JP2004004634A - 焦点位置検出装置およびそれを備えた蛍光顕微鏡 - Google Patents
焦点位置検出装置およびそれを備えた蛍光顕微鏡 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】物体からの光量が少なくても良好に焦点検出を行える焦点位置検出装置およびそれを備えた蛍光顕微鏡を提供する。
【解決手段】物体２５を斜光照明する照明手段（１１〜１８，２６）と、照明手段により斜光照明された物体からの光を集光して、物体の像を形成する像形成手段（２６〜２７，１９）と、物体の像形成手段による合焦位置と共役な面（例えば、受光視野絞り２０の配置面）の後方に配された受光面を有し、像形成手段により受光面に形成される像に応じて受光面に入射する光量を検出する光量検出手段２１とを備える。
【選択図】 図１
【解決手段】物体２５を斜光照明する照明手段（１１〜１８，２６）と、照明手段により斜光照明された物体からの光を集光して、物体の像を形成する像形成手段（２６〜２７，１９）と、物体の像形成手段による合焦位置と共役な面（例えば、受光視野絞り２０の配置面）の後方に配された受光面を有し、像形成手段により受光面に形成される像に応じて受光面に入射する光量を検出する光量検出手段２１とを備える。
【選択図】 図１
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、焦点位置検出装置およびそれを備えた蛍光顕微鏡に関し、特に、光学機器のオートフォーカス機構に適用して好適な焦点位置検出装置およびそれを備えた蛍光顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、顕微鏡やカメラなどの光学機器には、所定の結像面（例えばイメージセンサの撮像面）に物体の鮮明な像を形成するため、オートフォーカス機構が設けられている。また、オートフォーカス機構の中で重要な部分は、光学系により結像される像と所定の結像面との位置ずれ（焦点ずれ）を検出するための焦点位置検出装置である。焦点位置検出装置としては、物体の像を画像として取り込み、その画像のコントラストに基づいて焦点検出を行う方式が知られている（例えば特許文献１を参照）。
【０００３】
【特許文献１】
特許第３２３９３４３号公報
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記した従来の画像コントラスト方式は、物体から発生する光の光量の影響を受けやすい。このため、物体からの光量が少ないと、焦点検出に膨大な時間を要したり、焦点検出が困難になったりする。
【０００５】
本発明の目的は、物体からの光量が少なくても良好に焦点検出を行える焦点位置検出装置およびそれを備えた蛍光顕微鏡を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
請求項１に記載の焦点位置検出装置は、物体を斜光照明する照明手段と、前記照明手段により斜光照明された前記物体からの光を集光して、前記物体の像を形成する像形成手段と、前記物体の前記像形成手段による合焦位置と共役な面の後方に配された受光面を有し、前記像形成手段により前記受光面に形成される前記像に応じて前記受光面に入射する光量を検出する光量検出手段とを備えたものである。
【０００７】
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の焦点位置検出装置において、前記光量検出手段で検出した光量に基づいて焦点位置を検出する焦点位置検出手段をさらに備え、前記像形成手段は、光軸方向に移動する移動手段を有し、前記光量検出手段は、前記像形成手段を光軸方向に移動して複数の位置で光量を検出し、前記焦点位置検出手段は、前記複数の位置で検出した光量のうち最大の光量を検出した位置を焦点位置とするものである。
【０００８】
請求項３に記載の発明は、請求項１または請求項２に記載の焦点位置検出装置において、前記合焦位置と共役な面に、受光視野絞りが配置され、前記光量検出手段が、前記受光視野絞りを介して前記受光面に形成される前記像に応じて、前記光量を検出するものである。
請求項４に記載の発明は、請求項３に記載の焦点位置検出装置において、前記照明手段が、前記物体の照明範囲を規定する照明視野絞りを有し、前記照明視野絞りと前記受光視野絞りとを、相似形状としたものである。
【０００９】
請求項５に記載の発明は、請求項４に記載の焦点位置検出装置において、前記照明手段と前記像形成手段とは、前記合焦位置と共役な面から前記物体までの間に配置された光学素子が共通であり、前記照明視野絞りは、前記受光視野絞りとしても機能するものである。
請求項６に記載の発明は、請求項４または請求項５に記載の焦点位置検出装置において、前記照明視野絞りおよび前記受光視野絞りの大きさを調整する調整手段をさらに備えたものである。
【００１０】
請求項７に記載の発明は、請求項１から請求項６の何れか１項に記載した焦点位置検出装置において、前記合焦位置と共役な面の後方に配された補助用の受光面を有し、該補助用の受光面に入射する光量に応じて前記物体の位置ずれ方向を検出する方向検出手段をさらに備えたものである。
請求項８に記載の発明は、請求項１から請求項７の何れか１項に記載した焦点位置検出装置において、前記照明手段は、無限遠系の対物レンズを利用して前記物体を斜光照明する手段であり、前記対物レンズの瞳面と共役な開口絞りを有するものである。
【００１１】
請求項９に記載の発明は、請求項３から請求項８に記載の焦点位置検出装置において、前記受光視野絞りの形状と該受光視野絞りの配置面に形成される前記像の形状とに応じた関数を用いて、前記光量検出手段による検出光量と前記物体の位置との関係を近似することにより、前記合焦位置を算出する算出手段をさらに備えたものである。
【００１２】
請求項１０に記載の発明は、請求項９に記載の焦点位置検出装置において、前記算出手段は、前記合焦位置の前後の各々において前記検出光量と前記物体の位置との関係を直線で近似し、得られた２つの直線の交点に基づいて前記合焦位置を算出するものである。
請求項１１に記載の発明は、請求項１から請求項１０の何れか１項に記載した焦点位置検出装置において、前記照明手段は、前記物体に含まれる蛍光物質を励起可能な波長域の光で、前記物体を斜光照明する手段であり、前記像形成手段は、前記物体からの蛍光を集光して、前記物体の蛍光像を形成する手段であり、前記光量検出手段は、前記受光面に形成される前記蛍光像に応じて前記受光面に入射する光量を検出するものである。
【００１３】
請求項１２に記載の発明は、蛍光物質で標識された物体の蛍光観察に用いられる蛍光顕微鏡において、無限遠系の対物レンズと、請求項１１に記載の焦点位置検出装置とを備え、前記照明手段は、前記対物レンズを利用して前記物体を斜光照明し、前記像形成手段は、前記対物レンズを利用して前記物体の蛍光像を形成するものである。
【００１４】
請求項１３に記載の発明は、請求項１２に記載の蛍光顕微鏡において、前記物体の蛍光観察時に、前記蛍光物質を励起可能な波長の光で、前記対物レンズを利用して前記物体を照明する観察照明手段と、前記焦点位置検出装置の前記照明手段による照明タイミングと前記観察照明手段による照明タイミングとを切り換える切換制御手段とを備えたものである。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、図面を用いて本発明の実施形態を詳細に説明する。
（第１実施形態）
本発明の第１実施形態は、請求項１〜請求項４，請求項８，請求項１１に対応する。ここでは、図１に示すように、標本２５の蛍光像を形成する観察系（２６〜２８）に組み込まれた焦点位置検出装置１０の例を説明する。標本２５（物体）は、例えば、蛍光物質で標識された生物標本（ＤＮＡや蛋白質など）である。
【００１６】
この標本２５は、不図示のステージ上に載置され、観察系（２６〜２８）の光軸２０ａの方向に沿って移動可能である。光軸２０ａの方向を「ｚ方向」とする。なお、図１には、標本２５が観察系（２６〜２８）の焦点位置に一致した状態（合焦状態）を例示している。このときの標本２５のＺ位置を「合焦位置」という。
まず、焦点位置検出装置１０の説明に先立って、観察系（２６〜２８）の構成を説明しておく。観察系（２６〜２８）は、無限遠系の対物レンズ２６と、第２対物レンズとして機能する結像レンズ２７と、これら対物レンズ２６，結像レンズ２７の間に配置された波長選択フィルタ２８とで構成されている。波長選択フィルタ２８は、標本２５から発生した蛍光（例えば波長５２０ｎｍ〜６００ｎｍの光）を選択的に透過する特性を持つ。
【００１７】
標本２５の蛍光観察時、合焦状態の標本２５から発生した蛍光は、対物レンズ２６と結像レンズ２７の作用によって、標本２５の合焦位置と共役な所定の結像面２９に集光される。このとき、所定の結像面２９には、標本２５の蛍光像が鮮明に形成される。
図示省略したが、所定の結像面２９（または結像面２９と共役な面）には、２次元撮像素子（例えばＣＣＤイメージセンサ）が設置されている。そして、標本２５が合焦状態にあるときには、標本２５の鮮明な蛍光像を２次元撮像素子によって取り込むことができる。第１実施形態では、対物レンズ２６と結像レンズ２７とによる観察倍率を２０倍、対物レンズ２６の開口数を０．４とする。
【００１８】
さて、第１実施形態の焦点位置検出装置１０は、標本２５が合焦状態にあるか否かを検出するための装置であり、照明系（１１〜１８）と受光系（１９〜２１）とを有している。さらに、上記の観察系（２６〜２８）は、焦点位置検出装置１０としての機能も兼用している。このため、焦点位置検出装置１０の構成要素としては、照明系（１１〜１８）と受光系（１９〜２１）だけでなく、観察系（２６〜２８）も含まれる。
【００１９】
照明系（１１〜１８）の構成を具体的に説明する。照明系（１１〜１８）は、光軸１０ａに沿って、光源１１と、レンズ１２，１３と、開口絞り１４と、レンズ１５と、照明視野絞り１６と、レンズ１７と、ダイクロイックミラー１８とが順に配置された構成となっている。
また、照明系（１１〜１８）は、その光軸１０ａが上記した観察系（２６〜２８）の光軸２０ａに対して略直交する向きで、観察系（２６〜２８）の対物レンズ２６と波長選択フィルタ２８との間に組み込まれる。このとき、照明系（１１〜１８）のうち、ダイクロイックミラー１８が光軸２０ａ上に配置される。
【００２０】
照明系（１１〜１８）の光源１１は、例えば高圧水銀ランプであり、紫外線や可視光線などの励起光を発生する。励起光は、標本２５に含まれる蛍光物質を励起可能な波長域（例えば５０５ｎｍ以下）の光である。光源１１からの励起光は、レンズ１２，１３を介した後、開口絞り１４に達する。
開口絞り１４は、観察系（２６〜２８）の対物レンズ２６の瞳面（像側焦点面）と共役な面に配置されている。また、開口絞り１４には、照明系（１１〜１８）の光軸１０ａから外れた位置に円形状の開口１４ａが設けられている。開口絞り１４の開口１４ａを通過した励起光は、レンズ１５を介した後、照明視野絞り１６に達する。
【００２１】
照明視野絞り１６は、標本２５の合焦位置および結像面２９と共役な面に配置されている。また、照明視野絞り１６には、照明系（１１〜１８）の光軸１０ａ上に細長いスリット形状の開口１６ａが設けられている。開口１６ａの長手方向は、紙面に垂直である。照明視野絞り１６の開口１６ａを通過した励起光Ｌ１は、光軸１０ａに対して斜めの方向に進行し、レンズ１７を介した後、ダイクロイックミラー１８に達する。
【００２２】
ダイクロイックミラー１８は、例えば波長５０５ｎｍ以下の光を反射すると共に、波長５０５ｎｍ以上の光を透過する特性を持つ。このため、光源１１からの励起光はダイクロイックミラー１８で反射され、観察系（２６〜２８）の対物レンズ２６を介した後、標本２５に達する。なお、標本２５からの蛍光（例えば波長５２０ｎｍ〜６００ｎｍの光）はダイクロイックミラー１８を透過する。
【００２３】
上記のように、照明系（１１〜１８）は、対物レンズ２６を利用して標本２５を照明する落射照明系である。また、この照明系（１１〜１８）では、開口絞り１４の開口１４ａが光軸１０ａから外れているため、照明視野絞り１６の開口１６ａを通過した後の励起光Ｌ１を光軸１０ａに対して斜めに進行させることができ、その結果、標本２５を斜光照明することができる。
【００２４】
斜光照明とは、観察系（２６〜２８）の光軸２０ａに対して斜めの方向から、励起光を標本２５に照射する方式のことである。厳密にいえば、標本２５に入射する励起光の主光線の方向が光軸２０ａに対して斜め方向となっている。
さらに、照明系（１１〜１８）では、開口絞り１４が対物レンズ２６の瞳面と共役な関係にあるため、標本２５に入射する励起光の主光線の方向を互いに平行な状態に揃えることができる。これにより、第１実施形態の焦点位置検出装置１０における焦点検出の精度が向上する。
【００２５】
また、照明系（１１〜１８）では、開口絞り１４が対物レンズ２６の瞳面と共役で、かつ、照明視野絞り１６が標本２５の合焦位置および結像面２９と共役な配置となっているため、いわゆるケーラー照明が実現する。
さらに、照明系（１１〜１８）では、照明視野絞り１６の開口１６ａを細長いスリット形状としたため、標本２５の照明範囲２５ａを細長いスリット形状に規定することができる。照明範囲２５ａの長手方向も、紙面に垂直である。照明範囲２５ａと照明視野絞り１６の開口１６ａとは、相似形状である。第１実施形態では、照明範囲２５ａの幅を０．０５ｍｍとする。
【００２６】
また、標本２５の照明範囲２５ａの長手方向と、照明範囲２５ａに入射する励起光の主光線の方向とは、互いに直交する。すなわち、標本２５は、照明範囲２５ａの幅方向から斜光照明されたことになる。これは、照明系（１１〜１８）において、開口絞り１４の開口１４ａの軸外し方向と照明視野絞り１６の開口１６ａの幅方向とを一致させたからである。
【００２７】
なお、標本２５の照明範囲２５ａには、観察系（２６〜２８）の光軸２０ａが含まれている。特に、標本２５が合焦状態のとき、照明範囲２５ａの中心は、観察系（２６〜２８）の光軸２０ａに一致する。光軸２０ａは、標本２５を蛍光観察する際の視野（観察視野）の中心に相当する。
このようにして、照明系（１１〜１８）と対物レンズ２６とにより斜光照明された標本２５は、照明範囲２５ａ内で励起され、照明範囲２５ａ内から蛍光を発生させる。この蛍光は、上記した蛍光観察時と同様に、対物レンズ２６と結像レンズ２７の作用によって集光され、受光系（１９〜２１）に導かれる。
【００２８】
対物レンズ２６と結像レンズ２７との間には、上記したダイクロイックミラー１８と波長選択フィルタ２８とが配置されているため、標本２５に対する励起光（例えば５０５ｎｍ以下）の反射光を遮断して、標本２５で発生した蛍光（例えば波長５２０ｎｍ〜６００ｎｍの光）のみを受光系（１９〜２１）に導くことができる。
【００２９】
標本２５が例えば生物標本のとき、標本２５からの蛍光は、一般に、標本２５に対する励起光と比較して非常に暗い（１００分の１以下）ので、これらのダイクロイックミラー１８と波長選択フィルタ２８の働きにより、標本２５からの蛍光を効率良く捉えることができる。
【００３０】
次に、受光系（１９〜２１）の構成を具体的に説明する。受光系（１９〜２１）は、光軸１０ｂに沿って、ハーフミラー１９と、受光視野絞り２０と、光電検出器２１とが順に配置された構成となっている。
また、受光系（１９〜２１）は、その光軸１０ｂが上記した観察系（２６〜２８）の光軸２０ａに対して略直交する向きで、観察系（２６〜２８）の結像レンズ２７と所定の結像面２９との間に組み込まれる。このとき、受光系（１９〜２１）のうち、ハーフミラー１９が光軸２０ａ上に配置される。
【００３１】
したがって、照明系（１１〜１８）と対物レンズ２６により斜光照明された標本２５の照明範囲２５ａ内から発生し、その後、対物レンズ２６と結像レンズ２７により集光された蛍光（以下「焦点検出時の蛍光」という）は、ハーフミラー１９で反射した後、受光視野絞り２０に達する。
受光視野絞り２０は、標本２５の合焦位置および結像面２９と共役な面に配置されている。また、受光視野絞り２０には、受光系（１９〜２１）の光軸１０ｂ上に細長いスリット形状の開口２０ｂ（詳細は後述する）が設けられている。開口２０ｂの長手方向は、紙面に垂直である。
【００３２】
受光視野絞り２０の配置面（標本２５の合焦位置と共役な面）には、標本２５が合焦状態にあるとき、この標本２５の照明範囲２５ａ内から発生した焦点検出時の蛍光が良好に集光される。つまり、標本２５の照明範囲２５ａの鮮明な蛍光像が受光視野絞り２０の配置面に形成される。
ここで、受光視野絞り２０の開口２０ｂについて具体的に説明する。受光視野絞り２０の開口２０ｂは、上記した照明視野絞り１６の開口１６ａと相似形状である。このため、開口２０ｂは、標本２５の照明範囲２５ａと相似形状になり、標本２５の照明範囲２５ａの蛍光像とも相似形状になる。
【００３３】
そして、第１実施形態の焦点位置検出装置１０では、照明範囲２５ａの蛍光像と大きさが合致するように、受光視野絞り２０の開口２０ｂの大きさを定めている。例えば、照明範囲２５ａの幅を０．０５ｍｍ、対物レンズ２６，結像レンズ２７による観察倍率を２０倍とすると、照明範囲２５ａの蛍光像の幅は１ｍｍとなる。この場合には、受光視野絞り２０の開口２０ｂの幅も１ｍｍに設定する。
【００３４】
したがって、標本２５が合焦状態にあるとき、受光視野絞り２０の配置面に形成される照明範囲２５ａの蛍光像は、受光視野絞り２０の開口２０ｂと重なり、そのまま開口２０ｂを通過する。受光視野絞り２０の開口２０ｂを通過した焦点検出時の蛍光は、光電検出器２１に達する。
光電検出器２１は、受光視野絞り２０の配置面（標本２５の合焦位置および結像面２９と共役な面）の後方に配された受光面２１ｂを有している。受光面２１ｂの中心は、受光系（１９〜２１）の光軸１０ｂ上に位置する。この受光面２１ｂには、受光視野絞り２０の開口２０ｂを通過した後の蛍光による像（ボケた蛍光像）が形成される。
【００３５】
そして、光電検出器２１は、受光面２１ｂに形成されるボケた蛍光像に応じて受光面２１ｂに入射する光量を一括で検出する。このような光電検出器２１には、例えばフォトマルチプライヤなど、微弱光の検出に適したものを用いることが好ましい。
なお、上記のように構成された焦点位置検出装置１０の照明系（１１〜１８）と対物レンズ２６とは請求項の「照明手段」に対応する。観察系（２６〜２８）とハーフミラー１９とは「像形成手段」に対応する。光電検出器２１は「光量検出手段」に対応する。
【００３６】
次に、第１実施形態記の焦点位置検出装置１０における焦点検出の原理について、図２，図３を用いて説明する。
図２には、原理説明に必要な部分（標本２５，対物レンズ２６，結像レンズ２７，受光視野絞り２０，光電検出器２１）のみを示している。また、図２（ａ）はいわゆる前ピン状態、図２（ｂ）は合焦状態、図２（ｃ）はいわゆる後ピン状態を示したものである。図３は、標本２５と対物レンズ２６との光軸方向の距離（Ｚ位置）が変化したときに、光電検出器２１によって検出される光量の変化を示したものである。
【００３７】
図２（ｂ）に示す合焦状態のとき、標本２５の照明範囲２５ａの中心は、対物レンズ２６，結像レンズ２７の光軸２０ａに一致する。このため、標本２５の照明範囲２５ａの蛍光像は、受光視野絞り２０の開口２０ｂと重なる位置に形成される。そして、蛍光像の形成に関わる全ての蛍光が、そのまま開口２０ｂを通過する。このため、光電検出器２１によって検出される光量は、最大となる。
【００３８】
一方、図２（ａ）に示す前ピン状態のとき、標本２５の照明範囲２５ａは、上記の光軸２０ａから外れ、図中左方に位置する。これは、標本２５が図中左方から斜光照明されているからである。このとき、標本２５の照明範囲２５ａの蛍光像は、受光視野絞り２０の開口２０ｂから外れ、図中右方に位置する。このため、蛍光像の形成に関わる蛍光は、開口２０ｂを通過することができず、光電検出器２１によって検出される光量は、ほぼ零となる。
【００３９】
逆に、図２（ｃ）に示す後ピン状態のとき、標本２５の照明範囲２５ａは、上記の光軸２０ａから外れ、図中右方に位置する。これは、標本２５が図中左方から斜光照明されているからである。このとき、標本２５の照明範囲２５ａの蛍光像は、受光視野絞り２０の開口２０ｂから外れ、図中左方に位置する。このため、蛍光像の形成に関わる蛍光は、開口２０ｂを通過することができず、光電検出器２１によって検出される光量は、ほぼ零となる。
【００４０】
このように、第１実施形態の焦点位置検出装置１０では、標本２５をＺ方向に移動させると、標本２５の照明範囲２５ａがその幅方向（図中左右方向）に移動し、照明範囲２５ａの蛍光像もその幅方向（図中左右方向）つまり受光視野絞り２０の開口２０ｂの幅方向に移動する。そして、蛍光像のうち開口２０ｂとの重なり部分の面積が変化する。後段の光電検出器２１に達するのは、重なり部分を通過した焦点検出時の蛍光であり、そこでの検出光量は重なり部分の面積に比例する。
【００４１】
したがって、第１実施形態の焦点位置検出装置１０では、標本２５をＺ方向に移動させながら、光電検出器２１によって検出される光量を監視することにより、焦点検出を行うことができる。そして、光電検出器２１による検出光量が最大となったところ（図３の位置Ｚｂ）が、標本２５の合焦位置と判断される。
なお、上記した第１実施形態の焦点位置検出装置１０では、対物レンズ２６と結像レンズ２７とによる観察倍率を２０倍としたので、標本２５の位置が光軸方向に０．０１ｍｍだけ移動すると、照明範囲２５ａの蛍光像の位置は、受光視野絞り２０の配置面上で横方向に０．２ｍｍずれることになる。
【００４２】
また、受光視野絞り２０の開口２０ｂの幅は１ｍｍであるため、照明範囲２５ａの蛍光像が開口２０ｂの幅方向（横方向）に０．２ｍｍずれると、光電検出器２１による検出光量は２０％ほど変化することになる。このため、標本１５が例えば生物標本のように０．０５ｍｍ程度の厚みを持つ場合でも、光電検出器２１による検出光量を監視することで、必要上十分な焦点検出を行うことができる。
【００４３】
上述したように、第１実施形態の焦点位置検出装置１０によれば、標本２５の蛍光像の光量変化を監視することにより焦点検出を行うため、標本２５の蛍光観察時のように、標本２５からの光量が微弱であっても、短時間で良好に焦点検出を行うことができる。
また、標本２５をＺ方向に移動させながら、光電検出器２１による検出光量を監視して、この検出光量が最大となったか否かを判断するような制御装置との組み合わせにより、標本２５からの光量が微弱であっても、極めて精度の高いオートフォーカスを実行することができる。
【００４４】
さらに、上記した第１実施形態の焦点位置検出装置１０では、標本２５の照明範囲２５ａをスリット形状としたので、標本２５に含まれる蛍光物質がまばらに分布している場合でも、光電検出器２１による検出光量を確保することができ、短時間で良好に焦点検出を行うことができる。この場合には、標本２５の照明範囲２５ａ内で平均化された合焦位置が得られる。
【００４５】
また、上記した第１実施形態の焦点位置検出装置１０では、標本２５の合焦位置と共役な面に受光視野絞り２０を設けたので、観察系（２６〜２８）の対物レンズ２６を交換して標本２５の観察倍率を変えたときのように、受光視野絞り２０の配置面における蛍光像（標本２５の照明範囲２５ａに対応）の大きさが変化しても、これに応じて受光視野絞り２０の開口２０ｂの大きさを変えることができる。つまり、観察倍率を変更しても、蛍光像と開口２０ｂの大きさを合致させることができ、上記と同様の焦点検出を短時間で良好に行うことができる。
【００４６】
また、第１実施形態の焦点位置検出装置１０では、受光視野絞り２０の配置面における蛍光像と開口２０ｂの大きさを合致させるため、合焦状態の近傍でも光電検出器２１による検出光量の変化を容易に捉えることができ、効率良く焦点検出を行える。
さらに、照明視野絞り１６と受光視野絞り２０の開口１６ａ，２０ｂの幅を調整する手段を設けることにより、２つの開口１６ａ，２０ｂの相似形状を保ちながら、つまり、受光視野絞り２０の配置面における蛍光像（標本２５の照明範囲２５ａに対応）と開口２０ｂの大きさを合致させたままで、２つの開口１６ａ，２０ｂの幅を調整することもできる（請求項５）。
【００４７】
例えば、２つの開口１６ａ，２０ｂの幅を２段階で調整する場合、光電検出器２１による検出光量の変化は、図４（ａ），（ｂ）に示すようになる。図４（ａ）は、開口１６ａ，２０ｂの幅が広い状態に対応し、図４（ｂ）は、開口１６ａ，２０ｂの幅が狭い状態に対応する。
図４（ａ），（ｂ）の比較から分かるように、開口１６ａ，２０ｂの幅を広くした状態（ａ）での焦点検出範囲（ΔＺ１）は、幅を狭くした状態（ｂ）での焦点検出範囲（ΔＺ２）より拡大する。また、焦点検出精度は、開口１６ａ，２０ｂの幅が広い状態（ａ）に比べて狭い状態（ｂ）の方が向上する。
【００４８】
したがって、まず、開口１６ａ，２０ｂの幅を広くしておき、広い焦点検出範囲（ΔＺ１）内で粗く焦点検出を行い、その後で、開口１６ａ，２０ｂの幅を狭い状態に切り換えて、狭い焦点検出範囲（ΔＺ２）内で精度良く焦点検出を行うことができる。
なお、上記した第１実施形態では、受光系（１９〜２０）を結像レンズ２７と結像面２９の間に配置したが、結像レンズ２７と波長選択フィルタ２８の間に配置しても良い。ただし、この場合には、受光系（１９〜２０）のハーフミラー１９と受光視野絞り２０との間に、結像レンズ２７と同等の作用を持つ光学素子を設けることが必要となる。
【００４９】
さらに、受光系（１９〜２０）を波長選択フィルタ２８と対物レンズ２６との間に配置しても良い。ただし、この場合には、受光系（１９〜２０）のハーフミラー１９と受光視野絞り２０との間に、結像レンズ２７および波長選択フィルタ２８と同等の作用を持つ光学素子を各々設けることが必要となる。
また、この場合には、受光系（１９〜２０，結像レンズ２７および波長選択フィルタ２８と同等の光学素子を含む）と照明系（１１〜１８）との一体化を図ることができるという利点がある。この一体化を図った構成例については、後述する第３実施形態の焦点位置検出装置４０（図６）および第４実施形態の焦点位置検出装置６０（図８）で説明する。
【００５０】
さらに、上記した第１実施形態では、照明系（１１〜１８）において、光源１１とレンズ１２，１３とで開口絞り１４に励起光を導いたが、光源１１，レンズ１２，１３に代えて、小型の半導体レーザーや発光ダイオードなどの光源を、開口絞り１４の開口１４ａの近傍位置に設けても良い。
また、上記した第１実施形態では、照明系（１１〜１８）において、光源１１とレンズ１２，１３と開口絞り１４とレンズ１５とで照明視野絞り１６に励起光を導いたが、これらの光学素子（１１〜１５）に代えて、小型の半導体レーザーや発光ダイオードなどの光源を、照明視野絞り１６の開口１６ａの近傍位置に設けても良い。この構成例については、後述する第３実施形態の焦点位置検出装置４０（図６）で説明する。
【００５１】
さらに、光学素子（１１〜１５）に代えて小型の半導体レーザーや発光ダイオードなどの光源を設け、かつ、照明開口絞り１６と受光視野絞り２０とを兼用にした構成例について、後述する第４実施形態の焦点位置検出装置６０（図８）で説明する。
（第２実施形態）
本発明の第２実施形態は、請求項１〜請求項４，請求項７，請求項８，請求項１１に対応する。
【００５２】
第２実施形態の焦点位置検出装置は、図５に示すように、第１実施形態の焦点位置検出装置１０（図１，図２）の受光視野絞り２０に代えて受光視野絞り３０を設け、光電検出器２１に代えて光電検出器３１を設けたものである。受光視野絞り３０，光電検出器３１の各々の配置は、上記した受光視野絞り２０，光電検出器２１と同じである。図５は、図２と同様に、原理説明に必要な部分（標本２５，対物レンズ２６，結像レンズ２７，受光視野絞り３０，光電検出器３１）のみを示した図である。
【００５３】
受光視野絞り３０には、３つの開口３０ａ，３０ｂ，３０ｃが設けられている。開口３０ａ〜３０ｃは何れも細長いスリット形状であり、中央の開口３０ｂが受光系（１９，３０，３１）の光軸上に設けられている。開口３０ａ〜３０ｃの長手方向は、紙面に垂直である。
さらに、中央の開口３０ｂの大きさは、上記の受光視野絞り２０の開口２０ｂと同様、受光視野絞り３０の配置面における蛍光像（標本２５の照明範囲２５ａに対応）と合致する大きさに設定されている。
【００５４】
光電検出器３１には、受光視野絞り３０の開口３０ａ〜３０ｃに対応するように、３つの独立した受光面３１ａ，３１ｂ，３１ｃが設けられている。中央の受光面３１ｂは、上記の光電検出器２１の受光面２１ｂと同様、受光系（１９，３０，３１）の光軸上に位置する。
【００５５】
このため、光電検出器３１の中央の受光面３１ｂには、受光視野絞り３０の中央の開口３０ｂを通過した後の蛍光による像（ボケた蛍光像）が形成される。また、両側の受光面３１ａ，３１ｃには、受光視野絞り３０の両側の開口３０ａ，３１ｃを通過した後の蛍光像が形成される。
そして、光電検出器３１は、中央の受光面３１ｂに形成されるボケた蛍光像に応じて受光面３１ｂに入射する光量を一括で検出する。また同様に、両側の受光面３１ａ，３１ｃの各々に形成される蛍光像に応じて受光面３１ａ，３１ｃに入射する光量も、各々一括で検出する。
【００５６】
なお、光電検出器３１の両側の受光面３１ａ，３１ｃは、請求項の「補助用の受光面」に対応する。光電検出器３１のうち、両側の受光面３１ａ，３１ｃに関わる部分は「方向検出手段」に対応し、中央の受光面３１ｂに関わる部分は「光量検出手段」に対応する。
第２実施形態の焦点位置検出装置では、受光視野絞り３０と光電検出器３１が上記のように構成されているため、次のようにして焦点検出が行われる。
【００５７】
まず、図５（ｂ）に示す合焦状態のとき、標本２５の照明範囲２５ａの中心は対物レンズ２６，結像レンズ２７の光軸２０ａに一致し、標本２５の照明範囲２５ａの蛍光像は、受光視野絞り３０の中央の開口３０ｂと重なる位置に形成される。そして、蛍光像の形成に関わる全ての蛍光が、そのまま開口３０ｂを通過する。このため、光電検出器３１の中央の受光面３１ｂにて検出される光量は、最大となる（図３参照）。
【００５８】
一方、図５（ａ）に示す前ピン状態のとき、標本２５の照明範囲２５ａは、上記の光軸２０ａから外れ、図中左方に位置する。このとき、標本２５の照明範囲２５ａの蛍光像は、受光視野絞り３０の中央の開口３０ｂから外れ、図中右方（例えば右側の開口３０ｃと重なる位置）に形成される。
【００５９】
このため、蛍光像の形成に関わる蛍光は、中央の開口３０ｂを通過することができず、光電検出器３１の中央の受光面３１ｂにて検出される光量は、ほぼ零となる。しかし、この蛍光は、右側の開口３０ｃを通過可能であり、光電検出器３１の右側の受光面３１ｃにて光量が検出される。そして、右側の受光面３１ｃで光量が検出されたことに基づいて、標本２５の位置ずれ方向が前ピン方向であると検出できる。
【００６０】
逆に、図５（ｃ）に示す後ピン状態のとき、標本２５の照明範囲２５ａは、上記の光軸２０ａから外れ、図中右方に位置する。このとき、標本２５の照明範囲２５ａの蛍光像は、受光視野絞り３０の中央の開口３０ｂから外れ、図中左方（例えば左側の開口３０ａと重なる位置）に形成される。
このため、蛍光像の形成に関わる蛍光は、中央の開口２０ｂを通過することができず、光電検出器３１の中央の受光面３１ｂにて検出される光量は、ほぼ零となる。しかし、この蛍光は、左側の開口３０ａを通過可能であり、光電検出器３１の左側の受光面３１ａにて光量が検出される。そして、左側の受光面３１ａで光量が検出されたことに基づいて、標本２５の位置ずれ方向が後ピン方向であると検出できる。
【００６１】
したがって、第２実施形態の焦点位置検出装置では、標本２５をＺ方向に移動させながら、光電検出器３１の両側の受光面３１ａ，３１ｃによって各々検出される光量を監視することにより、標本２５の位置ずれ方向を検出すると共に、光電検出器３１の中央の受光面３１ｂによって検出される光量を監視することにより、焦点検出を行うことができる。そして、光電検出器３１の中央の受光面３１ｂによる検出光量が最大となったところ（図３の位置Ｚｂ）が、標本２５の合焦位置と判断される。
【００６２】
上述したように、第２実施形態の焦点位置検出装置によれば、標本２５の蛍光像の光量変化を監視することにより焦点検出を行うため、標本２５の蛍光観察時のように、標本２５からの光量が微弱であっても、短時間で良好に焦点検出を行うことができる。
（第３実施形態）
本発明の第３実施形態は、請求項１〜請求項４，請求項６，請求項１１〜請求項１３に対応する。
【００６３】
第３実施形態では、図６に示すように、焦点位置検出装置４０が組み込まれた蛍光顕微鏡５０の例を説明する。蛍光顕微鏡５０は、蛍光物質で標識された標本２５の蛍光観察に用いられる顕微鏡であり、上述と同様の観察系（２６〜２８）と、後述する観察照明系（５１〜５８）とで構成されている。
蛍光顕微鏡５０の観察照明系（５１〜５８）は、基本的な構成が、図１に示す焦点位置検出装置１０の照明系（１１〜１８）と同じである。つまり、光軸５０ａに沿って、光源５１と、レンズ５２，５３と、開口絞り５４と、レンズ５５と、照明視野絞り５６と、レンズ５７と、ダイクロイックミラー５８とが順に配置された構成となっている。
【００６４】
また、観察照明系（５１〜５８）は、その光軸５０ａが観察系（２６〜２８）の光軸２０ａに対して略直交する向きで、観察系（２６〜２８）の対物レンズ２６と波長選択フィルタ２８との間に組み込まれる。このとき、観察照明系（５１〜５８）のうち、ダイクロイックミラー５８が光軸２０ａ上に配置される。
観察照明系（５１〜５８）の中で図１の照明系（１１〜１８）と異なる点は、開口絞り５４の開口５４ａの形状および大きさと、照明視野絞り５６の開口５６ａの形状および大きさとである。このため、観察照明系（５１〜５８）に関わる他の説明を省略する。
【００６５】
開口絞り５４の開口５４ａは、径の大きな円形状であり、観察照明系（５１〜５８）の光軸５０ａに中心を揃えて設けられている。また、照明視野絞り５６の開口５６ａも、径の大きな円形状であり、観察照明系（５１〜５８）の光軸５０ａに中心を揃えて設けられている。観察照明系（５１〜５８）は、請求項の「観察照明手段」に対応する。
【００６６】
このように構成された観察照明系（５１〜５８）において、光源５１からの励起光（標本２５の蛍光物質を励起可能な光）は、レンズ５２，５３と、開口絞り５４の開口５４ａと、レンズ５５と、照明視野絞り５６の開口５６ａと、レンズ５７を通過し、ダイクロイックミラー５８で反射して観察系（２６〜２８）に導かれ、対物レンズ２６を介した後、標本２５に達する（ケーラー照明）。
【００６７】
観察照明系（５１〜５８）による標本２５の照明範囲２５ｂは、照明視野絞り５６の開口５６ａと相似形状であり、観察系（２６〜２８）の光軸２０ａを中心とした径の大きな円形状となる。標本２５は、この照明範囲２５ｂ内で励起され、照明範囲２５ｂ内から蛍光を発生させる。
標本２５の蛍光観察時、合焦状態の標本２５から発生した蛍光は、対物レンズ２６と結像レンズ２７の作用によって、標本２５の合焦位置と共役な所定の結像面２９に集光される。このとき、所定の結像面２９には、標本２５の蛍光像が鮮明に形成される。
【００６８】
図示省略したが、所定の結像面２９（または結像面２９と共役な面）には、２次元撮像素子（例えばＣＣＤイメージセンサ）が設置されている。そして、標本２５が合焦状態にあるときには、標本２５の鮮明な蛍光像を２次元撮像素子によって取り込むことができる。
次に、上記構成の蛍光顕微鏡５０に組み込まれた焦点位置検出装置４０について説明する。焦点位置検出装置４０は、標本２５が合焦状態にあるか否かを検出するための装置である。
【００６９】
焦点位置検出装置４０は、照明系（１６，４１，４２）と受光系（２０，２１，４３〜４５）とを有する。さらに、蛍光顕微鏡５０の対物レンズ２６は、焦点位置検出装置４０としての機能も兼用する。このため、焦点位置検出装置４０の構成要素としては、照明系（１６，４１，４２）と受光系（２０，２１，４３〜４５）だけでなく、対物レンズ２６も含まれる。
【００７０】
照明系（１６，４１，４２）は、光軸４０ａに沿って、光源４１と、照明視野絞り１６と、ダイクロイックミラー４２とが順に配置された構成となっている。また、受光系（２０，２１，４３〜４５）は、光軸４０ｂに沿って、反射ミラー４４と、結像レンズ４３と、波長選択フィルタ４５と、受光視野絞り２０と、光電検出器２１とが順に配置された構成となっている。
【００７１】
そして、受光系（２０，２１，４３〜４５）は、その光軸４０ｂが上記した観察系（２６〜２８）の光軸２０ａに対して略直交する向きで、観察系（２６〜２８）の対物レンズ２６と観察照明系（５１〜５８）のダイクロイックミラー５８との間に組み込まれる。このとき、受光系（２０，２１，４３〜４５）のうち、反射ミラー４４が光軸２０ａ上に配置される。
【００７２】
さらに、照明系（１６，４１，４２）は、その光軸４０ａが受光系（２０，２１，４３〜４５）の光軸４０ｂに対して略直交する向きで、受光系（２０，２１，４３〜４５）の結像レンズ４３と波長選択フィルタ４５との間に組み込まれる。このとき、照明系（１６，４１，４２）のうち、ダイクロイックミラー４２が光軸４０ａ上に配置される。
【００７３】
このように構成された照明系（１６，４１，４２）および受光系（２０，２１，４３〜４５）のうち、光源４１は、図１の光源１１，レンズ１２，１３，開口絞り１４，レンズ１５に代えて設けたものである。また、結像レンズ４３は、図１のレンズ１７と結像レンズ２７の機能を兼ね備えたものである。ダイクロイックミラー４２は、前述のダイクロイックミラー１８と同様の機能を有し、波長選択フィルタ４５は、前述の波長選択フィルタ２８と同様の機能を有している。照明視野絞り１６，受光視野絞り２０，光電検出器２１の配置や開口１６ａ，２０ｂの形状などは、基本的に前述の通りである。
【００７４】
つまり、第３実施形態の焦点位置検出装置４０において、図１の焦点位置検出装置１０と異なる特徴的な部分は、光源４１の配置と、反射ミラー４４による照明タイミングの切り換え制御（図７）とである。これらの特徴的な部分について、次に説明する。
光源４１は、小型の半導体レーザーや発光ダイオードなどであり、紫外線や可視光線などの励起光を射出する。この光源４１は、照明視野絞り１６の開口１６ａの近傍位置に、励起光の射出方向を光軸４０ａに対して斜めに向けて設置されている。
【００７５】
このため、光源４１からの励起光は、照明視野絞り１６の開口１６ａを通過した後も（励起光Ｌ２）、光軸４０ａに対して斜めの方向に進行して、ダイクロイックミラー４２に達する。そして、ダイクロイックミラー４２で反射した励起光は、結像レンズ４３を介した後、反射ミラー４４で反射し、対物レンズ２６を介して標本２５に達する。すなわち、標本２５を斜光照明する。
【００７６】
また、標本２５は、スリット形状の照明範囲２５ａの幅方向から斜光照明されたことになる。これは、照明系（１６，４１，４２）において、光源４１からの励起光の射出方向を照明視野絞り１６の開口１６ａの幅方向に傾けたからである。
斜光照明された標本２５は、照明範囲２５ａ内で励起され、照明範囲２５ａ内から蛍光を発生させる。この蛍光は、対物レンズ２６を介した後、反射ミラー４４で反射して、結像レンズ４３に達する。そして、ダイクロイックミラー４２を透過し、波長選択フィルタ４５を透過して、受光視野絞り２０に達する。
【００７７】
この焦点位置検出装置４０でも、対物レンズ２６と受光視野絞り２０との間には、ダイクロイックミラー４２と波長選択フィルタ４５とが配置されているため、標本２５に対する励起光（例えば５０５ｎｍ以下）の反射光を遮断して、標本２５で発生した蛍光（例えば波長５２０ｎｍ〜６００ｎｍの光）のみを光電検出器２１に効率良く導くことができる。
【００７８】
焦点位置検出装置４０では、光源４１から標本２５へ導かれる励起光と、標本２５から光電検出器２１へ導かれる蛍光とが、共通の光学素子（２６，４３）を通過する。このため、照明視野絞り１６の開口１６ａと受光視野絞り２０の開口２０ｂとが同じ大きさの場合に、受光視野絞り２０の配置面における標本２５の蛍光像を開口２０ｂの大きさと合致させることができる。
【００７９】
なお、上記の照明系（１６，４１，４２）と結像レンズ４３と反射ミラー４４と対物レンズ２６とは、請求項の「照明手段」に対応する。対物レンズ２６と結像レンズ４３と反射ミラー４４と波長選択フィルタ４５とダイクロイックミラー４２とは、「像形成手段」に対応する。
第３実施形態の焦点位置検出装置４０における焦点検出の原理は、前述した焦点位置検出装置１０（図２，図３参照）と同じであり、標本２５をＺ方向に移動させながら、光電検出器２１によって検出される光量を監視することにより、焦点検出を行うことができる。そして、光電検出器２１による検出光量が最大となったところ（図３の位置Ｚｂ）が、標本２５の合焦位置と判断される。
【００８０】
このように、第３実施形態の焦点位置検出装置４０でも、標本２５の蛍光像の光量変化を監視することにより焦点検出を行うため、標本２５の蛍光観察時のように、標本２５からの光量が微弱であっても、短時間で良好に焦点検出を行うことができる。
次に、焦点位置検出装置４０の反射ミラー４４による照明タイミングの切り換え制御について、図７のフローチャートを用いて説明する。この切り換え制御は、蛍光顕微鏡５０の全体的な制御を行う不図示の制御装置が実行する。制御装置は、請求項の「切換制御手段」に対応する。なお、焦点検出時に、照明視野絞り１６と受光視野絞り２０の開口１６ａ，２０ｂの幅の２段階調整も行われる。
【００８１】
制御装置は、まず初めに、反射ミラー４４を観察系（２６〜２８）の光軸２０ａ中に配置して（ステップＳ１）、標本２５を斜光照明する（ステップＳ２）。このとき、照明視野絞り１６と受光視野絞り２０の開口１６ａ，２０ｂの幅は、広い状態（図４（ａ））に設定される。
【００８２】
このとき、標本２５のスリット形状の照明範囲２５ａから蛍光が発生し、光電検出器２１の受光面２１ｂには、受光視野絞り２０の開口２０ｂを通過した蛍光による像が形成される。すなわち、光電検出器２１によって蛍光の光量が検出される（ステップＳ３）。
制御装置は、光電検出器２１による検出光量を監視しながら、標本２５をＺ方向に移動させて（ステップＳ４）、光電検出器２１による検出光量が最大になると、そこで標本２５を停止させる（ステップＳ５）。この段階で、図４（ａ）のように広い焦点検出範囲（ΔＺ１）内での粗い焦点検出が終了する。
【００８３】
次に、制御装置は、照明視野絞り１６と受光視野絞り２０の開口１６ａ，２０ｂの幅が充分に小さいか否かを判断し（ステップＳ６）、まだ小さくできる場合には、開口１６ａ，２０ｂの幅を狭める（ステップＳ７）。そして、ステップＳ２〜Ｓ６の処理を繰り返す。
つまり、開口１６ａ，２０ｂの幅を狭い状態（図４（ｂ））に切り換えて、狭い焦点検出範囲（ΔＺ２）内での焦点検出を行う。その結果、光電検出器２１による検出光量が最大になり、標本２５が合焦位置に停止されると（ステップＳ５）、高精度な焦点検出が終了したことになる。
【００８４】
制御装置は、照明視野絞り１６と受光視野絞り２０の開口１６ａ，２０ｂの幅を充分小さくした状態での焦点検出が終了すると、次のステップＳ８に進み、反射ミラー４４を観察系（２６〜２８）の光軸２０ａ外に配置する。その結果、焦点位置検出装置４０による標本２５の斜光照明が終了する。
この状態で、制御装置は、観察照明系（５１〜５８）を用いて標本２５の広い範囲（照明範囲２５ｂ）を照明する（ステップＳ９）。標本２５は合焦状態にあるため、標本２５の照明範囲２５ｂから発生した蛍光は、対物レンズ２６，結像レンズ２７の作用により、標本２５の合焦位置と共役な結像面２９に集光される。このとき、結像面２９には、標本２５の蛍光像が鮮明に形成される。
【００８５】
したがって、制御装置は、結像面２９（または結像面２９と共役な面）に設置された２次元撮像素子（例えばＣＣＤイメージセンサ）によって、標本２５の鮮明な蛍光像を取り込むことができる（ステップＳ１０）。
このように、第３実施形態の蛍光顕微鏡５０では、焦点位置検出装置４０による斜光照明のタイミングと、観察照明系（５１〜５８）による照明のタイミングとを切り換え、標本２５を順に照明するため、標本２５から発生する蛍光の光量が微弱であっても、短時間で良好に焦点検出を行うことができ、標本２５の蛍光観察を精度良く行うことができる。
【００８６】
なお、上記した第３実施形態では、照明視野絞り１６の開口１６ａの近傍に光源４１のみを配置したが、ビームエキスパンダやコリメータレンズを介して光源４１を配置しても良い。
また、上記した第３実施形態では、蛍光顕微鏡の観察照明系と焦点位置検出装置の照明系とを別々に設けると共に、反射ミラー４４によって照明タイミングを切り換える制御の例を説明したが、本発明はこの構成に限定されない。
【００８７】
例えば、蛍光顕微鏡に組み込む焦点位置検出装置の照明系を図１の照明系（１１〜１８）のように構成する場合には、この照明系を観察照明系と兼用させることができ、開口絞り１４と照明視野絞り１６の開口１４ａ，１６ａの位置や形状を調整することにより、照明タイミングを切り換えることができる。
つまり、焦点検出時には図１の開口１４ａ，１６ａのように設定し、蛍光観察時には図６の開口５４ａ，５６ａのように設定すれば良い。開口１４ａ，１６ａの位置や形状を調整する代わりに、開口絞り１４や照明視野絞り１６を交換してもよい。
【００８８】
（第４実施形態）
本発明の第４実施形態は、請求項１〜請求項６，請求項１１〜請求項１３に対応する。
【００８９】
第４実施形態では、図８に示すように、蛍光顕微鏡５０に組み込まれた焦点位置検出装置６０の例を説明する。蛍光顕微鏡５０の構成については第３実施形態（図６）で説明したため、ここでの説明を省略する。なお、図８の蛍光顕微鏡５０で図示した波長選択フィルタ５９は、光源５１からの励起光（例えば波長５０５ｎｍ以下の光）を選択的に透過する特性を持つ。蛍光顕微鏡５０の対物レンズ２６は、焦点位置検出装置６０としての機能も兼用する。
【００９０】
第４実施形態の焦点位置検出装置６０には、対物レンズ２６の他に、反射ミラー４４と、結像レンズ４３と、視野絞り６１と、結像レンズ６２と、ダイクロイックミラー６３と、波長選択フィルタ６４と、光電検出器２１と、光源６５とが設けられている。このうち反射ミラー４４，結像レンズ４３，光電検出器２１の説明は既に行ったため、ここでの説明を省略する。ダイクロイックミラー６３と波長選択フィルタ６４の機能、および光源６５の構成も、上記の光学素子（４２，４５，４１）と同じであり、ここでの説明を省略する。
【００９１】
焦点位置検出装置６０の特徴は、標本２５の合焦位置および結像面２９と共役な面に、視野絞り６１を設けた点にある。視野絞り６１は、図６の照明視野絞り１６と受光視野絞り２０の機能を兼ね備えたものである。つまり、焦点位置検出装置６０は、照明視野絞り１６と受光視野絞り２０とを共通の光学素子（視野絞り６１）にて構成した点を特徴とする。視野絞り６１には、光軸４０ｂ上に細長いスリット形状の開口６１ａが設けられている。開口６１ａの長手方向は、紙面に垂直である。
【００９２】
また、このような視野絞り６１の配置を実現するために、焦点位置検出装置６０の照明手段（６５，６３〜６１，４３，４４，２６）と像形成手段（２６，４４，４３，６２〜６４）とは、標本２５の合焦位置および結像面２９と共役な面から標本２５までの間に配置された光学素子（４３，４４，２６）が共通となっている。
【００９３】
視野絞り６１と光電検出器２１との間で順に配置された光学素子（６２〜６４）は、光源６５からの励起光を光軸４０ｂに対して斜めの方向に進行させながら視野絞り６１に導く（励起光Ｌ３参照）と共に、視野絞り６１の開口６１ａを通過した焦点検出時の蛍光を効率良く光電検出器２１に導くためのものである。
焦点位置検出装置６０において、光源６５は、励起光の射出方向が光軸４０ａに対して平行（つまり光軸４０ｂに対して垂直）となるように設置されている。また、光源６５は、偏心状態で設置されている。光源６５の偏心量（つまり励起光と光軸４０ａとの間隔）を“α”とする。
【００９４】
このため、ダイクロイックミラー６３を光軸４０ｂに対して４５度に傾け、結像レンズ６２と視野絞り６１との間隔を結像レンズ６２の焦点距離と等しくすることで、視野絞り６１に入射する励起光Ｌ３を光軸４０ｂに対して斜めに進行させることができる。
そして、視野絞り６１の開口６１ａを通過した後の励起光も、光軸４０ｂに対して斜めの方向に進行し、結像レンズ４３を介した後、反射ミラー４４で反射して、対物レンズ２６を介して標本２５に達する。すなわち、標本２５を斜光照明する。
【００９５】
また、標本２５は、スリット形状の照明範囲２５ａの幅方向から斜光照明されたことになる。これは、光源６５からダイクロイックミラー６３と結像レンズ６２を介して視野絞り６１に入射する励起光Ｌ３の進行方向を、視野絞り６１の開口６１ａの幅方向に傾けたからである。この場合、光源６５の偏心方向は、視野絞り６１の開口６１ａの幅方向と等価である。励起光Ｌ３の光軸４０ｂに対する傾斜角度と、標本２５を斜光照明する励起光の光軸２０ａに対する傾斜角度とは、光源６５の偏心量αに応じて調整可能である。
【００９６】
斜光照明された標本２５は、照明範囲２５ａ内から蛍光を発生させる。この蛍光は、対物レンズ２６を介した後、反射ミラー４４で反射し、結像レンズ４３を介して視野絞り６１に達する。視野絞り６１の配置面には標本２５の照明範囲２５ａの蛍光像が形成される。蛍光像の大きさは視野絞り６１の開口６１ａの大きさに合致している。そして、視野絞り６１の開口６１ａを通過した蛍光は、結像レンズ６２とダイクロイックミラー６３と波長選択フィルタ６４を透過した後、光電変換器２１に入射する。
【００９７】
第４実施形態の焦点位置検出装置６０における焦点位置検出の原理も、前述した焦点位置検出装置１０，４０と同様である（図２，図３参照）。標本２５をＺ方向に移動させると、標本２５の照明範囲２５ａの蛍光像がその幅方向（つまり視野絞り６１の開口６１ａの幅方向，紙面に対して上下方向）に移動する。そして、蛍光像のうち開口６１ａとの重なり部分の面積が変化する。後段の光電変換器２１による検出光量は、重なり部分の面積に比例する。
【００９８】
したがって、標本２５をＺ方向に移動させながら、光電検出器２１によって検出される光量を監視することにより、焦点検出を行うことができる。そして、光電検出器２１による検出光量が最大となったところ（図３の位置Ｚｂ）が、標本２５の合焦位置と判断される。
このように、第４実施形態の焦点位置検出装置６０でも、標本２５の蛍光像の光量変化を監視することにより焦点検出を行うため、標本２５の蛍光観察時のように、標本２５からの光量が微弱であっても、短時間で良好に焦点検出を行うことができる。
【００９９】
また、上述した図７のフローチャート（Ｓ１〜Ｓ１０）にしたがって反射ミラー４４による照明タイミングの切り替え制御を行い、焦点位置検出装置６０による斜光照明のタイミングと、観察照明系（５１〜５８）による照明のタイミングとを切り替え、標本２５を順に照明することにより、標本２５の蛍光観察を精度良く行うことができる。
【０１００】
さらに、焦点検出時（図７のＳ１〜Ｓ７）に、視野絞り６１の開口６１ａの幅を２段階調整することで、図４（ａ）のように広い焦点検出範囲（ΔＺ１）内での粗い検出と、図４（ｂ）のように狭い焦点検出範囲（ΔＺ２）内での高精度な検出とを順に実行することができる。
また、第４実施形態の焦点位置検出装置６０では、視野絞り６１が照明視野絞りと受光視野絞りの機能を兼ね備えるため、照明視野絞りと受光視野絞りの中心を一致させる調整作業が不要となる。その結果、装置の調整を簡略化できると共に、合焦精度の高い焦点検出を行うことができる。さらに、反射ミラー４４が繰り返し移動によって位置ずれを起こした場合でも調整上の影響がない。
【０１０１】
なお、上記した第２〜第４実施形態では、焦点検出の範囲や精度を変える際に、照明視野絞り１６，受光視野絞り２０の開口１６ａ，２０ｂの幅、または視野絞り６１の開口６１ａの幅を調整したが、調整する代わりに、照明視野絞り１６，受光視野絞り２０または視野絞り６１を交換してもよい。
また、上記した第１，第３実施形態では、照明視野絞り１６，受光視野絞り２０の開口１６ａ，２０ｂをスリット形状としたが、図９（ａ），（ｂ）に示すように、小さい円形状（スポット形状）の開口１６ｃ，２０ｃを照明視野絞り１６，受光視野絞り２０に設けても良い。この場合、標本２５の照明範囲も小さい円形状となる。その結果、標本２５の合焦位置を絞り込むことができ、観察対象の位置を特定することができる。同様に、第２実施形態の受光視野絞り３０の開口３０ｂや、第４実施形態の視野絞り６１の開口６１ａをスポット形状としても良い。
【０１０２】
さらに、上記した第１〜第３実施形態では、受光視野絞り２０，３０の配置面における蛍光像（標本２５の照明範囲に対応）と開口２０ｂ，３０ｂの大きさを合致させる例を説明したが、蛍光像と開口２０ｂ，３０ｂの大きさが異なる場合にも本発明を適用できる。同様に、第４実施形態の視野絞り６１の開口６１ａと蛍光像の大きさが異なる場合にも本発明を適用できる。
【０１０３】
また、上記した第１，第３実施形態では、焦点位置検出装置に受光視野絞り２０を設けたが、観察系（２６〜２８）の対物レンズ２６が固定されている場合には、受光視野絞り２０を省略できる。
【０１０４】
さらに、上記した実施形態では、受光面に入射する蛍光の光量を一括で検出する光電検出器の例を説明したが、本発明はこれに限定されない。例えば、蛍光の光量を分割して検出し、後段の信号処理系で総和を取る構成が考えられる。
また、上記した実施形態では、開口絞り１４（図１）を対物レンズ２６の瞳面に共役な位置に設けたが、この瞳面から外れた位置に開口絞りを設けた構成にも本発明を適用することができ、標本を斜光照明できる。
【０１０５】
さらに、第３実施形態の受光視野絞り２０（図６）に代えて第２実施形態の受光視野絞り３０（図５）を設けることもできる。第４実施形態の視野絞り６１（図８）に代えて第２実施形態の受光視野絞り３０（図５）と同様の視野絞りを設けることもできる。この場合、光電検出器２１（図６，図８）は光電検出器３１（図５）に置き換えることになる。
【０１０６】
また、上記した第１〜第４実施形態では、標本２５をＺ方向に移動させながら光電検出器２１，３１による検出光量を監視し（図３）、検出光量が最大となったところ（位置Ｚｂ）を標本２５の合焦位置と判断する例を説明したが、本発明はこれに限定されない。
既に説明したように、標本２５をＺ方向に移動させると、その移動量に比例して標本２５の照明範囲２５ａの蛍光像と開口２０ｂ，３０ｂ，６１ａ（スリット形状）との重なり部分の面積が変化し、この面積に比例して光電検出器２１，３１による検出光量が変化する。つまり検出光量は、標本２５の合焦位置より前ピン側と後ピン側との各々で、標本２５の移動量に比例して一次関数的に増減する。最大の検出光量は、合焦位置のときである。
【０１０７】
このため、合焦位置より前ピン側の検出光量と標本２５のＺ位置との関係を直線で近似し、同様に、後ピン側の検出光量とＺ位置との関係を直線で近似し、得られた２直線の交点を求めることにより、標本２５の合焦位置を算出することができる。この例の具体的な説明を次の第５実施形態で行う。
【０１０８】
（第５実施形態）
本発明の第５実施形態は、請求項９，請求項１０に対応する。
第５実施形態の焦点位置検出装置は、図１，図６，図８の光電検出器２１の出力または図５の光電検出器３１のうち中央の受光面３１ｂの出力に接続された制御装置を有し、この制御装置で標本２５の合焦位置を算出するように構成されている。合焦位置の算出手順は、図１０のフローチャートに示す通りである。算出手順の説明に当たり、図１１も参照する。図１１の横軸は、標本２５と対物レンズ２６との光軸方向の距離（Ｚ位置）を表す。縦軸は、例えば光電検出器２１によって検出される光量を表す。
【０１０９】
制御装置は、図１０のステップＳ１１において、標本２５をＺ方向に移動させながら、図１１に示す一定の間隔δ１ごとに、例えば光電検出器２１による検出光量を取り込む（測定点Ａ１〜Ａ１５）。このような取り込みは、標本２５の合焦位置を含む所定の広い範囲δ２内で行われる。上記の間隔δ１は、広い範囲δ２内に測定点Ａが所定数（例えば１５個）含まれるように粗く設定されている。
【０１１０】
次いで、制御装置は、ステップＳ１１で取り込んだ離散的な測定点Ａ１〜Ａ１５のうち最大光量の測定点Ａ８を選択する（ステップＳ１２）。本実施形態では、粗い間隔δ１ごとに測定点Ａを取り込むため、最大光量の測定点Ａ８が標本２５の合焦位置とは限らない。しかし、標本２５の合焦位置が、最大光量の測定点Ａ８に隣接する２つの測定点Ａ７，Ａ９の間にあることは分かる。
【０１１１】
制御装置は、標本２５の合焦位置を算出するために、次のステップＳ１３〜Ｓ１６を実行する。まずステップＳ１３では、全ての測定点Ａ１〜Ａ１５から最大光量の測定点Ａ８を除外し、残りを前ピン側（Ａ１〜Ａ７）と後ピン側（Ａ９〜Ａ１５）とに分類する。この分類の理由は、前ピン側と後ピン側との各々で、検出光量と標本２５のＺ位置との関係を直線で近似するためである。最大光量の測定点Ａ８を除外する理由は、この時点での所属が不明だからである。
【０１１２】
次のステップＳ１４では、前ピン側の測定点Ａ１〜Ａ７のうち、直線近似に有効なもの（Ａ３〜Ａ７）を選択する。この選択は、最大光量の測定点Ａ８に対応する位置Ｚ８を基準にして、位置Ｚ８から前ピン側に一定の間隔δ３だけ離れた位置Ｚ（Ｌ）を求め、測定点Ａ１〜Ａ７に対応する位置Ｚ１〜Ｚ７の各々が位置Ｚ（Ｌ）から位置Ｚ８までの範囲に含まれるか否かにより行われる。もちろん、その範囲（Ｚ（Ｌ）〜Ｚ８）に含まれる測定点Ａ３〜Ａ７が有効なものとして選択される。
【０１１３】
間隔δ３は、受光視野絞り２０のスリット形状の開口２０ｂ（または受光視野絞り３０の開口３０ｂまたは視野絞り６１の開口６１ａ）の幅Ｗ、対物レンズ２６の倍率Ｂ、および標本２５を斜光照明する励起光の光軸２０ａに対する傾斜角度θを変数とする関数Ｆ（例えば次式（１））によって表すことができる。なお、幅Ｗは、例えば受光視野絞り２０の配置面における“標本２５の照明範囲２５ａの蛍光像”の幅にも対応している。
【０１１４】
δ３＝Ｆ（Ｗ，Ｂ，θ）＝０．８×Ｗ／（Ｂ・ｔａｎθ） ……（１）
ステップＳ１４における有効な測定点（Ａ３〜Ａ７）の選択に当たり、間隔δ３は、式（１）に基づいて予め計算した結果を変数Ｗ，Ｂ，θに対応づけて制御装置のメモリに記憶させておき、必要に応じて読み出すようにすればよい。また、必要に応じてその都度計算しても構わない。
【０１１５】
同様に、ステップＳ１４では、後ピン側の測定点Ａ９〜Ａ１５のうち、直線近似に有効なもの（Ａ９〜Ａ１３）を選択する。この選択は、最大光量の測定点Ａ８に対応する位置Ｚ８を基準にして、位置Ｚ８から後ピン側に一定の間隔δ３だけ離れた位置Ｚ（Ｕ）を求め、測定点Ａ９〜Ａ１５に対応する位置Ｚ９〜Ｚ１５の各々が位置Ｚ８から位置Ｚ（Ｕ）までの範囲に含まれるか否かにより行われる。もちろん、その範囲（Ｚ８〜Ｚ（Ｕ））に含まれる測定点Ａ９〜Ａ１３が有効なものとして選択される。
【０１１６】
そして次のステップＳ１５において、制御装置は、前ピン側の有効な測定点Ａ３〜Ａ７の検出光量と標本２５のＺ位置との関係を直線で近似する。この場合、周知の最小自乗法を用いることが好ましい。つまり、各々の測定点Ａ３〜Ａ７の検出光量（Ｋ）とＺ位置（Ｚ）と誤差（Ｇ）を一次式（Ｋ＝ａＺ＋ｂ＋Ｇ）で表し、誤差Ｇの自乗和の平均が最小となるように係数ａ，ｂを求めればよい。前ピン側の測定点Ａ３〜Ａ７を近似する直線は、次の式（２）で表される。
【０１１７】
Ｋ＝ａＺ＋ｂ ……（２）
同様に、制御装置は、後ピン側の有効な測定点Ａ９〜Ａ１３の検出光量と標本２５のＺ位置との関係を直線で近似する。つまり、各々の測定点Ａ９〜Ａ１３の検出光量（Ｋ）とＺ位置（Ｚ）と誤差（Ｇ）を一次式（Ｋ＝ｃＺ＋ｄ＋Ｇ）で表し、誤差Ｇの自乗和の平均が最小となるように係数ｃ，ｄを求める。後ピン側の測定点Ａ９〜Ａ１３を近似する直線は、次の式（３）で表される。
【０１１８】
Ｋ＝ｃＺ＋ｄ ……（３）
このようにして２つの直線（式（２），（３））が得られると、制御装置は、最後のステップＳ１６において、２つの直線の交点Ｐ（Ｋｆ，Ｚｆ）を求める。そして、交点Ｐ（Ｋｆ，Ｚｆ）の横軸の値“Ｚｆ”を標本２５の合焦位置として決定する。
第５実施形態の焦点位置検出装置によれば、標本２５から発生する蛍光がノイズに埋もれるような微弱な光量で、光電検出器２１，３１による検出光量の最大値を正確に見つけることが困難な場合であっても、最大検出光量の前後の測定点の情報を利用することにより、短時間で精度良く合焦位置を求めることができる。
【０１１９】
また、微弱な蛍光を少しでも多く光電検出器２１，３１に導くために、受光視野絞り２０の開口２０ｂ（または受光視野絞り３０の開口３０ｂまたは視野絞り６１の開口６１ａ）の幅Ｗを広げると、検出光量と標本２５のＺ位置との関係がブロードになるため最大検出光量を正確に見つけ難いが、この場合でも第５実施形態によれば、短時間で精度良く合焦位置を求めることができる。
【０１２０】
さらに、上記した第５実施形態では、式（１）に基づいて計算した適切な間隔δ３を利用し、直線近似に有効な測定点Ａ３〜Ａ７，Ａ９〜Ａ１３を選択したため、確実に精度良く合焦位置を求めることができる。また、直線近似により簡単に合焦位置を算出することができる。
なお、上記した第５実施形態では、図１０のステップＳ１５で５つの測定点Ａ３〜Ａ７と測定点Ａ９〜Ａ１３をそれぞれ直線近似したが、直線近似の際の測定点の数は３点〜１０点（好ましくは４点〜６点）あればよい。
【０１２１】
また、上記した第５実施形態では、受光視野絞り２０の開口２０ｂ（または受光視野絞り３０の開口３０ｂまたは視野絞り６１の開口６１ａ）および照明範囲２５ａの蛍光像がスリット形状である例を説明したが、円形状の場合にも本発明を適用できる。この場合は、上記した一次式（例えばＫ＝ａＺ＋ｂ＋Ｇ）での直線近似に代えて、次の式（４）で表される関数を用いて近似すればよい。
【０１２２】
Ｋ＝ｐ［πｒ２−２Ｘ√（ｒ２−Ｘ２）−２ｒ２ｓｉｎ−１（Ｘ／ｒ）］＋ｑ …（４）
ただし、Ｘ＝（Ｚ／２）・ｔａｎθ ， ｒ＝Ｒ／Ｂ
式（４）のｐ，ｑは係数、Ｒは円形状の開口の半径、Ｂは対物レンズ２６の倍率、θは標本２５に対する斜光照明の角度である。半径Ｒは、例えば受光視野絞り２０の配置面における“標本２５の照明範囲２５ａの蛍光像”の半径にも対応している。Ｚは、標本２５の合焦位置からの距離（０≦Ｚ≦２Ｒ／（Ｂ・ｔａｎθ））である。
【０１２３】
さらに、式（４）を用いた近似に有効な測定点を選択する際の間隔δ３としては、上記した式（１）に代えて、次の式（５）で表される関数Ｇの間隔δ３を用いることが好ましい。
δ３＝Ｇ（Ｒ，Ｂ，θ）＝０．８×２Ｒ／（Ｂ・ｔａｎθ） …（５）
【０１２４】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、物体からの光量が少なくても良好に焦点検出を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】第１実施形態の焦点位置検出装置１０の全体構成図である。
【図２】焦点位置検出装置１０における焦点検出の原理を説明する図である。
【図３】焦点位置検出装置１０における焦点検出の原理を説明する図である。
【図４】焦点検出の範囲と精度を調整する場合の原理を説明する図である。
【図５】第２実施形態の焦点位置検出装置の主要構成部分を示す図である。
【図６】第３実施形態の蛍光顕微鏡５０および焦点位置検出装置４０の全体構成を示す図である。
【図７】蛍光顕微鏡５０における照明タイミングの切り換え制御に関するフローチャートである。
【図８】第４実施形態の焦点位置検出装置６０の全体構成を示す図である。
【図９】照明視野絞り１６と受光視野絞り２０の別の構成を示す図である。
【図１０】第５実施形態の焦点位置検出装置における合焦位置の算出手順を示すフローチャートである。
【図１１】第５実施形態の焦点位置検出装置において合焦位置を算出する手順の一例を説明する図である。
【符号の説明】
１０，４０，６０ 焦点位置検出装置
１１，４１，６５ 光源
１２，１３，１５，１７ レンズ
１６ 照明視野絞り
１８，４２，６３ ダイクロイックミラー
１９ ハーフミラー
２０，３０ 受光視野絞り
２１，３１ 光電検出器
２５ 標本
２６ 対物レンズ
２７，４３，６２ 結像レンズ
２８，４５，６４ 波長選択フィルタ
２９ 結像面
４４ 反射ミラー
６１ 視野絞り
【発明の属する技術分野】
本発明は、焦点位置検出装置およびそれを備えた蛍光顕微鏡に関し、特に、光学機器のオートフォーカス機構に適用して好適な焦点位置検出装置およびそれを備えた蛍光顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、顕微鏡やカメラなどの光学機器には、所定の結像面（例えばイメージセンサの撮像面）に物体の鮮明な像を形成するため、オートフォーカス機構が設けられている。また、オートフォーカス機構の中で重要な部分は、光学系により結像される像と所定の結像面との位置ずれ（焦点ずれ）を検出するための焦点位置検出装置である。焦点位置検出装置としては、物体の像を画像として取り込み、その画像のコントラストに基づいて焦点検出を行う方式が知られている（例えば特許文献１を参照）。
【０００３】
【特許文献１】
特許第３２３９３４３号公報
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記した従来の画像コントラスト方式は、物体から発生する光の光量の影響を受けやすい。このため、物体からの光量が少ないと、焦点検出に膨大な時間を要したり、焦点検出が困難になったりする。
【０００５】
本発明の目的は、物体からの光量が少なくても良好に焦点検出を行える焦点位置検出装置およびそれを備えた蛍光顕微鏡を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
請求項１に記載の焦点位置検出装置は、物体を斜光照明する照明手段と、前記照明手段により斜光照明された前記物体からの光を集光して、前記物体の像を形成する像形成手段と、前記物体の前記像形成手段による合焦位置と共役な面の後方に配された受光面を有し、前記像形成手段により前記受光面に形成される前記像に応じて前記受光面に入射する光量を検出する光量検出手段とを備えたものである。
【０００７】
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の焦点位置検出装置において、前記光量検出手段で検出した光量に基づいて焦点位置を検出する焦点位置検出手段をさらに備え、前記像形成手段は、光軸方向に移動する移動手段を有し、前記光量検出手段は、前記像形成手段を光軸方向に移動して複数の位置で光量を検出し、前記焦点位置検出手段は、前記複数の位置で検出した光量のうち最大の光量を検出した位置を焦点位置とするものである。
【０００８】
請求項３に記載の発明は、請求項１または請求項２に記載の焦点位置検出装置において、前記合焦位置と共役な面に、受光視野絞りが配置され、前記光量検出手段が、前記受光視野絞りを介して前記受光面に形成される前記像に応じて、前記光量を検出するものである。
請求項４に記載の発明は、請求項３に記載の焦点位置検出装置において、前記照明手段が、前記物体の照明範囲を規定する照明視野絞りを有し、前記照明視野絞りと前記受光視野絞りとを、相似形状としたものである。
【０００９】
請求項５に記載の発明は、請求項４に記載の焦点位置検出装置において、前記照明手段と前記像形成手段とは、前記合焦位置と共役な面から前記物体までの間に配置された光学素子が共通であり、前記照明視野絞りは、前記受光視野絞りとしても機能するものである。
請求項６に記載の発明は、請求項４または請求項５に記載の焦点位置検出装置において、前記照明視野絞りおよび前記受光視野絞りの大きさを調整する調整手段をさらに備えたものである。
【００１０】
請求項７に記載の発明は、請求項１から請求項６の何れか１項に記載した焦点位置検出装置において、前記合焦位置と共役な面の後方に配された補助用の受光面を有し、該補助用の受光面に入射する光量に応じて前記物体の位置ずれ方向を検出する方向検出手段をさらに備えたものである。
請求項８に記載の発明は、請求項１から請求項７の何れか１項に記載した焦点位置検出装置において、前記照明手段は、無限遠系の対物レンズを利用して前記物体を斜光照明する手段であり、前記対物レンズの瞳面と共役な開口絞りを有するものである。
【００１１】
請求項９に記載の発明は、請求項３から請求項８に記載の焦点位置検出装置において、前記受光視野絞りの形状と該受光視野絞りの配置面に形成される前記像の形状とに応じた関数を用いて、前記光量検出手段による検出光量と前記物体の位置との関係を近似することにより、前記合焦位置を算出する算出手段をさらに備えたものである。
【００１２】
請求項１０に記載の発明は、請求項９に記載の焦点位置検出装置において、前記算出手段は、前記合焦位置の前後の各々において前記検出光量と前記物体の位置との関係を直線で近似し、得られた２つの直線の交点に基づいて前記合焦位置を算出するものである。
請求項１１に記載の発明は、請求項１から請求項１０の何れか１項に記載した焦点位置検出装置において、前記照明手段は、前記物体に含まれる蛍光物質を励起可能な波長域の光で、前記物体を斜光照明する手段であり、前記像形成手段は、前記物体からの蛍光を集光して、前記物体の蛍光像を形成する手段であり、前記光量検出手段は、前記受光面に形成される前記蛍光像に応じて前記受光面に入射する光量を検出するものである。
【００１３】
請求項１２に記載の発明は、蛍光物質で標識された物体の蛍光観察に用いられる蛍光顕微鏡において、無限遠系の対物レンズと、請求項１１に記載の焦点位置検出装置とを備え、前記照明手段は、前記対物レンズを利用して前記物体を斜光照明し、前記像形成手段は、前記対物レンズを利用して前記物体の蛍光像を形成するものである。
【００１４】
請求項１３に記載の発明は、請求項１２に記載の蛍光顕微鏡において、前記物体の蛍光観察時に、前記蛍光物質を励起可能な波長の光で、前記対物レンズを利用して前記物体を照明する観察照明手段と、前記焦点位置検出装置の前記照明手段による照明タイミングと前記観察照明手段による照明タイミングとを切り換える切換制御手段とを備えたものである。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、図面を用いて本発明の実施形態を詳細に説明する。
（第１実施形態）
本発明の第１実施形態は、請求項１〜請求項４，請求項８，請求項１１に対応する。ここでは、図１に示すように、標本２５の蛍光像を形成する観察系（２６〜２８）に組み込まれた焦点位置検出装置１０の例を説明する。標本２５（物体）は、例えば、蛍光物質で標識された生物標本（ＤＮＡや蛋白質など）である。
【００１６】
この標本２５は、不図示のステージ上に載置され、観察系（２６〜２８）の光軸２０ａの方向に沿って移動可能である。光軸２０ａの方向を「ｚ方向」とする。なお、図１には、標本２５が観察系（２６〜２８）の焦点位置に一致した状態（合焦状態）を例示している。このときの標本２５のＺ位置を「合焦位置」という。
まず、焦点位置検出装置１０の説明に先立って、観察系（２６〜２８）の構成を説明しておく。観察系（２６〜２８）は、無限遠系の対物レンズ２６と、第２対物レンズとして機能する結像レンズ２７と、これら対物レンズ２６，結像レンズ２７の間に配置された波長選択フィルタ２８とで構成されている。波長選択フィルタ２８は、標本２５から発生した蛍光（例えば波長５２０ｎｍ〜６００ｎｍの光）を選択的に透過する特性を持つ。
【００１７】
標本２５の蛍光観察時、合焦状態の標本２５から発生した蛍光は、対物レンズ２６と結像レンズ２７の作用によって、標本２５の合焦位置と共役な所定の結像面２９に集光される。このとき、所定の結像面２９には、標本２５の蛍光像が鮮明に形成される。
図示省略したが、所定の結像面２９（または結像面２９と共役な面）には、２次元撮像素子（例えばＣＣＤイメージセンサ）が設置されている。そして、標本２５が合焦状態にあるときには、標本２５の鮮明な蛍光像を２次元撮像素子によって取り込むことができる。第１実施形態では、対物レンズ２６と結像レンズ２７とによる観察倍率を２０倍、対物レンズ２６の開口数を０．４とする。
【００１８】
さて、第１実施形態の焦点位置検出装置１０は、標本２５が合焦状態にあるか否かを検出するための装置であり、照明系（１１〜１８）と受光系（１９〜２１）とを有している。さらに、上記の観察系（２６〜２８）は、焦点位置検出装置１０としての機能も兼用している。このため、焦点位置検出装置１０の構成要素としては、照明系（１１〜１８）と受光系（１９〜２１）だけでなく、観察系（２６〜２８）も含まれる。
【００１９】
照明系（１１〜１８）の構成を具体的に説明する。照明系（１１〜１８）は、光軸１０ａに沿って、光源１１と、レンズ１２，１３と、開口絞り１４と、レンズ１５と、照明視野絞り１６と、レンズ１７と、ダイクロイックミラー１８とが順に配置された構成となっている。
また、照明系（１１〜１８）は、その光軸１０ａが上記した観察系（２６〜２８）の光軸２０ａに対して略直交する向きで、観察系（２６〜２８）の対物レンズ２６と波長選択フィルタ２８との間に組み込まれる。このとき、照明系（１１〜１８）のうち、ダイクロイックミラー１８が光軸２０ａ上に配置される。
【００２０】
照明系（１１〜１８）の光源１１は、例えば高圧水銀ランプであり、紫外線や可視光線などの励起光を発生する。励起光は、標本２５に含まれる蛍光物質を励起可能な波長域（例えば５０５ｎｍ以下）の光である。光源１１からの励起光は、レンズ１２，１３を介した後、開口絞り１４に達する。
開口絞り１４は、観察系（２６〜２８）の対物レンズ２６の瞳面（像側焦点面）と共役な面に配置されている。また、開口絞り１４には、照明系（１１〜１８）の光軸１０ａから外れた位置に円形状の開口１４ａが設けられている。開口絞り１４の開口１４ａを通過した励起光は、レンズ１５を介した後、照明視野絞り１６に達する。
【００２１】
照明視野絞り１６は、標本２５の合焦位置および結像面２９と共役な面に配置されている。また、照明視野絞り１６には、照明系（１１〜１８）の光軸１０ａ上に細長いスリット形状の開口１６ａが設けられている。開口１６ａの長手方向は、紙面に垂直である。照明視野絞り１６の開口１６ａを通過した励起光Ｌ１は、光軸１０ａに対して斜めの方向に進行し、レンズ１７を介した後、ダイクロイックミラー１８に達する。
【００２２】
ダイクロイックミラー１８は、例えば波長５０５ｎｍ以下の光を反射すると共に、波長５０５ｎｍ以上の光を透過する特性を持つ。このため、光源１１からの励起光はダイクロイックミラー１８で反射され、観察系（２６〜２８）の対物レンズ２６を介した後、標本２５に達する。なお、標本２５からの蛍光（例えば波長５２０ｎｍ〜６００ｎｍの光）はダイクロイックミラー１８を透過する。
【００２３】
上記のように、照明系（１１〜１８）は、対物レンズ２６を利用して標本２５を照明する落射照明系である。また、この照明系（１１〜１８）では、開口絞り１４の開口１４ａが光軸１０ａから外れているため、照明視野絞り１６の開口１６ａを通過した後の励起光Ｌ１を光軸１０ａに対して斜めに進行させることができ、その結果、標本２５を斜光照明することができる。
【００２４】
斜光照明とは、観察系（２６〜２８）の光軸２０ａに対して斜めの方向から、励起光を標本２５に照射する方式のことである。厳密にいえば、標本２５に入射する励起光の主光線の方向が光軸２０ａに対して斜め方向となっている。
さらに、照明系（１１〜１８）では、開口絞り１４が対物レンズ２６の瞳面と共役な関係にあるため、標本２５に入射する励起光の主光線の方向を互いに平行な状態に揃えることができる。これにより、第１実施形態の焦点位置検出装置１０における焦点検出の精度が向上する。
【００２５】
また、照明系（１１〜１８）では、開口絞り１４が対物レンズ２６の瞳面と共役で、かつ、照明視野絞り１６が標本２５の合焦位置および結像面２９と共役な配置となっているため、いわゆるケーラー照明が実現する。
さらに、照明系（１１〜１８）では、照明視野絞り１６の開口１６ａを細長いスリット形状としたため、標本２５の照明範囲２５ａを細長いスリット形状に規定することができる。照明範囲２５ａの長手方向も、紙面に垂直である。照明範囲２５ａと照明視野絞り１６の開口１６ａとは、相似形状である。第１実施形態では、照明範囲２５ａの幅を０．０５ｍｍとする。
【００２６】
また、標本２５の照明範囲２５ａの長手方向と、照明範囲２５ａに入射する励起光の主光線の方向とは、互いに直交する。すなわち、標本２５は、照明範囲２５ａの幅方向から斜光照明されたことになる。これは、照明系（１１〜１８）において、開口絞り１４の開口１４ａの軸外し方向と照明視野絞り１６の開口１６ａの幅方向とを一致させたからである。
【００２７】
なお、標本２５の照明範囲２５ａには、観察系（２６〜２８）の光軸２０ａが含まれている。特に、標本２５が合焦状態のとき、照明範囲２５ａの中心は、観察系（２６〜２８）の光軸２０ａに一致する。光軸２０ａは、標本２５を蛍光観察する際の視野（観察視野）の中心に相当する。
このようにして、照明系（１１〜１８）と対物レンズ２６とにより斜光照明された標本２５は、照明範囲２５ａ内で励起され、照明範囲２５ａ内から蛍光を発生させる。この蛍光は、上記した蛍光観察時と同様に、対物レンズ２６と結像レンズ２７の作用によって集光され、受光系（１９〜２１）に導かれる。
【００２８】
対物レンズ２６と結像レンズ２７との間には、上記したダイクロイックミラー１８と波長選択フィルタ２８とが配置されているため、標本２５に対する励起光（例えば５０５ｎｍ以下）の反射光を遮断して、標本２５で発生した蛍光（例えば波長５２０ｎｍ〜６００ｎｍの光）のみを受光系（１９〜２１）に導くことができる。
【００２９】
標本２５が例えば生物標本のとき、標本２５からの蛍光は、一般に、標本２５に対する励起光と比較して非常に暗い（１００分の１以下）ので、これらのダイクロイックミラー１８と波長選択フィルタ２８の働きにより、標本２５からの蛍光を効率良く捉えることができる。
【００３０】
次に、受光系（１９〜２１）の構成を具体的に説明する。受光系（１９〜２１）は、光軸１０ｂに沿って、ハーフミラー１９と、受光視野絞り２０と、光電検出器２１とが順に配置された構成となっている。
また、受光系（１９〜２１）は、その光軸１０ｂが上記した観察系（２６〜２８）の光軸２０ａに対して略直交する向きで、観察系（２６〜２８）の結像レンズ２７と所定の結像面２９との間に組み込まれる。このとき、受光系（１９〜２１）のうち、ハーフミラー１９が光軸２０ａ上に配置される。
【００３１】
したがって、照明系（１１〜１８）と対物レンズ２６により斜光照明された標本２５の照明範囲２５ａ内から発生し、その後、対物レンズ２６と結像レンズ２７により集光された蛍光（以下「焦点検出時の蛍光」という）は、ハーフミラー１９で反射した後、受光視野絞り２０に達する。
受光視野絞り２０は、標本２５の合焦位置および結像面２９と共役な面に配置されている。また、受光視野絞り２０には、受光系（１９〜２１）の光軸１０ｂ上に細長いスリット形状の開口２０ｂ（詳細は後述する）が設けられている。開口２０ｂの長手方向は、紙面に垂直である。
【００３２】
受光視野絞り２０の配置面（標本２５の合焦位置と共役な面）には、標本２５が合焦状態にあるとき、この標本２５の照明範囲２５ａ内から発生した焦点検出時の蛍光が良好に集光される。つまり、標本２５の照明範囲２５ａの鮮明な蛍光像が受光視野絞り２０の配置面に形成される。
ここで、受光視野絞り２０の開口２０ｂについて具体的に説明する。受光視野絞り２０の開口２０ｂは、上記した照明視野絞り１６の開口１６ａと相似形状である。このため、開口２０ｂは、標本２５の照明範囲２５ａと相似形状になり、標本２５の照明範囲２５ａの蛍光像とも相似形状になる。
【００３３】
そして、第１実施形態の焦点位置検出装置１０では、照明範囲２５ａの蛍光像と大きさが合致するように、受光視野絞り２０の開口２０ｂの大きさを定めている。例えば、照明範囲２５ａの幅を０．０５ｍｍ、対物レンズ２６，結像レンズ２７による観察倍率を２０倍とすると、照明範囲２５ａの蛍光像の幅は１ｍｍとなる。この場合には、受光視野絞り２０の開口２０ｂの幅も１ｍｍに設定する。
【００３４】
したがって、標本２５が合焦状態にあるとき、受光視野絞り２０の配置面に形成される照明範囲２５ａの蛍光像は、受光視野絞り２０の開口２０ｂと重なり、そのまま開口２０ｂを通過する。受光視野絞り２０の開口２０ｂを通過した焦点検出時の蛍光は、光電検出器２１に達する。
光電検出器２１は、受光視野絞り２０の配置面（標本２５の合焦位置および結像面２９と共役な面）の後方に配された受光面２１ｂを有している。受光面２１ｂの中心は、受光系（１９〜２１）の光軸１０ｂ上に位置する。この受光面２１ｂには、受光視野絞り２０の開口２０ｂを通過した後の蛍光による像（ボケた蛍光像）が形成される。
【００３５】
そして、光電検出器２１は、受光面２１ｂに形成されるボケた蛍光像に応じて受光面２１ｂに入射する光量を一括で検出する。このような光電検出器２１には、例えばフォトマルチプライヤなど、微弱光の検出に適したものを用いることが好ましい。
なお、上記のように構成された焦点位置検出装置１０の照明系（１１〜１８）と対物レンズ２６とは請求項の「照明手段」に対応する。観察系（２６〜２８）とハーフミラー１９とは「像形成手段」に対応する。光電検出器２１は「光量検出手段」に対応する。
【００３６】
次に、第１実施形態記の焦点位置検出装置１０における焦点検出の原理について、図２，図３を用いて説明する。
図２には、原理説明に必要な部分（標本２５，対物レンズ２６，結像レンズ２７，受光視野絞り２０，光電検出器２１）のみを示している。また、図２（ａ）はいわゆる前ピン状態、図２（ｂ）は合焦状態、図２（ｃ）はいわゆる後ピン状態を示したものである。図３は、標本２５と対物レンズ２６との光軸方向の距離（Ｚ位置）が変化したときに、光電検出器２１によって検出される光量の変化を示したものである。
【００３７】
図２（ｂ）に示す合焦状態のとき、標本２５の照明範囲２５ａの中心は、対物レンズ２６，結像レンズ２７の光軸２０ａに一致する。このため、標本２５の照明範囲２５ａの蛍光像は、受光視野絞り２０の開口２０ｂと重なる位置に形成される。そして、蛍光像の形成に関わる全ての蛍光が、そのまま開口２０ｂを通過する。このため、光電検出器２１によって検出される光量は、最大となる。
【００３８】
一方、図２（ａ）に示す前ピン状態のとき、標本２５の照明範囲２５ａは、上記の光軸２０ａから外れ、図中左方に位置する。これは、標本２５が図中左方から斜光照明されているからである。このとき、標本２５の照明範囲２５ａの蛍光像は、受光視野絞り２０の開口２０ｂから外れ、図中右方に位置する。このため、蛍光像の形成に関わる蛍光は、開口２０ｂを通過することができず、光電検出器２１によって検出される光量は、ほぼ零となる。
【００３９】
逆に、図２（ｃ）に示す後ピン状態のとき、標本２５の照明範囲２５ａは、上記の光軸２０ａから外れ、図中右方に位置する。これは、標本２５が図中左方から斜光照明されているからである。このとき、標本２５の照明範囲２５ａの蛍光像は、受光視野絞り２０の開口２０ｂから外れ、図中左方に位置する。このため、蛍光像の形成に関わる蛍光は、開口２０ｂを通過することができず、光電検出器２１によって検出される光量は、ほぼ零となる。
【００４０】
このように、第１実施形態の焦点位置検出装置１０では、標本２５をＺ方向に移動させると、標本２５の照明範囲２５ａがその幅方向（図中左右方向）に移動し、照明範囲２５ａの蛍光像もその幅方向（図中左右方向）つまり受光視野絞り２０の開口２０ｂの幅方向に移動する。そして、蛍光像のうち開口２０ｂとの重なり部分の面積が変化する。後段の光電検出器２１に達するのは、重なり部分を通過した焦点検出時の蛍光であり、そこでの検出光量は重なり部分の面積に比例する。
【００４１】
したがって、第１実施形態の焦点位置検出装置１０では、標本２５をＺ方向に移動させながら、光電検出器２１によって検出される光量を監視することにより、焦点検出を行うことができる。そして、光電検出器２１による検出光量が最大となったところ（図３の位置Ｚｂ）が、標本２５の合焦位置と判断される。
なお、上記した第１実施形態の焦点位置検出装置１０では、対物レンズ２６と結像レンズ２７とによる観察倍率を２０倍としたので、標本２５の位置が光軸方向に０．０１ｍｍだけ移動すると、照明範囲２５ａの蛍光像の位置は、受光視野絞り２０の配置面上で横方向に０．２ｍｍずれることになる。
【００４２】
また、受光視野絞り２０の開口２０ｂの幅は１ｍｍであるため、照明範囲２５ａの蛍光像が開口２０ｂの幅方向（横方向）に０．２ｍｍずれると、光電検出器２１による検出光量は２０％ほど変化することになる。このため、標本１５が例えば生物標本のように０．０５ｍｍ程度の厚みを持つ場合でも、光電検出器２１による検出光量を監視することで、必要上十分な焦点検出を行うことができる。
【００４３】
上述したように、第１実施形態の焦点位置検出装置１０によれば、標本２５の蛍光像の光量変化を監視することにより焦点検出を行うため、標本２５の蛍光観察時のように、標本２５からの光量が微弱であっても、短時間で良好に焦点検出を行うことができる。
また、標本２５をＺ方向に移動させながら、光電検出器２１による検出光量を監視して、この検出光量が最大となったか否かを判断するような制御装置との組み合わせにより、標本２５からの光量が微弱であっても、極めて精度の高いオートフォーカスを実行することができる。
【００４４】
さらに、上記した第１実施形態の焦点位置検出装置１０では、標本２５の照明範囲２５ａをスリット形状としたので、標本２５に含まれる蛍光物質がまばらに分布している場合でも、光電検出器２１による検出光量を確保することができ、短時間で良好に焦点検出を行うことができる。この場合には、標本２５の照明範囲２５ａ内で平均化された合焦位置が得られる。
【００４５】
また、上記した第１実施形態の焦点位置検出装置１０では、標本２５の合焦位置と共役な面に受光視野絞り２０を設けたので、観察系（２６〜２８）の対物レンズ２６を交換して標本２５の観察倍率を変えたときのように、受光視野絞り２０の配置面における蛍光像（標本２５の照明範囲２５ａに対応）の大きさが変化しても、これに応じて受光視野絞り２０の開口２０ｂの大きさを変えることができる。つまり、観察倍率を変更しても、蛍光像と開口２０ｂの大きさを合致させることができ、上記と同様の焦点検出を短時間で良好に行うことができる。
【００４６】
また、第１実施形態の焦点位置検出装置１０では、受光視野絞り２０の配置面における蛍光像と開口２０ｂの大きさを合致させるため、合焦状態の近傍でも光電検出器２１による検出光量の変化を容易に捉えることができ、効率良く焦点検出を行える。
さらに、照明視野絞り１６と受光視野絞り２０の開口１６ａ，２０ｂの幅を調整する手段を設けることにより、２つの開口１６ａ，２０ｂの相似形状を保ちながら、つまり、受光視野絞り２０の配置面における蛍光像（標本２５の照明範囲２５ａに対応）と開口２０ｂの大きさを合致させたままで、２つの開口１６ａ，２０ｂの幅を調整することもできる（請求項５）。
【００４７】
例えば、２つの開口１６ａ，２０ｂの幅を２段階で調整する場合、光電検出器２１による検出光量の変化は、図４（ａ），（ｂ）に示すようになる。図４（ａ）は、開口１６ａ，２０ｂの幅が広い状態に対応し、図４（ｂ）は、開口１６ａ，２０ｂの幅が狭い状態に対応する。
図４（ａ），（ｂ）の比較から分かるように、開口１６ａ，２０ｂの幅を広くした状態（ａ）での焦点検出範囲（ΔＺ１）は、幅を狭くした状態（ｂ）での焦点検出範囲（ΔＺ２）より拡大する。また、焦点検出精度は、開口１６ａ，２０ｂの幅が広い状態（ａ）に比べて狭い状態（ｂ）の方が向上する。
【００４８】
したがって、まず、開口１６ａ，２０ｂの幅を広くしておき、広い焦点検出範囲（ΔＺ１）内で粗く焦点検出を行い、その後で、開口１６ａ，２０ｂの幅を狭い状態に切り換えて、狭い焦点検出範囲（ΔＺ２）内で精度良く焦点検出を行うことができる。
なお、上記した第１実施形態では、受光系（１９〜２０）を結像レンズ２７と結像面２９の間に配置したが、結像レンズ２７と波長選択フィルタ２８の間に配置しても良い。ただし、この場合には、受光系（１９〜２０）のハーフミラー１９と受光視野絞り２０との間に、結像レンズ２７と同等の作用を持つ光学素子を設けることが必要となる。
【００４９】
さらに、受光系（１９〜２０）を波長選択フィルタ２８と対物レンズ２６との間に配置しても良い。ただし、この場合には、受光系（１９〜２０）のハーフミラー１９と受光視野絞り２０との間に、結像レンズ２７および波長選択フィルタ２８と同等の作用を持つ光学素子を各々設けることが必要となる。
また、この場合には、受光系（１９〜２０，結像レンズ２７および波長選択フィルタ２８と同等の光学素子を含む）と照明系（１１〜１８）との一体化を図ることができるという利点がある。この一体化を図った構成例については、後述する第３実施形態の焦点位置検出装置４０（図６）および第４実施形態の焦点位置検出装置６０（図８）で説明する。
【００５０】
さらに、上記した第１実施形態では、照明系（１１〜１８）において、光源１１とレンズ１２，１３とで開口絞り１４に励起光を導いたが、光源１１，レンズ１２，１３に代えて、小型の半導体レーザーや発光ダイオードなどの光源を、開口絞り１４の開口１４ａの近傍位置に設けても良い。
また、上記した第１実施形態では、照明系（１１〜１８）において、光源１１とレンズ１２，１３と開口絞り１４とレンズ１５とで照明視野絞り１６に励起光を導いたが、これらの光学素子（１１〜１５）に代えて、小型の半導体レーザーや発光ダイオードなどの光源を、照明視野絞り１６の開口１６ａの近傍位置に設けても良い。この構成例については、後述する第３実施形態の焦点位置検出装置４０（図６）で説明する。
【００５１】
さらに、光学素子（１１〜１５）に代えて小型の半導体レーザーや発光ダイオードなどの光源を設け、かつ、照明開口絞り１６と受光視野絞り２０とを兼用にした構成例について、後述する第４実施形態の焦点位置検出装置６０（図８）で説明する。
（第２実施形態）
本発明の第２実施形態は、請求項１〜請求項４，請求項７，請求項８，請求項１１に対応する。
【００５２】
第２実施形態の焦点位置検出装置は、図５に示すように、第１実施形態の焦点位置検出装置１０（図１，図２）の受光視野絞り２０に代えて受光視野絞り３０を設け、光電検出器２１に代えて光電検出器３１を設けたものである。受光視野絞り３０，光電検出器３１の各々の配置は、上記した受光視野絞り２０，光電検出器２１と同じである。図５は、図２と同様に、原理説明に必要な部分（標本２５，対物レンズ２６，結像レンズ２７，受光視野絞り３０，光電検出器３１）のみを示した図である。
【００５３】
受光視野絞り３０には、３つの開口３０ａ，３０ｂ，３０ｃが設けられている。開口３０ａ〜３０ｃは何れも細長いスリット形状であり、中央の開口３０ｂが受光系（１９，３０，３１）の光軸上に設けられている。開口３０ａ〜３０ｃの長手方向は、紙面に垂直である。
さらに、中央の開口３０ｂの大きさは、上記の受光視野絞り２０の開口２０ｂと同様、受光視野絞り３０の配置面における蛍光像（標本２５の照明範囲２５ａに対応）と合致する大きさに設定されている。
【００５４】
光電検出器３１には、受光視野絞り３０の開口３０ａ〜３０ｃに対応するように、３つの独立した受光面３１ａ，３１ｂ，３１ｃが設けられている。中央の受光面３１ｂは、上記の光電検出器２１の受光面２１ｂと同様、受光系（１９，３０，３１）の光軸上に位置する。
【００５５】
このため、光電検出器３１の中央の受光面３１ｂには、受光視野絞り３０の中央の開口３０ｂを通過した後の蛍光による像（ボケた蛍光像）が形成される。また、両側の受光面３１ａ，３１ｃには、受光視野絞り３０の両側の開口３０ａ，３１ｃを通過した後の蛍光像が形成される。
そして、光電検出器３１は、中央の受光面３１ｂに形成されるボケた蛍光像に応じて受光面３１ｂに入射する光量を一括で検出する。また同様に、両側の受光面３１ａ，３１ｃの各々に形成される蛍光像に応じて受光面３１ａ，３１ｃに入射する光量も、各々一括で検出する。
【００５６】
なお、光電検出器３１の両側の受光面３１ａ，３１ｃは、請求項の「補助用の受光面」に対応する。光電検出器３１のうち、両側の受光面３１ａ，３１ｃに関わる部分は「方向検出手段」に対応し、中央の受光面３１ｂに関わる部分は「光量検出手段」に対応する。
第２実施形態の焦点位置検出装置では、受光視野絞り３０と光電検出器３１が上記のように構成されているため、次のようにして焦点検出が行われる。
【００５７】
まず、図５（ｂ）に示す合焦状態のとき、標本２５の照明範囲２５ａの中心は対物レンズ２６，結像レンズ２７の光軸２０ａに一致し、標本２５の照明範囲２５ａの蛍光像は、受光視野絞り３０の中央の開口３０ｂと重なる位置に形成される。そして、蛍光像の形成に関わる全ての蛍光が、そのまま開口３０ｂを通過する。このため、光電検出器３１の中央の受光面３１ｂにて検出される光量は、最大となる（図３参照）。
【００５８】
一方、図５（ａ）に示す前ピン状態のとき、標本２５の照明範囲２５ａは、上記の光軸２０ａから外れ、図中左方に位置する。このとき、標本２５の照明範囲２５ａの蛍光像は、受光視野絞り３０の中央の開口３０ｂから外れ、図中右方（例えば右側の開口３０ｃと重なる位置）に形成される。
【００５９】
このため、蛍光像の形成に関わる蛍光は、中央の開口３０ｂを通過することができず、光電検出器３１の中央の受光面３１ｂにて検出される光量は、ほぼ零となる。しかし、この蛍光は、右側の開口３０ｃを通過可能であり、光電検出器３１の右側の受光面３１ｃにて光量が検出される。そして、右側の受光面３１ｃで光量が検出されたことに基づいて、標本２５の位置ずれ方向が前ピン方向であると検出できる。
【００６０】
逆に、図５（ｃ）に示す後ピン状態のとき、標本２５の照明範囲２５ａは、上記の光軸２０ａから外れ、図中右方に位置する。このとき、標本２５の照明範囲２５ａの蛍光像は、受光視野絞り３０の中央の開口３０ｂから外れ、図中左方（例えば左側の開口３０ａと重なる位置）に形成される。
このため、蛍光像の形成に関わる蛍光は、中央の開口２０ｂを通過することができず、光電検出器３１の中央の受光面３１ｂにて検出される光量は、ほぼ零となる。しかし、この蛍光は、左側の開口３０ａを通過可能であり、光電検出器３１の左側の受光面３１ａにて光量が検出される。そして、左側の受光面３１ａで光量が検出されたことに基づいて、標本２５の位置ずれ方向が後ピン方向であると検出できる。
【００６１】
したがって、第２実施形態の焦点位置検出装置では、標本２５をＺ方向に移動させながら、光電検出器３１の両側の受光面３１ａ，３１ｃによって各々検出される光量を監視することにより、標本２５の位置ずれ方向を検出すると共に、光電検出器３１の中央の受光面３１ｂによって検出される光量を監視することにより、焦点検出を行うことができる。そして、光電検出器３１の中央の受光面３１ｂによる検出光量が最大となったところ（図３の位置Ｚｂ）が、標本２５の合焦位置と判断される。
【００６２】
上述したように、第２実施形態の焦点位置検出装置によれば、標本２５の蛍光像の光量変化を監視することにより焦点検出を行うため、標本２５の蛍光観察時のように、標本２５からの光量が微弱であっても、短時間で良好に焦点検出を行うことができる。
（第３実施形態）
本発明の第３実施形態は、請求項１〜請求項４，請求項６，請求項１１〜請求項１３に対応する。
【００６３】
第３実施形態では、図６に示すように、焦点位置検出装置４０が組み込まれた蛍光顕微鏡５０の例を説明する。蛍光顕微鏡５０は、蛍光物質で標識された標本２５の蛍光観察に用いられる顕微鏡であり、上述と同様の観察系（２６〜２８）と、後述する観察照明系（５１〜５８）とで構成されている。
蛍光顕微鏡５０の観察照明系（５１〜５８）は、基本的な構成が、図１に示す焦点位置検出装置１０の照明系（１１〜１８）と同じである。つまり、光軸５０ａに沿って、光源５１と、レンズ５２，５３と、開口絞り５４と、レンズ５５と、照明視野絞り５６と、レンズ５７と、ダイクロイックミラー５８とが順に配置された構成となっている。
【００６４】
また、観察照明系（５１〜５８）は、その光軸５０ａが観察系（２６〜２８）の光軸２０ａに対して略直交する向きで、観察系（２６〜２８）の対物レンズ２６と波長選択フィルタ２８との間に組み込まれる。このとき、観察照明系（５１〜５８）のうち、ダイクロイックミラー５８が光軸２０ａ上に配置される。
観察照明系（５１〜５８）の中で図１の照明系（１１〜１８）と異なる点は、開口絞り５４の開口５４ａの形状および大きさと、照明視野絞り５６の開口５６ａの形状および大きさとである。このため、観察照明系（５１〜５８）に関わる他の説明を省略する。
【００６５】
開口絞り５４の開口５４ａは、径の大きな円形状であり、観察照明系（５１〜５８）の光軸５０ａに中心を揃えて設けられている。また、照明視野絞り５６の開口５６ａも、径の大きな円形状であり、観察照明系（５１〜５８）の光軸５０ａに中心を揃えて設けられている。観察照明系（５１〜５８）は、請求項の「観察照明手段」に対応する。
【００６６】
このように構成された観察照明系（５１〜５８）において、光源５１からの励起光（標本２５の蛍光物質を励起可能な光）は、レンズ５２，５３と、開口絞り５４の開口５４ａと、レンズ５５と、照明視野絞り５６の開口５６ａと、レンズ５７を通過し、ダイクロイックミラー５８で反射して観察系（２６〜２８）に導かれ、対物レンズ２６を介した後、標本２５に達する（ケーラー照明）。
【００６７】
観察照明系（５１〜５８）による標本２５の照明範囲２５ｂは、照明視野絞り５６の開口５６ａと相似形状であり、観察系（２６〜２８）の光軸２０ａを中心とした径の大きな円形状となる。標本２５は、この照明範囲２５ｂ内で励起され、照明範囲２５ｂ内から蛍光を発生させる。
標本２５の蛍光観察時、合焦状態の標本２５から発生した蛍光は、対物レンズ２６と結像レンズ２７の作用によって、標本２５の合焦位置と共役な所定の結像面２９に集光される。このとき、所定の結像面２９には、標本２５の蛍光像が鮮明に形成される。
【００６８】
図示省略したが、所定の結像面２９（または結像面２９と共役な面）には、２次元撮像素子（例えばＣＣＤイメージセンサ）が設置されている。そして、標本２５が合焦状態にあるときには、標本２５の鮮明な蛍光像を２次元撮像素子によって取り込むことができる。
次に、上記構成の蛍光顕微鏡５０に組み込まれた焦点位置検出装置４０について説明する。焦点位置検出装置４０は、標本２５が合焦状態にあるか否かを検出するための装置である。
【００６９】
焦点位置検出装置４０は、照明系（１６，４１，４２）と受光系（２０，２１，４３〜４５）とを有する。さらに、蛍光顕微鏡５０の対物レンズ２６は、焦点位置検出装置４０としての機能も兼用する。このため、焦点位置検出装置４０の構成要素としては、照明系（１６，４１，４２）と受光系（２０，２１，４３〜４５）だけでなく、対物レンズ２６も含まれる。
【００７０】
照明系（１６，４１，４２）は、光軸４０ａに沿って、光源４１と、照明視野絞り１６と、ダイクロイックミラー４２とが順に配置された構成となっている。また、受光系（２０，２１，４３〜４５）は、光軸４０ｂに沿って、反射ミラー４４と、結像レンズ４３と、波長選択フィルタ４５と、受光視野絞り２０と、光電検出器２１とが順に配置された構成となっている。
【００７１】
そして、受光系（２０，２１，４３〜４５）は、その光軸４０ｂが上記した観察系（２６〜２８）の光軸２０ａに対して略直交する向きで、観察系（２６〜２８）の対物レンズ２６と観察照明系（５１〜５８）のダイクロイックミラー５８との間に組み込まれる。このとき、受光系（２０，２１，４３〜４５）のうち、反射ミラー４４が光軸２０ａ上に配置される。
【００７２】
さらに、照明系（１６，４１，４２）は、その光軸４０ａが受光系（２０，２１，４３〜４５）の光軸４０ｂに対して略直交する向きで、受光系（２０，２１，４３〜４５）の結像レンズ４３と波長選択フィルタ４５との間に組み込まれる。このとき、照明系（１６，４１，４２）のうち、ダイクロイックミラー４２が光軸４０ａ上に配置される。
【００７３】
このように構成された照明系（１６，４１，４２）および受光系（２０，２１，４３〜４５）のうち、光源４１は、図１の光源１１，レンズ１２，１３，開口絞り１４，レンズ１５に代えて設けたものである。また、結像レンズ４３は、図１のレンズ１７と結像レンズ２７の機能を兼ね備えたものである。ダイクロイックミラー４２は、前述のダイクロイックミラー１８と同様の機能を有し、波長選択フィルタ４５は、前述の波長選択フィルタ２８と同様の機能を有している。照明視野絞り１６，受光視野絞り２０，光電検出器２１の配置や開口１６ａ，２０ｂの形状などは、基本的に前述の通りである。
【００７４】
つまり、第３実施形態の焦点位置検出装置４０において、図１の焦点位置検出装置１０と異なる特徴的な部分は、光源４１の配置と、反射ミラー４４による照明タイミングの切り換え制御（図７）とである。これらの特徴的な部分について、次に説明する。
光源４１は、小型の半導体レーザーや発光ダイオードなどであり、紫外線や可視光線などの励起光を射出する。この光源４１は、照明視野絞り１６の開口１６ａの近傍位置に、励起光の射出方向を光軸４０ａに対して斜めに向けて設置されている。
【００７５】
このため、光源４１からの励起光は、照明視野絞り１６の開口１６ａを通過した後も（励起光Ｌ２）、光軸４０ａに対して斜めの方向に進行して、ダイクロイックミラー４２に達する。そして、ダイクロイックミラー４２で反射した励起光は、結像レンズ４３を介した後、反射ミラー４４で反射し、対物レンズ２６を介して標本２５に達する。すなわち、標本２５を斜光照明する。
【００７６】
また、標本２５は、スリット形状の照明範囲２５ａの幅方向から斜光照明されたことになる。これは、照明系（１６，４１，４２）において、光源４１からの励起光の射出方向を照明視野絞り１６の開口１６ａの幅方向に傾けたからである。
斜光照明された標本２５は、照明範囲２５ａ内で励起され、照明範囲２５ａ内から蛍光を発生させる。この蛍光は、対物レンズ２６を介した後、反射ミラー４４で反射して、結像レンズ４３に達する。そして、ダイクロイックミラー４２を透過し、波長選択フィルタ４５を透過して、受光視野絞り２０に達する。
【００７７】
この焦点位置検出装置４０でも、対物レンズ２６と受光視野絞り２０との間には、ダイクロイックミラー４２と波長選択フィルタ４５とが配置されているため、標本２５に対する励起光（例えば５０５ｎｍ以下）の反射光を遮断して、標本２５で発生した蛍光（例えば波長５２０ｎｍ〜６００ｎｍの光）のみを光電検出器２１に効率良く導くことができる。
【００７８】
焦点位置検出装置４０では、光源４１から標本２５へ導かれる励起光と、標本２５から光電検出器２１へ導かれる蛍光とが、共通の光学素子（２６，４３）を通過する。このため、照明視野絞り１６の開口１６ａと受光視野絞り２０の開口２０ｂとが同じ大きさの場合に、受光視野絞り２０の配置面における標本２５の蛍光像を開口２０ｂの大きさと合致させることができる。
【００７９】
なお、上記の照明系（１６，４１，４２）と結像レンズ４３と反射ミラー４４と対物レンズ２６とは、請求項の「照明手段」に対応する。対物レンズ２６と結像レンズ４３と反射ミラー４４と波長選択フィルタ４５とダイクロイックミラー４２とは、「像形成手段」に対応する。
第３実施形態の焦点位置検出装置４０における焦点検出の原理は、前述した焦点位置検出装置１０（図２，図３参照）と同じであり、標本２５をＺ方向に移動させながら、光電検出器２１によって検出される光量を監視することにより、焦点検出を行うことができる。そして、光電検出器２１による検出光量が最大となったところ（図３の位置Ｚｂ）が、標本２５の合焦位置と判断される。
【００８０】
このように、第３実施形態の焦点位置検出装置４０でも、標本２５の蛍光像の光量変化を監視することにより焦点検出を行うため、標本２５の蛍光観察時のように、標本２５からの光量が微弱であっても、短時間で良好に焦点検出を行うことができる。
次に、焦点位置検出装置４０の反射ミラー４４による照明タイミングの切り換え制御について、図７のフローチャートを用いて説明する。この切り換え制御は、蛍光顕微鏡５０の全体的な制御を行う不図示の制御装置が実行する。制御装置は、請求項の「切換制御手段」に対応する。なお、焦点検出時に、照明視野絞り１６と受光視野絞り２０の開口１６ａ，２０ｂの幅の２段階調整も行われる。
【００８１】
制御装置は、まず初めに、反射ミラー４４を観察系（２６〜２８）の光軸２０ａ中に配置して（ステップＳ１）、標本２５を斜光照明する（ステップＳ２）。このとき、照明視野絞り１６と受光視野絞り２０の開口１６ａ，２０ｂの幅は、広い状態（図４（ａ））に設定される。
【００８２】
このとき、標本２５のスリット形状の照明範囲２５ａから蛍光が発生し、光電検出器２１の受光面２１ｂには、受光視野絞り２０の開口２０ｂを通過した蛍光による像が形成される。すなわち、光電検出器２１によって蛍光の光量が検出される（ステップＳ３）。
制御装置は、光電検出器２１による検出光量を監視しながら、標本２５をＺ方向に移動させて（ステップＳ４）、光電検出器２１による検出光量が最大になると、そこで標本２５を停止させる（ステップＳ５）。この段階で、図４（ａ）のように広い焦点検出範囲（ΔＺ１）内での粗い焦点検出が終了する。
【００８３】
次に、制御装置は、照明視野絞り１６と受光視野絞り２０の開口１６ａ，２０ｂの幅が充分に小さいか否かを判断し（ステップＳ６）、まだ小さくできる場合には、開口１６ａ，２０ｂの幅を狭める（ステップＳ７）。そして、ステップＳ２〜Ｓ６の処理を繰り返す。
つまり、開口１６ａ，２０ｂの幅を狭い状態（図４（ｂ））に切り換えて、狭い焦点検出範囲（ΔＺ２）内での焦点検出を行う。その結果、光電検出器２１による検出光量が最大になり、標本２５が合焦位置に停止されると（ステップＳ５）、高精度な焦点検出が終了したことになる。
【００８４】
制御装置は、照明視野絞り１６と受光視野絞り２０の開口１６ａ，２０ｂの幅を充分小さくした状態での焦点検出が終了すると、次のステップＳ８に進み、反射ミラー４４を観察系（２６〜２８）の光軸２０ａ外に配置する。その結果、焦点位置検出装置４０による標本２５の斜光照明が終了する。
この状態で、制御装置は、観察照明系（５１〜５８）を用いて標本２５の広い範囲（照明範囲２５ｂ）を照明する（ステップＳ９）。標本２５は合焦状態にあるため、標本２５の照明範囲２５ｂから発生した蛍光は、対物レンズ２６，結像レンズ２７の作用により、標本２５の合焦位置と共役な結像面２９に集光される。このとき、結像面２９には、標本２５の蛍光像が鮮明に形成される。
【００８５】
したがって、制御装置は、結像面２９（または結像面２９と共役な面）に設置された２次元撮像素子（例えばＣＣＤイメージセンサ）によって、標本２５の鮮明な蛍光像を取り込むことができる（ステップＳ１０）。
このように、第３実施形態の蛍光顕微鏡５０では、焦点位置検出装置４０による斜光照明のタイミングと、観察照明系（５１〜５８）による照明のタイミングとを切り換え、標本２５を順に照明するため、標本２５から発生する蛍光の光量が微弱であっても、短時間で良好に焦点検出を行うことができ、標本２５の蛍光観察を精度良く行うことができる。
【００８６】
なお、上記した第３実施形態では、照明視野絞り１６の開口１６ａの近傍に光源４１のみを配置したが、ビームエキスパンダやコリメータレンズを介して光源４１を配置しても良い。
また、上記した第３実施形態では、蛍光顕微鏡の観察照明系と焦点位置検出装置の照明系とを別々に設けると共に、反射ミラー４４によって照明タイミングを切り換える制御の例を説明したが、本発明はこの構成に限定されない。
【００８７】
例えば、蛍光顕微鏡に組み込む焦点位置検出装置の照明系を図１の照明系（１１〜１８）のように構成する場合には、この照明系を観察照明系と兼用させることができ、開口絞り１４と照明視野絞り１６の開口１４ａ，１６ａの位置や形状を調整することにより、照明タイミングを切り換えることができる。
つまり、焦点検出時には図１の開口１４ａ，１６ａのように設定し、蛍光観察時には図６の開口５４ａ，５６ａのように設定すれば良い。開口１４ａ，１６ａの位置や形状を調整する代わりに、開口絞り１４や照明視野絞り１６を交換してもよい。
【００８８】
（第４実施形態）
本発明の第４実施形態は、請求項１〜請求項６，請求項１１〜請求項１３に対応する。
【００８９】
第４実施形態では、図８に示すように、蛍光顕微鏡５０に組み込まれた焦点位置検出装置６０の例を説明する。蛍光顕微鏡５０の構成については第３実施形態（図６）で説明したため、ここでの説明を省略する。なお、図８の蛍光顕微鏡５０で図示した波長選択フィルタ５９は、光源５１からの励起光（例えば波長５０５ｎｍ以下の光）を選択的に透過する特性を持つ。蛍光顕微鏡５０の対物レンズ２６は、焦点位置検出装置６０としての機能も兼用する。
【００９０】
第４実施形態の焦点位置検出装置６０には、対物レンズ２６の他に、反射ミラー４４と、結像レンズ４３と、視野絞り６１と、結像レンズ６２と、ダイクロイックミラー６３と、波長選択フィルタ６４と、光電検出器２１と、光源６５とが設けられている。このうち反射ミラー４４，結像レンズ４３，光電検出器２１の説明は既に行ったため、ここでの説明を省略する。ダイクロイックミラー６３と波長選択フィルタ６４の機能、および光源６５の構成も、上記の光学素子（４２，４５，４１）と同じであり、ここでの説明を省略する。
【００９１】
焦点位置検出装置６０の特徴は、標本２５の合焦位置および結像面２９と共役な面に、視野絞り６１を設けた点にある。視野絞り６１は、図６の照明視野絞り１６と受光視野絞り２０の機能を兼ね備えたものである。つまり、焦点位置検出装置６０は、照明視野絞り１６と受光視野絞り２０とを共通の光学素子（視野絞り６１）にて構成した点を特徴とする。視野絞り６１には、光軸４０ｂ上に細長いスリット形状の開口６１ａが設けられている。開口６１ａの長手方向は、紙面に垂直である。
【００９２】
また、このような視野絞り６１の配置を実現するために、焦点位置検出装置６０の照明手段（６５，６３〜６１，４３，４４，２６）と像形成手段（２６，４４，４３，６２〜６４）とは、標本２５の合焦位置および結像面２９と共役な面から標本２５までの間に配置された光学素子（４３，４４，２６）が共通となっている。
【００９３】
視野絞り６１と光電検出器２１との間で順に配置された光学素子（６２〜６４）は、光源６５からの励起光を光軸４０ｂに対して斜めの方向に進行させながら視野絞り６１に導く（励起光Ｌ３参照）と共に、視野絞り６１の開口６１ａを通過した焦点検出時の蛍光を効率良く光電検出器２１に導くためのものである。
焦点位置検出装置６０において、光源６５は、励起光の射出方向が光軸４０ａに対して平行（つまり光軸４０ｂに対して垂直）となるように設置されている。また、光源６５は、偏心状態で設置されている。光源６５の偏心量（つまり励起光と光軸４０ａとの間隔）を“α”とする。
【００９４】
このため、ダイクロイックミラー６３を光軸４０ｂに対して４５度に傾け、結像レンズ６２と視野絞り６１との間隔を結像レンズ６２の焦点距離と等しくすることで、視野絞り６１に入射する励起光Ｌ３を光軸４０ｂに対して斜めに進行させることができる。
そして、視野絞り６１の開口６１ａを通過した後の励起光も、光軸４０ｂに対して斜めの方向に進行し、結像レンズ４３を介した後、反射ミラー４４で反射して、対物レンズ２６を介して標本２５に達する。すなわち、標本２５を斜光照明する。
【００９５】
また、標本２５は、スリット形状の照明範囲２５ａの幅方向から斜光照明されたことになる。これは、光源６５からダイクロイックミラー６３と結像レンズ６２を介して視野絞り６１に入射する励起光Ｌ３の進行方向を、視野絞り６１の開口６１ａの幅方向に傾けたからである。この場合、光源６５の偏心方向は、視野絞り６１の開口６１ａの幅方向と等価である。励起光Ｌ３の光軸４０ｂに対する傾斜角度と、標本２５を斜光照明する励起光の光軸２０ａに対する傾斜角度とは、光源６５の偏心量αに応じて調整可能である。
【００９６】
斜光照明された標本２５は、照明範囲２５ａ内から蛍光を発生させる。この蛍光は、対物レンズ２６を介した後、反射ミラー４４で反射し、結像レンズ４３を介して視野絞り６１に達する。視野絞り６１の配置面には標本２５の照明範囲２５ａの蛍光像が形成される。蛍光像の大きさは視野絞り６１の開口６１ａの大きさに合致している。そして、視野絞り６１の開口６１ａを通過した蛍光は、結像レンズ６２とダイクロイックミラー６３と波長選択フィルタ６４を透過した後、光電変換器２１に入射する。
【００９７】
第４実施形態の焦点位置検出装置６０における焦点位置検出の原理も、前述した焦点位置検出装置１０，４０と同様である（図２，図３参照）。標本２５をＺ方向に移動させると、標本２５の照明範囲２５ａの蛍光像がその幅方向（つまり視野絞り６１の開口６１ａの幅方向，紙面に対して上下方向）に移動する。そして、蛍光像のうち開口６１ａとの重なり部分の面積が変化する。後段の光電変換器２１による検出光量は、重なり部分の面積に比例する。
【００９８】
したがって、標本２５をＺ方向に移動させながら、光電検出器２１によって検出される光量を監視することにより、焦点検出を行うことができる。そして、光電検出器２１による検出光量が最大となったところ（図３の位置Ｚｂ）が、標本２５の合焦位置と判断される。
このように、第４実施形態の焦点位置検出装置６０でも、標本２５の蛍光像の光量変化を監視することにより焦点検出を行うため、標本２５の蛍光観察時のように、標本２５からの光量が微弱であっても、短時間で良好に焦点検出を行うことができる。
【００９９】
また、上述した図７のフローチャート（Ｓ１〜Ｓ１０）にしたがって反射ミラー４４による照明タイミングの切り替え制御を行い、焦点位置検出装置６０による斜光照明のタイミングと、観察照明系（５１〜５８）による照明のタイミングとを切り替え、標本２５を順に照明することにより、標本２５の蛍光観察を精度良く行うことができる。
【０１００】
さらに、焦点検出時（図７のＳ１〜Ｓ７）に、視野絞り６１の開口６１ａの幅を２段階調整することで、図４（ａ）のように広い焦点検出範囲（ΔＺ１）内での粗い検出と、図４（ｂ）のように狭い焦点検出範囲（ΔＺ２）内での高精度な検出とを順に実行することができる。
また、第４実施形態の焦点位置検出装置６０では、視野絞り６１が照明視野絞りと受光視野絞りの機能を兼ね備えるため、照明視野絞りと受光視野絞りの中心を一致させる調整作業が不要となる。その結果、装置の調整を簡略化できると共に、合焦精度の高い焦点検出を行うことができる。さらに、反射ミラー４４が繰り返し移動によって位置ずれを起こした場合でも調整上の影響がない。
【０１０１】
なお、上記した第２〜第４実施形態では、焦点検出の範囲や精度を変える際に、照明視野絞り１６，受光視野絞り２０の開口１６ａ，２０ｂの幅、または視野絞り６１の開口６１ａの幅を調整したが、調整する代わりに、照明視野絞り１６，受光視野絞り２０または視野絞り６１を交換してもよい。
また、上記した第１，第３実施形態では、照明視野絞り１６，受光視野絞り２０の開口１６ａ，２０ｂをスリット形状としたが、図９（ａ），（ｂ）に示すように、小さい円形状（スポット形状）の開口１６ｃ，２０ｃを照明視野絞り１６，受光視野絞り２０に設けても良い。この場合、標本２５の照明範囲も小さい円形状となる。その結果、標本２５の合焦位置を絞り込むことができ、観察対象の位置を特定することができる。同様に、第２実施形態の受光視野絞り３０の開口３０ｂや、第４実施形態の視野絞り６１の開口６１ａをスポット形状としても良い。
【０１０２】
さらに、上記した第１〜第３実施形態では、受光視野絞り２０，３０の配置面における蛍光像（標本２５の照明範囲に対応）と開口２０ｂ，３０ｂの大きさを合致させる例を説明したが、蛍光像と開口２０ｂ，３０ｂの大きさが異なる場合にも本発明を適用できる。同様に、第４実施形態の視野絞り６１の開口６１ａと蛍光像の大きさが異なる場合にも本発明を適用できる。
【０１０３】
また、上記した第１，第３実施形態では、焦点位置検出装置に受光視野絞り２０を設けたが、観察系（２６〜２８）の対物レンズ２６が固定されている場合には、受光視野絞り２０を省略できる。
【０１０４】
さらに、上記した実施形態では、受光面に入射する蛍光の光量を一括で検出する光電検出器の例を説明したが、本発明はこれに限定されない。例えば、蛍光の光量を分割して検出し、後段の信号処理系で総和を取る構成が考えられる。
また、上記した実施形態では、開口絞り１４（図１）を対物レンズ２６の瞳面に共役な位置に設けたが、この瞳面から外れた位置に開口絞りを設けた構成にも本発明を適用することができ、標本を斜光照明できる。
【０１０５】
さらに、第３実施形態の受光視野絞り２０（図６）に代えて第２実施形態の受光視野絞り３０（図５）を設けることもできる。第４実施形態の視野絞り６１（図８）に代えて第２実施形態の受光視野絞り３０（図５）と同様の視野絞りを設けることもできる。この場合、光電検出器２１（図６，図８）は光電検出器３１（図５）に置き換えることになる。
【０１０６】
また、上記した第１〜第４実施形態では、標本２５をＺ方向に移動させながら光電検出器２１，３１による検出光量を監視し（図３）、検出光量が最大となったところ（位置Ｚｂ）を標本２５の合焦位置と判断する例を説明したが、本発明はこれに限定されない。
既に説明したように、標本２５をＺ方向に移動させると、その移動量に比例して標本２５の照明範囲２５ａの蛍光像と開口２０ｂ，３０ｂ，６１ａ（スリット形状）との重なり部分の面積が変化し、この面積に比例して光電検出器２１，３１による検出光量が変化する。つまり検出光量は、標本２５の合焦位置より前ピン側と後ピン側との各々で、標本２５の移動量に比例して一次関数的に増減する。最大の検出光量は、合焦位置のときである。
【０１０７】
このため、合焦位置より前ピン側の検出光量と標本２５のＺ位置との関係を直線で近似し、同様に、後ピン側の検出光量とＺ位置との関係を直線で近似し、得られた２直線の交点を求めることにより、標本２５の合焦位置を算出することができる。この例の具体的な説明を次の第５実施形態で行う。
【０１０８】
（第５実施形態）
本発明の第５実施形態は、請求項９，請求項１０に対応する。
第５実施形態の焦点位置検出装置は、図１，図６，図８の光電検出器２１の出力または図５の光電検出器３１のうち中央の受光面３１ｂの出力に接続された制御装置を有し、この制御装置で標本２５の合焦位置を算出するように構成されている。合焦位置の算出手順は、図１０のフローチャートに示す通りである。算出手順の説明に当たり、図１１も参照する。図１１の横軸は、標本２５と対物レンズ２６との光軸方向の距離（Ｚ位置）を表す。縦軸は、例えば光電検出器２１によって検出される光量を表す。
【０１０９】
制御装置は、図１０のステップＳ１１において、標本２５をＺ方向に移動させながら、図１１に示す一定の間隔δ１ごとに、例えば光電検出器２１による検出光量を取り込む（測定点Ａ１〜Ａ１５）。このような取り込みは、標本２５の合焦位置を含む所定の広い範囲δ２内で行われる。上記の間隔δ１は、広い範囲δ２内に測定点Ａが所定数（例えば１５個）含まれるように粗く設定されている。
【０１１０】
次いで、制御装置は、ステップＳ１１で取り込んだ離散的な測定点Ａ１〜Ａ１５のうち最大光量の測定点Ａ８を選択する（ステップＳ１２）。本実施形態では、粗い間隔δ１ごとに測定点Ａを取り込むため、最大光量の測定点Ａ８が標本２５の合焦位置とは限らない。しかし、標本２５の合焦位置が、最大光量の測定点Ａ８に隣接する２つの測定点Ａ７，Ａ９の間にあることは分かる。
【０１１１】
制御装置は、標本２５の合焦位置を算出するために、次のステップＳ１３〜Ｓ１６を実行する。まずステップＳ１３では、全ての測定点Ａ１〜Ａ１５から最大光量の測定点Ａ８を除外し、残りを前ピン側（Ａ１〜Ａ７）と後ピン側（Ａ９〜Ａ１５）とに分類する。この分類の理由は、前ピン側と後ピン側との各々で、検出光量と標本２５のＺ位置との関係を直線で近似するためである。最大光量の測定点Ａ８を除外する理由は、この時点での所属が不明だからである。
【０１１２】
次のステップＳ１４では、前ピン側の測定点Ａ１〜Ａ７のうち、直線近似に有効なもの（Ａ３〜Ａ７）を選択する。この選択は、最大光量の測定点Ａ８に対応する位置Ｚ８を基準にして、位置Ｚ８から前ピン側に一定の間隔δ３だけ離れた位置Ｚ（Ｌ）を求め、測定点Ａ１〜Ａ７に対応する位置Ｚ１〜Ｚ７の各々が位置Ｚ（Ｌ）から位置Ｚ８までの範囲に含まれるか否かにより行われる。もちろん、その範囲（Ｚ（Ｌ）〜Ｚ８）に含まれる測定点Ａ３〜Ａ７が有効なものとして選択される。
【０１１３】
間隔δ３は、受光視野絞り２０のスリット形状の開口２０ｂ（または受光視野絞り３０の開口３０ｂまたは視野絞り６１の開口６１ａ）の幅Ｗ、対物レンズ２６の倍率Ｂ、および標本２５を斜光照明する励起光の光軸２０ａに対する傾斜角度θを変数とする関数Ｆ（例えば次式（１））によって表すことができる。なお、幅Ｗは、例えば受光視野絞り２０の配置面における“標本２５の照明範囲２５ａの蛍光像”の幅にも対応している。
【０１１４】
δ３＝Ｆ（Ｗ，Ｂ，θ）＝０．８×Ｗ／（Ｂ・ｔａｎθ） ……（１）
ステップＳ１４における有効な測定点（Ａ３〜Ａ７）の選択に当たり、間隔δ３は、式（１）に基づいて予め計算した結果を変数Ｗ，Ｂ，θに対応づけて制御装置のメモリに記憶させておき、必要に応じて読み出すようにすればよい。また、必要に応じてその都度計算しても構わない。
【０１１５】
同様に、ステップＳ１４では、後ピン側の測定点Ａ９〜Ａ１５のうち、直線近似に有効なもの（Ａ９〜Ａ１３）を選択する。この選択は、最大光量の測定点Ａ８に対応する位置Ｚ８を基準にして、位置Ｚ８から後ピン側に一定の間隔δ３だけ離れた位置Ｚ（Ｕ）を求め、測定点Ａ９〜Ａ１５に対応する位置Ｚ９〜Ｚ１５の各々が位置Ｚ８から位置Ｚ（Ｕ）までの範囲に含まれるか否かにより行われる。もちろん、その範囲（Ｚ８〜Ｚ（Ｕ））に含まれる測定点Ａ９〜Ａ１３が有効なものとして選択される。
【０１１６】
そして次のステップＳ１５において、制御装置は、前ピン側の有効な測定点Ａ３〜Ａ７の検出光量と標本２５のＺ位置との関係を直線で近似する。この場合、周知の最小自乗法を用いることが好ましい。つまり、各々の測定点Ａ３〜Ａ７の検出光量（Ｋ）とＺ位置（Ｚ）と誤差（Ｇ）を一次式（Ｋ＝ａＺ＋ｂ＋Ｇ）で表し、誤差Ｇの自乗和の平均が最小となるように係数ａ，ｂを求めればよい。前ピン側の測定点Ａ３〜Ａ７を近似する直線は、次の式（２）で表される。
【０１１７】
Ｋ＝ａＺ＋ｂ ……（２）
同様に、制御装置は、後ピン側の有効な測定点Ａ９〜Ａ１３の検出光量と標本２５のＺ位置との関係を直線で近似する。つまり、各々の測定点Ａ９〜Ａ１３の検出光量（Ｋ）とＺ位置（Ｚ）と誤差（Ｇ）を一次式（Ｋ＝ｃＺ＋ｄ＋Ｇ）で表し、誤差Ｇの自乗和の平均が最小となるように係数ｃ，ｄを求める。後ピン側の測定点Ａ９〜Ａ１３を近似する直線は、次の式（３）で表される。
【０１１８】
Ｋ＝ｃＺ＋ｄ ……（３）
このようにして２つの直線（式（２），（３））が得られると、制御装置は、最後のステップＳ１６において、２つの直線の交点Ｐ（Ｋｆ，Ｚｆ）を求める。そして、交点Ｐ（Ｋｆ，Ｚｆ）の横軸の値“Ｚｆ”を標本２５の合焦位置として決定する。
第５実施形態の焦点位置検出装置によれば、標本２５から発生する蛍光がノイズに埋もれるような微弱な光量で、光電検出器２１，３１による検出光量の最大値を正確に見つけることが困難な場合であっても、最大検出光量の前後の測定点の情報を利用することにより、短時間で精度良く合焦位置を求めることができる。
【０１１９】
また、微弱な蛍光を少しでも多く光電検出器２１，３１に導くために、受光視野絞り２０の開口２０ｂ（または受光視野絞り３０の開口３０ｂまたは視野絞り６１の開口６１ａ）の幅Ｗを広げると、検出光量と標本２５のＺ位置との関係がブロードになるため最大検出光量を正確に見つけ難いが、この場合でも第５実施形態によれば、短時間で精度良く合焦位置を求めることができる。
【０１２０】
さらに、上記した第５実施形態では、式（１）に基づいて計算した適切な間隔δ３を利用し、直線近似に有効な測定点Ａ３〜Ａ７，Ａ９〜Ａ１３を選択したため、確実に精度良く合焦位置を求めることができる。また、直線近似により簡単に合焦位置を算出することができる。
なお、上記した第５実施形態では、図１０のステップＳ１５で５つの測定点Ａ３〜Ａ７と測定点Ａ９〜Ａ１３をそれぞれ直線近似したが、直線近似の際の測定点の数は３点〜１０点（好ましくは４点〜６点）あればよい。
【０１２１】
また、上記した第５実施形態では、受光視野絞り２０の開口２０ｂ（または受光視野絞り３０の開口３０ｂまたは視野絞り６１の開口６１ａ）および照明範囲２５ａの蛍光像がスリット形状である例を説明したが、円形状の場合にも本発明を適用できる。この場合は、上記した一次式（例えばＫ＝ａＺ＋ｂ＋Ｇ）での直線近似に代えて、次の式（４）で表される関数を用いて近似すればよい。
【０１２２】
Ｋ＝ｐ［πｒ２−２Ｘ√（ｒ２−Ｘ２）−２ｒ２ｓｉｎ−１（Ｘ／ｒ）］＋ｑ …（４）
ただし、Ｘ＝（Ｚ／２）・ｔａｎθ ， ｒ＝Ｒ／Ｂ
式（４）のｐ，ｑは係数、Ｒは円形状の開口の半径、Ｂは対物レンズ２６の倍率、θは標本２５に対する斜光照明の角度である。半径Ｒは、例えば受光視野絞り２０の配置面における“標本２５の照明範囲２５ａの蛍光像”の半径にも対応している。Ｚは、標本２５の合焦位置からの距離（０≦Ｚ≦２Ｒ／（Ｂ・ｔａｎθ））である。
【０１２３】
さらに、式（４）を用いた近似に有効な測定点を選択する際の間隔δ３としては、上記した式（１）に代えて、次の式（５）で表される関数Ｇの間隔δ３を用いることが好ましい。
δ３＝Ｇ（Ｒ，Ｂ，θ）＝０．８×２Ｒ／（Ｂ・ｔａｎθ） …（５）
【０１２４】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、物体からの光量が少なくても良好に焦点検出を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】第１実施形態の焦点位置検出装置１０の全体構成図である。
【図２】焦点位置検出装置１０における焦点検出の原理を説明する図である。
【図３】焦点位置検出装置１０における焦点検出の原理を説明する図である。
【図４】焦点検出の範囲と精度を調整する場合の原理を説明する図である。
【図５】第２実施形態の焦点位置検出装置の主要構成部分を示す図である。
【図６】第３実施形態の蛍光顕微鏡５０および焦点位置検出装置４０の全体構成を示す図である。
【図７】蛍光顕微鏡５０における照明タイミングの切り換え制御に関するフローチャートである。
【図８】第４実施形態の焦点位置検出装置６０の全体構成を示す図である。
【図９】照明視野絞り１６と受光視野絞り２０の別の構成を示す図である。
【図１０】第５実施形態の焦点位置検出装置における合焦位置の算出手順を示すフローチャートである。
【図１１】第５実施形態の焦点位置検出装置において合焦位置を算出する手順の一例を説明する図である。
【符号の説明】
１０，４０，６０ 焦点位置検出装置
１１，４１，６５ 光源
１２，１３，１５，１７ レンズ
１６ 照明視野絞り
１８，４２，６３ ダイクロイックミラー
１９ ハーフミラー
２０，３０ 受光視野絞り
２１，３１ 光電検出器
２５ 標本
２６ 対物レンズ
２７，４３，６２ 結像レンズ
２８，４５，６４ 波長選択フィルタ
２９ 結像面
４４ 反射ミラー
６１ 視野絞り
Claims (13)
- 物体を斜光照明する照明手段と、
前記照明手段により斜光照明された前記物体からの光を集光して、前記物体の像を形成する像形成手段と、
前記物体の前記像形成手段による合焦位置と共役な面の後方に配された受光面を有し、前記像形成手段により前記受光面に形成される前記像に応じて前記受光面に入射する光量を検出する光量検出手段とを備えた
ことを特徴とする焦点位置検出装置。 - 請求項１に記載の焦点位置検出装置において、
前記光量検出手段で検出した光量に基づいて焦点位置を検出する焦点位置検出手段をさらに備え、
前記像形成手段は、光軸方向に移動する移動手段を有し、
前記光量検出手段は、前記像形成手段を光軸方向に移動して複数の位置で光量を検出し、
前記焦点位置検出手段は、前記複数の位置で検出した光量のうち最大の光量を検出した位置を焦点位置とする
ことを特徴とする焦点位置検出装置。 - 請求項１または請求項２に記載の焦点位置検出装置において、
前記合焦位置と共役な面には、受光視野絞りが配置され、
前記光量検出手段は、前記受光視野絞りを介して前記受光面に形成される前記像に応じて、前記光量を検出する
ことを特徴とする焦点位置検出装置。 - 請求項３に記載の焦点位置検出装置において、
前記照明手段は、前記物体の照明範囲を規定する照明視野絞りを有し、
前記照明視野絞りと前記受光視野絞りとは、相似形状である
ことを特徴とする焦点位置検出装置。 - 請求項４に記載の焦点位置検出装置において、
前記照明手段と前記像形成手段とは、前記合焦位置と共役な面から前記物体までの間に配置された光学素子が共通であり、
前記照明視野絞りは、前記受光視野絞りとしても機能する
ことを特徴とする焦点位置検出装置。 - 請求項４または請求項５に記載の焦点位置検出装置において、
前記照明視野絞りおよび前記受光視野絞りの大きさを調整する調整手段をさらに備えた
ことを特徴とする焦点位置検出装置。 - 請求項１から請求項６の何れか１項に記載した焦点位置検出装置において、
前記合焦位置と共役な面の後方に配された補助用の受光面を有し、該補助用の受光面に入射する光量に応じて前記物体の位置ずれ方向を検出する方向検出手段をさらに備えた
ことを特徴とする焦点位置検出装置。 - 請求項１から請求項７の何れか１項に記載した焦点位置検出装置において、
前記照明手段は、無限遠系の対物レンズを利用して前記物体を斜光照明する手段であり、前記対物レンズの瞳面と共役な開口絞りを有する
ことを特徴とする焦点位置検出装置。 - 請求項３から請求項８に記載の焦点位置検出装置において、
前記受光視野絞りの形状と該受光視野絞りの配置面に形成される前記像の形状とに応じた関数を用いて、前記光量検出手段による検出光量と前記物体の位置との関係を近似することにより、前記合焦位置を算出する算出手段をさらに備えた
ことを特徴とする焦点位置検出装置。 - 請求項９に記載の焦点位置検出装置において、
前記算出手段は、前記合焦位置の前後の各々において前記検出光量と前記物体の位置との関係を直線で近似し、得られた２つの直線の交点に基づいて前記合焦位置を算出する
ことを特徴とする焦点位置検出装置。 - 請求項１から請求項１０の何れか１項に記載した焦点位置検出装置において、
前記照明手段は、前記物体に含まれる蛍光物質を励起可能な波長域の光で、前記物体を斜光照明する手段であり、
前記像形成手段は、前記物体からの蛍光を集光して、前記物体の蛍光像を形成する手段であり、
前記光量検出手段は、前記受光面に形成される前記蛍光像に応じて前記受光面に入射する光量を検出する
ことを特徴とする焦点位置検出装置。 - 蛍光物質で標識された物体の蛍光観察に用いられる蛍光顕微鏡において、
無限遠系の対物レンズと、
請求項１１に記載の焦点位置検出装置とを備え、
前記照明手段は、前記対物レンズを利用して前記物体を斜光照明し、
前記像形成手段は、前記対物レンズを利用して前記物体の蛍光像を形成する
ことを特徴とする蛍光顕微鏡。 - 請求項１２に記載の蛍光顕微鏡において、
前記物体の蛍光観察時に、前記蛍光物質を励起可能な波長の光で、前記対物レンズを利用して前記物体を照明する観察照明手段と、
前記焦点位置検出装置の前記照明手段による照明タイミングと前記観察照明手段による照明タイミングとを切り換える切換制御手段とを備えた
ことを特徴とする蛍光顕微鏡。
Priority Applications (1)
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| JP2003077838A JP2004004634A (ja) | 2002-04-02 | 2003-03-20 | 焦点位置検出装置およびそれを備えた蛍光顕微鏡 |
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