WO2021019597A1 - 核酸分析装置及び方法 - Google Patents

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WO2021019597A1
WO2021019597A1 PCT/JP2019/029409 JP2019029409W WO2021019597A1 WO 2021019597 A1 WO2021019597 A1 WO 2021019597A1 JP 2019029409 W JP2019029409 W JP 2019029409W WO 2021019597 A1 WO2021019597 A1 WO 2021019597A1
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WO
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nucleic acid
dimensional sensor
fine pattern
optical path
light
Prior art date
Application number
PCT/JP2019/029409
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
曽根原　剛志
裕美 日下
Original Assignee
株式会社日立ハイテク
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid analyzer and method, and particularly relates to a cluster-type nucleic acid sequencing technique for analyzing a DNA sample based on a chemical reaction between a reagent and a DNA sample and a microscopic image of emitted fluorescence.
  • a sample DNA fragment is fixed on a substrate so that each DNA molecule is separated from each other at an appropriate distance, and each DNA molecule is composed of a large number of DNA molecules having the same sequence by an amplification reaction. Generate a cluster.
  • the extension reaction of DNA having a sequence complementary to the generated DNA cluster is repeated on the substrate.
  • the elongated DNA is modified with four types of phosphors having different emission bands so that the sequence can be seen.
  • the substrate is irradiated with excitation light for each elongation reaction, and an image of fluorescence emitted from the elongated complementary DNA is photographed by a camera equipped with an imaging sensor such as a CCD sensor or a C-MOS sensor.
  • the type of phosphor is determined based on the color of the image, and the sequence of the sample DNA is determined.
  • the imaging optical system in the cluster-type nucleic acid analyzer is generally a magnifying system, which constitutes a kind of microscope.
  • These microscopes are fluorescence microscopes incorporating a dichroic mirror and a filter in order to distinguish four types of phosphors by fluorescent color, and generally from an objective lens and an imaging lens in order to avoid the occurrence of aberrations due to these optical elements. It is a fluorescence microscope with substantially infinity correction.
  • an objective lens having a relatively high NA of 0.45 or more is used in order to detect weak fluorescence.
  • the depth of focus of a high NA objective lens is at the submicron level. Therefore, in order to match (focus) the in-focus position (the conjugate surface of the imaging sensor surface with respect to the lens system consisting of the objective lens and the imaging lens) and the DNA fixing surface of the substrate at submicron, 0.1 micron or that.
  • a Z stage having the following resolution is provided, and the objective lens or the substrate is moved up and down with high resolution.
  • the most basic method of focusing is to move the objective lens to a position that is surely below (above) the in-focus position even if mechanical errors are taken into consideration, and then take sufficiently fine steps while imaging the sample. Move up (down) with to find the position where the contrast is maximized. Such an operation is called a through scan.
  • Patent Document 1 is a related prior art.
  • a light flux other than the excitation light is obliquely incident on the target surface, and the deviation (defocus) between the target surface and the focus position is detected based on the amount of the light reflected by the target surface of the light flux.
  • a fluorescence microscope is described. In this method, a signal proportional to the defocus is obtained in real time, and an autofocus operation based on the signal is possible.
  • a light receiving element other than the image pickup element for obtaining a fluorescent image is provided in order to detect defocus.
  • a light receiving element dedicated to autofocus is added, which not only increases the cost, but also adds a light receiving optical system for the light receiving element, which increases the labor of assembly and adjustment, and the entire device. The size also increases.
  • An object of the present invention is to solve the above-mentioned problems and to provide a nucleic acid analyzer and a method using a fluorescence microscope with autofocus, which has a low cost and a simple structure and high accuracy.
  • At least one or two of a first light source that emits excitation light, an objective lens, and a sample substrate on which DNA that absorbs excitation light and emits fluorescence is fixed.
  • DNA A control unit that generates an image based on the fluorescence emitted by the light beam and an image based on the radiation of a fine pattern emitted by the illumination of the second light source, and the conjugate position of the two-dimensional sensor in the first optical path and the second
  • a nucleic acid analyzer having a structure in which the center of gravity of the conjugate position of the pattern film of the fine pattern in the optical path of the above is matched.
  • At least one is a first light source that emits excitation light, an objective lens, and a sample substrate on which DNA that absorbs excitation light and emits fluorescence is fixed.
  • Two-dimensional sensor at least one imaging lens, at least one fine pattern, a second light source that illuminates the fine pattern, a collimating lens, and the light emitted from the sample substrate and collected by the objective lens.
  • Nucleic acid analysis in a nucleic acid analyzer including a beam splitter that branches the light path to be traced into a first optical path through an imaging lens to a two-dimensional sensor and a second optical path through a collimating lens to a fine pattern.
  • the center of gravity of the conjugate position of the two-dimensional sensor in the first optical path and the conjugate position of the pattern film of the fine pattern in the second optical path are matched, and the DNA is emitted using the output of the two-dimensional sensor.
  • a nucleic acid analysis method for producing an image based on fluorescence and an image based on a fine pattern of emitted light by illumination of a second light source.
  • the present invention it is possible to construct a highly accurate fluorescence microscope with autofocus with a low cost and a simple configuration, and it is possible to provide a nucleic acid analyzer and a method with high analysis accuracy at a low cost.
  • FIG. Top view of an example of a filter wheel according to the first embodiment.
  • FIG. The enlarged view of the fine pattern film which concerns on Example 2.
  • FIG. The figure which shows an example of the focus error signal which concerns on Example 2.
  • FIG. The figure which shows one structural example of the nucleic acid analyzer which concerns on Example 3.
  • FIG. An enlarged view of the filter cube slide mechanism according to the third embodiment.
  • FIG. which shows an example of the pixel arrangement of the color sensor which concerns on Example 4.
  • FIG. The figure which shows an example of the spectral sensitivity curve of each pixel which concerns on Example 4.
  • FIG. The figure which shows an example of the vector of the luminance g of G pixel and the luminance r of R pixel which concerns on Example 4.
  • FIG. The figure which shows an example of the vector of the luminance g of G pixel and
  • the substrate on which the DNA is fixed is generally much larger than the field of view of the microscope. Therefore, the substrate is moved on the XY stage for each elongation reaction cycle to image the entire substrate.
  • the area of the substrate that is imaged in one field of view is called a panel. Since the substrate is not perfectly perpendicular to the optical axis, the Z coordinate to focus on will vary from panel to panel. Theoretically, if a through scan is performed on each panel in the first reaction cycle and the Z coordinate to be focused is stored, and the objective lens is moved to the Z coordinate stored in each panel in the subsequent reaction cycle, the through scan is performed. No scanning required.
  • the nucleic acid analyzer carries out a DNA elongation reaction, the process of raising and lowering the temperature of the substrate by 40 degrees or more in about one minute is repeated. As a result, the temperature of the members around the substrate including the support of the objective lens is not stable. Due to the thermal expansion of these members, no matter how high the resolution and accuracy of the Z stage, open-loop control based only on the number of pulses driving the Z stage reduces the distance between the objective lens and the substrate at the submicron level. It is impossible to reproduce. On the other hand, it is not practical to perform a through scan on each panel in each cycle because it takes too much time and long-time exposure in taking a fluorescent image involves damage to the sample.
  • nucleic acid analyzers it is important for nucleic acid analyzers to provide a fluorescence microscope with an autofocus mechanism that detects and focuses on the deviation between the DNA fixed surface (called the target surface) and the in-focus position with high accuracy with a low cost and simple configuration. It becomes an issue.
  • a first light source that emits excitation light, an objective lens, a sample substrate on which a DNA that absorbs excitation light and emits fluorescence is fixed, at least one two-dimensional sensor, and at least one connection.
  • An image lens, a fine pattern, a second light source that illuminates the fine pattern, a collimating lens, and an optical path that is traced by light emitted from a sample substrate and collected by an objective lens are detected by a two-dimensional sensor via an imaging lens.
  • a beam splitter that branches into a first optical path leading to and a second optical path leading to a fine pattern via a collimating lens, an image based on fluorescence emitted by DNA using the output of a two-dimensional sensor, and a second It is equipped with a control unit that generates an image based on the emitted light of a fine pattern by the illumination of the light source of the light source, and the conjugate position of the two-dimensional sensor in the first optical path and the conjugate position of the pattern film of the fine pattern in the second optical path.
  • This is an example of a nucleic acid analyzer having a structure in which the centers of gravity of the above are matched and a method thereof.
  • the center of gravity of the conjugate position of the pattern film of the fine pattern is the conjugate position of the pattern film of one fine pattern itself.
  • FIG. 1 is a diagram showing a configuration example of the nucleic acid analyzer of Example 1.
  • the excitation light emitted from the excitation light source 1 is incident on the filter cube 2a.
  • the light incident on the filter cube 2a passes through the excitation filter 3a, is reflected by the dichroic mirror 4a, is focused by the objective lens 8, and illuminates the sample substrate 9 on which the DNA is fixed.
  • the objective lens 8 is attached to a high-resolution Z stage 10 driven by a stepping motor, and the amount of movement of the Z stage 10 per pulse is 50 nm.
  • FIG. 1 shows the state when the filter cube 2a is located on the objective lens 8.
  • the nucleic acid analyzer since the nucleic acid analyzer has to excite and detect four types of phosphors, it is actually a rotary table.
  • Four filter cubes 2a, 2b, 2c, and 2d are mounted on the 6 to form a filter wheel.
  • FIG. 2 is a top view of the filter wheel on which the filter cubes 2a, 2b, 2c, and 2d are mounted.
  • the filter wheel shown in the figure can rotate the rotary table 6 by the motor 7 to switch the filter cubes 2a, 2b, 2c, and 2d on the objective lens.
  • adenine is labeled with FAM
  • guanine is labeled with Cy3
  • cytosine is labeled with Texas Red (TXR)
  • thymine is labeled with Cy5.
  • the filter cubes 2a, 2b, 2c, and 2d correspond to the excitation / detection of FAM, Cy3, TXR, and Cy5, respectively.
  • the dichroic mirror 4i reflects the light in the excitation wavelength band and transmits the light in the fluorescence wavelength band, and the fluorescence filter 5i transmits the light in the fluorescence wavelength band. Fluorescent images are taken for all four filter cubes in one panel.
  • the fluorescence emitted from the DNA on the sample substrate 9 is collected by the objective lens 8, passes through the filter cube, and then split into transmitted light and reflected light by the beam splitter 11.
  • the transmitted light is focused on the two-dimensional sensor 13 via the imaging lens 12.
  • the optical path from the sample substrate 9 to the two-dimensional sensor 13 is called the first optical path, and the optical path from the sample substrate 9 to the fine pattern film 15 forming the fine pattern is called the second optical path.
  • the output signal of the two-dimensional sensor 13 is sent to the controller 20, which is the control unit of the nucleic acid analyzer.
  • the controller 20 can be realized by executing a functional program in a normal central processing unit (CPU).
  • the output signal of the two-dimensional sensor 13 is input to the controller 20, and an image based on the fluorescence emitted by the DNA is generated by executing the image generation program.
  • the reflected light is collected on the fine pattern film 15 via the collimating lens 14 on the second optical path.
  • the fine pattern film 15 constituting the fine pattern is formed of, for example, 100 to 200 fine lines having a pitch of 10 ⁇ m to 100 ⁇ m.
  • the synchrotron radiation from the fine pattern film 15 induced by illuminating the fine pattern film 15 with the second light source 16 is substantially collimated by the collimating lens 14.
  • This substantially collimated luminous flux is reflected by the beam splitter 11 and follows the same optical path as the light emitted from the sample substrate 9 and transmitted through the filter cube in the opposite direction, and is transmitted through the objective lens 8.
  • the sample substrate 9 After that, it is reflected by the sample substrate 9 and follows the first optical path and is focused on the two-dimensional sensor 13 in the same manner as the fluorescence emitted from the DNA.
  • the optical path followed by the transmitted light of the beam splitter is the first optical path
  • the optical path followed by the reflected light is the second optical path, but the reverse is also possible.
  • the fine pattern film 15 coincides with the conjugate position of the two-dimensional sensor 13 on the first optical path and the conjugate position of the fine pattern film 15 on the second optical path. Is installed. An image focused on DNA is obtained on the two-dimensional sensor 13 when the two-dimensional sensor 13 and the DNA fixing surface of the sample substrate 9 are conjugated in the first optical path.
  • the DNA fixing surface of the fine pattern film 15 and the sample substrate 9 becomes conjugated. Therefore, the image of the fine pattern film 15 is imaged on the DNA fixed surface, and the image is relayed on the first optical path and reimaged on the two-dimensional sensor 13. That is, if the Z stage is moved so as to focus on the fine pattern film, it will be focused on the DNA fixing surface of the sample substrate. In other words, if the defocus on the fine pattern film 15 is evaluated based on the image of the fine pattern film, the defocus on the DNA fixed surface can be evaluated.
  • the output signal of the two-dimensional sensor 13 is sent to the controller 20 which is a control unit.
  • the controller 20 uses the output signal of the two-dimensional sensor 13 to obtain an image based on the fluorescence emitted by the DNA on the sample substrate 9 and an image based on the synchrotron radiation of the fine pattern film 15 derived from illumination by the second light source 16. To generate.
  • the fine pattern film 15 constituting the fine pattern in this embodiment is a slit-shaped metal thin film formed on a glass substrate.
  • the fine pattern may be a hole pattern arranged in a grid pattern.
  • a thin resin or metal plate with holes or slits may be formed.
  • the filter wheel is moved to the position where the filter cube 2a comes on the objective lens, the excitation light source 1 is turned off, only the second light source 16 is turned on, and two fine pattern images are displayed.
  • the controller calculates the standard deviation of the brightness of the image, which is the contrast of the image, as an index (focus index) indicating the degree of focusing of the image of the fine pattern, and if the value is smaller than the set predetermined threshold value, the through Perform a scan and move the objective lens to the best focus position.
  • the second light source is turned off, the excitation light source is turned on, and a fluorescence image for the filter cube 2a is taken.
  • the filter cubes are sequentially switched to 2b, 2c, and 2d, and fluorescence images for each are taken.
  • a fine pattern image is taken for each panel, but since the light emitted from the fine pattern is much stronger than fluorescence, it can be taken with an exposure time sufficiently shorter than the exposure time required to acquire a fluorescent image, which is derived from this shooting. The increase in measurement time is small enough.
  • the contrast at the best focus fluctuates every cycle due to deterioration of the phosphor even in the same panel, and the degree of defocus is determined from one image. It cannot be done and a through scan is required.
  • the contrast at the best focus of the fine pattern is substantially constant, the defocus can be evaluated by shooting only one image, and the through scan should be performed only when it is determined that the defocus is large to some extent. The increase in measurement time can be suppressed to a small extent.
  • the defocus evaluation was performed only on the cube 5a. Since the light from the second light source only needs to pass through the cube 5a, a blue LED having an emission wavelength band substantially the same as that of FAM was used as the second light source.
  • a light source that includes the transmission band of all cubes in its emission wavelength band such as a white LED or halogen lamp, is used as the second light source, and defocus evaluation is performed for all cubes. , It is also possible to perform a through scan if necessary.
  • the condition for focusing on the DNA fixed surface is that the DNA fixed surface and the two-dimensional sensor 13 are conjugate with respect to the synthetic lens system composed of the objective lens and the imaging lens.
  • the light between the objective lens and the imaging lens is a parallel luminous flux so as not only to focus but also to prevent aberration due to transmission of the filter or the dichroic mirror. Therefore, in this embodiment, the two-dimensional sensor 13 is installed at the focal point of the imaging lens 12 and the fine pattern film 15 is installed at the focal point of the collimating lens 14 so that this condition is automatically satisfied at the time of focusing. In this state, focusing occurs when the DNA fixing surface is located at the focal point of the objective lens 8, and the light collected by the objective lens is emitted as a parallel luminous flux.
  • the focal lengths of the objective lens 8, the imaging lens 12, and the collimating lens 14 are f0, f1, and f2, respectively. Assuming that the thermal expansion is uniform throughout the device, let the temperature change be ⁇ T and the coefficient of linear expansion of the member be ⁇ . The deviation ⁇ 1 from the focal position of the imaging lens of the two-dimensional sensor 13 and the deviation ⁇ 2 from the focal position of the collimating lens 14 of the fine pattern film 15 are respectively.
  • f2 is at least half of f1 and at least f1.
  • Example 1 the contrast of the image was calculated and used as the focusing index, but the brightness standard deviation standardized by the brightness average value, the sum of the pixel values of the original image with the Laplacian filter applied, A modulation transfer function (MTF) and a two-dimensional power spectrum can also be suitably used as a focusing index.
  • MTF modulation transfer function
  • the focusing index may be calculated for the entire image or a part of the image (region of interest, ROI).
  • ROI region of interest
  • the Laplacian filter is defined by the following equation 8.
  • Equation 8 Since the actual image data is a two-dimensional array of discrete pixel values acquired by a digital camera, the differentiation of Equation 8 is approximated by the difference as shown in Equation 9 below.
  • the AF defined by the following equation 10 can be used as the focusing index.
  • the coordinates of the upper left pixel of the image or ROI are (0, 0), the size in the x direction is M, and the size in the y direction is N.
  • Equation 2 can be replaced by Equation 11.
  • the FV of the formula 12 can be used as the focusing index instead of the AF defined by the formula 10.
  • AE is the sum of the pixels defined by Equation 13.
  • BG is the background value of the pixel value, and the pixel mean value of the image acquired in the dark state (the light sources 1 and 16 are both turned off) or the 1% percentile of the histogram of the pixel value (the histogram accumulation from 0 is cumulative). Pixel value that becomes 1%) can be used.
  • FV is a value obtained by dividing AF by (pixel average value-background), and has the advantage that the degree of focusing can be evaluated without depending on the overall brightness of the image.
  • a fine difference pattern composed of a pair of fine pattern films installed before and after the conjugate position on the second optical path with respect to the conjugate position of the two-dimensional sensor on the first optical path is used.
  • the dimensional sensor is an example of a nucleic acid analyzer that produces an image based on fluorescence emitted by DNA and an image based on synchrotron radiation of a fine pattern derived from illumination by a second light source.
  • FIG. 3 is a diagram showing a configuration example of the nucleic acid analyzer of Example 2.
  • This embodiment has almost the same configuration as that of the first embodiment. The difference is that there are two fine pattern films, one before and after the conjugate position on the second optical path (hereinafter referred to as the second conjugate position) with respect to the conjugate position of the two-dimensional sensor 13 on the first optical path.
  • a fine pattern composed of 15a and 15b is provided. By doing so, not only the magnitude of defocus but also the orientation can be detected from the images of the fine patterns formed by the fine pattern films 15a and 15b.
  • FIG. 4 shows an enlarged view of the patterns of the fine pattern films 15a and 15b seen from the side of the collimating lens 14.
  • fine patterns are formed in two diagonal regions (upper left and lower right) out of the four regions cut in the shape of a paddy on the substrate.
  • the fine pattern film 15b is the same product only by rotating 15a by 90 degrees.
  • the fine pattern films 15a and 15b were installed at the second conjugate position ⁇ 0.5 mm.
  • the center of gravity of the conjugate position of the two-dimensional sensor 13 in the first optical path and the conjugate position of the fine pattern films 15a and 15b in the second optical path coincide with each other.
  • the conjugate position itself is the center of gravity of the conjugate position, so that the conjugate position of the fine pattern film 15 in the second optical path
  • the center of gravity coincides with the conjugate position of the two-dimensional sensor 13 in the first optical path.
  • the excitation light source 1 is turned off, the second light source 16 is turned on, and the objective lens 9 is through-scanned in 1 um steps within a range of the best focus position ⁇ 20 um with respect to the DNA fixed surface to take an image.
  • the obtained image is divided into four parts, and (upper left area + contrast with respect to lower right area)-(contrast with lower left area + upper right area) is calculated and expressed as a function for defocus Z, as shown in FIG. It becomes a graph.
  • a signed signal (FES) proportional to the defocus is obtained for a defocus of ⁇ 7 um. Therefore, if Z is moved by an amount multiplied by a proportional coefficient (-7.7 ⁇ 10 -6 in this embodiment) in FES, the objective lens 8 can be moved to the best focus position instantly without a through scan. is there.
  • FES signed signal
  • two glass substrates on which a film having a pattern as shown in FIG. 4 is formed are used, but a fine pattern film 15a is formed on the front surface and a fine pattern film 15b is formed on the back surface of one glass substrate.
  • This single glass substrate may be installed on the second optical path so that the second conjugate position is in the glass substrate layer.
  • the two-dimensional sensor includes a first two-dimensional sensor and a second two-dimensional sensor
  • the imaging lens includes a first imaging lens and a second imaging lens
  • a beam splitter and a third embodiment.
  • a fluorescence separation dichroic mirror is provided between the first two-dimensional sensor and the second two-dimensional sensor, and the transmitted light of the fluorescence separation dichroic mirror is imaged on the first two-dimensional sensor by the first imaging lens to perform fluorescence separation.
  • This is an example of a nucleic acid analyzer having a configuration in which the reflected light of the dichroic mirror is imaged on the second two-dimensional sensor by the second imaging lens.
  • FIG. 6 shows a configuration example of the nucleic acid analyzer of Example 3.
  • the configuration of this embodiment is substantially the same as that of the first embodiment in the range below the beam splitter 11.
  • the number of filter cubes is two as shown in FIG. 7, and the filter wheel Instead, a filter slider is provided.
  • a fluorescence separation dichroic mirror 17 is provided on the beam splitter 11, and the transmitted light is imaged on the first two-dimensional sensor 13a by the first imaging lens 12a, and the reflected light is imaged on the second imaging lens. The image is formed on the second two-dimensional sensor 13b by 12b.
  • the output signal of the second two-dimensional sensor 13b is also input to the controller 20.
  • FIG. 7 is a front view of the filter slider.
  • the two filter cubes 2a and 2b are fixed on the member 18 having the jagged portion, and the rotation of the gear 19 by the motor 7 is converted into the linear motion of the member 18.
  • the filter and the fluorescence separation dichroic mirror in the filter cubes 2a and 2b each have two transmission wavelength bands so that two kinds of dyes can be excited and detected at the same time.
  • FAM and TXR are excited / detected when the filter cube 2a is on the objective lens (timing 1)
  • Cy3 and Cy5 are excited / detected when the filter cube 2b is on the objective lens (timing 2).
  • the fluorescence separation dichroic mirror 17 reflects light having a wavelength of 590 nm or more and transmits light having a wavelength of 590 nm or less so that fluorescence from a kind of dye is detected by each two-dimensional sensor at each timing.
  • FAM is detected by the first two-dimensional sensor 13a
  • TXR is detected by the second two-dimensional sensor 13b.
  • Cy3 is detected by the two-dimensional sensor 13a
  • Cy5 is detected by the two-dimensional sensor 13b.
  • defocus detection was performed based on the image of the fine pattern film 15 by the first two-dimensional sensor 13a at timing 2. Therefore, as the second light source, an orange LED having an emission wavelength range (550-590 nm) substantially the same as that of Cy3 fluorescence was adopted.
  • the algorithm for defocus detection and subsequent best focus position search is the same as in the first embodiment.
  • a fine pattern composed of a pair of fine pattern films can be provided before and after the second conjugate position.
  • the effect that the objective lens can be moved to the best focus position instantly without a through scan is also the same as in the second embodiment.
  • FIG. 8 shows a configuration example of the nucleic acid analyzer of Example 4.
  • the configuration of this embodiment is a configuration in which the filter wheel in the first embodiment is replaced with the filter slider in the third embodiment.
  • the two-dimensional sensor 13 is a four-color sensor
  • the second light source 16 is a near-infrared LED having a wavelength of 780 nm.
  • the sequence of four-color imaging by the two-dimensional sensor 13 is the same as in the third embodiment, the filter cubes are switched by the filter slider, and two colors are imaged for each filter cube.
  • FIG. 9 shows an example of the pixel arrangement of the color sensor 13 used in this embodiment.
  • the pixel (B) having sensitivity to blue
  • the pixel (G) having sensitivity to green
  • the pixel (R) having sensitivity to red
  • the pixel (N) having sensitivity to near infrared is arranged.
  • FIG. 10 shows the spectral sensitivity curve of each pixel. Only N pixels are sensitive to the light of the near infrared LED.
  • the N pixel has no sensitivity to fluorescence.
  • the excitation light source 1 and the second light source 16 can be turned on at the same time, and the fluorescence image of DNA and the image of the fine pattern film 15 for defocus detection can be taken at the same time, and the measurement time is shortened as compared with the first embodiment. It has the effect of being able to do it.
  • a near-infrared LED having a wavelength of 780 nm is used as a light source for easy availability, but the N pixels for near-infrared have sufficient sensitivity, and the sensitivities of other visible pixels R, G, and B. Any near-infrared light source with a low wavelength of 760-1000 nm can be preferably used.
  • the fluorescence wavelength is about 30-60 nm longer than the excitation wavelength, a near-ultraviolet and visible light source having a wavelength of 300 to 670 nm can be preferably used as a light source for exciting visible fluorescence of 360 to 700 nm.
  • the type of fluorescent dye can be identified only by the brightness of the G pixel and the R pixel.
  • the vectors (g, r) composed of the brightness g of the G pixel and the brightness r of the R pixel obtained with an exposure time of 0.1 seconds are FAM (9,1.5), Cy3 (7,3), and TXR. (1,7), Cy5 (0,5).
  • a graph obtained by plotting this on the gr plane is shown in FIG.
  • the combinations of dyes detected at the same time are FAM-TXR and Cy3-Cy5, and the luminance vectors of the dyes detected at the same time have significantly different directions, so that they can be identified with sufficient accuracy.
  • a fine pattern composed of a pair of fine pattern films can be provided before and after the second conjugate position as in the second embodiment.
  • the effect that the objective lens can be moved to the best focus position instantly without a through scan is also the same as in the second embodiment.
  • the present invention is not limited to the above-mentioned examples, but includes various modifications.
  • the above-mentioned examples have been described in detail for a better understanding of the present invention, and are not necessarily limited to those having all the configurations of the description.
  • each of the above-mentioned configurations, functions, controllers, etc. has been described mainly with an example of creating a program that realizes a part or all of them, but it is hard to design a part or all of them by, for example, an integrated circuit. Needless to say, it can be realized with hardware. That is, all or part of the functions of the processing unit may be realized by, for example, an integrated circuit such as an ASIC (Application Specific Integrated Circuit) or an FPGA (Field Programmable Gate Array) instead of the program.
  • ASIC Application Specific Integrated Circuit
  • FPGA Field Programmable Gate Array

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Abstract

高精度なオートフォーカス付き蛍光顕微鏡を使った核酸分析装置を提供するため、励起光を射出する第一の光源と、対物レンズと、励起光を吸収し蛍光を放射するＤＮＡが固定された試料基板と、一個の二次元センサと、一個の結像レンズと、微細パターンと、微細パターンを照明する第二の光源と、コリメートレンズと、試料基板から放射されて対物レンズで収集された光がたどる光路を、結像レンズを介して二次元センサへ至る第一の光路と、コリメートレンズを介して微細パターンへ至る第二の光路とに分岐するビームスプリッタと、二次元センサの出力を用いて、ＤＮＡが放射する蛍光に基づく画像と、第二の光源の照明による微細パターンの放射光に基づく画像を生成する制御部を備え、第一の光路における二次元センサの共役位置と、第二の光路における微細パターンのパターン膜の共役位置の重心を一致させた。

Description

核酸分析装置及び方法
　本発明は核酸分析装置及び方法に係り、特に試薬とＤＮＡ試料の化学反応と、放射された蛍光の顕微鏡画像に基づき、ＤＮＡ試料の解析を行うクラスタ方式の核酸配列決定技術に関する。
　クラスタ方式の核酸分析装置においては、基板上に試料ＤＮＡ断片を各ＤＮＡ分子が互いに適切な距離で離れるよう固定され、各ＤＮＡ分子から増幅反応により、同一の配列を持つ多数のＤＮＡ分子から構成されたクラスタを生成する。生成したＤＮＡクラスタに対して相補な配列のＤＮＡの伸長反応を基板上で繰返す。伸長されるＤＮＡは，その配列がわかるように発光帯の異なる４種の蛍光体で修飾されている。伸長反応ごとに基板に励起光を照射し，伸長した相補ＤＮＡから放射される蛍光の像を、ＣＣＤセンサやＣ－ＭＯＳセンサといった撮像センサを搭載したカメラによって撮影する。像の色に基づいて蛍光体の種類を判定し，試料ＤＮＡの配列が決定される。
　ＤＮＡクラスタは、光学的に分離可能な範囲でできる限り高密度に配置されるため、クラスタ方式の核酸分析装置における撮像光学系は一般に拡大系で、一種の顕微鏡を構成する。これらの顕微鏡は、４種の蛍光体を蛍光色で識別するため、ダイクロイックミラーおよびフィルタが組み込まれた蛍光顕微鏡であり、これら光学素子による収差の発生を避けるため、一般に対物レンズと結像レンズからなる実質的に無限遠補正の蛍光顕微鏡である。
　核酸分析装置における蛍光顕微鏡では、微弱な蛍光を検出するため、ＮＡが０．４５以上の比較的高ＮＡの対物レンズが用いられる。このように高ＮＡの対物レンズでは焦点深度がサブミクロンレベルとなる。そのため、合焦位置（撮像センサ面の、対物レンズと結像レンズからなるレンズ系に関する共役面）と基板のＤＮＡ固定面をサブミクロンで合致させる（ピントを合わせる）ため、０．１ミクロンあるいはそれ以下の分解能を持つＺステージを設け、対物レンズもしくは基板を高分解能で上下させる。
　ピントを合わせる最も基本的な方法は、対物レンズを、機械的な誤差を考慮しても確実に合焦位置より下（上）になる位置に移動させてから、試料を撮像しながら十分細かいステップで上（下）に移動させ、コントラストが最大になる位置を見出すことである。このような操作をスルースキャンと呼ぶ。
　関連する先行技術として、特許文献１がある。特許文献１には、励起光以外の光束を標的面に斜めに入射させ、その光束の標的面による反射光の検出量にもとづいて、標的面と合焦位置のずれ（デフォーカス）を検知する蛍光顕微鏡が記載されている。この方法では、デフォーカスに比例した信号がリアルタイムで得られ、その信号に基づくオートフォーカス動作が可能である。
特開２００４－００４６３４号公報
　上述した先行技術においては、オートフォーカス用の照明光学系に加え、デフォーカスを検知するために、蛍光画像を得るための撮像素子以外の受光素子を設けている。このような構成ではオートフォーカス専用の受光素子が追加されるためそのぶんコストアップになるだけでなく、受光素子のための受光光学系が追加され、組立・調整の手間が増加し、装置全体のサイズもまた増加する。また、撮像素子とオートフォーカス用受光素子の位置が異なるため、熱膨張による位置変化が両者で異なるため、撮像素子上での画像コントラストが最大となる対物レンズ位置（真の合焦位置）と、受光素子により得たフォーカス誤差信号（以下、ＦＥＳ）に基づく合焦位置との差（合焦誤差）が生じうるという課題もある。
　本発明の目的は、上記の課題を解決し、低コストかつシンプルな構成で高精度なオートフォーカス付き蛍光顕微鏡を使った核酸分析装置及び方法を提供することにある。
　上記の目的を達成するため、本発明においては、励起光を射出する第一の光源と、対物レンズと、励起光を吸収し蛍光を放射するＤＮＡが固定された試料基板と、少なくとも一個の二次元センサと、少なくとも一個の結像レンズと、少なくとも一個の微細パターンと、微細パターンを照明する第二の光源と、コリメートレンズと、試料基板から放射されて対物レンズで収集された光がたどる光路を、結像レンズを介して二次元センサへ至る第一の光路と、コリメートレンズを介して微細パターンへ至る第二の光路とに分岐するビームスプリッタと、二次元センサの出力を用いて、ＤＮＡが放射する蛍光に基づく画像と、第二の光源の照明による微細パターンの放射光に基づく画像とを生成する制御部と、を備え、第一の光路における二次元センサの共役位置と、第二の光路における微細パターンのパターン膜の共役位置の重心を一致させた構成の核酸分析装置を提供する。
　また、上記の目的を達成するため、本発明においては、励起光を射出する第一の光源と、対物レンズと、励起光を吸収し蛍光を放射するＤＮＡが固定された試料基板と、少なくとも一個の二次元センサと、少なくとも一個の結像レンズと、少なくとも一個の微細パターンと、微細パターンを照明する第二の光源と、コリメートレンズと、試料基板から放射されて対物レンズで収集された光がたどる光路を、結像レンズを介して二次元センサへ至る第一の光路と、コリメートレンズを介して微細パターンへ至る第二の光路とに分岐するビームスプリッタと、を備える核酸分析装置における核酸分析方法であって、第一の光路における二次元センサの共役位置と、第二の光路における微細パターンのパターン膜の共役位置の重心を一致させ、二次元センサの出力を用いて、ＤＮＡが放射する蛍光に基づく画像と、第二の光源の照明による微細パターンの放射光に基づく画像とを生成する核酸分析方法を提供する。
　本発明によれば、低コストかつシンプルな構成で高精度なオートフォーカス付き蛍光顕微鏡を構築することができ、低価格で解析精度が高い核酸分析装置及び方法を提供できる。
実施例１の核酸分析装置の一構成例を示す図。 実施例１に係る、フィルタホイールの一例の上面図。 実施例２に係る、核酸分析装置の一構成例を示す図。 実施例２に係る、微細パターン膜の拡大図。 実施例２に係る、フォーカス誤差信号の一例を示す図。 実施例３に係る、核酸分析装置の一構成例を示す図。 実施例３に係る、フィルタキューブスライド機構の拡大図。 実施例４に係る、核酸分析装置の一構成例を示す図。 実施例４に係る、カラーセンサの画素配置の一例を示す図。 実施例４に係る、各画素の分光感度曲線の一例を示す図。 実施例４に係る、Ｇ画素の輝度gとＲ画素の輝度rのベクトルの一例を示す図。
　以下、図面に基づいて本発明の実施の形態を説明する。それに先立ち、本発明の対象であるクラスタ方式の核酸分析装置特有の課題を説明する。
　クラスタ方式の核酸分析装置では、多数のＤＮＡを分析するため、ＤＮＡが固定される基板の面積は一般に顕微鏡の視野よりはるかに大きい。そこで、伸長反応サイクルごとにＸＹステージで基板を移動させて基板全体を撮像する。一視野で撮像される基板の領域をパネルとよぶ。基板は光軸に対して完全に垂直ではないので、合焦するＺ座標はパネルごとに異なる。理論的には、最初の反応サイクルで各パネルに対しスルースキャンを行い、合焦するＺ座標を記憶し、以降の反応サイクルでは各パネルで記憶したＺ座標に対物レンズを移動させれば、スルースキャンは不要である。
　しかしながら、核酸分析装置ではＤＮＡの伸長反応を行うため、基板の温度を一分程度の間に４０度以上上昇および下降させるというプロセスが繰り替えされる。その結果、対物レンズの支持体を含む基板周辺の部材の温度が安定しない。それらの部材の熱膨張のため、Ｚステージがいかに高分解能で高精度であっても、Ｚステージを駆動するパルス数のみに基づくオープンループ制御では、対物レンズ－基板間の距離をサブミクロンレベルで再現させることは不可能である。かといって、各サイクル各パネルでスルースキャンを行うのは、時間がかかりすぎるばかりでなく、蛍光画像の撮影における長時間の露光は試料の損傷をともなうため、実用的でない。
　したがって、低コストかつシンプルな構成で高精度にＤＮＡ固定面（標的面と呼ぶ）と合焦位置とのずれを検知してピントを合わせるオートフォーカス機構付き蛍光顕微鏡の提供が核酸分析装置にとって重要な課題となる。
　実施例１は、励起光を射出する第一の光源と、対物レンズと、励起光を吸収し蛍光を放射するＤＮＡが固定された試料基板と、少なくとも一個の二次元センサと、少なくとも一個の結像レンズと、微細パターンと、微細パターンを照明する第二の光源と、コリメートレンズと、試料基板から放射されて対物レンズで収集された光がたどる光路を、結像レンズを介して二次元センサへ至る第一の光路と、コリメートレンズを介して微細パターンへ至る第二の光路とに分岐するビームスプリッタと、二次元センサの出力を用いて、ＤＮＡが放射する蛍光に基づく画像と、第二の光源の照明による微細パターンの放射光に基づく画像とを生成する制御部と、を備え、第一の光路における二次元センサの共役位置と、第二の光路における微細パターンのパターン膜の共役位置の重心を一致させた構成の核酸分析装置及びその方法の実施例である。なお、本実施例では、微細パターン膜が単一であるので、微細パターンのパターン膜の共役位置の重心とは、一つの微細パターンのパターン膜の共役位置そのものである。
　図1は実施例１の核酸分析装置の一構成例を示す図である。励起光源１から放射された励起光はフィルタキューブ２ａに入射する。フィルタキューブ２ａに入射した光は励起フィルタ３ａを透過後、ダイクロイックミラー４ａで反射され、対物レンズ８で集光されて、ＤＮＡが固定された試料基板９を照明する。対物レンズ８はステッピングモーターで駆動される高分解能のＺステージ１０に取り付けられており、Ｚステージ１０の１パルスあたりの移動量は５０ｎｍである。
　試料基板９で反射された励起光は、フィルタキューブ内のダイクロイックミラー４ａと蛍光フィルタ５ａで遮断され、ＤＮＡから放射された蛍光のみが蛍光フィルタ５ａを透過する。図1は、フィルタキューブ２ａが対物レンズ８の上に位置するときの状態を示しているが、核酸分析装置では４種の蛍光体の励起・検出を行わなければならないため、実際には回転テーブル６の上に４個のフィルタキューブ２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄが実装され、フィルタホイールを構成している。図２はフィルタキューブ２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄが実装されたフィルタホイールを上から見た図である。同図に示すフィルタホイールは、モータ７によって回転テーブル６を回転し、対物レンズ上にあるフィルタキューブ２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄを切り替えることができる。
　本実施例の基板９上のＤＮＡ伸長反応においては、アデニンがＦＡＭ，グアニンがＣｙ３、シトシンがテキサスレッド（ＴＸＲ）、チミンがＣｙ５で標識されている。フィルタキューブ２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄはそれぞれ、ＦＡＭ，Ｃｙ３、ＴＸＲ、Ｃｙ５の励起・検出に対応している。各フィルタキューブ２ｉ（ｉ＝ａ，ｂ，ｃ，ｄ）は、励起フィルタ３ｉ、ダイクロイックミラー４ｉおよび蛍光フィルタ５ｉを内蔵し、励起フィルタ３ｉは対応した色素の励起波長帯の光のみが透過し、ダイクロイックミラー４ｉは励起波長帯の光を反射して蛍光波長帯の光を透過し、蛍光フィルタ５ｉは蛍光波長帯の光を透過させる。一つのパネルにおいて、４つのフィルタキューブのすべてに対して蛍光画像を撮影する。
　試料基板９上のＤＮＡから放射された蛍光は、対物レンズ８で収集され、フィルタキューブを透過したのちに、ビームスプリッタ１１で透過光と反射光に分岐される。透過光は、結像レンズ１２を介して二次元センサ１３上に集光される。試料基板９から二次元センサ１３へ至る光路を第一の光路と呼び、試料基板９から微細パターンを構成する微細パターン膜１５へ至る光路を第二の光路と呼ぶ。
　二次元センサ１３の出力信号は核酸分析装置の制御部であるコントローラ２０に送られる。コントローラ２０は、通常の中央処理部（ＣＰＵ）における機能プログラム実行によって実現できる。コントローラ２０には二次元センサ１３の出力信号が入力され、画像生成プログラムの実行により、ＤＮＡが放射する蛍光に基づく画像を生成する。
　一方、反射光は第二の光路上のコリメートレンズ１４を介して微細パターン膜１５上に集光される。微細パターンを構成する微細パターン膜１５は、例えば１０μｍ～１００μｍピッチの１００～２００本の細線で形成される。微細パターン膜１５が第二の光源１６で照明されることによって誘起された微細パ0ターン膜１５からの放射光は、コリメートレンズ１４によってほぼコリメートされる。このほぼコリメートされた光束は、ビームスプリッタ１１で反射され、試料基板９から放射されてフィルタキューブを透過する光と同一の光路を逆向きにたどり、対物レンズ８を透過する。
　その後、試料基板９で反射され、ＤＮＡから放射された蛍光と同様に、第一の光路をたどり、二次元センサ１３上に集光される。なお、本実施例ではビームスプリッタの透過光がたどる光路を第一の光路、反射光がたどる光路を第二の光路としているが、逆にすることも可能である。
　上述したように本実施例の構成においては、第一の光路上における二次元センサ１３の共役位置と、第二の光路上における微細パターン膜１５の共役位置が一致するように、微細パターン膜１５が設置されている。ＤＮＡに合焦した画像が二次元センサ１３上で得られるのは、第一の光路において、二次元センサ１３と試料基板９のＤＮＡ固定面が共役になるときである。
　このとき、第二の光路においては、微細パターン膜１５と試料基板９のＤＮＡ固定面が共役になる。したがって、微細パターン膜１５の像がＤＮＡ固定面に結像され、その像が第一の光路上でリレーされて二次元センサ１３上に再結像される。つまり、微細パターン膜に合焦するようにＺステージを動かせば、試料基板のＤＮＡ固定面に合焦することになる。いいかえれば、微細パターン膜１５に対するデフォーカスを微細パターン膜の画像に基づいて評価すれば、ＤＮＡ固定面に対するデフォーカスを評価することができる。
　上述のように、二次元センサ１３の出力信号は制御部であるコントローラ２０に送られる。コントローラ２０は、二次元センサ１３の出力信号を用いて、試料基板９上のＤＮＡが放射する蛍光に基づく画像と、第二の光源１６による照明に由来する微細パターン膜１５の放射光に基づく画像を生成する。
　なお本実施例における微細パターンを構成する微細パターン膜１５は、ガラス基板上に形成されたスリット状の金属薄膜である。微細パターンは格子状にならんだホールパターンでも良い。基板上に成形した薄膜ではなく、樹脂や金属の薄板に穴やスリットを加工したものでもよい。
　本実施例では、パネルを移動後、フィルタホイールをフィルタキューブ２ａが対物レンズ上に来る位置に動かすとともに、励起光源１を消灯し、第二の光源１６のみを点灯させ、微細パターンの像を二次元センサ１３で取得する。コントローラは微細パターンの画像の合焦の度合いを表す指標（合焦指標）として、画像のコントラストである画像の輝度の標準偏差を計算し、その値が設定された所定の閾値より小さい場合、スルースキャンを実施し、対物レンズをベストフォーカス位置に移動させる。
　その後、第二の光源を消灯し、励起光源を点灯させ、フィルタキューブ２ａに対する蛍光画像を撮影する。その後にフィルタキューブを２ｂ、２ｃ、２ｄに順次切り替え、それぞれに対する蛍光画像を撮影する。パネルごとに微細パターンの画像を撮影するが、微細パターンから放射される光は蛍光よりはるかに強いので、蛍光画像の取得に必要な露光時間よりも十分小さい露光時間で撮影でき、この撮影に由来する測定時間増加は十分小さい。
　また、蛍光画像にもとづいてデフォーカスを評価しようとすると、同一パネルであっても蛍光体の劣化などによってサイクルごとにベストフォーカスでのコントラストが変動し、１枚の画像からデフォーカスの度合いが判定できず、スルースキャンが必要になる。一方、微細バターンのベストフォーカスにおけるコントラストは実質的に一定なので、１枚の撮影のみでデフォーカスが評価でき、デフォーカスがある程度大きいと判定されるときのみスルースキャンを行えばよいので、スルースキャン由来の測定時間増加も小さくおさえることができる。
　本実施例では、レンズ系の色収差が十分小さいので、キューブ５ａでのみデフォーカス評価を行った。第二の光源の光はキューブ５ａを透過すればよいので、発光波長帯がＦＡＭとほぼ同じ青色ＬＥＤを第二の光源として使用した。色収差が問題となる場合は、すべてのキューブの透過帯をその発光波長帯に含むような光源、例えば白色ＬＥＤやハロゲンランプなどを第二の光源として用い、すべてのキューブにおいてデフォーカス評価を実施し、必要に応じてスルースキャンを行うことも可能である。
　ＤＮＡ固定面に合焦する条件は、対物レンズと結像レンズで構成される合成レンズ系に関して、ＤＮＡ固定面と二次元センサ１３が共役になることである。撮像する時には、単に合焦するだけでなく、フィルタやダイクロイックミラーの透過による収差が発生しないよう、対物レンズと結像レンズの間の光が平行光束になっていることが好ましい。そこで本実施例では、合焦時に自動的にこの条件が満たされるよう、二次元センサ１３を結像レンズ１２の焦点に、微細パターン膜１５をコリメートレンズ１４の焦点に設置している。この状態では、合焦するのは対物レンズ８の焦点にＤＮＡ固定面が位置するときであり、対物レンズで収集された光は平行光束として射出される。
　装置組立・調整時からの温度変化により熱膨張が発生し、二次元センサ１３および微細パターン膜１５の位置がレンズの焦点位置からずれると、微細パターンの合焦条件と、ＤＮＡ固定面への合焦条件にずれが生じる。このずれについて以下で説明する。
　対物レンズ８、結像レンズ１２、コリメートレンズ１４の焦点距離をそれぞれ、ｆ０、ｆ１、ｆ２とする。装置全体で熱膨張は一様であると仮定し、温度変化をΔＴ，部材の線膨張係数をαとする。二次元センサ１３の結像レンズ焦点位置からのずれδ１、微細パターン膜１５のコリメートレンズ１４の焦点位置からのずれδ２はそれぞれ、
δ１＝ｆ１（αΔＴ）　　　（式１）
δ２＝ｆ２（αΔＴ）　　　（式２）
　二次元センサ共役位置の対物レンズ焦点からのずれＺ１、パターン膜像の結像位置の対物レンズ焦点からのずれＺ２はそれぞれ
Ｚ１＝（ｆ０／ｆ１）２δ１　　　　　　　　　　　（式３）
Ｚ２＝（ｆ０／ｆ２）２δ２　　　　　　　　　　　（式４）
で近似される。
　試料基板面の位置が　Ｚ２－ε　であるとすると、微細パターン像の見掛けの位置は　Ｚ２－２ε　となる。したがって、２次元センサ１３にリレーされる微細パターン像が合焦する条件は
Ｚ２－２ε＝Ｚ1　　　　　（式５）
　一方、微細パターン像に合焦した時の、ＤＮＡ固定面に対するデフォーカスδは
δ＝（Ｚ２－ε）－Ｚ１＝（Ｚ２－Ｚ１）／２　　　　　　（式６）
　数１～数４をもちいると、数６は
δ＝（１／ｆ２－１／ｆ１）ｆ０２αΔＴ／２　　　　　　（式７）
となり、数７は、熱膨張由来のデフォーカスを小さくするには、ｆ１～ｆ２が好ましいことを示している。
　他方、オートフォーカス用の照明系を小さくするにはコリメートレンズ１４の焦点距離ｆ２が小さいほど良い。二つの条件のバランスをとるには、ｆ２がｆ１の半分以上かつｆ1以下とするのが好適と考えられる。
　本実施例ではｆ０＝１０ｍｍ、ｆ１＝１００ｍｍ、ｆ２＝ｆ１／２＝５０ｍｍとして、１０倍の蛍光顕微鏡を構築している。アルミの線膨張係数としてα＝２３×１０－６／Ｋ、ΔＴ＝１０Ｋを数７に代入すると、δ＝１１５ｎｍとなり、熱膨張由来のデフォーカスは顕微鏡の焦点深度以下となる。
　以上説明した実施例１では、合焦指標として画像のコントラストを計算して使用したが、輝度平均値で規格化した輝度標準偏差、元の画像にラプラシアンフィルタをかけた画像の画素値の和、変調伝達関数（ＭＴＦ）、二次元パワースペクトルもまた合焦指標として好適に用いることができる。
　また、合焦指標は、画像全体で計算してもよいし、画像の一部（region of interest, ＲＯＩ）で計算してもよい。上記の合焦指標のなかで、ラプラシアンフィルタをかけた画像の画素値の和は、比較的短時間で計算できるので、高速なオートフォーカスを実現するうえでは有用である。
　画像が連続的な輝度分布 f(x, y) (x, yは画像中の位置を表す座標)を持つとすると、ラプラシアンフィルタは下式８で定義される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　実際の画像データは、デジタルカメラで取得した離散的な画素値の二次元配列なので、式８の微分は下式９のような差分で近似される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
　また次式１０で定義されるＡＦを合焦指標として用いることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
ここで、画像あるいはROIの左上画素の座標を (0, 0) とし、x方向のサイズがM、y方向のサイズがNである。
　画像が方向依存性が無いランダムなものであるならば、ラプラシアンはxのみ、あるいはyのみに関する二次偏微分に置き換えることができる。たとえば、xのみの偏微分とすれば、数２は式１１で置き換えることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
　式１０で定義されたＡＦの代わりに式１２のＦＶを合焦指標として用いることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000005
ここでＡＥは式１３で定義される画素の総和であり、
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000006
ＢＧは画素値のバックグラウンド値であり、暗状態（光源１、16がいずれも消灯した状態）で取得した画像の画素平均値、あるいは画素値のヒストグラムの1%パーセンタイル（0からのヒストグラム累積が1％になる画素値）などが使用できる。
　ＦＶはＡＦを（画素平均値―バックグラウンド）で除算した値であり、画像の全体的な明るさに依存することなく合焦の程度を評価できるという利点がある。
　実施例２は、第一の光路上における二次元センサの共役位置に対し、第二の光路上において共役となる位置の前後に設置された一対の微細パターン膜からなる微差パターンを用い、二次元センサは、ＤＮＡが放射する蛍光に基づく画像と、第二の光源による照明に由来する微細パターンの放射光に基づく画像を生成する核酸分析装置の実施例である。
　図３は、実施例２の核酸分析装置の一構成例を示す図である。本実施例は実施例１の構成とほぼ同一の構成である。異なる点は、第一の光路上における二次元センサ１３の共役位置に対する、第二の光路上における共役位置（以下、第二共役位置と呼ぶ）の前後に一つずつ、計二つの微細パターン膜１５ａ、１５ｂからなる微細パターンを設けることである。このようにすることで、微細パターン膜１５ａ、１５ｂによる微細パターンの画像から、デフォーカスの大きさだけでなく、向きを検知することができる。
　図４に、コリメートレンズ１４の側から見た微細パターン膜１５ａ、１５ｂのパターンの拡大図を示す。微細パターン膜１５ａでは、基板の田の字に切られた四つの領域うち対角の２領域（左上と右下）に微細パターンが形成されている。微細パターン膜１５ｂは１５ａを９０度回転しただけで同一品である。
　本実施例では微細パターン膜１５ａ、１５ｂを第二共役位置±０．５ｍｍに設置した。その結果、第一の光路における二次元センサ１３の共役位置と、前記第二の光路における微細パターン膜１５ａ、１５ｂの共役位置の重心が一致する。先に説明した通り、実施例1のように微細パターン膜が単一である場合には、その共役位置そのものが共役位置の重心であるから、第二の光路における微細パターン膜１５の共役位置の重心は、第一の光路における二次元センサ１３の共役位置と一致している。
　励起光源1を消灯して第二の光源１６を点灯し、対物レンズ９をＤＮＡ固定面に対するベストフォーカス位置±２０ｕｍの範囲で、1ｕｍステップでスルースキャンして撮像する。得られた画像を田の字に４分割し、（左上領域＋右下領域に対するコントラスト）－（左下領域＋右上領域のコントラスト）を計算し、デフォーカスＺに対する関数としてあらわすと図５に示すようなグラフになる。
　図５に示すように、本実施例では±７ｕｍのデフォーカスに対してはデフォーカスに比例した符号付の信号（ＦＥＳ）が得られる。そのため、ＦＥＳにある比例係数（本実施例では－７．７×１０-６）をかけた量だけＺを動かせば、スルースキャンなしで瞬時にベストフォーカス位置に対物レンズ８を移動できるという効果がある。
　本実施例では、図４のようなパターンの膜が製膜されたガラス基板を２枚使用したが、一枚のガラス基板の表に微細パターン膜１５a、裏に微細パターン膜１５ｂを製膜して微細パターンとし、第二の共役位置がガラス基板層内に来るように、この一枚のガラス基板を第二の光路上に設置してもよい。
　実施例３は、二次元センサは第一の二次元センサと第二の二次元センサを含み、結像レンズは第一の結像レンズと第二の結像レンズを含み、ビームスプリッタと、第一の二次元センサ及び第二の二次元センサの間に蛍光分離ダイクロイックミラーを設け、蛍光分離ダイクロイックミラーの透過光を第一の結像レンズによって第一の二次元センサに結像し、蛍光分離ダイクロイックミラーの反射光を第二の結像レンズによって第二の二次元センサに結像する構成の核酸分析装置の実施例である。
　図６は実施例３の核酸分析装置の一構成例を示す。本実施例の構成は、ビームスプリッタ１１以下の範囲は第一の実施例とほぼ同一である。ただし、本実施例では第一、第二の二次元センサ１３ａ、１３ｂを使って、２種の色素を同時に励起・検出するため、フィルタキューブは図７に示すように２個で、フィルタホイールのかわりにフィルタスライダーが設けられている。ビームスプリッタ１１の上には蛍光分離ダイクロイックミラー１７が設けられ、その透過光を第一の結像レンズ１２ａによって第一の二次元センサ１３ａに結像し、その反射光を第二の結像レンズ１２ｂによって第二の二次元センサ１３ｂに結像する。なお、図示を省略したが、第二の二次元センサ１３ｂの出力信号もコントローラ２０に入力される。
　図７はフィルタスライダーの正面図である。二つのフィルタキューブ２ａと２ｂがギザギザ部を有する部材１８の上に固定されており、モータ７による歯車１９の回転が部材１８の直線運動に変換される。２種の色素を同時に励起・検出できるよう、フィルタキューブ２ａ、２ｂ内のフィルタと蛍光分離ダイクロイックミラーはそれぞれ二つの透過波長帯を持っている。フィルタキューブ２ａが対物レンズ上にあるタイミング（タイミング1）では、ＦＡＭとＴＸＲが励起・検出され、フィルタキューブ２ｂが対物レンズ上にある（タイミング２）では、Ｃｙ３とＣｙ５が励起・検出される。各タイミングにおいて各二次元センサで一種の色素からの蛍光が検出されるよう、蛍光分離ダイクロイックミラー１７は、波長５９０ｎｍ以上の光を反射し、波長５９０ｎｍ以下の光を透過する。その結果、タイミング1では、第一の二次元センサ１３ａでＦＡＭが、第二の二次元センサ１３ｂでＴＸＲが検出される。タイミング２では、二次元センサ１３ａでＣｙ３が、二次元センサ１３ｂでＣｙ５が検出される。
　本実施例では、タイミング２における第一の二次元センサ１３ａによる微細パターン膜１５の画像をもとにデフォーカス検知をした。そのため、第二の光源として、Ｃｙ３の蛍光とほぼ同じ発光波長域（５５０－５９０ｎｍ）を有する橙色ＬＥＤを採用した。デフォーカス検知およびその後のベストフォーカス位置探索のアルゴリズムは第一の実施例と同様である。もちろん他の発光波長域を有する第二の光源を用い、他方のタイミングにおける他方の二次元センサの画像にもとづいてデフォーカス検知をすることもでき、第二の光源として白色光源を用いて両方のタイミング、両方のカメラでデフォーカス検知をすることも可能である。
　本実施例の構成においても、実施例２のように第二の共役位置の前後に一対の微細パターン膜からなる微細パターンを設けることできる。その場合、スルースキャンなしで瞬時に対物レンズをベストフォーカス位置に移動させられるという効果もまた実施例２と同様である。
　図８は実施例４の核酸分析装置の一構成例を示す。本実施例の構成は、実施例１におけるフィルタホイールを、実施例３におけるフィルタスライダーに置き換えた構成である。ただし、二次元センサ１３が４色のカラーセンサ、第二の光源１６が波長７８０ｎｍの近赤外ＬＥＤである。二次元センサ１３による４色撮像のシーケンスは実施例３と同様で、フィルタスライダーでフィルタキューブを切り替え、一つのフィルタキューブごとに２色ずつ撮像する。
　図９に、本実施例で用いたカラーセンサ１３の画素配置の一例を示す。青に感度を有する画素（Ｂ）、緑に感度を有する画素（Ｇ），赤に感度を有する画素（Ｒ）に加えて、近赤外に感度を有する画素（Ｎ）が並んでいる。図１０に各画素の分光感度曲線を示す。Ｎ画素のみが近赤外ＬＥＤの光に感度を有する。
　一方、ＤＮＡを修飾した色素の蛍光の波長は７００ｎｍ以下なので、Ｎ画素は蛍光に対して感度を有さない。この結果、励起光源1と第二の光源１６を同時に点灯し、ＤＮＡの蛍光画像とデフォーカス検知のための微細パターン膜１５の画像を同時に撮影でき、第一の実施例よりも測定時間を短縮できるという効果がある。
　本実施例では、入手しやすさから波長７８０ｎｍの近赤外ＬＥＤを光源としているが、近赤外用のＮ画素が十分な感度を有し、他の可視用の画素Ｒ，Ｇ，Ｂの感度が低い波長７６０－１０００ｎｍの任意の近赤外光源が好適に使用できる。一方、蛍光波長は励起波長に対して３０－６０ｎｍ程度長波長になるので、３６０～７００ｎｍの可視蛍光を励起する光源としては波長が３００～６７０ｎｍの近紫外および可視の光源が好適に使用できる。
　蛍光色素の種類は、Ｇ画素とＲ画素の輝度のみで識別できる。露光時間０．１秒で得られる、Ｇ画素の輝度gとＲ画素の輝度rで構成されるベクトル（ｇ、ｒ）は、ＦＡＭ（９，１．５）、Ｃｙ３（７，３）、ＴＸＲ（１，７）、Ｃｙ５（０、５）である。これをｇｒ平面にプロットしたグラフを図１１に示す。同時に検出される色素の組み合わせはＦＡＭ－ＴＸＲ，Ｃｙ３－Ｃｙ５であり、同時に検出される色素の輝度ベクトルは方向が大きく異なるため、十分な精度で識別が可能である。
　もちろん、本実施例の構成においても、実施例２のように第二の共役位置の前後に一対の微細パターン膜からなる微細パターンを設けることできる。その場合、スルースキャンなしで瞬時に対物レンズをベストフォーカス位置に移動させられるという効果もまた実施例２と同様である。
　本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明のより良い理解のために詳細に説明したのであり、必ずしも説明の全ての構成を備えるものに限定されるものではない。
　更に、上述した各構成、機能、コントローラ等は、それらの一部又は全部を実現するプログラムを作成する例を中心に説明したが、それらの一部又は全部を例えば集積回路で設計する等によりハードウェアで実現しても良いことは言うまでもない。すなわち、処理部の全部または一部の機能は、プログラムに代え、例えば、ＡＳＩＣ（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　Ｃｉｒｃｕｉｔ）、ＦＰＧＡ（Ｆｉｅｌｄ　Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ　Ｇａｔｅ　Ａｒｒａｙ）などの集積回路などにより実現してもよい。
１　励起光源
２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ　フィルタキューブ
３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ　励起フィルタ
４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ　ダイクロイックミラー
５ａ、５ｂ、５ｃ、５ｄ　蛍光フィルタ
６　回転テーブル
７　モータ
８　対物レンズ
９　試料基板
１０　Ｚステージ
１１　ビームスプリッタ
１２　結像レンズ
１３　二次元センサ
１４　コリメートレンズ
１５、１５ａ、１５ｂ　微細パターン膜
１６　第二の光源
１７　蛍光分離ダイクロイックミラー
１８　スライド部材
１９　歯車
２０　コントローラ

Claims (15)

  1. 励起光を射出する第一の光源と、対物レンズと、前記励起光を吸収し蛍光を放射するＤＮＡが固定された試料基板と、少なくとも一個の二次元センサと、少なくとも一個の結像レンズと、少なくとも一個の微細パターンと、前記微細パターンを照明する第二の光源と、コリメートレンズと、前記試料基板から放射されて前記対物レンズで収集された光がたどる光路を、前記結像レンズを介して前記二次元センサへ至る第一の光路と、前記コリメートレンズを介して前記微細パターンへ至る第二の光路とに分岐するビームスプリッタと、
    前記二次元センサの出力を用いて、前記ＤＮＡが放射する蛍光に基づく画像と、前記第二の光源の照明による前記微細パターンの放射光に基づく画像とを生成する制御部と、を備え、
    前記第一の光路における前記二次元センサの共役位置と、前記第二の光路における前記微細パターンのパターン膜の共役位置の重心を一致させた、
    ことを特徴とする核酸分析装置。
  2. 請求項１に記載の核酸分析装置であって、
    前記微細パターンは、前記第一の光路における前記二次元センサの共役位置に対し、前記第二の光路において共役となる位置の前後に設置された一対の微細パターン膜からなる、
    ことを特徴とする核酸分析装置。
  3. 請求項１または２に記載の核酸分析装置であって、
    前記コリメートレンズの焦点距離が前記結像レンズの焦点距離の半分以上かつ同等以下である、
    ことを特徴とする核酸分析装置。
  4. 請求項１または２に記載の核酸分析装置であって、
    前記制御部は、前記二次元センサの出力に基づき生成した前記微細パターンの放射光に基づく画像から、合焦の度合いを表す値である合焦指標を計算する、
    ことを特徴とする核酸分析装置。
  5. 請求項４に記載の核酸分析装置であって、
    前記合焦指標は、前記微細パターンの放射光に基づく画像の輝度の標準偏差、輝度平均値で規格化した標準偏差、ラプラシアンフィルタをかけた画像の画素値の和、ＭＴＦ、二次元パワースペクトルのいずれかである、
    ことを特徴とする核酸分析装置。
  6. 請求項１または２に記載の核酸分析装置であって、
    前記二次元センサは第一の二次元センサと第二の二次元センサを含み、前記結像レンズは第一の結像レンズと第二の結像レンズを含み、
    前記ビームスプリッタと、前記第一の二次元センサ及び前記第二の二次元センサの間に蛍光分離ダイクロイックミラーを設け、前記蛍光分離ダイクロイックミラーの透過光を前記第一の結像レンズによって前記第一の二次元センサに結像し、前記蛍光分離ダイクロイックミラーの反射光を前記第二の結像レンズによって前記第二の二次元センサに結像する、
    ことを特徴とする核酸分析装置。
  7. 請求項６に記載の核酸分析装置であって、
    前記制御部は、前記第一の二次元センサの出力を用いて、前記第二の光源による照明に由来する前記微細パターンの放射光に基づく画像を生成する、
    ことを特徴とする核酸分析装置。
  8. 請求項１または２に記載の核酸分析装置であって、
    前記二次元センサの少なくとも一つがカラーセンサであり、前記第一の光源の光の波長が３００ｎｍ以上６７０ｎｍ以下であり、前記第二の光源の光の波長が７６０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下である、
    ことを特徴とする核酸分析装置。
  9. 励起光を射出する第一の光源と、対物レンズと、前記励起光を吸収し蛍光を放射するＤＮＡが固定された試料基板と、少なくとも一個の二次元センサと、少なくとも一個の結像レンズと、少なくとも一個の微細パターンと、前記微細パターンを照明する第二の光源と、コリメートレンズと、前記試料基板から放射されて前記対物レンズで収集された光がたどる光路を、前記結像レンズを介して前記二次元センサへ至る第一の光路と、前記コリメートレンズを介して前記微細パターンへ至る第二の光路とに分岐するビームスプリッタと、を備える核酸分析装置における核酸分析方法であって、
    前記第一の光路における前記二次元センサの共役位置と、前記第二の光路における前記微細パターンのパターン膜の共役位置の重心を一致させ、
    前記二次元センサの出力を用いて、前記ＤＮＡが放射する蛍光に基づく画像と、前記第二の光源の照明による前記微細パターンの放射光に基づく画像とを生成する、
    ことを特徴とする核酸分析方法。
  10. 請求項９に記載の核酸分析方法であって、
    前記コリメートレンズの焦点距離が前記結像レンズの焦点距離の半分以上かつ同等以下である、
    ことを特徴とする核酸分析方法。
  11. 請求項９に記載の核酸分析方法であって、
    前記二次元センサの出力に基づき生成した前記微細パターンの放射光に基づく画像から、合焦の度合いを表す値である合焦指標を計算する、
    ことを特徴とする核酸分析方法。
  12. 請求項１１に記載の核酸分析方法であって、
    前記合焦指標は、前記微細パターンの放射光に基づく画像の輝度の標準偏差、輝度平均値で規格化した標準偏差、ラプラシアンフィルタをかけた画像の画素値の和、ＭＴＦ、二次元パワースペクトルのいずれかである、
    ことを特徴とする核酸分析方法。
  13. 請求項９に記載の核酸分析方法であって、
    前記二次元センサは第一の二次元センサと第二の二次元センサを含み、前記結像レンズは第一の結像レンズと第二の結像レンズを含み、
    前記ビームスプリッタと、前記第一の二次元センサ及び前記第二の二次元センサの間に蛍光分離ダイクロイックミラーを設け、前記蛍光分離ダイクロイックミラーの透過光を前記第一の結像レンズによって前記第一の二次元センサに結像し、前記蛍光分離ダイクロイックミラーの反射光を前記第二の結像レンズによって前記第二の二次元センサに結像する、
    ことを特徴とする核酸分析方法。
  14. 請求項１３に記載の核酸分析方法であって、
    前記第一の二次元センサの出力を用いて、前記第二の光源による照明に由来する前記微細パターンの放射光に基づく画像を生成する、
    ことを特徴とする核酸分析方法。
  15. 請求項９に記載の核酸分析方法であって、
    前記二次元センサの少なくとも一つがカラーセンサであり、前記第一の光源の光の波長が３００ｎｍ以上６７０ｎｍ以下であり、前記第二の光源の光の波長が７６０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下である、
    ことを特徴とする核酸分析方法。
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