成された蛍光顕微鏡２０のダイクロイックミラー３８と対物レンズ２６との間（光軸２０ａ上）には、第１実施形態の焦点検出装置１０（後述）の平行平面ガラス１５が配置されている。平行平面ガラス１５は、上記した波長選択フィルタ２８やダイクロイックミラー３８のような波長選択性を持たず、標本２５の蛍光物質を励起可能な波長域の光を一部透過して一部反射すると共に、標本２５の蛍光物質から発生する蛍光を一部透過して一部反射する。また、平行平面ガラス１５のダイクロイックミラー３８側の面には反射防止膜(不図示)が施されている。平行平面ガラス１５の対物レンズ２６側の面において、反射率は波長に拘わらず約４％であり、透過率は波長に拘わらず約９６％である。平行平面ガラス１５は、請求項の「光学手段」,「１つの光学素子」に対応する。

上記の構成において、蛍光顕微鏡２０の光源３１からの照明光（標本２５の蛍光物質を励起可能な光）は、レンズ３２,３３→開口絞り３４の開口３４ａ→レンズ３５→照明視野絞り３６の開口３６ａ→レンズ３７を順に通過した後、ダイクロイックミラー３８で反射して観察結像系(２６〜２８)に導かれ、平行平面ガラス１５と対物レンズ２６を介して標本２５に達する（ケーラー照明）。照明光は、対物レンズ２６により集光され、標本２５に含まれる蛍光物質を励起する。

なお、観察照明系(３１〜３８)のうち、ダイクロイックミラー３８以外の光学素子(３１〜３７)は、請求項の「観察照明手段」に対応し、観察用の照明光を少なくともダイクロイックミラー３８と対物レンズ２６とを介して標本２５に導く手段である（落射照明系）。
観察照明系(３１〜３８)による標本２５の照明範囲２５ｂは、照明視野絞り３６の開口３６ａと相似形状であり、観察結像系(２６〜２８)の光軸２０ａを中心とした矩形状となる。光軸２０ａは、標本２５を蛍光観察する際の視野（観察視野）の中心に相当する。符号２６ａの円形領域は、対物レンズ２６の視野に相当する。標本２５に含まれる蛍光物質は、照明範囲２５ｂ内で励起され、照明範囲２５ｂ内から蛍光を発生する。

標本２５の蛍光観察時、合焦状態の標本２５から発生した蛍光は、観察結像系(２６〜２８)の対物レンズ２６→焦点検出装置１０の平行平面ガラス１５→観察照明系(３１〜３８)のダイクロイックミラー３８→観察結像系(２６〜２８)の波長選択フィルタ２８→結像レンズ２７を順に通過し、対物レンズ２６と結像レンズ２７の作用によって、標本２５の合焦位置（つまり対物レンズ２６の焦点位置）と共役な所定の結像面２９に集光される。このとき、所定の結像面２９には、標本２５の蛍光像が鮮明に形成される。

結像面２９には２次元撮像素子３０（例えばＣＣＤイメージセンサ）が設置されるため、標本２５が合焦状態にあるときには、標本２５の鮮明な蛍光像を２次元撮像素子３０によって取り込むことができる。第１実施形態では、対物レンズ２６と結像レンズ２７とによる観察倍率を２０倍、対物レンズ２６の開口数を０.４とする。
次に、第１実施形態の焦点検出装置１０について説明する。焦点検出装置１０は、標本２５が合焦状態にあるか否かを検出するための装置であり、照明系(１１〜１３)と受光系(１４〜１８)とで構成される。照明系(１１〜１３)は、光軸１０ａに沿って、光源１１と照明視野絞り１２とダイクロイックミラー１３とが順に配置された構成となっている。受光系(１４〜１８)は、光軸１０ｂに沿って、上記の平行平面ガラス１５と、結像レンズ１４と波長選択フィルタ１６と受光視野絞り１７と光電検出器１８とが順に配置された構成となっている。

そして、受光系(１４〜１８)は、その光軸１０ｂが上記した観察結像系(２６〜２８)の光軸２０ａに対して略直交する向きで、観察結像系(２６〜２８)の対物レンズ２６と観察照明系(３１〜３８)のダイクロイックミラー３８との間に組み込まれる。このとき、受光系(１４〜１８)の平行平面ガラス１５が光軸２０ａ上に配置される。照明系(１１〜１３)は、その光軸１０ａが受光系(１４〜１８)の光軸１０ｂに対して略直交する向きで、受光系(１４〜１８)の結像レンズ１４と波長選択フィルタ１６との間に組み込まれる。このとき、照明系(１１〜１３)のダイクロイックミラー１３が光軸１０ｂ上に配置される。

また、光源１１は、小型の半導体レーザーや発光ダイオード(例えば白色ＬＥＤ)などであり、紫外線や可視光線などの焦点検出用の照明光を射出する。焦点検出用の照明光は、上記した観察用の照明光と同様、標本２５内の蛍光物質を励起可能な波長域（例えば５０５ｎｍ以下）の光である。この光源１１は、照明視野絞り１２の開口１２ａの近傍位置に、照明光の射出方向を光軸１０ａに対して斜めに向けて設置されている。

照明視野絞り１２は、標本２５の合焦位置および結像面２９と共役な面に配置されている。また、照明視野絞り１２には、細長いスリット形状の開口１２ａが光軸１０ａから外れた位置に設けられている。開口１２ａの長手方向は、紙面に垂直である。開口１２ａの軸外し方向は、開口１２ａの幅方向と一致している。照明視野絞り１２は、光源１１からの照明光により、開口１２ａの幅方向から斜光照明されている。

光源１１から射出されて照明視野絞り１２の開口１２ａを通過した照明光Ｌ１は、光軸１０ａに対して斜めの方向に進行し、ダイクロイックミラー１３に達する。ダイクロイックミラー１３の特性は、観察照明系(３１〜３８)のダイクロイックミラー３８と同じである。このため、照明光Ｌ１は、ダイクロイックミラー１３で反射した後、受光系(１４〜１８)の結像レンズ１４を介して平行平面ガラス１５に入射し、そこで反射した成分が対物レンズ２６により集光されて標本２５に達する。

すなわち、観察結像系(２６〜２８)の光軸２０ａに対して斜め方向から照明光Ｌ１を標本２５に照射して、標本２５を斜光照明する。厳密にいえば、標本２５に入射する照明光Ｌ１の主光線の方向が光軸２０ａに対して斜め方向となっている。第１実施形態の焦点検出装置１０では、照明視野絞り１２の開口１２ａを通過した後の照明光Ｌ１を光軸１０ａに対して斜めに進行させることにより、標本２５の斜光照明を実現している。

さらに、第１実施形態では、照明視野絞り１２の開口１２ａを細長いスリット形状としたため、標本２５の照明範囲２５ａを細長いスリット形状に規定することができる。照明範囲２５ａの長手方向も、紙面に垂直である。照明範囲２５ａと照明視野絞り１２の開口１２ａとは、相似形状である。第１実施形態では、照明範囲２５ａの幅を０.０５ｍｍとする。

また、標本２５の照明範囲２５ａの長手方向と、照明範囲２５ａに入射する照明光Ｌ１の主光線の方向とは、互いに直交する。すなわち、標本２５は、スリット形状の照明範囲２５ａの幅方向から斜光照明されたことになる。これは、光源１１からの照明光の射出方向を照明視野絞り１２の開口１２ａの幅方向に傾けたからである。
さらに、焦点検出装置１０による標本２５の照明範囲２５ａは、観察結像系(２６〜２８)の光軸２０ａから外れ、蛍光顕微鏡２０による標本２５の照明範囲２５ｂと重ならないようになっている。詳細は後述するように、焦点検出装置１０による照明範囲２５ａの位置は、標本２５の合焦状態に応じて照明範囲２５ａの幅方向に変化する。このような照明範囲２５ａの移動を考慮しても、焦点検出装置１０による照明範囲２５ａが蛍光顕微鏡２０による照明範囲２５ｂと重なることはない。これは、照明視野絞り１２の開口１２ａを軸外しの状態で配置したからである。

そして、斜光照明された標本２５に含まれる蛍光物質は、照明範囲２５ａ内で励起され、照明範囲２５ａ内から蛍光（以下「焦点検出時の蛍光」という）を発生する。焦点検出時の蛍光は、対物レンズ２６を介して平行平面ガラス１５に入射し、そこで反射した成分が結像レンズ１４に達する。さらに、焦点検出時の蛍光は、ダイクロイックミラー１３を透過して波長選択フィルタ１６に達する。波長選択フィルタ１６の特性は、観察結像系(２６〜２８)の波長選択フィルタ２８と同じである。このため、焦点検出時の蛍光（対物レンズ２６と結像レンズ２７の作用により集光された蛍光）は、波長選択フィルタ１６を透過して、受光視野絞り１７に達する。

受光視野絞り１７は、標本２５の合焦位置および結像面２９と共役な面に配置されている。また、受光視野絞り１７には、細長いスリット形状の開口１７ａ（詳細は後述する）が光軸１０ｂから外れた位置に設けられている。開口１７ａの長手方向は、紙面に垂直である。開口１７ａの軸外し方向は、開口１７ａの幅方向と一致している。
受光視野絞り１７の配置面（標本２５の合焦位置と共役な面）には、標本２５が合焦状態にあるとき、この標本２５の照明範囲２５ａ内から発生した焦点検出時の蛍光が良好に集光される。つまり、標本２５の照明範囲２５ａの鮮明な蛍光像が受光視野絞り１７の配置面に形成される。

ここで、受光視野絞り１７の開口１７ａについて具体的に説明する。受光視野絞り１７の開口１７ａは、上記した照明視野絞り１２の開口１２ａと相似形状である。このため、開口１７ａは、標本２５の照明範囲２５ａと相似形状になり、標本２５の照明範囲２５ａの蛍光像とも相似形状になる。
そして、第１実施形態の焦点検出装置１０では、照明範囲２５ａの蛍光像と大きさが合致するように、受光視野絞り１７の開口１７ａの大きさを定めている。例えば、照明範囲２５ａの幅を０.０５ｍｍ、対物レンズ２６,結像レンズ１４による観察倍率を２０倍とすると、照明範囲２５ａの蛍光像の幅は１ｍｍとなる。この場合には、受光視野絞り１７の開口１７ａの幅も１ｍｍに設定する。

なお、焦点検出装置１０では、光源１１から標本２５へ導かれる照明光Ｌ１と、標本２５から受光視野絞り１７へ導かれる蛍光とが、共通の光学素子(２６,１４)を通過する。このため、照明視野絞り１２の開口１２ａと受光視野絞り１７の開口１７ａとが同じ大きさの場合に、受光視野絞り１７の配置面における標本２５の蛍光像を開口１７ａの大きさと合致させることができる。

したがって、標本２５が合焦状態にあるとき、受光視野絞り１７の配置面に形成される照明範囲２５ａの蛍光像は、受光視野絞り１７の開口１７ａと重なり、そのまま開口１７ａを通過する。受光視野絞り１７の開口１７ａを通過した焦点検出時の蛍光は、光電検出器１８に達する。
光電検出器１８は、受光視野絞り１７の配置面（標本２５の合焦位置および結像面２９と共役な面）の後方に配された受光面１８ａを有している。受光面１８ａの中心は、光軸１０ｂから外れている。受光面１８ａには、受光視野絞り１７の開口１７ａを通過した後の蛍光による像（ボケた蛍光像）が形成される。そして、光電検出器１８は、受光面１８ａに形成されるボケた蛍光像に応じて受光面１８ａに入射する光量を一括で検出し、その光量に応じた受光信号を出力する。このような光電検出器１８には、例えばフォトマルチプライヤなど、微弱光の検出に適したものを用いることが好ましい。

焦点検出装置１０では、対物レンズ２６と受光視野絞り１７との間に、ダイクロイックミラー１３と波長選択フィルタ１６とが配置されるため、標本２５に対する照明光Ｌ１の反射光（ノイズ光）を遮断して、標本２５で発生した蛍光のみを光電検出器１８に効率良く導くことができる。
上記のように構成された焦点検出装置１０のうち、光源１１,照明視野絞り１２,ダイクロイックミラー１３,結像レンズ１４は、請求項の「照明手段」に対応し、焦点検出用の照明光Ｌ１を少なくとも平行平面ガラス１５と対物レンズ２６とを介して標本２５に導く手段である。また、結像レンズ１４,ダイクロイックミラー１３,波長選択フィルタ１６,受光視野絞り１７,光電検出器１８は、請求項の「受光手段」に対応し、照明光Ｌ１により励起された蛍光物質からの蛍光を少なくとも対物レンズ２６と平行平面ガラス１５とを介して受光し、対物レンズ２６と標本２５との相対的な位置関係に応じた受光信号を出力するものである。第１実施形態の焦点検出装置１０では、「照明手段」を構成する光学系(１１〜１４)と「受光手段」を構成する光学系(１３,１４,１６〜１８)とが、光軸２０ａ上の平行平面ガラス１５を共有している。

次に、第１実施形態の焦点検出装置１０における焦点検出の原理について、図２,図３を用いて説明する。
図２には、原理説明に必要な部分（標本２５,対物レンズ２６,結像レンズ１４,受光視野絞り１７,光電検出器１８）のみを示している。また、図２(ａ)はいわゆる前ピン状態、図２(ｂ)は合焦状態、図２(ｃ)はいわゆる後ピン状態を示したものである。図３は、標本２５と対物レンズ２６との光軸方向の距離（Ｚ位置）が変化したときに、光電検出器１８によって検出される光量の変化を示したものである。

図２(ｂ)に示す合焦状態のとき、標本２５の照明範囲２５ａの蛍光像は、受光視野絞り１７の開口１７ａと重なる位置に形成される。そして、蛍光像の形成に関わる全ての蛍光が、そのまま開口１７ａを通過する。このため、光電検出器１８によって検出される光量は、最大となる。
一方、図２(ａ)に示す前ピン状態のとき、標本２５の照明範囲２５ａは図中左方に移動する。これは、標本２５が図中左方から斜光照明されているからである。このとき、標本２５の照明範囲２５ａの蛍光像は、受光視野絞り１７の開口１７ａから外れ、図中右方に位置する。このため、蛍光像の形成に関わる蛍光は、開口１７ａを通過することができず、光電検出器１８によって検出される光量は、ほぼ零となる。

逆に、図２(ｃ)に示す後ピン状態のとき、標本２５の照明範囲２５ａは図中右方に移動する。これは、標本２５が図中左方から斜光照明されているからである。このとき、標本２５の照明範囲２５ａの蛍光像は、受光視野絞り１７の開口１７ａから外れ、図中左方に位置する。このため、蛍光像の形成に関わる蛍光は、開口１７ａを通過することができず、光電検出器１８によって検出される光量は、ほぼ零となる。

このように、第１実施形態の焦点検出装置１０では、標本２５をＺ方向に移動させると、標本２５の照明範囲２５ａがその幅方向(図中左右方向)に移動し、照明範囲２５ａの蛍光像もその幅方向(図中左右方向)つまり受光視野絞り１７の開口１７ａの幅方向に移動する。そして、蛍光像のうち開口１７ａとの重なり部分の面積が変化する。後段の光電検出器１８に達するのは、重なり部分を通過した焦点検出時の蛍光であり、そこでの検出光量は重なり部分の面積に比例する。

したがって、第１実施形態の焦点検出装置１０では、標本２５をＺ方向に移動させながら、光電検出器１８から出力される受光信号（∝検出光量）を監視することにより、焦点検出を行うことができる。そして、光電検出器１８による検出光量が最大となったところ(図３の位置Ｚｂ)が、標本２５の合焦位置と判断される。
なお、上記した第１実施形態の焦点検出装置１０では、対物レンズ２６と結像レンズ１４とによる観察倍率を２０倍としたので、標本２５の位置が光軸方向に０.０１ｍｍだけ移動すると、照明範囲２５ａの蛍光像の位置は、受光視野絞り１７の配置面上で横方向に０.２ｍｍずれることになる。

また、受光視野絞り１７の開口１７ａの幅は１ｍｍであるため、照明範囲２５ａの蛍光像が開口１７ａの幅方向（横方向）に０.２ｍｍずれると、光電検出器１８による検出光量は２０％ほど変化することになる。このため、標本１５が例えば生物標本のように０.０５ｍｍ程度の厚みを持つ場合でも、光電検出器１８による検出光量を監視することで、必要十分な焦点検出を行うことができる。

上述したように、第１実施形態の焦点検出装置１０によれば、標本２５の蛍光像の光量変化を監視することにより焦点検出を行うため、標本２５の蛍光観察時のように、標本２５からの光量が微弱であっても、短時間で良好に焦点検出を行うことができる。また、標本２５をＺ方向に移動させながら光電検出器１８による検出光量を監視し、この検出光量が最大となったか否かを判断するような制御装置との組み合わせにより、標本２５からの光量が微弱であっても、極めて精度の高いオートフォーカスを実行することができる。

さらに、第１実施形態の焦点検出装置１０によれば、対物レンズ２６の光軸２０ａ上の平行平面ガラス１５を介して、焦点検出用の照明光Ｌ１を標本２５に導くと共に、照明光Ｌ１により標本２５から発生した蛍光を受光するため、標本２０ａの蛍光観察と同時に焦点検出を行うことができる。つまり、焦点検出を高速に行うことができる。その結果、全体の作業効率が向上する。さらに、照明用と受光用とで１つの平行平面ガラス１５を共有するため、焦点検出時と蛍光観察時の光量低下を最小限に抑えられ、構成も簡単化する。

また、第１実施形態の焦点検出装置１０によれば、標本２５の焦点検出用の照明範囲２５ａと蛍光観察用の照明範囲２５ｂとが互いに重なることはないため、照明範囲２５ａから発生した焦点検出用の蛍光が２次元撮像素子３０に入射する事態は起きない。したがって、標本２０ａの蛍光観察と同時に焦点検出を行う場合でも、良好な観察画像を取り込むことができる。また、蛍光観察用の照明範囲２５ｂでの照明光Ｌ１による退色を確実に防止できる。逆に、照明範囲２５ｂから発生した観察用の蛍光は、一部が平行平面ガラス１５で反射して焦点検出装置１０の側に導かれるが、受光視野絞り１７の開口１７ａ以外の箇所で遮断される。このため、標本２０ａの蛍光観察と同時に良好な焦点検出を行うことができる。

さらに、上記した第１実施形態の焦点検出装置１０では、標本２５の照明範囲２５ａをスリット形状としたので、標本２５に含まれる蛍光物質がまばらに分布している場合でも、光電検出器１８による検出光量を確保することができ、短時間で良好に焦点検出を行うことができる。この場合には、標本２５の照明範囲２５ａ内で平均化された合焦位置が得られる。

また、上記した第１実施形態の焦点検出装置１０では、標本２５の合焦位置と共役な面に受光視野絞り１７を設けたので、対物レンズ２６を交換して標本２５の観察倍率を変えたときのように、受光視野絞り１７の配置面における蛍光像（標本２５の照明範囲２５ａに対応）の大きさが変化しても、これに応じて受光視野絞り１７の開口１７ａの大きさを変えることができる。つまり、観察倍率を変更しても、蛍光像と開口１７ａの大きさを合致させることができ、上記と同様の焦点検出を短時間で良好に行うことができる。

さらに、第１実施形態の焦点検出装置１０では、受光視野絞り１７の配置面における蛍光像と開口１７ａの大きさを合致させるため、合焦状態の近傍でも光電検出器１８による検出光量の変化を容易に捉えることができ、効率良く焦点検出を行える。
（第２実施形態）
ここでは、図４に示す通り、蛍光顕微鏡２０の観察結像系(２６〜２８)に組み込まれた焦点検出装置６０の例を説明する。蛍光顕微鏡２０の構成については第１実施形態(図１)で説明したため、ここでの説明を省略する。なお、図４の蛍光顕微鏡２０で図示した波長選択フィルタ３９は、光源３１からの照明光（例えば波長５０５ｎｍ以下の光）を選択的に透過する特性を持つ。

第２実施形態の焦点検出装置６０には、平行平面ガラス１５と、結像レンズ１４と、視野絞り６１と、結像レンズ６２と、ダイクロイックミラー６３と、波長選択フィルタ６４と、光電検出器１８と、光源６５とが設けられている。このうち平行平面ガラス１５,結像レンズ１４,光電検出器１８の説明は既に行ったため、ここでの説明を省略する。ダイクロイックミラー６３と波長選択フィルタ６４の機能、および光源６５の構成も、上記の光学素子(１３,１６,１１)と同じであり、ここでの説明を省略する。

焦点検出装置６０の特徴は、標本２５の合焦位置および結像面２９と共役な面に、視野絞り６１を設けた点にある。視野絞り６１は、図１の照明視野絞り１２と受光視野絞り１７の機能を兼ね備えたものである。つまり、焦点検出装置６０は、照明視野絞り１２と受光視野絞り１７とを共通の光学素子（視野絞り６１）にて構成した点を特徴とする。視野絞り６１には、光軸１０ｂから外れた位置に細長いスリット形状の開口６１ａが設けられている。開口６１ａの長手方向は、紙面に垂直である。

また、このような視野絞り６１の配置を実現するために、焦点検出装置６０の照明手段(６５,６３〜６１,１４)と受光手段(１４,６１〜６４,１８)とは、標本２５の合焦位置および結像面２９と共役な面から標本２５までの間に配置された光学素子(１４,１５,２６)が共通となっている。
視野絞り６１と光電検出器１８との間で順に配置された光学素子(６２〜６４)は、光源６５からの照明光を光軸１０ｂに対して斜めの方向に進行させながら視野絞り６１に導く（照明光Ｌ３参照）と共に、視野絞り６１の開口６１ａを通過した焦点検出時の蛍光を効率良く光電検出器１８に導くためのものである。

視野絞り６１の開口６１ａを通過した後の照明光Ｌ３も、光軸１０ｂに対して斜めの方向に進行し、結像レンズ１４を介した後、平行平面ガラス１５で反射して、対物レンズ２６を介して標本２５に達する。すなわち、標本２５を斜光照明する。このとき、標本２５は、スリット形状の照明範囲２５ａの幅方向から斜光照明されたことになる。
斜光照明された標本２５は、照明範囲２５ａ内から蛍光を発生する。この蛍光は、対物レンズ２６を介した後、平行平面ガラス１５で反射し、結像レンズ１４を介して視野絞り６１に達する。視野絞り６１の配置面には標本２５の照明範囲２５ａの蛍光像が形成される。蛍光像の大きさは視野絞り６１の開口６１ａの大きさに合致している。そして、視野絞り６１の開口６１ａを通過した蛍光は、結像レンズ６２とダイクロイックミラー６３と波長選択フィルタ６４を透過した後、光電検出器１８に入射する。

第２実施形態の焦点検出装置６０における焦点検出の原理も、前述した焦点検出装置１０と同様である（図２,図３参照）。標本２５をＺ方向に移動させると、標本２５の照明範囲２５ａの蛍光像がその幅方向（つまり視野絞り６１の開口６１ａの幅方向，紙面に対して上下方向）に移動する。そして、蛍光像のうち開口６１ａとの重なり部分の面積が変化する。後段の光電検出器１８による検出光量は、重なり部分の面積に比例する。

したがって、標本２５をＺ方向に移動させながら、光電検出器１８によって検出される光量を監視することにより、焦点検出を行うことができる。そして、光電検出器１８による検出光量が最大となったところ（図３の位置Ｚｂ）が、標本２５の合焦位置と判断される。
このように、第２実施形態の焦点検出装置６０でも、標本２５の蛍光像の光量変化を監視することにより焦点検出を行うため、標本２５の蛍光観察時のように、標本２５からの光量が微弱であっても、短時間で良好に焦点検出を行うことができる。

さらに、第２実施形態の焦点検出装置６０によれば、対物レンズ２６の光軸２０ａ上の平行平面ガラス１５を介して、焦点検出用の照明光Ｌ１を標本２５に導くと共に、照明光Ｌ１により標本２５から発生した蛍光を受光するため、標本２０ａの蛍光観察と同時に焦点検出を行うことができる。つまり、焦点検出を高速に行うことができる。その結果、全体の作業効率が向上する。さらに、照明用と受光用とで１つの平行平面ガラス１５を共有するため、焦点検出時と蛍光観察時の光量低下を最小限に抑えられ、構成も簡単化する。

また、第２実施形態の焦点検出装置６０によれば、標本２５の焦点検出用の照明範囲２５ａと蛍光観察用の照明範囲２５ｂとが互いに重なることはないため、標本２０ａの蛍光観察と同時に焦点検出を行う場合でも、良好な観察画像を取り込むことができる。また、蛍光観察用の照明範囲２５ｂでの照明光Ｌ１による退色を確実に防止できる。逆に、照明範囲２５ｂから発生した観察用の蛍光は、一部が平行平面ガラス１５で反射して焦点検出装置１０の側に導かれるが、受光視野絞り１７の開口１７ａ以外の箇所で遮断される。このため、標本２０ａの蛍光観察と同時に良好な焦点検出を行うことができる。

さらに、第２実施形態の焦点検出装置６０では、視野絞り６１が照明視野絞りと受光視野絞りの機能を兼ね備えるため、照明視野絞りと受光視野絞りの中心を一致させる調整作業が不要となる。その結果、装置の調整を簡略化できると共に、合焦精度の高い焦点検出を行うことができる。
（変形例）
なお、上記した実施形態では、焦点検出装置１０,６０の照明用と受光用とで１つの平行平面ガラス１５を共有する例を説明したが、本発明はこれに限定されない。照明用の平行平面ガラスと受光用の平行平面ガラスとを別々に設けた場合にも、本発明を適用できる。この場合、２つの平行平面ガラスが、請求項の「光学手段」に対応する。また、照明用の平行平面ガラスは、光軸２０ａ上の対物レンズ２６とダイクロイックミラー３８との間に配置する必要がある。これに対し、受光用の平行平面ガラスの配置は、対物レンズ２６とダイクロイックミラー３８との間でも構わないし、ダイクロイックミラー３８より像側でも構わない。

また、上記した実施形態では、平行平面ガラス１５のダイクロイックミラー３８側の面に反射防止膜を施したが、対物レンズ２６側の面に同様の反射防止膜を施してもよい。ただし、ダイクロイックミラー３８側の面に施した方が、蛍光顕微鏡への焦点検出装置の組み込みが容易になるため好ましい。
さらに、上記した実施形態では、対物レンズ２６の光軸２０ａ上に平行平面ガラス１５を配置したが、本発明はこれに限定されない。平行平面ガラス１５に代えて、ハーフミラー(半透鏡)を用いても同様の効果を得ることができる。ハーフミラーとは、平行平面ガラスの一方の面に反射膜（例えば反射率は波長に拘わらず１０％〜２０％）を形成し、他方の面に反射防止膜を形成したものである。反射膜の形成面を対物レンズ２６側とした方が、蛍光顕微鏡への焦点検出装置の組み込みが容易になるため好ましい。しかし、反射膜の形成面をダイクロイックミラー３８側としても構わない。

対物レンズ２６の光軸２０ａ上に焦点検出装置のためのハーフミラーを配置する場合、ハーフミラーの反射率が１０％〜２０％であれば、焦点検出用の照明光Ｌ１を効率良く標本２５に導くことができ、焦点検出の精度が向上する。また、ハーフミラーの透過率は９０％〜８０％となり、蛍光観察用の照明光と蛍光の利用効率は低下するが、照明光の透過率(９０％〜８０％)と蛍光の透過率(９０％〜８０％)との掛け算により、２次元撮像素子３０に入射する蛍光として８１％〜６４％の光量を確保でき、実用上問題はない。

また、上記した実施形態では、平行平面ガラス,ハーフミラーの一方の面に反射防止膜を形成したが、反射防止膜を省略してもよい。この場合、平行平面ガラス,ハーフミラーの２つの面を厳密に平行なものとすることが好ましい。２つの面が厳密に平行であれば、各々の面で反射した照明光は標本２５上の１点に集光する。このため、焦点検出の精度が低下することはない。

本発明の焦点検出装置を蛍光顕微鏡に組み込むための光学手段としては、平行平面ガラスやハーフミラーに限らず、標本２５の蛍光物質を励起可能な波長域の光を一部透過して一部反射すると共に、標本２５の蛍光物質から発生する蛍光を一部透過して一部反射するものであれば何でも用いることができる。光学手段の反射率は、３％以上２０％以下が好ましい。

さらに、上記した実施形態では、焦点検出用の照明範囲２５ａを蛍光観察用の照明範囲２５ｂの左側（図１参照）に位置付けたが、照明範囲２５ｂの右側に位置付けてもよい。
また、上記した実施形態では、焦点検出用の照明範囲２５ａと蛍光観察用の照明範囲２５ｂとが重ならないようにしたが、照明範囲２５ａ,２５ｂが重なる場合にも、本発明を適用できる。この場合、視野中心での高精度な焦点検出を行うことができる。焦点検出装置に駆動部を設け、焦点検出用の照明範囲２５ａの位置を変化させ、蛍光観察用の照明範囲２５ｂに重なった状態と重ならない状態とを切り換えてもよい。照明光Ｌ１による不要な退色を防止するため、２次元撮像素子による蛍光画像の取り込み時以外は、照明光Ｌ１をシャッタにより遮断したり、光源１１を消灯したりすることが好ましい。

さらに、上記した実施形態では、焦点検出装置の照明視野絞り１２,受光視野絞り１７（または視野絞り６１）の開口をスリット形状としたが、小さい円形状（スポット形状）としても良い。この場合、標本２５の照明範囲も小さい円形状となる。その結果、標本２５の合焦位置を絞り込むことができ、観察対象の位置を特定することができる。
また、上記した実施形態では、受光視野絞り１７の配置面における蛍光像（照明範囲２５ａに対応）と開口１７ａの大きさを合致させる例を説明したが、蛍光像と開口１７ａの大きさが異なる場合にも本発明を適用できる。同様に、視野絞り６１の開口６１ａと蛍光像の大きさが異なる場合にも本発明を適用できる。

さらに、上記した実施形態では、焦点検出装置に受光視野絞り１７を設けたが、蛍光顕微鏡２０の対物レンズ２６が固定されている場合には、受光視野絞り１７を省略できる。
また、上記した実施形態では、受光面に入射する蛍光の光量を一括で検出する光電検出器の例を説明したが、本発明はこれに限定されない。例えば、蛍光の光量を分割して検出し、後段の信号処理系で総和を取る構成が考えられる。

さらに、上記した実施形態では、標本２５をＺ方向に移動させながら光電検出器１８による検出光量を監視し(図３)、検出光量が最大となったところ(位置Ｚｂ)を標本２５の合焦位置と判断する例を説明したが、本発明はこれに限定されない。標本２５をＺ方向に移動させると、その移動量に比例して標本２５の照明範囲２５ａの蛍光像と開口１７ａ(スリット形状)との重なり部分の面積が変化し、この面積に比例して光電検出器１８よる検出光量が変化する。つまり検出光量は、標本２５の合焦位置より前ピン側と後ピン側との各々で、標本２５の移動量に比例して一次関数的に増減する。最大の検出光量は、合焦位置のときである。このため、合焦位置より前ピン側の検出光量と標本２５のＺ位置との関係を直線で近似し、同様に、後ピン側の検出光量とＺ位置との関係を直線で近似し、得られた２直線の交点を求めることにより、標本２５の合焦位置を算出することができる。

また、上記した実施形態では、焦点検出時に標本２５を斜光照明する例を説明したが、本発明はこれに限定されない。標本２５に対して光軸２０ａに平行な照明光を導くことにより焦点検出を行う場合にも本発明を適用できる。

第１実施形態の焦点検出装置１０と蛍光顕微鏡２０の全体構成を示す図である。 焦点検出装置１０における焦点検出の原理を説明する図である。 焦点検出装置１０における焦点検出の原理を説明する図である。 第２実施形態の焦点検出装置６０と蛍光顕微鏡２０の全体構成を示す図である。

符号の説明

１０，６０ 焦点検出装置
１１，３１，６５ 光源
１２，３６ 照明視野絞り
１３，３８，６３ ダイクロイックミラー
１４，２７，６２ 結像レンズ
１５ 平行平面ガラス
１６，２８，３９，６４ 波長選択フィルタ
１７ 受光視野絞り
１８ 光電検出器
２５ 標本
２６ 対物レンズ
２９ 結像面
３０ ２次元撮像素子
３２，３３，３５，３７ レンズ
３４ 開口絞り
６１ 視野絞り

Claims (7)

1. 蛍光顕微鏡の対物レンズの光軸上に配置され、観察対象物に含まれる蛍光物質を励起可能な所定波長域の光を一部透過して一部反射すると共に、前記蛍光物質から発生する蛍光を一部透過して一部反射する光学手段と、
   焦点検出用の前記所定波長域の照明光を少なくとも前記光学手段と前記対物レンズとを介して前記観察対象物に導く照明手段と、
   前記照明光により励起された前記蛍光物質からの前記蛍光を少なくとも前記対物レンズと前記光学手段とを介して受光し、前記対物レンズと前記観察対象物との相対的な位置関係に応じた受光信号を出力する受光手段とを備えた
   ことを特徴とする焦点検出装置。
2. 請求項１に記載の焦点検出装置において、
   前記照明手段は、前記照明光を前記光軸に対して斜め方向から前記観察対象物に導き、
   前記受光手段は、前記対物レンズの焦点位置と共役な面の後方に配された受光面を有し、該受光面に入射する前記蛍光の光量に応じて前記受光信号を出力する
   ことを特徴とする焦点検出装置。
3. 請求項２に記載の焦点検出装置において、
   前記焦点位置と共役な面には、受光視野絞りが配置され、
   前記受光手段は、前記受光視野絞りを介して前記受光面に入射する前記蛍光の光量に応じて前記受光信号を出力する
   ことを特徴とする焦点検出装置。
4. 請求項３に記載の焦点検出装置において、
   前記照明手段は、前記観察対象物の照明範囲を規定する照明視野絞りを有し、
   前記照明視野絞りと前記受光視野絞りとは、相似形状である
   ことを特徴とする焦点検出装置。
5. 請求項１から請求項４の何れか１項に記載の焦点検出装置において、
   前記光学手段は、１つの光学素子からなり、
   前記照明手段と前記受光手段とは、前記１つの光学素子を共有している
   ことを特徴とする焦点検出装置。
6. 蛍光物質で標識された観察対象物の蛍光観察に用いられる蛍光顕微鏡において、
   対物レンズと、
   前記対物レンズの光軸上に配置され、前記蛍光物質を励起可能な所定波長域の光を反射して前記蛍光物質から発生する蛍光を透過するダイクロイックミラーと、
   観察用の前記所定波長域の照明光を少なくとも前記ダイクロイックミラーと前記対物レンズとを介して前記観察対象物に導く観察照明手段と、
   請求項５に記載の焦点検出装置とを備え、
   前記焦点検出装置の前記１つの光学素子は、前記対物レンズと前記ダイクロイックミラーとの間に配置されている
   ことを特徴とする蛍光顕微鏡。
7. 請求項６に記載の蛍光顕微鏡において、
   前記観察照明手段と前記焦点検出装置の前記照明手段とは、前記観察照明手段による前記観察対象物の照明範囲と前記照明手段による前記観察対象物の照明範囲とが重ならないように構成されている
   ことを特徴とする蛍光顕微鏡。

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