WO2022050221A1 - 顕微鏡 - Google Patents

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WO2022050221A1
WO2022050221A1 PCT/JP2021/031749 JP2021031749W WO2022050221A1 WO 2022050221 A1 WO2022050221 A1 WO 2022050221A1 JP 2021031749 W JP2021031749 W JP 2021031749W WO 2022050221 A1 WO2022050221 A1 WO 2022050221A1
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WO
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image
light
detection
wavelength
sample
Prior art date
Application number
PCT/JP2021/031749
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English (en)
French (fr)
Inventor
勇輝 照井
哲朗 星野
陽輔 藤掛
朝陽 福田
Original Assignee
株式会社ニコン
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社ニコン filed Critical 株式会社ニコン
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    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes

Definitions

  • the present invention relates to a microscope. This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2020-147642 filed on September 2, 2020, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • a scanning microscope (hereinafter, also referred to as "Image Scanning Microscope”, abbreviated as "ISM") is proposed in which the sample is focused and irradiated with illumination light, and the fluorescence generated from the sample is detected by a detector in which a plurality of detection pixels are arranged.
  • Patent Document 1 A scanning microscope (hereinafter, also referred to as "Image Scanning Microscope”, abbreviated as "ISM”) is proposed in which the sample is focused and irradiated with illumination light, and the fluorescence generated from the sample is detected by a detector in which a plurality of detection pixels are arranged.
  • the image due to fluorescence of a plurality of different wavelengths formed on the detector in which a plurality of detection pixels are arranged is received, and the image due to the plurality of fluorescence is separated and detected by mathematical processing.
  • a method has been proposed (Non-Patent Document 1).
  • the microscope has an illumination optical system that collects illumination light to form an illumination region on a sample, a scanning unit that relatively scans the illumination region and the sample, and a detection surface.
  • a detector in which a plurality of detection units are arranged, a first image of light of the first wavelength from the sample in which the illumination region is formed, and the first wavelength from the sample in which the illumination region is formed.
  • the microscope has an illumination optical system that collects illumination light to form an illumination region on a sample, a scanning unit that relatively scans the illumination region and the sample, and a detection surface.
  • a detector in which a plurality of detection units are arranged, a first image of light of the first wavelength from the sample in which the illumination region is formed, and the first wavelength from the sample in which the illumination region is formed.
  • the microscope has an illumination optical system that collects illumination light to form an illumination region on a sample, a scanning unit that relatively scans the illumination region and the sample, and a detection surface.
  • a detector in which a plurality of detection units are arranged, a first image of the first polarized light from the sample in which the illuminated region is formed, and the first polarized light from the sample in which the illuminated region is formed. Includes a detection optical system that forms a second image of different second polarized light on the detection surface of the detector, wherein the detection optical system is at least one of the first image and the second image.
  • One of the first image and the second image, in which the portions are overlapped to form the detection surface and the first image and the second image are relatively rotated in the in-plane direction of the detection surface.
  • FIG. 2A is a diagram showing an example of an image conversion element included in the image conversion unit.
  • FIG. 2B is a diagram showing an example of an image on a detection surface in the microscope of the first embodiment.
  • FIG. 4A is a diagram showing a modification 1 of the image conversion unit.
  • FIG. 4B is a diagram showing an example of an image on the detection surface formed by the modification 1 of the image conversion unit.
  • FIG. 5A is a diagram showing an image conversion element in the modification 2 of the image conversion unit.
  • FIG. 5B is a diagram showing an example of an image on the detection surface formed by the modification 2 of the image conversion unit.
  • FIG. 9A is a diagram showing a modification 6 of the image conversion unit.
  • FIG. 9B is a diagram showing an example of an image on the detection surface formed by the modification 6 of the image conversion unit.
  • FIG. 14A is a diagram showing a modification 11 of the image conversion unit.
  • FIG. 14B is a diagram showing a modification 12 of the image conversion unit. The figure which shows the modification 13 of the image conversion part.
  • FIG. 16A is a diagram showing a modified example 14 of the image conversion unit.
  • FIG. 16B is a diagram showing a modified example 15 of the image conversion unit.
  • FIG. 17 is a diagram showing the entire detector of the modified example.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing the configuration of the microscope 1 of the first embodiment.
  • the structure of the microscope 1 of the first embodiment is the same as that of the conventional image scanning microscope (ISM) described above, except for the image conversion unit 30 and the removal filter 21, which will be described later.
  • ISM image scanning microscope
  • the microscope 1 will be described as being a scanning fluorescence microscope, but the microscope according to the embodiment is not limited to the fluorescence microscope.
  • the XYZ coordinate system in which the downward direction parallel to the optical axis of the objective lens 16 is the + Z direction is appropriately referred to.
  • the microscope 1 includes an objective lens 16, a relay lens 13, a relay lens 15, a deflection unit 12, a branch mirror 11, an image conversion unit 30, a detector 40, and the like.
  • the light source unit 50 has a plurality of light sources 51a and 51b such as lasers that emit light having different wavelengths, and the light emitted from the respective light sources 51a and 51b is shaped and parallelized by the lenses 52a and 52b. Then, it is converged into one light flux by the mirror 54 and the dichroic mirror 53, emitted from the light source unit 50 as illumination light Li, and supplied to the illumination optical system 10 arranged in the region surrounded by the broken line.
  • the light sources 51a and 51b may be either a laser that emits continuously oscillated light or a laser that emits pulsed light. Further, the light sources 51a and 51b may not be lasers, but may be LEDs or emission line lamps. Further, the light source unit 50 does not necessarily have to have a plurality of light sources 51a and 51b, and may have one light source 51a.
  • the illumination light Li incident on the illumination optical system 10 passes through the branch mirror 11 made of a dichroic mirror or the like and is incident on the deflection unit 12.
  • the deflection unit 12 is provided with an X-direction deflection mirror 12a and a Y-direction deflection mirror 12b as an example.
  • the illumination light Li reflected by the X-direction deflection mirror 12a and the Y-direction deflection mirror 12b is focused by the relay lens 13 and focused on the intermediate imaging point 14.
  • the illumination light Li then enters the objective lens 16 via the relay lens 15 and is focused by the objective lens 16 on the sample 18 held on the stage 17. Therefore, on the sample 18, an illumination region 19 in which the illumination light Li is focused to a size of about the resolution limit of the objective lens 16 is formed.
  • the illumination optical system 10 includes a branch mirror 11, a deflection unit 12, relay lenses 13 and 15, and an objective lens 16 arranged along the optical path of the illumination light Li.
  • the X-direction deflection mirror 12a and the Y-direction deflection mirror 12b substantially refer to the conjugate surface of the pupil surface of the objective lens 16 (or the pupil surface of the objective lens 16) with respect to the sample 18 via the objective lens 16 and the relay lenses 13 and 15. ). Then, the X-direction deflection mirror 12a of the deflection unit 12 swings in a predetermined direction, so that the illumination region 19 moves (vibrates) in the X direction on the sample 18. Further, the illumination region 19 moves (vibrates) in the Y direction on the sample 18 due to the Y-direction deflection mirror 12b swinging in a predetermined direction.
  • control unit 60 controls the deflection unit 12 by the control signal S1, that is, by controlling the swing positions of the X-direction deflection mirror 12a and the Y-direction deflection mirror 12b, the illumination region 19 is set in the XY direction on the sample 18. It can be scanned in two dimensions.
  • the X-direction deflection mirror 12a and the Y-direction deflection mirror 12b can be configured by a galvano mirror, a MEMS mirror, a resonant mirror (resonant mirror), or the like.
  • the control unit 60 controls the stage 17 holding the sample 18 by the control signal S2 and moves the stage 17 in the X direction and the Y direction, whereby the illumination region 19 and the sample 18 on the stage 17 are relatively scanned. It may be configured to make it. Further, the configuration may be such that both scanning by the deflection unit 12 and scanning by the stage 17 are performed. It can also be said that at least one of the deflection unit 12 and the stage 17 is a scanning unit that scans the illuminated area 19 and the sample 18 on the stage 17 relative to each other.
  • the control unit 60 including the calculation unit 61 controls the relative positional relationship between the illumination region 19 and the sample 18 by controlling the deflection unit 12 or the stage 17 which is a scanning unit.
  • the sample for example, cells that have been fluorescently stained in advance are used, but the sample is not necessarily limited to a substance that emits fluorescence.
  • a substance that emits fluorescence it is preferable to select a wavelength that excites the fluorescent substance contained in the sample 18 as the wavelength of the light sources 51a and 51b.
  • a wavelength that excites the fluorescent substance contained in the sample 18 by multiple photons may be selected as the wavelength of the light sources 51a and 51b.
  • the light source unit 50 may be provided interchangeably (attachable or removable) with the microscope 1, or may be externally attached to the microscope 1 when observing with the microscope 1.
  • the light (detection light) Ld emitted from the sample 18 by irradiating the illumination region 19 with the illumination light Li is incident on the objective lens 16, is refracted by the objective lens 16, passes through the relay lenses 15 and 13, and is deflected by the deflection portion 12. To. Then, it is reflected by the Y-direction deflection mirror 12b and the X-direction deflection mirror 12a of the deflection unit 12, respectively. Due to the reflection by the Y-direction deflection mirror 12b and the X-direction deflection mirror 12a, the detected light Ld is returned (descanned) to the same optical path as the illumination light Li and reaches the branch mirror 11.
  • the detected light Ld is reflected by the branch mirror 11 and is incident on the image conversion unit 30 arranged in the region surrounded by the broken line.
  • the branch mirror 11 transmits the illumination light Li and reflects the detection light Ld to branch the light, but the branch mirror 11 reflects the illumination light Li and transmits the detection light Ld. It may be a mirror that branches light.
  • the image conversion unit 30 of the microscope of the first embodiment includes a branching element 32 and a merging element 35, which are dichroic mirrors, as an example of transmitting or reflecting the incident light according to the wavelength of the incident light.
  • the detected light Ld the detected light L1 having the first wavelength ⁇ 1 passes through the branching element 32, is reflected by the mirror 33, reaches the merging element 35, and is reflected by the merging element 35.
  • the detection light L2 having a second wavelength ⁇ 2 having a wavelength longer than that of the first wavelength ⁇ 1 is reflected by the branch element 32, reflected by the mirror 34, reaches the merging element 35, and passes through the merging element 35.
  • the detection light L1 of the first wavelength ⁇ 1 and the detection light L2 of the second wavelength ⁇ 2 are merged by the merging element 35 to become emission light Le and are emitted from the image conversion unit 30.
  • the emitted light Le is condensed by the condenser lens 22 after the light of a part of the wavelength is removed by the removal filter 21 described later, and the image 23 of the illumination region 19 in the sample 18 is displayed on the detection surface 41 of the detector 40.
  • the detection light L2 having the second wavelength ⁇ 2 may be light having a shorter wavelength than the detection light L1 having the first wavelength ⁇ 1.
  • a light-shielding plate C1 is provided in the image conversion unit 30 beside the optical path of the detection light L1 so as to be removable from the optical path of the detection light L1, and a light-shielding plate C2 is provided beside the optical path of the detection light L2. It is provided so that it can be removed from the optical path of.
  • the light-shielding plate C1 and the light-shielding plate C2 will be described later.
  • the objective lens 16, the relay lens 15, 13, the deflection unit 12, the branch mirror 11, the image conversion unit 30, the removal filter 21, and the condenser lens 22 arranged along the optical path of the detection light Ld include the detection optical system 20 ( The area surrounded by the dotted line) is composed.
  • the detection optical system 20 superimposes at least a part of the first image of the detection light L1 of the first wavelength ⁇ 1 and the second image of the detection light L2 of the second wavelength ⁇ 2 in the illumination region 19 of the sample 18. It is formed on the detection surface 41 of the detector 40.
  • FIG. 2B shows the first image 23a by the detection light L1 of the first wavelength ⁇ 1 in the illumination region 19 of the sample 18 on the detection surface 41 of the detector 40 in the microscope 1 of the first embodiment, and the detection light L2 of the second wavelength ⁇ 2.
  • the contour of the first image 23a shown by the alternate long and short dash line and the contour of the second image 23b shown by the alternate long and short dash line are, for example, at positions where the light intensity is 15% of the peak intensity of each image (boundary line). ) Is shown.
  • the first image 23a and the second image 23b are single spot images on the detection surface 41, respectively.
  • the detection surface 41 is arranged so as to be parallel to the YZ surface, but the direction of the detection surface 41 is such that the reflection surface (branch mirror 11, branch element 32, etc.) in the detection optical system 20 is arranged. It changes in any way. Therefore, in the present specification and the drawings, the detection surface 41 will be described with reference to the U direction and the V direction indicated by the arrows in FIG. 2B. As for the U direction and the V direction, the X direction and the Y direction on the sample 18 shown in FIG. 1 are projected onto the detection surface 41 by the detection optical system 20 through the optical path of the detection light L1 having the first wavelength ⁇ 1. The direction.
  • 5 detection pixels 42 in the U direction and 5 in the V direction, for a total of 5 ⁇ 5 25, are arranged on the detection surface 41.
  • the widths of one detection pixel 42 in the U direction and the V direction are converted into the length on the sample 18 when the wavelength of the first wavelength ⁇ 1 or the second wavelength ⁇ 2 is ⁇ and the numerical aperture of the objective lens 16 is NA. For example, it is about 0.2 ⁇ ⁇ / NA.
  • the detector 40 for example, an avalanche photodiode array having high sensitivity and high responsiveness can be used.
  • the respective detection pixels 42 do not necessarily have to be arranged in parallel in the U direction and the V direction, and may be arranged in the detection surface 41 along the directions rotated from the U direction and the V direction. Further, each of the detection pixels 42 may not be densely arranged in the detection surface 41, or may be arranged discretely. Further, each of the detection pixels 42 may be arranged one-dimensionally instead of two-dimensionally.
  • the first image 23a and the second image 23b are formed on the detection surface 41 by superimposing at least a part thereof, the first image 23a and the second image 23b are formed.
  • the total area of the detection pixels 42 for imaging can be reduced. Therefore, even if the detector 40 having a small total area of the detection pixels 42, that is, an inexpensive detector 40 is used, a highly accurate two-dimensional image of the sample 18 can be obtained as described later.
  • the total area of the detection pixels 42 may be 1.5 times or less the total area of the first image 23a and the second image 23b in the detection surface 41.
  • the area of each of the first image 23a and the second image 23b is the area inside the contour of each image shown by the alternate long and short dash line in FIG. 2B.
  • the light received by each of the detection pixels 42 arranged on the detection surface 41 is converted into a light amount signal S3 which is an electric signal corresponding to the light amount, and is transmitted to the calculation unit 61 in the control unit 60. Similar to the conventional ISM, the calculation unit 61 determines the relative positional relationship between the light amount signal S3 from each detection pixel 42 and the illumination region 19 and the sample 18 when the light amount signal S3 is detected in the X and Y directions. A two-dimensional image of the sample 18 is generated based on the above.
  • the relationship with the light amount signal S3 detected from the above is one two-dimensional image generated by one detection pixel 42.
  • the detection surface 41 is formed so that the first image 23a by the detection light L1 of the first wavelength ⁇ 1 and the second image 23b by the detection light L2 of the second wavelength ⁇ 2 are substantially overlapped with each other. Therefore, the two-dimensional image for each detection pixel 42 generated above includes a two-dimensional image detected by the detection light L1 of the first wavelength ⁇ 1 and a two-dimensional image detected by the detection light L2 of the second wavelength ⁇ 2. Is a mixture.
  • the calculation unit 61 is generated by detection light (L1, L2) having a plurality of wavelengths detected by each detection pixel 42 of the detector 40 by changing the relative positional relationship between the illumination region 19 and the sample 18.
  • a process of estimating the two-dimensional density distribution of each fluorescent substance of the first wavelength ⁇ 1 and the second wavelength ⁇ 2 is performed from the two-dimensional image (25 because the total number of detected pixels is 25). This estimation process is performed by CLEMENS ROIDER and 3 other authors, "Deconvolution approach for 3D scanning microscopy with helical phase engineering", OPTICS EXPRESS 15456, USA, The Optical Society, Vol. 24, No.
  • the two-dimensional image Im (x, y) generated by the detection light detected by the m-th detection pixel 42 of the detector 40 is expressed by the following equation (1). Will be done.
  • m is a subscript assigned to the detection pixel 42 constituting the detector 40. Since the detector 40 has 25 detection pixels 42, it is an integer value from 1 to 25.
  • x and y are the positions in the X direction and the Y direction in the sample 18, respectively.
  • ⁇ (x, y, ⁇ ) represents the density of the fluorescent substance that generates fluorescence at the wavelength ⁇ in the sample 18.
  • hm (x, y, ⁇ ) represents the point image intensity distribution (PSF) in the two-dimensional image generated by the detection light of the wavelength ⁇ detected by the m-th detection pixel 42 of the detector 40.
  • PSF point image intensity distribution
  • the equation (1) is as shown in the following equation (2). It will be expanded.
  • ⁇ (x, y, ⁇ 1) represents the density of the fluorescent substance that fluoresces at the wavelength ⁇ 1 in the sample 18, and ⁇ (x, y, ⁇ 2) represents the fluorescence substance that fluoresces at the wavelength ⁇ 2 in the sample 18.
  • hm (x, y, ⁇ 1) represents the point image intensity distribution (PSF) in the two-dimensional image generated by the detection light of the wavelength ⁇ 1 detected by the mth detection pixel 42 of the detector 40.
  • hm (x, y, ⁇ 2) represents the point image intensity distribution (PSF) in the two-dimensional image generated by the detection light of the wavelength ⁇ 2 detected by the mth detection pixel 42 of the detector 40.
  • Pixel recitation processing is described in, for example, "Superresolution by image scanning microscopy using pixel reassignment" by C. J. Sheppard, S. B. Mehta, R. Heintzmann, Optics Letters (USA), Volume 38, No. Since it is described in detail in .15, 2889, 2013, the explanation is omitted here.
  • the point image intensity distribution hm (x, y, ⁇ 1) is a point in a two-dimensional image generated by the detection light of the wavelength ⁇ 1 detected by the m-th detection pixel 42 of the detector 40, as described above.
  • Image intensity distribution (PSF) is a point in a two-dimensional image generated by the detection light of the wavelength ⁇ 1 detected by the m-th detection pixel 42 of the detector 40, as described above.
  • the point image intensity distribution hm (x, y, ⁇ 2) is a point image in a two-dimensional image generated by the detection light of the wavelength ⁇ 2 detected by the m-th detection pixel 42 of the detector 40, as described above.
  • Intensity distribution (PSF) is a point image in a two-dimensional image generated by the detection light of the wavelength ⁇ 2 detected by the m-th detection pixel 42 of the detector 40, as described above.
  • the point image intensity distribution hm (x, y, ⁇ 1) and the point image intensity distribution hm (x, y, ⁇ 2) need only have different distributions corresponding to at least one common subscript m. That is, the point image intensity distribution hm (x, y, ⁇ 1) corresponding to the specific subscript m and the point image intensity distribution hm (x, y, ⁇ 2) may have the same distribution.
  • Differentiation of the point image intensity distribution hm (x, y, ⁇ 1) corresponding to at least one common subscript m from the point image intensity distribution hm (x, y, ⁇ 2) can be described from, for example, from the following (a). It can be realized by any one or more up to (d).
  • (A) The first image 23a by the detection light L1 of the first wavelength ⁇ 1 and the second image 23b by the detection light L2 of the second wavelength ⁇ 2 are relatively rotated in the in-plane direction of the detection surface 41.
  • One of the first image 23a by the detection light L1 of the first wavelength ⁇ 1 or the second image 23b by the detection light L2 of the second wavelength ⁇ 2 is inverted in the plane of the detection surface 41.
  • FIG. 2A is a diagram showing an image rotator 31a as an image conversion element 31 arranged in the image conversion unit 30.
  • the image rotator 31a is arranged such that the long side of the dub prism coincides with the traveling direction (+ X direction) of the detection light L2.
  • Each side surface of the dub prism is arranged in a state of being rotated by 45 ° with respect to the XY plane and the XZ plane with the rotation center in the X direction.
  • each side surface of the dub prism is shown so as to coincide with the XY plane and the XZ plane so that the configuration of the dub prism as the image rotator 31a can be easily understood.
  • the second image 23b by the detection light L2 is mirrored (inverted) with respect to the first image 23a by the detection light L1 on the detection surface 41. And it is rotated by 90 ° in the plane of the detection surface 41.
  • the accuracy of estimation of the density ⁇ 1 (x, y, ⁇ 1) of the fluorescent substance and the density ⁇ 2 (x, y, ⁇ 2) of the fluorescent substance performed by the calculation unit 61 is improved.
  • the first image 23a by the detection light L1 of the first wavelength ⁇ 1 and the second image 23b by the detection light L2 of the second wavelength ⁇ 2 are formed on the detection surface 41 of one detector 40. Also, the two-dimensional density distribution of each fluorescent substance can be estimated with high accuracy. As a result, the number of detectors 40 such as an expensive avalanche photodiode array required for detection can be reduced.
  • an optical member such as a lens that gives rotational asymmetric aberration such as astigmatism or coma to the detected light Ld may be further arranged on the upstream side (the side close to the sample 18). Instead of this, an optical member such as a lens that gives rotational asymmetric aberration such as non-point aberration or coma aberration to the detected light L1 is arranged in the optical path of the detected light L1 in the image conversion unit 30. Alternatively, an optical member such as a lens that gives rotational asymmetric aberration such as non-point aberration or coma aberration to the detected light L2 may be arranged in the optical path of the detected light L2 in the image conversion unit 30. good.
  • the theoretically predicted distribution is used. You may use it. That is, a theoretically predicted distribution is used based on the data of the optical design of the microscope 1 of the embodiment, the theoretical influence of the image rotator 31a on the second image 23b, the position and size of the detection pixels 42, and the like. You may.
  • the point image intensity distribution at each detection wavelength of the microscope 1 of the first embodiment may be measured in advance, and the measured point image intensity distribution may be used.
  • the point image intensity distribution hm (x, y, ⁇ 1) and the point image intensity distribution hm (x, y, ⁇ 2) are determined based on the light amount distribution in the detection surface 41 of the 23a and the second image 23b. Is also good.
  • the coordinates (x, y) detected by the finite number of detection pixels 42 in the detection surface 41 are obtained by interpolating the measured values of the discrete image intensity distribution or by fitting with a continuous function.
  • the point image intensity distribution hm (x, y, ⁇ 1) and the point image intensity distribution hm (x, y, ⁇ 2) that are continuous with respect to x, y) may be determined.
  • the point image intensity distribution hm (x, y, ⁇ 1) and the point image intensity distribution hm (x, y, ⁇ 2) for example, two dimensions with respect to the (x, y) coordinates shown in the equation (3).
  • the Gaussian function p (x, y) of may be used.
  • the coordinates (x0, y0) represent the center position of the two-dimensional Gaussian distribution with respect to the origin (0,0)
  • Wx represents the width of the two-dimensional Gaussian distribution in the X direction
  • Wy is 2.
  • ⁇ represents the rotation angle in the XY plane centered on the coordinates (x0, y0) of the two-dimensional Gaussian distribution.
  • c is a predetermined constant
  • a is a predetermined proportionality constant.
  • the function used for fitting the point image intensity distribution hm (x, y, ⁇ 1) and the point image intensity distribution hm (x, y, ⁇ 2) is not limited to the above-mentioned two-dimensional Gaussian function, but is a two-dimensional Lorentz function. May be used.
  • the point image intensity distribution can be estimated even if a sample that is not a point-like fluorescent object sufficiently smaller than the point image intensity distribution (PSF) is used as the sample 18.
  • PSF point image intensity distribution
  • the light amount distributions of the first image 23a and the second image 23b in the detection surface 41 are measured at a plurality of points of the sample 18, respectively.
  • the point image intensity distribution hm (x, y, ⁇ 1) and the point image intensity distribution hm (x, y, ⁇ 2) can be estimated.
  • the optical path of the detection light L1 or the detection light is used by using the light-shielding plates C1 and C2 in the image conversion unit 30 so that only light of one wavelength is incident on the detector 40.
  • the measurement may be performed with one of the optical paths of L2 shielded from light. Further, with respect to the light source 51a and the light source 51b, the measurement may be performed with only one of them turned on and the other turned off.
  • FIG. 3 is a diagram showing an example of the spectral distribution of fluorescence emitted from the sample 18 and an example of the function of the removal filter 21.
  • the spectral distribution of the generated fluorescence spreads over a predetermined wavelength range centered on the first wavelength ⁇ 1 and the second wavelength ⁇ 2, respectively. It becomes. Then, the spectral distribution of the first fluorescent La centered on the first wavelength ⁇ 1 and the spectral distribution of the second fluorescent Lb centered on the second wavelength ⁇ 2 may partially overlap in a predetermined wavelength region. be.
  • the light having a wavelength longer than the boundary wavelength ⁇ c which is the boundary for transmitting or reflecting the incident light in the branch element 32 (see FIG. 1) which is a dichroic mirror, is reflected by the branch element 32. Therefore, it is mixed with the detection light L2 having the second wavelength ⁇ 2.
  • the second fluorescent Lb light having a wavelength shorter than the boundary wavelength ⁇ c passes through the branching element 32 and is mixed with the detection light L1 having the first wavelength ⁇ 1. Then, due to these contaminations, the accuracy of the two-dimensional image of the sample 18 may decrease.
  • the first wavelength ⁇ 1 and the second wavelength ⁇ 1 and the second wavelength ⁇ 1 and the second wavelength ⁇ 1 and the second wavelength ⁇ 1 pass through the portion of the detection optical system 20 through which the detection light L1 of the first wavelength ⁇ 1 and the detection light L2 of the second wavelength ⁇ 2 pass together.
  • a removal filter 21 for removing light in at least a part of the wavelength range BA between the wavelength ⁇ 2 and the wavelength ⁇ 2 is provided.
  • the removal filter 21 is, for example, a glass substrate on which an interference filter made of a multilayer film is formed, or a colored glass filter.
  • the removal filter 21 may be one that completely removes the light in the wavelength range BA, or may be one that dims the light.
  • the removal filter 21 By removing the light in the wavelength range BA by the removal filter 21, it is possible to prevent the above-mentioned light having an unfavorable wavelength from being mixed in the detector 40. This can prevent the accuracy of the two-dimensional image of the sample 18 from being lowered. Depending on the type of fluorescent substance contained in the sample 18, or if there is a low possibility that the accuracy of the two-dimensional image will deteriorate even if light of an unfavorable wavelength is mixed in, the removal filter 21 may not be provided. good.
  • the degree of contamination of light having an unfavorable wavelength is measured in advance or calculated by calculation, and the degree of contamination is determined by the point image intensity distribution hm (x, y, By reflecting it in ⁇ 1) and the point image intensity distribution hm (x, y, ⁇ 2), the influence of contamination can be reduced.
  • the point image intensity distribution hm (x, y, ⁇ 1) and the point image intensity distribution hm (x, y, ⁇ 2) can be made different. Therefore, similarly to the first embodiment described above, the two-dimensional density distribution of each fluorescent substance can be estimated with high accuracy by the calculation unit 61.
  • FIG. 4A is a diagram showing the image conversion unit 30a of the modification 1
  • FIG. 4B shows the first image 23a and the first image 23a formed on the detection surface 41 (see FIG. 1) by the image conversion unit 30a shown in FIG. 4A. It is a figure which shows the example of the 1st image 23b.
  • the configuration of the image conversion unit 30a of the first modification is substantially the same as that of the image conversion unit 30 shown in FIG. 1, but the image conversion element 31 is provided with cylindrical lenses 31b and 31c instead of the image rotator 31a. It's different.
  • the cylindrical lens 31b is arranged between the mirror 33 on the optical path of the detection light L1 and the merging element 35, and has an effect of converging the detection light L1 in the Y direction more strongly than in the X direction.
  • the cylindrical lens 31c is arranged between the mirror 34 on the optical path of the detection light L2 and the merging element 35, and has an effect of converging the detection light L2 in the Z direction more strongly than in the Y direction. That is, the cylindrical lenses 31b and 31c can be said to be optical members that add astigmatism to the passing light.
  • the size of the first image 23a on the detection surface 41 is reduced in size in the U direction as compared with the size in the V direction.
  • the size of the second image 23b on the detection surface 41 is reduced in the V direction as compared with the size in the U direction.
  • the shape of the first image 23a and the shape of the second image 23b on the detection surface 41 are made different from each other, so that the point image intensity distribution hm (x, y, ⁇ 1) and the point image intensity distribution hm (x, It can be different from y, ⁇ 2).
  • the cylindrical lenses 31b and 31c may be arranged so as to be rotated by substantially the same angle (for example, 90 °) with the directions along the optical paths of the detection light L1 and the detection light L2 as the rotation centers. Further, if one of the cylindrical lenses 31b and 31c is present, the shape of the first image 23a and the shape of the second image 23b are different from each other, so that the point image intensity distribution hm (x, y, ⁇ 1) and the point image are obtained. Since the intensity distribution hm (x, y, ⁇ 2) can be made different, only one of the cylindrical lenses 31b and 31c may be provided.
  • FIG. 5A is a diagram showing a part of the image conversion unit 30b of the modification 2, and is a diagram showing a portion corresponding to the part between the mirror 34 of the optical path of the detection light L2 in the image conversion unit 30 and the merging element 35. Is. In FIG. 5A, illustration of parts other than the above of the image conversion unit 30b is omitted.
  • the configuration of the image conversion unit 30b of the modification 2 is substantially the same as that of the image conversion unit 30 described above, except that the image conversion element 31 has a masking member 31d instead of the image rotator 31a.
  • the diameter (shape of the cross section) of the optical path of the detection light L2 is limited by the masking member 31d. That is, the diameter of the detection light L2o on the downstream side (merging element 35 side) of the masking member 31d is smaller than the diameter of the detection light L2i on the upstream side (mirror 34 side) of the masking member 31d.
  • FIG. 5B is a diagram showing an example of the first image 23a and the first image 23b formed on the detection surface 41 (see FIG. 1) by the image conversion unit 30b of the modification 2. Since the diameter of the optical path of the detection light L2 is limited by the masking member 31d, the numerical aperture (NA) when the detection light L2 is focused on the detection surface 41 by the condenser lens 22 is also reduced.
  • NA numerical aperture
  • the size of the second image 23b by the detection light L2 on the detection surface 41 is larger than the size of the first image 23a by the detection light L1.
  • the point image intensity distribution hm (x, y, ⁇ 1) and the point image intensity distribution hm (x, y, ⁇ 2) can be made different.
  • the masking member 31d may be provided not on the optical path of the detection light L2 but on the optical path of the detection light L1. Further, the shape of the opening of the masking member 31d may be any shape such as a circle or a polygon. Further, masking members 31d having different openings may be provided on the optical path of the detection light L1 and on the optical path of the detection light L2.
  • FIG. 6 is a diagram showing the image conversion unit 30c of the modification 3, the detector 40, the removal filter 21 included in the detection optical system 20, and the condenser lens 22.
  • the image conversion unit 30c of the modification 3 has a merging element 35a in which the light transmission and reflection characteristics of the merging element 35 of the image conversion unit 30 shown in FIG. 1 are inverted. That is, in the image conversion unit 30c of the modification 3, of the detected light Ld, the detected light L1 having the first wavelength ⁇ 1 passes through the branching element 32, is reflected by the mirror 33, reaches the merging element 35a, and reaches the merging element 35a. Is transmitted and becomes a part of the emitted light Le. On the other hand, the detection light L2 having the second wavelength ⁇ 2 is reflected by the branch element 32, reflected by the mirror 34 to reach the merging element 35a, reflected by the merging element 35a, and becomes a part of the emission light Le.
  • the above-mentioned image rotator 31a (see FIG. 2A) is arranged as an image conversion element 31 on the optical path of the detection light L2.
  • the image rotator 31a may be arranged on the optical path of the detection light L1.
  • the above-mentioned cylindrical lenses 31b and 31c (see FIG. 4A) or the masking member 31d (see FIG. 5A) are arranged on at least one of the optical path of the detection light L1 and the optical path of the detection light L2. May be.
  • the point image intensity distribution hm (x, y, ⁇ 1) and the point image intensity distribution hm (x, y, ⁇ 2) can also be made different by the image conversion unit 30c of the modification 3.
  • the branching element 32 and the merging element 35a may be configured by one integrated dichroic mirror 32a.
  • FIG. 7 is a diagram showing the image conversion unit 30d of the modification 4, the detector 40, the removal filter 21 included in the detection optical system 20, and the condenser lens 22.
  • the image conversion unit 30d of the modification 4 is substantially the same as the image conversion unit 30c of the modification 3 shown in FIG. 6 in which the branching element 32 and the merging element 35a are configured by one integrated dichroic mirror 32a. It has a similar configuration. However, the difference is that the incident angle of the detected light on the dichroic mirror 32a and the mirrors 33 and 34 is not about 45 °.
  • the image conversion element 31 is any of the above-mentioned image rotator 31a, cylindrical lens 31b, 31c, or masking member 31d arranged on the optical path of the detection light L1 or the detection light L2. It may be.
  • FIG. 8 is a diagram showing the image conversion unit 30e of the modification 5, the detector 40, the removal filter 21 included in the detection optical system 20, and the condenser lens 22.
  • the image conversion unit 30e of the modification 5 branches the incident detection light Ld into detection lights L1 to L3 that pass through three different optical paths according to the wavelength, merges them, and outputs the emission light Le. Is.
  • An image rotator 31a as the image conversion element 31 shown in FIG. 2A is provided on the optical path of the detection light L2 and on the optical path of the detection light L3.
  • the detected light L1 having the first wavelength ⁇ 1 passes through the branch element 32 and is reflected by the mirror 33. After that, the detection light L1 passes through the dichroic mirror 36b, becomes a part of the detection light L12, reaches the merging element 35, passes through the merging element 35, and becomes a part of the emission light Le.
  • the detection light L23 of the second wavelength ⁇ 2 and the third wavelength ⁇ 3 having a wavelength longer than the first wavelength ⁇ 1 is reflected by the branch element 32 and reaches the dichroic mirror 36a.
  • the detection light L2 having the second wavelength ⁇ 2 is reflected by the dichroic mirror 36a, passes through the image rotator 31a, is reflected by the dichroic mirror 36b, becomes a part of the detection light L12, reaches the merging element 35, and causes the merging element 35. It is transmitted and becomes a part of the emitted light Le.
  • the detection light L2 of the third wavelength ⁇ 3 having a wavelength longer than the second wavelength ⁇ 2 passes through the dichroic mirror 36a, is reflected by the mirror 34, passes through the image rotator 31a, reaches the merging element 35, and is reflected by the merging element 35. It becomes a part of the emission light Le.
  • the emitted light Le is collected by the condenser lens 22 after passing through the removal filter 21.
  • On the detection surface 41 of the detector 40 an image of an illuminated region 19 with light of each wavelength from the first wavelength ⁇ 1 to the third wavelength ⁇ 3 is formed in a state where at least a part thereof is overlapped.
  • the image rotator 31a on the optical path of the detection light L2 in the image conversion unit 30e of the modification 5 rotates the image of the illumination region 19 on the detection surface 41 by, for example, 120 °.
  • the image rotator 31a on the optical path of the detection light L3 rotates the image of the illumination region 19 on the detection surface 41 by, for example, 240 °.
  • the image conversion unit 30e of the modification 5 detects the images of the respective illumination regions 19 by the detection light L1 of the first wavelength ⁇ 1, the detection light L2 of the second wavelength ⁇ 2, and the detection light L3 of the third wavelength ⁇ 3.
  • the image conversion unit 30e of the modification 5 detects the images of the respective illumination regions 19 by the detection light L1 of the first wavelength ⁇ 1, the detection light L2 of the second wavelength ⁇ 2, and the detection light L3 of the third wavelength ⁇ 3.
  • each point image intensity distribution hm (x, y, ⁇ 1), point image intensity distribution hm (x, y, ⁇ 2), point image intensity distribution hm (x, y, ⁇ 3) is different. Therefore, even when each image of the detection lights L1 to L3 from the detection light of the first wavelength ⁇ 1 to the third wavelength ⁇ 3 of the illumination region 19 is formed on the detection surface 41 of one detector 40. ,
  • the two-dimensional density distribution of each fluorescent substance can be estimated with high accuracy.
  • the third wavelength ⁇ 3 is longer than the second wavelength ⁇ 2 and the second wavelength ⁇ 2 is longer than the first wavelength ⁇ 1, but the third wavelength ⁇ 3 is shorter than the second wavelength ⁇ 2 and the second wavelength.
  • ⁇ 2 may be shorter than the first wavelength ⁇ 1.
  • one of the image rotators 31a arranged on the optical path of the detection light L2 or the optical path of the detection light L3 may be arranged on the optical path of the detection light L1 instead.
  • the above-mentioned cylindrical lenses 31b, 31c and the masking member 31d may be arranged on the optical path of any two or more of the detection light L1 and the detection light L3.
  • FIG. 9A is a diagram showing the image conversion unit 30f of the modification 6, the detector 40, the removal filter 21 included in the detection optical system 20, and the condenser lens 22.
  • FIG. 9B is a diagram showing an example of the first image 23a and the first image 23b formed on the detection surface 41 by the image conversion unit 30f shown in FIG. 9A.
  • the configuration of the image conversion unit 30f of the modification 6 is almost the same as that of the image conversion unit 30 in the above-mentioned first embodiment shown in FIG. 1, but does not have the image conversion element 31. Instead, the mirror 33 included in the image conversion unit 30f is arranged so as to be rotated by a predetermined angle in the direction in the XZ plane.
  • the position of the first image 23a on the detection surface 41 is relative to the position of the second image 23b. Shift in the -V direction. Therefore, the point image intensity distribution hm (x, y, ⁇ 1) and the point image intensity distribution hm (x, y, ⁇ 2) can be made different.
  • the mirror 33 can be said to be an image shift portion that shifts the positions of the first image 23a and the second image 23b relative to the in-plane direction of the detection surface 41.
  • the direction in which the mirror 33 is rotated is not limited to the above-mentioned direction in the XZ plane, and may be any direction as long as it intersects the direction perpendicular to the reflection plane of the mirror 33. Therefore, the direction in which the first image 23a shifts on the detection surface 41 is not limited to the ⁇ V direction, and may be any direction.
  • FIG. 10 is a diagram showing the image conversion unit 30 g of the modification 7, the detector 40, the removal filter 21 included in the detection optical system 20, and the condenser lens 22.
  • the detection light L1 having the first wavelength ⁇ 1 passes through the branch element 32 and is reflected by the mirror 33. After that, the detection light L1 passes through the image conversion element 31, is reflected by the mirror 33a and the mirror 33b, and returns to the branch element 32. Then, it passes through the branch element 32 again and becomes a part of the emitted light Le.
  • the detected light L2 having a second wavelength ⁇ 2 having a wavelength longer than that of the first wavelength ⁇ 1 is reflected by the branching element 32 and becomes a part of the emitted light Le.
  • the image conversion element 31 may be any of the image rotator 31a, the cylindrical lenses 31b, 31c, or the masking member 31d described above.
  • the point image intensity distribution hm (x, y, ⁇ 1) and the point image intensity distribution hm (x, y, ⁇ 2) can be made different by the image conversion unit 30g of the modification 7. Therefore, similarly to the first embodiment described above, the two-dimensional density distribution of each fluorescent substance can be estimated with high accuracy by the calculation unit 61.
  • the branching element 32 also has a function as a merging element 35 in the image conversion unit 30 of the first embodiment shown in FIG. That is, the branching element 32 and the merging element 35 are also used in one branching element 32.
  • FIG. 11 is a diagram showing the image conversion unit 30h of the modification 8, the detector 40, the removal filter 21 included in the detection optical system 20, and the condenser lens 22.
  • the image conversion unit 30h of the modification 8 is obtained by replacing the three mirrors 33, 33a, 33b included in the image conversion unit 30g of the modification 7 with two mirrors 33, 33c. With this configuration, the number of mirrors can be reduced.
  • the image conversion element 31 may be omitted in the image conversion unit 30g of the modification 7 and the image conversion unit 30h of the modification 8.
  • the modified example 7 is detected by rotating the mirrors 33, 33a, 33b in the XZ plane by a predetermined angle in the same manner as the image conversion unit 30f of the modified example 6 described above.
  • the position of the first image 23a on the surface 41 may be shifted with respect to the position of the second image 23b.
  • the detection light L1 having the first wavelength ⁇ 1 of the detection light Ld is transmitted through the branch element 32 and reflected by the mirror 33 and the mirror 33c, that is, reflected twice. Return to the branch element 32.
  • the detected light L2 having the second wavelength ⁇ 2 reflects the branching element 32, that is, reflects once and becomes a part of the emitted light Le. Since the evenness and oddness of the number of reflections in the image conversion unit 30h differs between the detection light L1 and the detection light L2, the first image 23a formed on the detection surface 41 is mirrored with respect to the first image 23b. Since the image is inverted), the mirrors 33 and 33c may or may not be rotated by a predetermined angle in the direction in the XZ plane.
  • FIG. 12 is a diagram showing the image conversion unit 30i of the modification 9, the detector 40, the removal filter 21 included in the detection optical system 20, and the condenser lens 22.
  • the image conversion unit 30i of the modification 9 has a branch element 32 and two mirrors 33 and 33c as one prism 37, whereas the image conversion unit 30h of the modification 8 described above omits the image conversion element 31. It was replaced with.
  • a dichroic mirror is formed on one surface 37a of the prism 37 by a multilayer film or the like, and a highly reflective film is formed on the two surfaces 37b and 37c of the prism 37.
  • FIG. 13 is a diagram showing the image conversion unit 30j of the modification 10, the detector 40, the removal filter 21 included in the detection optical system 20, and the condenser lens 22.
  • the image conversion unit 30j of the modification 10 has a triangular prism 38 and a corner cube mirror 31e.
  • a dichroic mirror is formed on the first surface 38a and the second surface 38b of the triangular prism 38 by a multilayer film or the like.
  • the corner cube mirror 31e is a general mirror having three reflective surfaces orthogonal to each other. Since FIG. 13 is a cross-sectional view, only two of the reflective surfaces are shown.
  • the detection light L1 having the first wavelength ⁇ 1 passes through the first surface 38a and is reflected three times, that is, by the three orthogonal reflection surfaces of the corner cube mirror 31e. ..
  • the detected light L1 is further reflected by the second surface 38b of the triangular prism 38 and becomes a part of the emitted light Le.
  • the detection light L1 is reflected in the image conversion unit 30j a total of four times (even number of times) as described above.
  • the detected light L2 having the second wavelength ⁇ 2 is reflected by the first surface 38a, passes through the second surface 38b of the triangular prism 38, and becomes a part of the emitted light Le. ..
  • the detection light L2 is reflected only once (odd number times) in the image conversion unit 30j.
  • the first image 23a formed on the detection surface 41 is mirrored with respect to the first image 23b. It becomes an inverted image). Therefore, even in the image conversion unit 30j of the modification 10, the point image intensity distribution hm (x, y, ⁇ 1) and the point image intensity distribution hm (x, y, ⁇ 2) can be made different.
  • the first surface 38a has a function as a branch element 32 in the image conversion unit 30 of the first embodiment shown in FIG. Further, the second surface 38b has a function as a merging element 35.
  • the image conversion unit 30j of the modified example 10 may also be provided with the various image conversion elements 31 described above in the optical path of the detection light L1. Further, the position of the first image 23a on the detection surface 41 is changed to the position of the second image 23b by slightly shifting the angular relationship of the three reflecting surfaces constituting the corner cube mirror 31e from the directions orthogonal to each other. It may be shifted to. In this case, the corner cube mirror 31e can be said to be an image shift portion that shifts the positions of the first image 23a and the second image 23b relative to the in-plane direction of the detection surface 41.
  • FIG. 14A is a diagram showing the image conversion unit 30k of the modification 11, the detector 40, the removal filters 21a and 21b included in the detection optical system 20, and the condenser lens 22.
  • the image conversion unit 30k of the modification 11 has a branch element 32 and a roof prism (dach prism) 31f.
  • the roof prism 31f has a first reflecting surface 31fb on the back side of the paper surface and a second reflecting surface 31fc on the front side of the paper surface with the ridge line 31fa as a boundary.
  • the detection light L1 having the first wavelength ⁇ 1 passes through the branch element 32 and is incident on the roof prism 31f. Then, the detection light L1 is reflected by the first reflection surface 31fb and the second reflection surface 31fc of the roof prism 31f, then passes through the removal filter 21a, and is condensed by the condenser lens 22 to be condensed on the detection surface.
  • the first image 23a is formed on the 41.
  • the detection light L2 having the first wavelength ⁇ 2 is reflected by the branch element 32, passes through the removal filter 21b, is collected by the condenser lens 22, and is condensed by the condenser lens 22.
  • the second image 23b is formed on the top.
  • the condenser lens 22 also has a function as a merging element 35 in the image conversion unit 30 of the first embodiment shown in FIG.
  • the various image conversion elements 31 described above may be provided in the optical path of the detection light L1 or in the optical path of the detection light L2. Further, the position of the first image 23a on the detection surface 41 may be shifted with respect to the position of the second image 23b by slightly shifting the angle at which the roof prism 31f is arranged. In this case, the roof prism 31f can be said to be an image shift portion that shifts the positions of the first image 23a and the second image 23b relative to the in-plane direction of the detection surface 41.
  • FIG. 14B is a diagram showing the image conversion unit 30l of the modification 12, the detector 40, the removal filters 21a and 21b included in the detection optical system 20, and the condenser lens 22.
  • the image conversion unit 30l of the modification 12 is obtained by adding a so-called parallelogram prism 39 to the detector 40 side of the roof prism 31f of the optical path of the detection light L2 with respect to the image conversion unit 30k of the modification 11. ..
  • the parallelogram prism 39 can reduce the distance between the optical path of the detection light L1 and the optical path of the detection light L2 at the positions of the removal filter 21 and the condenser lens 22. As a result, the sizes of the removal filter 21 and the condenser lens 22 can be reduced, or the removal filter 21 required for the image conversion unit 30k of the modified example 11 can be reduced to one.
  • FIG. 15 is a diagram showing the image conversion unit 30 m of the modification 13, the detector 40, the removal filter 21 included in the detection optical system 20, and the condenser lens 22.
  • the image conversion unit 30m of the modification 13 has a lens 25a, a diffraction grating 32b, a lens 26a, and an image conversion element 31 arranged on the optical path of the detection light L2.
  • the detected light Ld incident on the image conversion unit 30 m is condensed by the lens 25a and irradiated on the diffraction grating 32b.
  • the detection light L1 having the first wavelength ⁇ 1 of the detection light Ld is diffracted by the diffraction grating 32b at a predetermined angle. After that, the light is made substantially parallel by the lens 26a, passes through the removal filter 21, and is condensed by the condenser lens 22 to form the first image 23a on the detection surface 41.
  • the detection light L2 having the first wavelength ⁇ 2 of the detection light Ld is diffracted by the diffraction grating 32b at an angle larger than that of the detection light L1. After that, the detection light L2 is converted into substantially parallel light by the lens 26a, passes through the removal filter 21, is condensed by the condenser lens 22, and forms the second image 23b on the detection surface 41.
  • the point image intensity distribution hm (x, y, ⁇ 1) and the point image intensity distribution hm (x, y,) are provided by the image conversion element 31 arranged on the optical path of the detection light L2. It can be different from ⁇ 2).
  • the image conversion element 31 the various elements described above can be used.
  • the image conversion element 31 may be arranged on the optical path of the detection light L1 instead of the optical path of the detection light L2.
  • the diffraction grating 32b has a function as a branching element 32 in the image conversion unit 30 of the first embodiment shown in FIG. Further, the condenser lens 22 has a function as a merging element 35.
  • FIG. 16A is a diagram showing an image conversion unit 30n of a modification 14, a detector 40, a removal filter 21 included in the detection optical system 20, and a condenser lens 22.
  • the image conversion unit 30n of the modification 14 is arranged on the optical path of the detection light L2 between the branch element 32, the lens 26b, the lens 26c, the merging element 35, and the branch element 32 and the lens 26b. It has an element 31.
  • the detection light L1 having the first wavelength ⁇ 1 passes through the branch element 32, passes through the lens 26b and the lens 26c, and reaches the merging element 35.
  • the detection light L1 passes through the merging element 35 and becomes a part of the emission light Le.
  • the detected light L2 having the second wavelength ⁇ 2 is reflected by the branching element 32 and is incident on the image conversion element 31. After that, the detection light L2 passes through the lens 26b and the lens 26c and reaches the merging element 35. The detection light L2 is reflected by the merging element 35 and becomes a part of the emission light Le.
  • the point image intensity distribution hm (x, y, ⁇ 1) and the point image intensity distribution hm (x, y,) are provided by the image conversion element 31 arranged on the optical path of the detection light L2. It can be different from ⁇ 2).
  • the image conversion element 31 the various elements described above can be used.
  • the image conversion element 31 may be arranged on the optical path of the detection light L1 instead of the optical path of the detection light L2.
  • FIG. 16B is a diagram showing the image conversion unit 30o of the modification 15, the detector 40, the removal filter 21 included in the detection optical system 20, and the condenser lens 22.
  • the image conversion unit 30o of the modification 15 has almost the same configuration as the image conversion unit 30n of the modification 14, but the image conversion element 31 is arranged on the optical path of the detection light L2 between the lens 26b and the lens 26c. The point is different from the image conversion unit 30n.
  • the point image intensity distribution hm (x, y, ⁇ 1) and the point image intensity distribution hm (x, y,) are provided by the image conversion element 31 arranged on the optical path of the detection light L2. It can be different from ⁇ 2).
  • the microscope 1 of the first embodiment and each modification has an illumination optical system 10 that collects illumination light to form an illumination region 19 on a sample 18, an illumination region 19 and a sample 18.
  • a detection optical system 20 formed on the detection surface 41 of the detector 40 is provided.
  • the detection optical system 20 forms the detection surface 41 by superimposing at least a part of the first image 23a and the second image 23b on the detection surface 41, and forms the first image 23a and the second image 23b on the surface of the detection surface 41.
  • One of the first image 23a and the second image 23b is inverted in the plane of the detection surface 41, and the shape of the first image 23a and the shape of the second image 23b on the detection surface 41 are rotated relatively in the inner direction.
  • It has an image conversion unit 30 that performs at least one of the above. With this configuration, the first image 23a by the detection light L1 of the first wavelength ⁇ 1 and the second image 23b by the detection light L2 of the second wavelength ⁇ 2 are imaged on the detection surface 41 of one detector 40, respectively.
  • the microscope 1 of the first embodiment and each modification has an illumination optical system 10 that collects illumination light to form an illumination region 19 on a sample 18, and an illumination region 19.
  • 20 is provided with a detection optical system 20 formed on the detection surface 41 of the detector 40.
  • the detection optical system 20 forms the detection surface 41 by superimposing at least a part of the first image 23a and the second image 23b on the detection surface 41, and forms the first image 23a and the second image 23b on the surface of the detection surface 41. It has an image shift portion (mirror 33, corner cube mirror 31e, roof prism 31f) whose position is relatively shifted in the inner direction, and the first image 23a and the second image 23b are each a single spot image.
  • the first image 23a by the detection light L1 of the first wavelength ⁇ 1 and the second image 23b by the detection light L2 of the second wavelength ⁇ 2 are formed on the detection surface 41 of one detector 40, respectively.
  • the two-dimensional density distribution of the fluorescent substance can be estimated with high accuracy. As a result, the number of detectors 40 such as an expensive avalanche photodiode array required for detection can be reduced, and the microscope 1 can be provided at low cost.
  • various embodiments and modifications estimate the density of the fluorescent substance that generates fluorescence at the first wavelength ⁇ 1 and the density of the fluorescent substance that generates fluorescence at the second wavelength ⁇ 2.
  • it can be changed to an apparatus for estimating the density of the fluorescent substance that generates polarization only by changing the configuration of the image conversion unit 30. For example, if the branching element 32 and the merging element 35a in FIG. 6 are changed to a polarizing beam splitter (PBS), the device estimates the density of the fluorescent substance that emits p-polarization and the density of the fluorescent substance that emits s-polarization.
  • PBS polarizing beam splitter
  • the PBS replaced with the branching element 32 is referred to as the first PBS
  • the PBS replaced with the merging element 35a is referred to as the second PBS.
  • the p-polarized light is transmitted through the first PBS and the s-polarized light is reflected by the first PBS. Therefore, of the detected light Ld, the detected light of the p-polarized light is transmitted through the first PBS and is a mirror. It is reflected at 33 to reach the second PBS, passes through the second PBS, and becomes part of the emitted light.
  • the s-polarized detection light is reflected by the first PBS, reflected by the mirror 34, reaches the second PBS, is reflected by the second PBS, and becomes a part of the emitted light.
  • An image rotator 31a (see FIG. 2A) is arranged as an image conversion element 31 on the s-polarized optical path.
  • the image conversion unit of this modification can also make the two point image intensity distributions described later different from each other. Further, by placing a wave plate upstream of the branching element 32, it also serves as a device for estimating the densities of fluorescent substances that emit two arbitrary orthogonal polarizations, such as clockwise circular polarization and counterclockwise circular polarization.
  • Equation (2) When the light to be detected is two arbitrary orthogonal polarizations, the equation (2) is modified as the following equation (2)'.
  • ⁇ (x, y, p1) represents the density of the fluorescent substance that emits the polarization p1 in the sample 18, and ⁇ (x, y, p2) is. It represents the density of the fluorescent substance that emits the polarized light p2 in the sample 18.
  • hm (x, y, p1) represents a point image intensity distribution (PSF) in a two-dimensional image generated by the detection light of the polarized light p1 detected by the m-th detection pixel 42 of the detector 40, and hm (x).
  • PSF point image intensity distribution
  • Y, p2 represent a point image intensity distribution (PSF) in a two-dimensional image generated by the detection light of the polarized light p2 detected by the m-th detection pixel 42 of the detector 40. Since this equation has exactly the same form as the equation (2), it is possible to estimate ⁇ (x, y, p1) and ⁇ (x, y, p2) using the above algorithm.
  • PSF point image intensity distribution
  • the detector 40 is directly arranged at the position of the image 23 in the illumination region 19.
  • one end (incident end) of an optical distribution element such as an optical fiber bundle is arranged at the position of the image 23 in the illumination region 19, and the other end (injection end) of the optical distribution element is arranged.
  • FIG. 17 is a diagram showing the entire detector 200 of the modified example.
  • the detector 200 of the modified example includes a photoelectric detector array 206 arranged one-dimensionally and an optical fiber bundle 201 that supplies light to the photoelectric detector array 206.
  • the optical fiber bundle 201 is formed from a single optical fiber 204.
  • One end (incident end) 202 of the optical fiber bundle 201 is arranged on the surface where the images 23a and 23b of the illumination region 19 are formed, and at one end 202, each single optical fiber 204 is densely arranged. ..
  • the other end (ejection end) of each optical fiber 204 in the optical fiber bundle 201 is arranged along a plug 205 extending in one dimension.
  • the other end (ejection end) 205 of each optical fiber 204 faces each photoelectric conversion surface 208 of the photoelectric detector array 206 arranged one-dimensionally.
  • the optical fiber bundle 201 corresponds to an optical distribution element that distributes light.
  • the optical distribution element is not limited to the optical fiber bundle, and other existing waveguides can be used.
  • the diameter of the incident end of each optical fiber 204 (to be exact, the diameter of the core of the fiber) is on the sample 18 when the wavelength of the first wavelength ⁇ 1 or the second wavelength ⁇ 2 is ⁇ and the numerical aperture of the objective lens 16 is NA. It is desirable that the length is set to, for example, about 0.2 ⁇ ⁇ / NA.
  • a light-collecting element array such as a microlens array may be arranged in front of the incident end of each optical fiber 204. In this case, for example, the incident end of each optical fiber 204 may be arranged at the position of the image formed via the light collecting element array.
  • the degree of freedom in arranging the photoelectric conversion unit is increased, and a larger photoelectric conversion unit can be used.
  • a highly sensitive and highly responsive photoelectric conversion unit such as a PIN photodiode or a photomultiplier tube can be used, and the S / N ratio of the two-dimensional image of the sample 18 can be improved.
  • the incident end of the optical fiber bundle 201 is a portion where the incident ends of the optical fibers that detect (photoelectrically convert) light by the photoelectric conversion unit arranged downstream thereof are two-dimensionally arranged, they are arranged two-dimensionally. It can be interpreted as a plurality of detectors.

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Abstract

顕微鏡は、照明光を集光して試料に照明領域を形成する照明光学系と、照明領域と試料とを相対的に走査させる走査部と、検出面内に検出部が複数配列されている検出器と、照明領域が形成された試料からの第１波長の光による第１像、および照明領域が形成された試料からの第１波長とは異なる第２波長の光による第２像を、検出器の検出面に形成する検出光学系と、を備え、検出光学系は、第１像と第２像との少なくとも一部を重ね合わせて検出面に形成するとともに、第１像と第２像とを検出面の面内の方向に相対的に回転させる、第１像もしくは第２像の一方を検出面の面内において反転させる、および検出面における第１像の形状と第２像の形状とを異ならせる、のうち少なくとも１つを行う像変換部を有する。

Description

顕微鏡
　本発明は、顕微鏡に関する。
　本願は、２０２０年９月２日に出願された日本国特願２０２０－１４７６４２号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　試料に照明光を集光して照射し、試料から生じる蛍光を検出画素が複数配列されている検出器で検出する走査型顕微鏡（以下、Image Scanning Microscope、略して「ＩＳＭ」とも呼ぶ）が提案されている（特許文献１）。
　また、検出画素が複数配列されている検出器上に形成された、複数の異なる波長の蛍光による像を受光し、数学的な処理により、これらの複数の蛍光による像をそれぞれ分離して検出する方法が提案されている（非特許文献１）。
米国特許第９６３２２９６号明細書
FRANZISKA STRASSER、他３名、「Spectral image scanning microscopy」、BIOMEDICAL OPTICS EXPRESS 2513、米国、The Optical Society、第１０巻、第５号、[Online]、平成31年4月22日、［令和2年9月1日検索］、インターネット＜URL：https://www.osapublishing.org/boe/fulltext.cfm?uri=boe-10-5-2513&id=409205＞
　第１の態様によると、顕微鏡は、照明光を集光して試料に照明領域を形成する照明光学系と、前記照明領域と前記試料とを相対的に走査させる走査部と、検出面内に検出部が複数配列されている検出器と、前記照明領域が形成された前記試料からの第１波長の光による第１像、および前記照明領域が形成された前記試料からの前記第１波長とは異なる第２波長の光による第２像を、前記検出器の前記検出面に形成する検出光学系と、を備え、前記検出光学系は、前記第１像と前記第２像との少なくとも一部を重ね合わせて前記検出面に形成するとともに、前記第１像と前記第２像とを前記検出面の面内の方向に相対的に回転させる、前記第１像もしくは前記第２像の一方を前記検出面の面内において反転させる、および前記検出面における前記第１像の形状と前記第２像の形状とを異ならせる、のうち少なくとも１つを行う像変換部を有する。
　第２の態様によると、顕微鏡は、照明光を集光して試料に照明領域を形成する照明光学系と、前記照明領域と前記試料とを相対的に走査させる走査部と、検出面内に検出部が複数配列されている検出器と、前記照明領域が形成された前記試料からの第１波長の光による第１像、および前記照明領域が形成された前記試料からの前記第１波長とは異なる第２波長の光による第２像を、前記検出器の前記検出面に形成する検出光学系と、を備え、前記検出光学系は、前記第１像と前記第２像との少なくとも一部を重ね合わせて前記検出面に形成するとともに、前記第１像と前記第２像とを前記検出面の面内の方向に相対的に位置シフトさせる像シフト部を有し、前記第１像および前記第２像が、それぞれ単一のスポット像である。
　第３の態様によると、顕微鏡は、照明光を集光して試料に照明領域を形成する照明光学系と、前記照明領域と前記試料とを相対的に走査させる走査部と、検出面内に検出部が複数配列されている検出器と、前記照明領域が形成された前記試料からの第１偏光の光による第１像、および前記照明領域が形成された前記試料からの前記第１偏光とは異なる第２偏光の光による第２像を、前記検出器の前記検出面に形成する検出光学系と、を備え、前記検出光学系は、前記第１像と前記第２像との少なくとも一部を重ね合わせて前記検出面に形成するとともに、前記第１像と前記第２像とを前記検出面の面内の方向に相対的に回転させる、前記第１像もしくは前記第２像の一方を前記検出面の面内において反転させる、および前記検出面における前記第１像の形状と前記第２像の形状とを異ならせる、のうち少なくとも１つを行う像変換部を有する。
第１実施形態の顕微鏡の構成を模式的に示す図。 図２Ａは、像変換部に含まれる像変換素子の一例を示す図。 図２Ｂは、第１実施形態の顕微鏡における検出面上の像の一例を示す図。 試料から発せられる蛍光のスペクトル分布の一例と、除去フィルタの機能の一例を示す図。 図４Ａは、像変換部の変形例１を示す図。 図４Ｂは、像変換部の変形例１により形成される検出面上の像の例を示す図。 図５Ａは、像変換部の変形例２における像変換素子を示す図。 図５Ｂは、像変換部の変形例２により形成される検出面上の像の例を示す図。 像変換部の変形例３を示す図。 像変換部の変形例４を示す図。 像変換部の変形例５を示す図。 図９Ａは、像変換部の変形例６を示す図。 図９Ｂは、像変換部の変形例６により形成される検出面上の像の例を示す図。 像変換部の変形例７を示す図。 像変換部の変形例８を示す図。 像変換部の変形例９を示す図。 像変換部の変形例１０を示す図。 図１４Ａは、像変換部の変形例１１を示す図。 図１４Ｂは、像変換部の変形例１２を示す図。 像変換部の変形例１３を示す図。 図１６Ａは、像変換部の変形例１４を示す図。 図１６Ｂは、像変換部の変形例１５を示す図。 図１７は、変形例の検出器の全体を示す図。
（第１実施形態の顕微鏡）
　図１は、第１実施形態の顕微鏡１の構成を模式的に示す図である。なお、第１実施形態の顕微鏡１は、後述する像変換部３０および除去フィルタ２１以外については、その構成は、上述した従来のImage scanning microscope(ＩＳＭ）と同様である。
　以下の実施形態において、顕微鏡１は走査型の蛍光顕微鏡であるものとして説明するが、実施形態に係る顕微鏡は、蛍光顕微鏡に限定されない。
　以下、説明において、対物レンズ１６の光軸に平行な下向き方向を＋Ｚ方向とするＸＹＺ座標系を適宜参照する。
　顕微鏡１は、対物レンズ１６、リレーレンズ１３、リレーレンズ１５、偏向部１２、分岐ミラー１１、像変換部３０、検出器４０等を備えている。
　光源部５０は、それぞれ異なる波長の光を発する複数のレーザー等の光源５１ａ、５１ｂを有し、それぞれの光源５１ａ、５１ｂから発せられた光は、レンズ５２ａ、５２ｂにより整形および平行化される。そして、ミラー５４およびダイクロイックミラー５３により１つの光束に収束されて、照明光Ｌｉとして光源部５０から射出され、破線で囲んだ領域内に配置されている照明光学系１０に供給される。
　光源５１ａ、５１ｂは、連続発振光を射出するレーザー、もしくはパルス光を射出するレーザーのどちらであってもよい。また、光源５１ａ、５１ｂは、レーザーでなくてもよく、ＬＥＤや輝線ランプであってもよい。
　また、光源部５０は、光源５１ａ、５１ｂを必ずしも複数有する必要は無く、１つの光源５１ａを有するものであっても良い。
　照明光学系１０に入射した照明光Ｌｉは、ダイクロイックミラー等からなる分岐ミラー１１を透過して、偏向部１２に入射する。偏向部１２には、一例としてＸ方向偏向ミラー１２ａおよびＹ方向偏向ミラー１２ｂが設けられている。Ｘ方向偏向ミラー１２ａおよびＹ方向偏向ミラー１２ｂにより反射された照明光Ｌｉは、リレーレンズ１３により集光されて、中間結像点１４に集光する。
　照明光Ｌｉは、その後、リレーレンズ１５を経て対物レンズ１６に入射し、対物レンズ１６により、ステージ１７上に保持されている試料１８上に集光される。従って、試料１８上には、照明光Ｌｉが対物レンズ１６の解像限界程度の大きさに集光された照明領域１９が形成される。
　照明光学系１０は、照明光Ｌｉの光路に沿って配置されている分岐ミラー１１、偏向部１２、リレーレンズ１３、１５、および対物レンズ１６を含む。
　Ｘ方向偏向ミラー１２ａおよびＹ方向偏向ミラー１２ｂは、試料１８に対して、対物レンズ１６およびリレーレンズ１３、１５を介して、ほぼ対物レンズ１６の瞳面の共役面（または対物レンズ１６の瞳面）となる位置に配置されている。そして、偏向部１２のＸ方向偏向ミラー１２ａが所定方向に揺動することにより、照明領域１９は、試料１８上をＸ方向に移動（振動）する。また、Ｙ方向偏向ミラー１２ｂが所定方向に揺動することにより、照明領域１９は、試料１８上をＹ方向に移動（振動）する。
　従って、制御部６０が制御信号Ｓ１により偏向部１２を制御する、すなわちＸ方向偏向ミラー１２ａおよびＹ方向偏向ミラー１２ｂの揺動位置を制御することにより、照明領域１９を試料１８上でＸＹ方向の２次元に走査させることができる。
　Ｘ方向偏向ミラー１２ａおよびＹ方向偏向ミラー１２ｂは、ガルバノミラー、ＭＥＭＳミラー、レゾナントミラー（共振型ミラー）等で構成することができる。
　なお、制御部６０が、制御信号Ｓ２により、試料１８を保持するステージ１７を制御してＸ方向およびＹ方向に移動させることにより、照明領域１９とステージ１７上の試料１８とを相対的に走査させる構成としても良い。また、偏向部１２による走査と、ステージ１７による走査を、両方行う構成としても良い。
　偏向部１２およびステージ１７の少なくとも一方を、照明領域１９とステージ１７上の試料１８とを相対的に走査させる走査部であるということもできる。演算部６１を含む制御部６０は、走査部である偏向部１２またはステージ１７を制御することにより、照明領域１９と試料１８との相対位置関係を制御する。
　試料１８としては、例えば予め蛍光染色された細胞などを使用するが、必ずしも蛍光を発する物質には限られない。また、試料１８としては、蛍光を発する物質を使用する場合には、光源５１ａ、５１ｂの波長として、試料１８に含まれる蛍光物質を励起する波長を選択することが好ましい。なお、試料１８としては、蛍光を発する物質を使用する場合には、光源５１ａ、５１ｂの波長として、試料１８に含まれる蛍光物質を多光子励起する波長を選択してもよい。
　なお、光源部５０は、顕微鏡１に交換可能（取り付け可能、取り外し可能）に設けられてもよく、顕微鏡１による観察時などに顕微鏡１に外付けされてもよい。
　照明領域１９への照明光Ｌｉの照射により試料１８から発せられた光（検出光）Ｌｄは、対物レンズ１６に入射し、対物レンズ１６により屈折され、リレーレンズ１５，１３を経て、偏向部１２に至る。そして、偏向部１２のＹ方向偏向ミラー１２ｂおよびＸ方向偏向ミラー１２ａでそれぞれ反射される。Ｙ方向偏向ミラー１２ｂおよびＸ方向偏向ミラー１２ａでの反射により、検出光Ｌｄは、照明光Ｌｉとほぼ同じ光路に戻されて（デスキャンされて）、分岐ミラー１１に至る。
　そして、検出光Ｌｄは、分岐ミラー１１で反射されて、破線で囲んだ領域内に配置されている像変換部３０に入射する。
　なお、上記においては、分岐ミラー１１は照明光Ｌｉを透過し、検出光Ｌｄを反射して光を分岐しているが、分岐ミラー１１は照明光Ｌｉを反射し、検出光Ｌｄを透過して光を分岐するようなミラーであってもよい。
　第１実施形態の顕微鏡の像変換部３０は、入射する光の波長に応じて、その光を透過または反射する一例としてダイクロイックミラーである分岐素子３２と合流素子３５とを備えている。検出光Ｌｄのうち、第１波長λ１の検出光Ｌ１は分岐素子３２を透過し、ミラー３３で反射されて合流素子３５に至り、合流素子３５で反射される。一方、一例として、第１波長λ１より波長の長い第２波長λ２の検出光Ｌ２は分岐素子３２で反射され、ミラー３４で反射されて合流素子３５に至り、合流素子３５を透過する。
　第１波長λ１の検出光Ｌ１および第２波長λ２の検出光Ｌ２は合流素子３５により合流されて、射出光Ｌｅとなって像変換部３０から射出される。射出光Ｌｅは、後述する除去フィルタ２１により一部の波長の光が除去された後に、集光レンズ２２により集光され、検出器４０の検出面４１に試料１８における照明領域１９の像２３を形成する。
　なお、第２波長λ２の検出光Ｌ２は、第１波長λ１の検出光Ｌ１よりも波長の短い光であっても良い。
　像変換部３０内の検出光Ｌ１の光路の傍らには、遮光板Ｃ１が検出光Ｌ１の光路に装脱可能に設けられ、検出光Ｌ２の光路の傍らには、遮光板Ｃ２が検出光Ｌ２の光路に装脱可能に設けられている。遮光板Ｃ１および遮光板Ｃ２については後述する。
　検出光Ｌｄの光路に沿って配置されている対物レンズ１６、リレーレンズ１５、１３、偏向部１２、分岐ミラー１１、像変換部３０、除去フィルタ２１および集光レンズ２２は、検出光学系２０（点線で囲った領域）を構成している。検出光学系２０は、試料１８の照明領域１９の第１波長λ１の検出光Ｌ１による第１像と、第２波長λ２の検出光Ｌ２による第２像とを、それらの少なくとも一部を重ね合わせて検出器４０の検出面４１に形成する。
　図２Ｂは、第１実施形態の顕微鏡１における検出器４０の検出面４１における試料１８の照明領域１９の第１波長λ１の検出光Ｌ１による第１像２３ａと、第２波長λ２の検出光Ｌ２による第２像２３ｂとの一例を示す図である。一点鎖線で示した第１像２３ａの輪郭、および二点鎖線で示した第２像２３ｂの輪郭は、一例として、光強度がそれぞれの像のピーク強度の１５％の値となる位置（境界線）を示している。
　図２Ｂに示したように、第１像２３ａおよび第２像２３ｂは、検出面４１において、それぞれ単一のスポット像となる。
　図１においては、検出面４１はＹＺ面に平行になるように配置されているが、検出面４１の向きは、検出光学系２０内の反射面（分岐ミラー１１、分岐素子３２等）の配置によって如何様にも変化する。そこで、本明細書および図面においては、検出面４１については、図２Ｂに矢印で示したＵ方向およびＶ方向を基準として説明する。Ｕ方向およびＶ方向は、図１に示した試料１８上でのＸ方向およびＹ方向が、検出光学系２０により第１波長λ１の検出光Ｌ１の光路を通って検出面４１にそれぞれ投影される方向である。
　検出面４１には、一例としてＵ方向に５個、Ｖ方向に５個の計５×５＝２５個の検出画素４２が配置されている。１つの検出画素４２のＵ方向およびＶ方向の幅は、第１波長λ１または第２波長λ２の波長をλ、対物レンズ１６の開口数をＮＡとするとき、試料１８上の長さに換算して、例えば、０．２×λ／ＮＡ程度である。
　検出器４０としては、例えば、高感度かつ高応答性を備えるアバランシェフォトダイオードアレイを用いることができる。
　なお、それぞれの検出画素４２は、必ずしもＵ方向およびＶ方向に平行に配置されている必要はなく、検出面４１内においてＵ方向およびＶ方向から回転した方向に沿って配置されていても良い。
　また、検出画素４２のそれぞれは、検出面４１内に密に配置されていなくても良く、離散的に配置されていても良い。また、検出画素４２のそれぞれは、２次元的にではなく、１次元に配置されていても良い。
　第１実施形態の顕微鏡１においては、第１像２３ａと第２像２３ｂとを、少なくとも一部を重ね合わせて検出面４１に形成しているため、第１像２３ａと第２像２３ｂとを撮像するための検出画素４２の合計面積を小さくすることができる。従って、検出画素４２の合計面積の小さな、すなわち安価な検出器４０を用いても、後述するように試料１８の高精度な２次元画像を得ることができる。
　検出画素４２の合計面積は、一例として、検出面４１内における第１像２３ａおよび第２像２３ｂの合計面積の１．５倍以下とすることもできる。ここで、第１像２３ａおよび第２像２３ｂのそれぞれの面積は、図２Ｂに一点鎖線および二点鎖線で示したそれぞれの像の輪郭の内部の面積である。
　検出面４１に配置されているそれぞれの検出画素４２が受光した光は、その光量に応じた電気信号である光量信号Ｓ３に変換され、制御部６０の中の演算部６１に伝達される。演算部６１は、従来のＩＳＭと同様に、各検出画素４２からの光量信号Ｓ３と、その光量信号Ｓ３を検出した際の照明領域１９と試料１８とのＸ方向およびＹ方向の相対位置関係とに基づいて、試料１８の２次元画像を生成する。
　すなわち、照明領域１９と試料１８との相対的な位置関係を表すＸ方向およびＹ方向の各座標位置（ｘ，ｙ）と、その各座標位置（ｘ，ｙ）において各検出画素４２の１つから検出された光量信号Ｓ３との関係が、１つの検出画素４２が生成した１つの２次元画像である。
　検出面４１には、第１波長λ１の検出光Ｌ１による第１像２３ａと第２波長λ２の検出光Ｌ２による第２像２３ｂとが概ね重なって形成されている。従って、上記で生成された検出画素４２毎の２次元画像は、第１波長λ１の検出光Ｌ１により検出された２次元画像と、第２波長λ２の検出光Ｌ２により検出された２次元画像とが混合されたものとなっている。
　演算部６１は、照明領域１９と試料１８との相対的な位置関係を変化させることにより検出器４０の各検出画素４２で検出された複数の波長の検出光（Ｌ１、Ｌ２）により生成される２次元画像（検出画素は合計２５個なので、２５枚）から、第１波長λ１、第２波長λ２それぞれの蛍光物質の２次元密度分布を推定する処理を行う。この推定処理は、CLEMENS ROIDER他３名の著作による文献、「Deconvolution approach for 3D scanning microscopy with helical phase engineering」、OPTICS EXPRESS 15456、米国、The Optical Society、第２４巻、第４号、[Online]、平成28年6月29日、［令和2年4月2日検索］、インターネット＜URL：https://www.osapublishing.org/oe/fulltext.cfm?uri=oe-24-14-15456&id=345215＞に開示される、multi-view Richardson-Lucy algorithm 等の数学的なアルゴリズムを用いて行うことができるため、その詳細についての説明は省略する。
　検出波長が１波長の場合は、検出器４０のｍ番目の検出画素４２により検出された検出光により生成される２次元画像Ｉｍ（ｘ，ｙ）は、以下の式（１）のように表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
 　ここで、ｍは、検出器４０を構成する検出画素４２に割り当てられる添え字である。検出器４０の検出画素４２は２５個あるので、１から２５までの整数値である。
　ここで、ｘおよびｙは、それぞれ試料１８におけるＸ方向およびＹ方向の位置である。ρ（ｘ，ｙ，λ）は、試料１８における波長λの蛍光を発生する蛍光物質の密度を表す。ｈｍ（ｘ，ｙ，λ）は、検出器４０のｍ番目の検出画素４２により検出された波長λの検出光により生成される２次元画像における点像強度分布（ＰＳＦ）を表す。そして、「＊」はｘ、ｙ座標に対するコンボリューション演算を表している。
　第１実施形態の顕微鏡１のように検出する光の波長が２波長（第１波長λ１および第２波長λ２）である場合には、（１）式は、以下の式（２）のように拡張される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
　ここで、ρ（ｘ、ｙ、λ１）は、試料１８における波長λ１の蛍光を発する蛍光物質の密度を表し、ρ（ｘ、ｙ、λ２）は、試料１８における波長λ２の蛍光を発する蛍光物質の密度を表す。ｈｍ（ｘ、ｙ、λ１）は、検出器４０のｍ番目の検出画素４２により検出された波長λ１の検出光により生成される２次元画像における点像強度分布（ＰＳＦ）を表す。ｈｍ（ｘ、ｙ、λ２）は、検出器４０のｍ番目の検出画素４２により検出された波長λ２の検出光により生成される２次元画像における点像強度分布（ＰＳＦ）を表す。
　multi-view Richardson-Lucy algorithmにおいては、式（２）の右辺が、検出値である式（２）の左辺に近づくように、ρ（ｘ，ｙ，λ１）およびρ（ｘ，ｙ，λ２）の分布形状を最適化する。これにより、検出する波長毎の蛍光物質の２次元密度分布に相当するρ（ｘ，ｙ，λ１）およびρ（ｘ，ｙ，λ２）が推定される。この最適化の過程で、ピクセルリアサイメント処理と等価な処理も同時に行うことができるため、蛍光物質の２次元密度分布を高い空間分解能で推定することができる。
　なお、ピクセルリアサイメント処理は、例えば文献、C. J. Sheppard, S. B. Mehta, R. Heintzmann著の「Superresolution by image scanning microscopy using pixel reassignment」, Optics Letter（米国）, Volume 38, No.15, 2889, 2013年、に詳述されているので、ここでは説明を省略する。
　このとき、高精度に検出波長毎の蛍光物質の密度ρ（ｘ，ｙ，λ）を推定するためには、点像強度分布ｈｍ（ｘ、ｙ、λ１）と、点像強度分布ｈｍ（ｘ、ｙ、λ２）とが、異なっていることが必要である。ここで、点像強度分布ｈｍ（ｘ、ｙ、λ１）とは、上述したとおり、検出器４０のｍ番目の検出画素４２により検出された波長λ１の検出光により生成される２次元画像における点像強度分布（ＰＳＦ）である。また、点像強度分布ｈｍ（ｘ、ｙ、λ２）とは、上述したとおり、検出器４０のｍ番目の検出画素４２により検出された波長λ２の検出光により生成される２次元画像における点像強度分布（ＰＳＦ）である。
　なお、点像強度分布ｈｍ（ｘ、ｙ、λ１）と点像強度分布ｈｍ（ｘ、ｙ、λ２）とは、少なくとも１つの共通の添え字ｍに対応する分布が異なっていればよい。すなわち、特定の添え字ｍに対応する点像強度分布ｈｍ（ｘ、ｙ、λ１）と点像強度分布ｈｍ（ｘ、ｙ、λ２）とは、同じ分布であっても良い。
　少なくとも１つの共通の添え字ｍに対応する点像強度分布ｈｍ（ｘ、ｙ、λ１）と点像強度分布ｈｍ（ｘ、ｙ、λ２）とを異ならせることは、例えば次の（ａ）から（ｄ）までのいずれか１つ以上により、実現することができる。
（ａ）第１波長λ１の検出光Ｌ１による第１像２３ａと第２波長λ２の検出光Ｌ２による第２像２３ｂとを検出面４１の面内の方向に相対的に回転させる。
（ｂ）第１波長λ１の検出光Ｌ１による第１像２３ａもしくは第２波長λ２の検出光Ｌ２による第２像２３ｂの一方を検出面４１の面内において反転させる。
（ｃ）検出面４１における第１波長λ１の検出光Ｌ１による第１像２３ａの形状と第２波長λ２の検出光Ｌ２による第２像２３ｂの形状とを異ならせる。
（ｄ）第１波長λ１の検出光Ｌ１による第１像２３ａと第２波長λ２の検出光Ｌ２による第２像２３ｂとを検出面４１の面内の方向に相対的に位置シフトさせる。
　上記の（ａ）から（ｄ）のいずれか１つ以上を行うために、第１実施形態の顕微鏡１においては、像変換部３０の中の検出光Ｌ２の光路上の、ミラー３４と合流素子３５との間に、像変換素子３１を配置している。
　図２Ａは、像変換部３０の中に配置されている像変換素子３１としてのイメージローテータ３１ａを示す図である。イメージローテータ３１ａは、ダブプリズムが、その長辺が検出光Ｌ２の進行方向（＋Ｘ方向）に一致するように配置されたものである。ダブプリズムの各側面は、Ｘ方向を回転中心として、ＸＹ面およびＸＺ面に対して、４５°回転した状態で配置されている。ただし、図２Ａでは、イメージローテータ３１ａとしてのダブプリズムの構成を理解しやすいように、ダブプリズムの各側面をＸＹ面およびＸＺ面と一致させて示している。
　図２Ｂに示したように、イメージローテータ３１ａの作用により、検出面４１において、検出光Ｌ２による第２像２３ｂは、検出光Ｌ１による第１像２３ａに対して、鏡写（反転された像）であり、かつ検出面４１の面内で９０°回転されたものとなる。これにより、演算部６１が行う、蛍光物質の密度ρ１（ｘ，ｙ，λ１）と蛍光物質の密度ρ２（ｘ，ｙ，λ２）の推定の精度が向上する。
　従って、第１波長λ１の検出光Ｌ１による第１像２３ａと第２波長λ２の検出光Ｌ２による第２像２３ｂとを、１つの検出器４０の検出面４１に結像させた場合であっても、それぞれの蛍光物質の２次元密度分布を高精度で推定することができる。これにより、検出に必要な高価なアバランシェフォトダイオードアレイ等の検出器４０の数を削減することができる。
　なお、点像強度分布ｈｍ（ｘ、ｙ、λ１）と点像強度分布ｈｍ（ｘ、ｙ、λ２）とに明確な違いを与えるために、検出光学系２０内の、像変換部３０よりも上流側（試料１８に近い側）に、検出光Ｌｄに対して、非点収差またはコマ収差等の、回転非対称な収差を与えるレンズ等の光学部材をさらに配置しても良い。これに代えて、検出光Ｌ１に対して、非点収差またはコマ収差等の、回転非対称な収差を与えるレンズ等の光学部材を、像変換部３０の中の検出光Ｌ１の光路に配置してもよいし、検出光Ｌ２に対して、非点収差またはコマ収差等の、回転非対称な収差を与えるレンズ等の光学部材を、像変換部３０の中の検出光Ｌ２の光路に配置してもよい。
　なお、点像強度分布ｈｍ（ｘ，ｙ，λ１）、点像強度分布ｈｍ（ｘ，ｙ，λ２）については、非特許文献１に開示されているように、理論的に予測される分布を使用しても良い。すなわち、実施形態の顕微鏡１の光学設計のデータ、イメージローテータ３１ａが第２像２３ｂに及ぼす理論上の影響、検出画素４２の位置および大きさ等に基づいて、理論的に予測される分布を使用しても良い。
　あるいは、事前に第１実施形態の顕微鏡１の各検出波長における点像強度分布を計測し、この計測した点像強度分布を使用しても良い。
　従って、例えば、試料１８として点像強度分布（ＰＳＦ）よりも十分小さな点状の蛍光物体（例えば蛍光ビーズ）を使用し、試料１８と照明領域１９を相対的に走査して得られる第１像２３ａ、および第２像２３ｂの検出面４１内での光量分布に基づいて、点像強度分布ｈｍ（ｘ，ｙ，λ１）、および点像強度分布ｈｍ（ｘ，ｙ，λ２）を決定しても良い。
　なお、検出面４１内の有限個の検出画素４２により検出された、座標（ｘ，ｙ）について離散的な像強度分布の計測値を補間して、あるいは連続関数によるフィッティングを行って、座標（ｘ，ｙ）に対して連続な、点像強度分布ｈｍ（ｘ，ｙ，λ１）および点像強度分布ｈｍ（ｘ，ｙ，λ２）を決定しても良い。
　点像強度分布ｈｍ（ｘ，ｙ，λ１）および点像強度分布ｈｍ（ｘ，ｙ，λ２）のフィッティングに用いる関数として、例えば、式（３）に示した（ｘ，ｙ）座標に対する２次元のガウス関数ｐ（ｘ，ｙ）を用いても良い。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
　ここで、座標（ｘ０，ｙ０）は、原点（０，０）を基準とした２次元ガウスの分布の中心位置を表し、Ｗｘは２次元ガウスの分布のＸ方向の幅を表し、Ｗｙは２次元ガウスの分布のＹ方向の幅を表す。θは、２次元ガウスの分布の座標（ｘ０，ｙ０）を中心とするＸＹ面内での回転角度を表す。ｃは所定の定数であり、ａは所定の比例定数である。
　なお、点像強度分布ｈｍ（ｘ，ｙ，λ１）および点像強度分布ｈｍ（ｘ，ｙ，λ２）のフィッティングに用いる関数として、上述の２次元のガウス関数に限らず、２次元のローレンツ関数を用いても良い。
　なお、試料１８として点像強度分布（ＰＳＦ）よりも十分小さな点状の蛍光物体でない試料を使用しても、点像強度分布を推定することができる。この場合には、試料１８と照明領域１９を相対的に走査しつつ、試料１８の複数の箇所において、それぞれ検出面４１内での第１像２３ａおよび第２像２３ｂの光量分布を計測する。そして、それらの複数の第１像２３ａおよび第２像２３ｂの光量分布をそれぞれ加算し、平均化することで、点像強度分布ｈｍ（ｘ，ｙ，λ１）および点像強度分布ｈｍ（ｘ，ｙ，λ２）を推定することができる。
　なお、点像強度分布の計測に際しては、検出器４０に１つの波長の光のみが入射するように、像変換部３０内の遮光板Ｃ１、Ｃ２を用いて、検出光Ｌ１の光路または検出光Ｌ２の光路の一方を遮光した状態で計測を行っても良い。
　また、光源５１ａ、光源５１ｂについても、一方のみを点灯し、他方は消灯した状態で計測を行っても良い。
　図３は、試料１８から発せられる蛍光のスペクトル分布の一例と、除去フィルタ２１の機能の一例を示す図である。
　図３に示したように、試料１８に含まれる蛍光物質の種類によっては、発生する蛍光のスペクトル分布は、第１波長λ１および第２波長λ２をそれぞれ中心として所定の波長の範囲に広がったものとなる。そして、第１波長λ１を中心とする第１の蛍光Ｌａのスペクトル分布と、第２波長λ２を中心とする第２の蛍光Ｌｂのスペクトル分布とが、所定の波長領域で一部重複する場合がある。
　この場合、第１の蛍光Ｌａのうち、ダイクロイックミラーである分岐素子３２（図１参照）における入射光を透過または反射する境界となる境界波長λｃよりも波長の長い光は、分岐素子３２で反射され、第２波長λ２の検出光Ｌ２に混入してしまう。同様に、第２の蛍光Ｌｂのうち、境界波長λｃよりも波長の短い光は、分岐素子３２を透過し、第１波長λ１の検出光Ｌ１に混入してしまう。そして、これらの混入により、試料１８の２次元画像の正確性が低下する恐れがある。
　そこで、第１実施形態の顕微鏡１においては、検出光学系２０のうち、第１波長λ１の検出光Ｌ１と第２波長λ２の検出光Ｌ２とが共に通る部分に、第１波長λ１と第２波長λ２との間の少なくとも一部の波長域ＢＡの光を除去する除去フィルタ２１を設けている。除去フィルタ２１は、例えば、多層膜による干渉フィルタが形成されたガラス基板や、色ガラスフィルタである。除去フィルタ２１は、波長域ＢＡの光を完全に除去するものであっても良く、減光するものであっても良い。
　除去フィルタ２１により、波長域ＢＡの光を除去することにより、検出器４０において上述した好ましくない波長の光の混入を防止することができる。これにより、試料１８の２次元画像の正確性が低下することを防止できる。
　なお、試料１８に含まれる蛍光物質の種類によっては、または、好ましくない波長の光が混入しても２次元画像の正確性が低下する恐れが低い場合には、除去フィルタ２１を設けなくても良い。除去フィルタ２１を設けなかった場合においても、予め好ましくない波長の光の混入の度合いを測定しておく、または計算により算出しておき、その混入の度合いを点像強度分布ｈｍ（ｘ、ｙ、λ１）及び点像強度分布ｈｍ（ｘ、ｙ、λ２）に反映させることで、混入の影響を低減することもできる。
（像変換部の各種の変形例）
　以下、像変換部３０の各種の変形例について説明する。各種の変形例の像変換部３０ａ～３０ｎは、上述の第１実施形態の顕微鏡１の像変換部３０に代えて、第１実施形態の顕微鏡１に装填して使用することができる。
　以下で説明する像変換部３０の各種の変形例においても、点像強度分布ｈｍ（ｘ、ｙ、λ１）と点像強度分布ｈｍ（ｘ、ｙ、λ２）とを異ならせることができる。従って、上述の第１実施形態と同様に、それぞれの蛍光物質の２次元密度分布を、演算部６１により高精度で推定することができる。
（像変換部の変形例１）
　図４Ａは、変形例１の像変換部３０ａを示す図であり、図４Ｂは、図４Ａに示した像変換部３０ａにより検出面４１（図１参照）上に形成される第１像２３ａおよび第１像２３ｂの例を示す図である。
　変形例１の像変換部３０ａの構成は、図１に示した像変換部３０と概ね同一であるが、像変換素子３１として、イメージローテータ３１ａの代わりに、シリンドリカルレンズ３１ｂ、３１ｃを有する点が異なっている。シリンドリカルレンズ３１ｂは、検出光Ｌ１の光路上のミラー３３と合流素子３５との間に配置され、検出光Ｌ１をＹ方向についてＸ方向よりも強く収束させる作用を有している。シリンドリカルレンズ３１ｃは、検出光Ｌ２の光路上のミラー３４と合流素子３５との間に配置され、検出光Ｌ２をＺ方向についてＹ方向よりも強く収束させる作用を有している。すなわち、シリンドリカルレンズ３１ｂ、３１ｃは、通過する光に非点収差を付加する光学部材ということができる。
　図４Ｂに示したように、シリンドリカルレンズ３１ｂの作用により、検出面４１（図１参照）上での第１像２３ａは、Ｕ方向の大きさがＶ方向の大きさに比べて縮小する。一方、シリンドリカルレンズ３１ｃの作用により、検出面４１上での第２像２３ｂは、Ｖ方向の大きさがＵ方向の大きさに比べて縮小する。これにより、検出面４１上での第１像２３ａの形状と第２像２３ｂの形状とを異ならせることで、点像強度分布ｈｍ（ｘ、ｙ、λ１）と点像強度分布ｈｍ（ｘ、ｙ、λ２）とを異ならせることができる。
　なお、それぞれのシリンドリカルレンズ３１ｂ、３１ｃは、検出光Ｌ１および検出光Ｌ２の光路に沿った方向を回転中心として、それぞれ概ね等しい角度（例えば９０°）だけ回転して配置されていても良い。
　また、シリンドリカルレンズ３１ｂ、３１ｃのうちの一方があれば、第１像２３ａの形状と第２像２３ｂの形状とを異なるせることで、点像強度分布ｈｍ（ｘ、ｙ、λ１）と点像強度分布ｈｍ（ｘ、ｙ、λ２）とを異ならせることができるので、シリンドリカルレンズ３１ｂ、３１ｃの、どちらか一方のみを設けた構成としても良い。
（像変換部の変形例２）
　図５Ａは、変形例２の像変換部３０ｂの一部を示す図であり、上述した像変換部３０における検出光Ｌ２の光路のミラー３４から合流素子３５までの間に相当する部分を示す図である。図５Ａにおいては、像変換部３０ｂの上記以外の部分の図示を省略している。
　変形例２の像変換部３０ｂの構成は、上述した像変換部３０と概ね同一であるが、像変換素子３１として、イメージローテータ３１ａの代わりに、マスキング部材３１ｄを有する点が異なっている。マスキング部材３１ｄにより、検出光Ｌ２の光路はその径（断面の形状）が制限される。すなわち、マスキング部材３１ｄよりも下流側（合流素子３５側）の検出光Ｌ２ｏの径は、マスキング部材３１ｄよりも上流側（ミラー３４側）の検出光Ｌ２ｉの径よりも小さくなる。
　図５Ｂは、変形例２の像変換部３０ｂにより検出面４１（図１参照）上に形成される第１像２３ａおよび第１像２３ｂの例を示す図である。マスキング部材３１ｄにより検出光Ｌ２の光路はその径が制限されるため、検出光Ｌ２が集光レンズ２２により検出面４１に集光される際の開口数（ＮＡ）も減少する。
　従って、検出面４１上での検出光Ｌ２による第２像２３ｂの大きさは、検出光Ｌ１による第１像２３ａの大きさよりも大きくなる。これにより、点像強度分布ｈｍ（ｘ、ｙ、λ１）と点像強度分布ｈｍ（ｘ、ｙ、λ２）とを異ならせることができる。
　なお、マスキング部材３１ｄは、検出光Ｌ２の光路上ではなく、検出光Ｌ１の光路上に設けても良い。また、マスキング部材３１ｄの開口部の形状は、円形、多角形等の任意の形状で良い。さらに、検出光Ｌ１の光路上と検出光Ｌ２の光路上とに、それぞれ開口部の形状の異なるマスキング部材３１ｄを設けても良い。
（像変換部の変形例３）
　図６は、変形例３の像変換部３０ｃと、検出器４０と、検出光学系２０に含まれる除去フィルタ２１および集光レンズ２２を示す図である。
　変形例３の像変換部３０ｃは、図１に示した像変換部３０の合流素子３５の光の透過および反射特性を反転させた、合流素子３５ａを有している。すなわち、変形例３の像変換部３０ｃにおいては、検出光Ｌｄのうち、第１波長λ１の検出光Ｌ１は分岐素子３２を透過し、ミラー３３で反射されて合流素子３５ａに至り、合流素子３５ａを透過して、射出光Ｌｅの一部となる。
　一方、第２波長λ２の検出光Ｌ２は分岐素子３２で反射され、ミラー３４で反射されて合流素子３５ａに至り、合流素子３５ａで反射されて、射出光Ｌｅの一部となる。
　一例として、検出光Ｌ２の光路上には、像変換素子３１として上述のイメージローテータ３１ａ（図２Ａ参照）が配置されている。イメージローテータ３１ａは、検出光Ｌ１の光路上に配置されても良い。また、像変換素子３１として上述のシリンドリカルレンズ３１ｂ、３１ｃ（図４Ａ参照）、またはマスキング部材３１ｄ（図５Ａ参照）が、検出光Ｌ１の光路上または検出光Ｌ２の光路上の少なくとも一方に配置されても良い。
　変形例３の像変換部３０ｃによっても点像強度分布ｈｍ（ｘ、ｙ、λ１）と点像強度分布ｈｍ（ｘ、ｙ、λ２）とを異ならせることができる。
　なお、変形例３の像変換部３０ｃにおいては、分岐素子３２と合流素子３５ａとを、１つの一体的なダイクロイックミラー３２ａで構成しても良い。
（像変換部の変形例４）
　図７は、変形例４の像変換部３０ｄと、検出器４０と、検出光学系２０に含まれる除去フィルタ２１および集光レンズ２２を示す図である。
　変形例４の像変換部３０ｄは、図６に示した変形例３の像変換部３０ｃのうち、分岐素子３２と合流素子３５ａとを、１つの一体的なダイクロイックミラー３２ａで構成したものとほぼ同様の構成を有している。ただし、ダイクロイックミラー３２ａ、およびミラー３３、３４への検出光の入射角が約４５°ではない点が異なっている。
　変形例４の像変換部３０ｄにおいても、像変換素子３１は、検出光Ｌ１または検出光Ｌ２の光路上に配置された、上述のイメージローテータ３１ａ、シリンドリカルレンズ３１ｂ、３１ｃ、またはマスキング部材３１ｄのいずれであっても良い。
（像変換部の変形例５）
　図８は、変形例５の像変換部３０ｅと、検出器４０と、検出光学系２０に含まれる除去フィルタ２１および集光レンズ２２を示す図である。
　変形例５の像変換部３０ｅは、入射される検出光Ｌｄを、波長に応じてそれぞれ３つの異なる光路を通る検出光Ｌ１～Ｌ３に分岐させ、それらを合流させて射出光Ｌｅとして出力するものである。そして、検出光Ｌ２の光路上および検出光Ｌ３の光路上に、図２Ａに示した像変換素子３１としてのイメージローテータ３１ａを備えている。
　検出光Ｌｄのうち、第１波長λ１の検出光Ｌ１は分岐素子３２を透過し、ミラー３３で反射される。その後、検出光Ｌ１は、ダイクロイックミラー３６ｂを透過して検出光Ｌ１２の一部となって合流素子３５に至り、合流素子３５を透過して射出光Ｌｅの一部となる。
　第１波長λ１より波長の長い第２波長λ２および第３波長λ３の検出光Ｌ２３は分岐素子３２で反射され、ダイクロイックミラー３６ａに至る。第２波長λ２の検出光Ｌ２はダイクロイックミラー３６ａで反射され、イメージローテータ３１ａを透過した後に、ダイクロイックミラー３６ｂで反射されて検出光Ｌ１２の一部となって合流素子３５に至り、合流素子３５を透過して射出光Ｌｅの一部となる。
　第２波長λ２より波長の長い第３波長λ３の検出光Ｌ２はダイクロイックミラー３６ａを透過して、ミラー３４で反射され、イメージローテータ３１ａを透過した後に合流素子３５に至り、合流素子３５で反射されて射出光Ｌｅの一部となる。
　射出光Ｌｅは、除去フィルタ２１を透過した後に、集光レンズ２２により集光される。検出器４０の検出面４１には、第１波長λ１から第３波長λ３までの各波長の光による照明領域１９の像が、それらの少なくとも一部を重ね合わせた状態で形成される。
　検出光Ｌ２の光路上に配置されたイメージローテータ３１ａ、および検出光Ｌ３の光路上に配置されたイメージローテータ３１ａは、いずれも図２Ａに示したイメージローテータ３１ａと同様の構成を有する。ただし、変形例５の像変換部３０ｅにおける検出光Ｌ２の光路上のイメージローテータ３１ａは検出面４１における照明領域１９の像を例えば１２０°回転させる。そして、検出光Ｌ３の光路上のイメージローテータ３１ａは検出面４１における照明領域１９の像を例えば２４０°回転させる。
　従って、変形例５の像変換部３０ｅにより、第１波長λ１の検出光Ｌ１、第２波長λ２の検出光Ｌ２、および第３波長λ３の検出光Ｌ３によるそれぞれの照明領域１９の像は、検出面４１において１２０°ずつ回転し、これにより、それぞれの点像強度分布ｈｍ（ｘ、ｙ、λ１）、点像強度分布ｈｍ（ｘ、ｙ、λ２）、点像強度分布ｈｍ（ｘ、ｙ、λ３）が異なっている。従って、照明領域１９の第１波長λ１の検出光から第３波長λ３までの検出光Ｌ１～Ｌ３によるそれぞれの像を、１つの検出器４０の検出面４１に結像させた場合であっても、それぞれの蛍光物質の２次元密度分布を高精度で推定することができる。
　なお、以上では、第３波長λ３は第２波長λ２よりも長く、第２波長λ２は第１波長λ１よりも長くとしたが、第３波長λ３は第２波長λ２よりも短く、第２波長λ２は第１波長λ１よりも短くても良い。
　また、検出光Ｌ２の光路上または検出光Ｌ３の光路上に配置したイメージローテータ３１ａの１つを、代わりに検出光Ｌ１の光路上に配置しても良い。
　また、イメージローテータ３１ａの代わりに、検出光Ｌ１から検出光Ｌ３のうちのいずれか２つ以上の光路上に、上述したシリンドリカルレンズ３１ｂ、３１ｃやマスキング部材３１ｄを配置しても良い。
（像変換部の変形例６）
　図９Ａは、変形例６の像変換部３０ｆと、検出器４０と、検出光学系２０に含まれる除去フィルタ２１および集光レンズ２２を示す図である。図９Ｂは、図９Ａに示した像変換部３０ｆにより検出面４１上に形成される第１像２３ａおよび第１像２３ｂの例を示す図である。
　変形例６の像変換部３０ｆの構成は、図１に示した上述の第１実施形態における像変換部３０とほぼ同様であるが、像変換素子３１を有していない。その代わりに、像変換部３０ｆに含まれるミラー３３が、ＸＺ面内の方向に所定角度だけ回転して配置されている。
　図４Ｂに示したように、ミラー３３をＸＺ面内の方向に所定角度だけ回転して配置することにより、検出面４１上での第１像２３ａの位置は、第２像２３ｂの位置に対して－Ｖ方向にシフトとする。よって、点像強度分布ｈｍ（ｘ、ｙ、λ１）と点像強度分布ｈｍ（ｘ、ｙ、λ２）とを異ならせることができる。
　ミラー３３を、第１像２３ａと第２像２３ｂを検出面４１の面内の方向に相対的に位置シフトさせる像シフト部ということができる。
　なお、ミラー３３を回転させる方向は、上述のＸＺ面内の方向に限らず、ミラー３３の反射面に垂直な方向に対して交差する方向であれば、どのように方向であっても良い。従って検出面４１上おいて、第１像２３ａがシフトする方向も－Ｖ方向に限られるものではなく、任意の方向であっても良い。
（像変換部の変形例７）
　図１０は、変形例７の像変換部３０ｇと、検出器４０と、検出光学系２０に含まれる除去フィルタ２１および集光レンズ２２を示す図である。
　変形例７の像変換部３０ｇにおいては、検出光Ｌｄのうち、第１波長λ１の検出光Ｌ１は分岐素子３２を透過し、ミラー３３で反射される。その後、検出光Ｌ１は像変換素子３１を透過して、ミラー３３ａおよびミラー３３ｂで反射され、分岐素子３２に戻る。そして、分岐素子３２を再度透過して、射出光Ｌｅの一部となる。
　検出光Ｌｄのうち、第１波長λ１より波長の長い第２波長λ２の検出光Ｌ２は、分岐素子３２で反射されて、射出光Ｌｅの一部となる。
　変形例７の像変換部３０ｇにおいても、像変換素子３１は上述したイメージローテータ３１ａ、シリンドリカルレンズ３１ｂ、３１ｃ、またはマスキング部材３１ｄのいずれであっても良い。
　変形例７の像変換部３０ｇによっても点像強度分布ｈｍ（ｘ、ｙ、λ１）と点像強度分布ｈｍ（ｘ、ｙ、λ２）とを異ならせることができる。従って、上述の第１実施形態と同様に、それぞれの蛍光物質の２次元密度分布を、演算部６１により高精度で推定することができる。
　なお、変形例７の像変換部３０ｇにおいては、分岐素子３２は、図１に示した第１実施形態の像変換部３０における合流素子３５としての機能も有している。すなわち、分岐素子３２と合流素子３５とが、１つの分岐素子３２で兼用されている。
（像変換部の変形例８）
　図１１は、変形例８の像変換部３０ｈと、検出器４０と、検出光学系２０に含まれる除去フィルタ２１および集光レンズ２２を示す図である。変形例８の像変換部３０ｈは、変形例７の像変換部３０ｇに含まれる３枚のミラー３３、３３ａ、３３ｂを２枚のミラー３３、３３ｃで置き換えたものである。この構成により、ミラーの枚数を削減することができる。
　なお、変形例７の像変換部３０ｇおよび変形例８の像変換部３０ｈにおいて、像変換素子３１を省略しても良い。この場合には、変形例７については、上述した変形例６の像変換部３０ｆと同様に、ミラー３３、３３ａ、３３ｂをＸＺ面内の方向に所定角度だけ回転して配置することにより、検出面４１上での第１像２３ａの位置を、第２像２３ｂの位置に対してシフトさせれば良い。
　変形例８については、像変換部３０ｈにおいては、検出光Ｌｄのうち、第１波長λ１の検出光Ｌ１は分岐素子３２を透過し、ミラー３３およびミラー３３ｃで反射され、すなわち２回反射され、分岐素子３２に戻る。そして、分岐素子３２を再度透過して、射出光Ｌｅの一部となる。
　検出光Ｌｄのうち、第２波長λ２の検出光Ｌ２は分岐素子３２を反射し、すなわち１回反射して、射出光Ｌｅの一部となる。検出光Ｌ１と検出光Ｌ２とでは、像変換部３０ｈ内での反射回数の偶奇が異なるため、検出面４１上に形成される第１像２３ａは、第１像２３ｂに対して、鏡写（反転された像）となるので、ミラー３３、３３ｃをＸＺ面内の方向に所定角度だけ回転して配置しても、しなくてもよい。
（像変換部の変形例９）
　図１２は、変形例９の像変換部３０ｉと、検出器４０と、検出光学系２０に含まれる除去フィルタ２１および集光レンズ２２を示す図である。変形例９の像変換部３０ｉは、上述した変形例８の像変換部３０ｈから像変換素子３１を省略したものに対して、分岐素子３２と２枚のミラー３３、３３ｃとを１つのプリズム３７で置き換えたものである。
　プリズム３７の１つの面３７ａには、多層膜等によりダイクロイックミラーが形成されており、プリズム３７の２つの面３７ｂ、３７ｃには高反射膜が形成されている。
　この構成により、光学部品（ミラー）の枚数を削減することができるとともに、光学部品間の相互の位置調整を簡素化することができる。
（像変換部の変形例１０）
　図１３は、変形例１０の像変換部３０ｊと、検出器４０と、検出光学系２０に含まれる除去フィルタ２１および集光レンズ２２を示す図である。
　変形例１０の像変換部３０ｊは、三角プリズム３８と、コーナーキューブミラー３１ｅとを有している。三角プリズム３８の第１面３８ａと第２面３８ｂには、多層膜等によりダイクロイックミラーが形成されている。コーナーキューブミラー３１ｅは、一般的な相互に直交する３面の反射面を有するミラーである。図１３は断面図であるので、そのうちの２面の反射面のみを示している。
　三角プリズム３８に入射した検出光Ｌｄのうち、第１波長λ１の検出光Ｌ１は第１面３８ａを透過し、コーナーキューブミラー３１ｅの直交する３面の反射面でそれぞれ、すなわち３回反射される。検出光Ｌ１は、さらに三角プリズム３８の第２面３８ｂで反射されて、射出光Ｌｅの一部となる。検出光Ｌ１は、像変換部３０ｊ内で上記の通り計４回（偶数回）反射される。
　三角プリズム３８に入射した検出光Ｌｄのうち、第２波長λ２の検出光Ｌ２は第１面３８ａで反射され、三角プリズム３８の第２面３８ｂを透過して、射出光Ｌｅの一部となる。検出光Ｌ２は、像変換部３０ｊ内で１回（奇数回）のみ反射される。
　検出光Ｌ１と検出光Ｌ２とでは、像変換部３０ｊ内での反射回数の偶奇が異なるため、検出面４１上に形成される第１像２３ａは、第１像２３ｂに対して、鏡写（反転された像）となる。従って、変形例１０の像変換部３０ｊにおいても、点像強度分布ｈｍ（ｘ、ｙ、λ１）と点像強度分布ｈｍ（ｘ、ｙ、λ２）とを異ならせることができる。
　なお、変形例１０の像変換部３０ｊにおいては、第１面３８ａは、図１に示した第１実施形態の像変換部３０における分岐素子３２としての機能を有している。また、第２面３８ｂは合流素子３５としての機能を有している。
　なお、変形例１０の像変換部３０ｊにおいても、検出光Ｌ１の光路内に上述した各種の像変換素子３１を設けても良い。
　また、コーナーキューブミラー３１ｅを構成する３つの反射面の角度関係を、相互に直交する方向から僅かにずらす等により、検出面４１上での第１像２３ａの位置を、第２像２３ｂの位置に対してシフトさせても良い。この場合には、コーナーキューブミラー３１ｅを、第１像２３ａと第２像２３ｂを検出面４１の面内の方向に相対的に位置シフトさせる像シフト部ということができる。
（像変換部の変形例１１）
　図１４Ａは、変形例１１の像変換部３０ｋと、検出器４０と、検出光学系２０に含まれる除去フィルタ２１ａ、２１ｂおよび集光レンズ２２を示す図である。
　変形例１１の像変換部３０ｋは、分岐素子３２と、ルーフプリズム（ダハプリズム）３１ｆとを有している。ルーフプリズム３１ｆは、稜線３１ｆａを境界として紙面奥側の第１反射面３１ｆｂと紙面手前側の第２反射面３１ｆｃとを有している。
　像変換部３０ｋに入射した検出光Ｌｄのうち、第１波長λ１の検出光Ｌ１は分岐素子３２を透過し、ルーフプリズム３１ｆに入射する。そして、検出光Ｌ１は、ルーフプリズム３１ｆの第１反射面３１ｆｂと第２反射面３１ｆｃとでそれぞれ反射された後、除去フィルタ２１ａを透過して、集光レンズ２２により集光されて、検出面４１上に第１像２３ａを形成する。
　像変換部３０ｋに入射した検出光Ｌｄのうち、第１波長λ２の検出光Ｌ２は分岐素子３２で反射され、除去フィルタ２１ｂを透過して、集光レンズ２２により集光されて、検出面４１上に第２像２３ｂを形成する。
　検出光Ｌ１と検出光Ｌ２とでは、像変換部３０ｋ内での反射回数の偶奇が異なるため、検出面４１上に形成される第１像２３ａは、第１像２３ｂに対して、鏡写（反転された像）となる。従って、変形例１１の像変換部３０ｋにおいても、点像強度分布ｈｍ（ｘ、ｙ、λ１）と点像強度分布ｈｍ（ｘ、ｙ、λ２）とを異ならせることができる。
　なお、変形例１１の像変換部３０ｋにおいては、集光レンズ２２は、図１に示した第１実施形態の像変換部３０における合流素子３５としての機能も有している。
　なお、変形例１１の像変換部３０ｋにおいても、検出光Ｌ１の光路内または検出光Ｌ２の光路内に上述した各種の像変換素子３１を設けても良い。
　また、ルーフプリズム３１ｆを配置する角度を僅かにずらすこと等により、検出面４１上での第１像２３ａの位置を、第２像２３ｂの位置に対してシフトさせても良い。この場合には、ルーフプリズム３１ｆを、第１像２３ａと第２像２３ｂを検出面４１の面内の方向に相対的に位置シフトさせる像シフト部ということができる。
（像変換部の変形例１２）
　図１４Ｂは、変形例１２の像変換部３０ｌと、検出器４０と、検出光学系２０に含まれる除去フィルタ２１ａ、２１ｂおよび集光レンズ２２を示す図である。変形例１２の像変換部３０ｌは、変形例１１の像変換部３０ｋに対して、検出光Ｌ２の光路のルーフプリズム３１ｆより検出器４０側に、いわゆる平行四辺形プリズム３９を加えたものである。
　平行四辺形プリズム３９により、除去フィルタ２１および集光レンズ２２の位置における検出光Ｌ１の光路と検出光Ｌ２の光路との間隔を縮小することができる。これにより、除去フィルタ２１および集光レンズ２２の大きさを削減する、または変形例１１の像変換部３０ｋでは２枚必要であった除去フィルタ２１を１枚で済ませることができる。
（像変換部の変形例１３）
　図１５は、変形例１３の像変換部３０ｍと、検出器４０と、検出光学系２０に含まれる除去フィルタ２１および集光レンズ２２を示す図である。
　変形例１３の像変換部３０ｍは、レンズ２５ａと、回折格子３２ｂと、レンズ２６ａと、検出光Ｌ２の光路上に配置された像変換素子３１とを有している。
　像変換部３０ｍに入射した検出光Ｌｄは、レンズ２５ａにより集光され、回折格子３２ｂに照射される。検出光Ｌｄのうちの第１波長λ１の検出光Ｌ１は回折格子３２ｂにより所定の角度で回折される。その後、レンズ２６ａにより略平行光とされて除去フィルタ２１を透過し、集光レンズ２２により集光されて、検出面４１上に第１像２３ａを形成する。
　検出光Ｌｄのうちの第１波長λ２の検出光Ｌ２は回折格子３２ｂにより、検出光Ｌ１よりも大きな角度で回折される。その後、検出光Ｌ２はレンズ２６ａにより略平行光とされて除去フィルタ２１を透過し、集光レンズ２２により集光されて、検出面４１上に第２像２３ｂを形成する。
　変形例１３の像変換部３０ｍにおいても、検出光Ｌ２の光路上に配置された像変換素子３１により、点像強度分布ｈｍ（ｘ、ｙ、λ１）と点像強度分布ｈｍ（ｘ、ｙ、λ２）とを異ならせることができる。像変換素子３１として、上述した各種の素子を使用することができる。像変換素子３１を、検出光Ｌ２の光路ではなく、検出光Ｌ１の光路上に配置しても良い。
　なお、変形例１３の像変換部３０ｍにおいては、回折格子３２ｂは、図１に示した第１実施形態の像変換部３０における分岐素子３２としての機能を有している。また、集光レンズ２２は合流素子３５としての機能を有している。
（像変換部の変形例１４）
　図１６Ａは、変形例１４の像変換部３０ｎと、検出器４０と、検出光学系２０に含まれる除去フィルタ２１および集光レンズ２２を示す図である。
　変形例１４の像変換部３０ｎは、分岐素子３２と、レンズ２６ｂと、レンズ２６ｃと、合流素子３５と、分岐素子３２とレンズ２６ｂとの間の検出光Ｌ２の光路上に配置された像変換素子３１とを有している。
　像変換部３０ｍに入射した検出光Ｌｄのうち、第１波長λ１の検出光Ｌ１は、分岐素子３２を透過して、レンズ２６ｂおよびレンズ２６ｃを経て、合流素子３５に至る。検出光Ｌ１は、合流素子３５を透過して射出光Ｌｅの一部となる。
　一方、検出光Ｌｄのうち、第２波長λ２の検出光Ｌ２は、分岐素子３２で反射され、像変換素子３１に入射する。その後、検出光Ｌ２は、レンズ２６ｂおよびレンズ２６ｃを経て、合流素子３５に至る。検出光Ｌ２は、合流素子３５で反射されて射出光Ｌｅの一部となる。
　変形例１４の像変換部３０ｎにおいても、検出光Ｌ２の光路上に配置された像変換素子３１により、点像強度分布ｈｍ（ｘ、ｙ、λ１）と点像強度分布ｈｍ（ｘ、ｙ、λ２）とを異ならせることができる。像変換素子３１として、上述した各種の素子を使用することができる。像変換素子３１を、検出光Ｌ２の光路ではなく、検出光Ｌ１の光路上に配置しても良い。
（像変換部の変形例１５）
　図１６Ｂは、変形例１５の像変換部３０ｏと、検出器４０と、検出光学系２０に含まれる除去フィルタ２１および集光レンズ２２を示す図である。
　変形例１５の像変換部３０ｏは、変形例１４の像変換部３０ｎとほぼ同様の構成を有するが、像変換素子３１が、レンズ２６ｂとレンズ２６ｃとの間の検出光Ｌ２の光路上に配置される点が、像変換部３０ｎとは異なっている。
　変形例１５の像変換部３０ｏにおいても、検出光Ｌ２の光路上に配置された像変換素子３１により、点像強度分布ｈｍ（ｘ、ｙ、λ１）と点像強度分布ｈｍ（ｘ、ｙ、λ２）とを異ならせることができる。
（１）第１実施形態および各変形例の顕微鏡１は、１つの観点からは、照明光を集光して試料１８に照明領域１９を形成する照明光学系１０と、照明領域１９と試料１８とを相対的に走査させる走査部（１２、１７）と、検出面４１内に検出画素４２が複数配列されている検出器４０と、照明領域１９が形成された試料１８からの第１波長λ１の光（検出光Ｌ１）による第１像２３ａ、および照明領域１９が形成された試料１８からの第１波長λ１とは異なる第２波長λ２の光（検出光Ｌ２）による第２像２３ｂを、検出器４０の検出面４１に形成する検出光学系２０と、を備えている。そして、検出光学系２０は、第１像２３ａと第２像２３ｂとの少なくとも一部を重ね合わせて検出面４１に形成するとともに、第１像２３ａと第２像２３ｂとを検出面４１の面内の方向に相対的に回転させる、第１像２３ａもしくは第２像２３ｂの一方を検出面４１の面内において反転させる、および検出面４１における第１像２３ａの形状と第２像２３ｂの形状とを異ならせる、のうち少なくとも１つを行う像変換部３０を有する。
　この構成により、第１波長λ１の検出光Ｌ１による第１像２３ａと第２波長λ２の検出光Ｌ２による第２像２３ｂとを、１つの検出器４０の検出面４１に結像させつつ、それぞれの検出光により検出される２次元画像を高精度で分離することができる。これにより、検出に必要な高価なアバランシェフォトダイオードアレイ等の検出器４０の数を削減することができ、顕微鏡１を安価で提供することができる。
（２）第１実施形態および各変形例の顕微鏡１は、別の１つの観点からは、照明光を集光して試料１８に照明領域１９を形成する照明光学系１０と、照明領域１９と試料１８とを相対的に走査させる走査部（１２、１７）と、検出面４１内に検出画素４２が複数配列されている検出器４０と、照明領域１９が形成された試料１８からの第１波長λ１の光（検出光Ｌ１）による第１像２３ａ、および照明領域１９が形成された試料１８からの第１波長λ１とは異なる第２波長λ２の光（検出光Ｌ２）による第２像２３ｂを、検出器４０の検出面４１に形成する検出光学系２０と、を備えている。そして、検出光学系２０は、第１像２３ａと第２像２３ｂとの少なくとも一部を重ね合わせて検出面４１に形成するとともに、第１像２３ａと第２像２３ｂとを検出面４１の面内の方向に相対的に位置シフトさせる像シフト部（ミラー３３、コーナーキューブミラー３１ｅ、ルーフプリズム３１ｆ）を有し、第１像２３ａおよび第２像２３ｂが、それぞれ単一のスポット像である。
　この構成により、第１波長λ１の検出光Ｌ１による第１像２３ａと第２波長λ２の検出光Ｌ２による第２像２３ｂとを、１つの検出器４０の検出面４１に結像させつつ、それぞれの蛍光物質の２次元密度分布を高精度で推定することができる。これにより、検出に必要な高価なアバランシェフォトダイオードアレイ等の検出器４０の数を削減することができ、顕微鏡１を安価で提供することができる。
　上述では、種々の実施形態および変形例は、第１波長λ１の蛍光を発生する蛍光物質の密度と、第２波長λ２の蛍光を発生する蛍光物質の密度とを推定するものである。しかし、像変換部３０の構成を変更するだけで、偏光を発生する蛍光物質の密度を推定する装置に変更することができる。例えば、図６の分岐素子３２と合流素子３５ａとをそれぞれ偏光ビームスプリッター（ＰＢＳ）に変更すると、ｐ偏光を発する蛍光物質の密度とｓ偏光を発する蛍光物質の密度とを推定する装置となる。分岐素子３２と置き換えたＰＢＳを第１のＰＢＳとし、合流素子３５ａと置き換えたＰＢＳを第２のＰＢＳとする。この装置の場合、ｐ偏光は第１のＰＢＳを透過し、ｓ偏光は第１のＰＢＳによって反射されるので、検出光Ｌｄのうち、ｐ偏光の検出光は第１のＰＢＳを透過し、ミラー３３で反射されて第２のＰＢＳに至り、第２のＰＢＳを透過して、射出光の一部となる。
　一方、ｓ偏光の検出光は第１のＰＢＳで反射され、ミラー３４で反射されて、第２のＰＢＳに至り、第２のＰＢＳで反射されて、射出光の一部となる。ｓ偏光の光路上には像変換素子３１としてイメージローテータ３１ａ（図２Ａ参照）が配置されている。この変形例の像変換部によっても、後述する２つの点像強度分布を互いに異ならせることができる。また、分岐素子３２の上流に波長板を置くことにより、右回り円偏光、左回り円偏光のような、任意の直交する２つの偏光を発する蛍光物質の密度をそれぞれ推定する装置にもなる。
　検出する光が任意の直交する２つの偏光である場合、（２）式は、以下の式（２）’のように変更される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
 　ここで、任意の直交する偏光をｐ１, ｐ２とすると、ρ（ｘ, ｙ, ｐ１）は、試料１８における偏光ｐ１を発する蛍光物質の密度をと表し、 ρ（ｘ, ｙ, ｐ２）は、試料１８における偏光ｐ２を発する蛍光物質の密度を表す。ｈｍ（ｘ、ｙ、ｐ１）は、検出器４０のｍ番目の検出画素４２により検出された偏光ｐ１の検出光により生成される２次元画像における点像強度分布（ＰＳＦ）を表し、ｈｍ（ｘ、ｙ、ｐ２）は、検出器４０のｍ番目の検出画素４２により検出された偏光ｐ２の検出光により生成される２次元画像における点像強度分布（ＰＳＦ）を表す。
　この式は、数式（２）と全く同じ形をしているため、上述のアルゴリズムを用いてρ（ｘ，ｙ，ｐ１）とρ（ｘ，ｙ，ｐ２）を推定することが可能である。
（変形例）
以上の各実施形態では、検出器４０は照明領域１９の像２３の位置に直接配置するものとしている。しかし、例えば特許文献１に開示されるように、照明領域１９の像２３の位置には、光ファイバー束等の光分配素子の一端（入射端）を配置し、光分配素子の他端（射出端）に光電変換部を配置する構成とすることもできる。
図１７は、変形例の検出器２００の全体を示す図である。変形例の検出器２００は、１次元に配置される光電検出器アレイ２０６と、光電検出器アレイ２０６に光を供給する光ファイバー束２０１とを含んでいる。光ファイバー束２０１は単一の光ファイバー２０４から形成されている。
光ファイバー束２０１の一端（入射端）２０２は、照明領域１９の像２３ａ、２３ｂが形成される面に配置されるとともに、一端２０２においては、それぞれの単一光ファイバー２０４は密集して配列されている。光ファイバー束２０１内の個々の光ファイバー２０４の他端（射出端）は、１次元方向に延在するプラグ２０５に沿って配置されている。そして、各光ファイバー２０４の他端（射出端）２０５は、１次元に配列されている光電検出器アレイ２０６の各光電変換面２０８と対向している。光ファイバー束２０１は、光を分配する光分配素子に相当する。なお、光分配素子は、光ファイバー束に限られず、他の既存の導波路を用いることができる。
　各光ファイバー２０４の入射端の直径（正確にはそのファイバーのコアの直径）は、第１波長λ１または第２波長λ２の波長をλ、対物レンズ１６の開口数をＮＡとするとき、試料１８上の長さに換算して、例えば、０．２×λ／ＮＡ程度に設定されていることが望ましい。なお、各光ファイバー２０４への集光効率を高めるため、各光ファイバー２０４の入射端の前面にマイクロレンズアレイなどの集光素子アレイを配置してもよい。この場合、例えば、集光素子アレイを介して形成される像の位置に各光ファイバー２０４の入射端が配置されるように構成してもよい。
　光ファイバー束等の光分配素子を使用することにより、光電変換部の配置の自由度が増し、より大きな光電変換部を使用することが可能となる。これにより、ＰＩＮフォトダイオードや光電子倍増管等の、高感度かつ高応答の光電変換部が使用可能となり、試料１８の２次元画像のＳ／Ｎ比を向上させることができる。
光ファイバー束２０１の入射端は、その下流に配置された光電変換部により光を検出（光電変換）する光ファイバーの入射端が２次元的に配列されている部分であることから、２次元的に配列されている複数の検出部と解釈することができる。
　上述では、種々の実施形態および変形例を説明したが、本発明はこれらの内容に限定されるものではない。また、各実施形態および変形例は、それぞれ単独で適用しても良いし、組み合わせて用いても良い。本発明の技術的思想の範囲内で考えられるその他の態様も本発明の範囲内に含まれる。また、法令で許容される限りにおいて、上述の各実施形態および変形例で引用した全ての文献（米国特許や論文）の開示を援用して本文の記載の一部とする。
　１：顕微鏡、１０：照明光学系、１１：分岐ミラー、１２：偏向部、１３，１５：リレーレンズ、１６：対物レンズ、１７：ステージ、１８：試料、１９：照明領域、２０：検出光学系、２１：除去フィルタ、２２：集光レンズ、２３：像、３０，３０ａ～３０ｏ：像変換部、３１：像変換素子、３１ａ：ダブプリズム、３１ｂ，３１ｃ：シリンドリカルレンズ、３２，３２ａ：分岐素子、３５，３５ａ：合流素子、３３，３４：ミラー、４０：検出器、４１：検出面、４２：検出画素、５０：光源部、５１ａ，５１ｂ：光源、Ｌｉ：照明光、Ｌｄ：検出光、６０：制御部、６１：演算部

Claims (13)

  1. 　照明光を集光して試料に照明領域を形成する照明光学系と、
    　前記照明領域と前記試料とを相対的に走査させる走査部と、
    　検出面内に検出部が複数配列されている検出器と、
    　前記照明領域が形成された前記試料からの第１波長の光による第１像、および前記照明領域が形成された前記試料からの前記第１波長とは異なる第２波長の光による第２像を、前記検出器の前記検出面に形成する検出光学系と、
    を備え、
    　前記検出光学系は、前記第１像と前記第２像との少なくとも一部を重ね合わせて前記検出面に形成するとともに、前記第１像と前記第２像とを前記検出面の面内の方向に相対的に回転させる、前記第１像もしくは前記第２像の一方を前記検出面の面内において反転させる、および前記検出面における前記第１像の形状と前記第２像の形状とを異ならせる、のうち少なくとも１つを行う像変換部を有する、顕微鏡。
  2. 　請求項１記載の顕微鏡において、
    　前記検出光学系は、さらに、前記第１像と前記第２像とを前記検出面の面内の方向に相対的に位置シフトさせる像シフト部を有する、顕微鏡。
  3. 　請求項１または請求項２に記載の顕微鏡において、
    　前記像変換部は、前記第１波長の光と前記第２波長の光とを分岐する分岐素子と、
    　前記分岐素子により分岐された前記第１波長の光の光路または前記第２波長の光の光路の少なくとも一方に配置された像変換素子と、
    　前記分岐素子により分岐された前記第１波長の光および前記第２波長の光を合流させる合流素子と、を有する顕微鏡。
  4. 　請求項３記載の顕微鏡において、
    　前記分岐素子および前記合流素子は、１つの素子で兼用されている、顕微鏡。
  5. 　請求項３に記載の顕微鏡において、
    　前記分岐素子および前記合流素子の少なくとも一方は、ダイクロイックミラーである、顕微鏡。
  6. 　請求項３から請求項５までのいずれか一項に記載の顕微鏡において、
    　前記検出光学系は、前記第１波長と前記第２波長との間の少なくとも一部の波長域の光を除去する除去フィルタを有する、顕微鏡。
  7. 　請求項３から請求項６までのいずれか一項に記載の顕微鏡において、
    　前記像変換素子はイメージローテータである、顕微鏡。
  8. 　請求項３から請求項６までのいずれか一項に記載の顕微鏡において、
    　前記像変換素子は、通過する光に非点収差を付加する光学部材である、顕微鏡。
  9. 　請求項３から請求項６までのいずれか一項に記載の顕微鏡において、
    　前記像変換素子は、通過する光の形状を制限するマスキング部材である、顕微鏡。
  10. 　照明光を集光して試料に照明領域を形成する照明光学系と、
    　前記照明領域と前記試料とを相対的に走査させる走査部と、
    　検出面内に検出部が複数配列されている検出器と、
    　前記照明領域が形成された前記試料からの第１波長の光による第１像、および前記照明領域が形成された前記試料からの前記第１波長とは異なる第２波長の光による第２像を、前記検出器の前記検出面に形成する検出光学系と、
    を備え、
    　前記検出光学系は、前記第１像と前記第２像との少なくとも一部を重ね合わせて前記検出面に形成するとともに、前記第１像と前記第２像とを前記検出面の面内の方向に相対的に位置シフトさせる像シフト部を有し、
    前記第１像および前記第２像が、それぞれ単一のスポット像である、
    顕微鏡。
  11. 請求項１から請求項１０までのいずれか一項に記載の顕微鏡において、
    　前記検出面において前記検出部の合計面積は、前記検出面内における前記第１像および前記第２像の合計面積の１．５倍以下である、顕微鏡。
  12. 　請求項１から請求項１１までのいずれか一項に記載の顕微鏡において、
    　前記検出器が検出する前記第１像と前記第２像とが合算された光量信号に基づいて、　前記第１波長の光による前記試料の第１画像と、前記第２波長の光による前記試料の第２画像とをそれぞれ算出する演算部をさらに有する顕微鏡。
  13. 　照明光を集光して試料に照明領域を形成する照明光学系と、
    　前記照明領域と前記試料とを相対的に走査させる走査部と、
    　検出面内に検出部が複数配列されている検出器と、
    　前記照明領域が形成された前記試料からの第１偏光の光による第１像、および前記照明領域が形成された前記試料からの前記第１偏光とは異なる第２偏光の光による第２像を、前記検出器の前記検出面に形成する検出光学系と、
    を備え、
    　前記検出光学系は、前記第１像と前記第２像との少なくとも一部を重ね合わせて前記検出面に形成するとともに、前記第１像と前記第２像とを前記検出面の面内の方向に相対的に回転させる、前記第１像もしくは前記第２像の一方を前記検出面の面内において反転させる、および前記検出面における前記第１像の形状と前記第２像の形状とを異ならせる、のうち少なくとも１つを行う像変換部を有する、顕微鏡。
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