JP2013167654A

JP2013167654A - 共焦点顕微鏡画像システム

Info

Publication number: JP2013167654A
Application number: JP2010124566A
Authority: JP
Inventors: Hideo Higuchi; 秀男樋口; Togo Shimozawa; 東吾下澤
Original assignee: University of Tokyo NUC
Current assignee: University of Tokyo NUC
Priority date: 2010-05-31
Filing date: 2010-05-31
Publication date: 2013-08-29
Also published as: WO2011152432A1

Abstract

【課題】異なるＺ位置を同時に観察することができ、観察対象物の深さ方向に関して異なる位置を迅速に計測することができる共焦点顕微鏡画像システムを提供すること。
【解決手段】対物レンズ１１を有する顕微鏡本体１０を備える共焦点顕微鏡画像システム１００であって、対物レンズ１１を通る第１光路上ＰＡ１に配置されて対象の観察を可能にする共焦点型の第１光学系２０と、対物レンズ１１を通るとともに第１光路ＰＡ１から分岐される第２光路ＰＡ２上に配置されて対象の観察を可能にする第２光学系３０と、を備え、第２光学系３０に関する対物レンズ１１の光軸方向における第１焦点面の位置は、第１光学系に関する光軸方向における第２焦点面の位置に対して異なるものに設定可能である。
【選択図】図１

Description

本発明は、２つの異なる光学系を有する共焦点顕微鏡画像システムに関する。

共焦点顕微鏡画像システムとして、対物レンズをＺ軸（光軸）方向に移動させて逐次的にスキャンすることで観察試料の画像を得るものがある（特許文献１参照）。また、観察試料を移動させることなく、観察する一対の焦点位置のうち一方を変化させる光学装置がある（特許文献２参照）。

特開２００８−２４９９６５号公報特開２００７−２８６３１０号公報

しかしながら、特許文献１のような共焦点顕微鏡画像システムでは、対物レンズをＺ軸方向に移動させて異なるＺ位置における観察試料の画像を逐次的にスキャンするため、異なるＺ位置の状態を同時に観察することができない。また、このような共焦点顕微鏡画像システムでは、対物レンズを移動する際に振動が発生するおそれがあるため、異なるＺ位置の画像を得るには５０ｍｓ程度の時間を必要とする。そのため、移動等する観察対象物を高時間分解で計測することが困難であった。さらに、共焦点像と同時に位相差像等を得ることはできなかった。

また、特許文献２の光学装置では、一般的な顕微鏡への応用が説明されており、特許文献２の手法を共焦点型の光学系にそのまま適用することができない。

そこで、本発明は、異なるＺ位置を同時に観察することができ、観察対象物の深さ方向に関して異なる位置を迅速に計測することができる共焦点顕微鏡画像システムを提供することを目的とする。

上記課題を解決するため、本発明に係る共焦点顕微鏡画像システムは、対物レンズを有する顕微鏡本体を備える共焦点顕微鏡画像システムであって、対物レンズを通る第１光路上に配置されて対象の観察を可能にする共焦点型の第１光学系と、対物レンズを通るとともに第１光路から分岐される第２光路上に配置されて対象の観察を可能にする第２光学系と、を備え、第２光学系に関する対物レンズの光軸方向における第１焦点面の位置は、第１光学系に関する光軸方向における第２焦点面の位置に対して異なるものに設定可能である。

上記共焦点顕微鏡画像システムでは、光路が異なる第１光学系及び第２光学系での光軸方向における第１及び第２焦点面の位置が互いに異なることにより、異なるＺ位置の観察画像を同時に取得することができる。そのため、連続撮影の時間分解能は、２つのＺ位置の画像取得速度の制限を受けず、カメラの画像取得速度のみに依存することとなり、対象を異なる深さで迅速に計測することができる。

本発明の具体的な態様又は側面では、上記共焦点顕微鏡画像システムにおいて、第１光学系は、共焦点型の照明系及び結像系を形成する共焦点ユニットを有し、第２光路は、共焦点ユニットよりも対物レンズ側で第１光路から分岐される。この場合、第１及び２光路の第１及び第２光学系が互いに影響し合うのを制限して第１光路の共焦点ユニットの機能を高めることができる。

本発明の別の側面では、共焦点ユニットは、対象の観察点を光軸に垂直な面内で走査する共焦点スキャナユニットである。この場合、対象を二次元的に走査することができ、対象である観察試料の焦点面を所望の領域で画像化することができる。

本発明のさらに別の側面では、第１光路と第２光路とを隣接させて観察部に導く合成系をさらに備える。この場合、第１光学系及び第２光学系によって得られる観察試料の各画像を並列的に配置した状態で同時に取得することができる。

本発明のさらに別の側面では、第２光路は、第１光路よりも長い。この場合、第１光路を主たる光路とし、第２光路を迂回光路として、第１及び第２光路の使い分けを行うことができる。

本発明のさらに別の側面では、第２光学系は、共焦点型の照明系及び結像系を形成する別の共焦点ユニットを有する。この場合、例えば共焦点顕微鏡画像システム内の光分岐素子、例えばダイクロイックミラーの反射特性を最適に設計することで、同種蛍光物質標識の切片画像と異種蛍光物質標識の切片画像の両方に対応することができる。

本発明のさらに別の側面では、第１光学系における共焦点ユニットに付随する照明用の第１レーザ光源の第１波長は、第２光学系における別の共焦点ユニットに付随する照明用の第２レーザ光源の第２波長と異なる。この場合、例えば共焦点顕微鏡画像システム内の光分岐素子、例えばダイクロイックミラーの反射特性を最適に設計することで、異種蛍光物質標識の切片画像の両方に対応することができる。

本発明のさらに別の側面では、第１光学系と第２光学系とが分岐する位置に、第１波長のレーザ光と第２波長のレーザ光とを結合する光分岐結合素子を有する。この場合、照明系における第１光路と第２光路とを結合して対象にレーザ光を導くことができる。

本発明のさらに別の側面では、光分岐結合素子は、対象の観察点からの蛍光の光量を略半分に分割する半透過性のフィルタである。この場合、対象の蛍光を略半分の光量で第１光路と第２光路とにそれぞれ導くことができる。

本発明のさらに別の側面では、対象の観察点からの蛍光は、第１及び第２波長と異なる第３波長である。

本発明のさらに別の側面では、第２光学系は、位相差光学系、暗視野光学系、微分干渉光学系、落射蛍光光学系、及び透過蛍光光学系のいずれかである。この場合、２つの光路を作り出すため、共焦点スキャナを１台にして蛍光像その他の共焦点画像を得ると同時に、他の光路から位相差像等の他の光学像を得ることもできる。

本発明のさらに別の側面では、第２光学系は、複数のリレーレンズを有し、複数のリレーレンズのうち少なくとも１つのリレーレンズを動かすことによって、対物レンズを観察試料との距離を維持しつつ光軸における焦点面を移動させる。この場合、対物レンズを移動させることなく観察試料の第２焦点位置を変えることができるため、対象を異なる深さで迅速に計測することができる。

第１実施形態にかかる共焦点顕微鏡画像システムについて説明する概念図である。図１の共焦点顕微鏡画像システムにおける光路の配置状態を示す図である。（Ａ）〜（Ｃ）は、図１等の共焦点顕微鏡画像システムを構成する光学素子の特性を説明する図である。（Ａ）、（Ｂ）は、図１等の共焦点顕微鏡画像システムによって得られた観察画像について説明する図である。図１等の共焦点顕微鏡画像システムによって得られた観察画像について説明する別の図である。第２実施形態にかかる共焦点顕微鏡画像システムについて説明する概念図である。図６の共焦点顕微鏡画像システムにおける光路の配置状態を示す図である。（Ａ）、（Ｂ）は、図６等の共焦点顕微鏡画像システムを構成する光学素子の特性を説明する図である。図６等の共焦点顕微鏡画像システムによって得られた観察画像について説明する図である。

〔第１実施形態〕
以下、本発明の第１実施形態である共焦点顕微鏡画像システムについて、図面を参照しつつ説明する。

図１及び図２に示すように、共焦点顕微鏡画像システム１００は、顕微鏡本体１０と、複合観察光学系８０とを備える。ここで、顕微鏡本体１０は、一般的なものであり、複合観察光学系８０は、第１光学系２０と、第２光学系３０と、結合分岐部７１と、合成部７３と、ＣＣＤカメラ４０とを備える。

共焦点顕微鏡画像システム１００のうち、顕微鏡本体１０は、対物レンズ１１と、観察試料Ｗを載せた試料台１２と、コンデンサレンズ１４と、光路折り曲げ用のミラー１５とを有する。また、図示は省略するが、顕微鏡本体１０は、特定波長域に設定可能な観察用光源、観察鏡筒等を有する。

複合観察光学系８０において、直進的な主光路としての第１光路ＰＡ１と、迂回的な副光路としての第２光路ＰＡ２とは、結合分岐部７１よりも顕微鏡本体１０側で互いに重複しており、合成部７３よりもＣＣＤカメラ４０側でも互いに重複している。つまり、共焦点顕微鏡画像システム１００は、観察対象側と撮像側との両端を共通化した２つの異なる観察用光学系を有するものとなっており、中央の並列的な部分として、第１光路ＰＡ１の独立した部分に沿って設けられる第１光学系２０と、第２光路ＰＡ２の独立した部分に沿って設けられる第２光学系３０とを備える。ここで、第１光学系２０は、顕微鏡本体１０側に照明光を導く照明系として機能するとともに顕微鏡本体１０側からの画像光をＣＣＤカメラ４０側に導く結像系として機能する第１共焦点ユニット２３等を有する。また、第２光学系３０は、顕微鏡本体１０側に照明光を導く照明系として機能するとともに顕微鏡本体１０側からの画像光をＣＣＤカメラ４０側に導く結像系として機能する第２共焦点ユニット３３等を有する。

図２に具体的に示すように、第１光学系２０は、第１共焦点ユニット２３と、結像レンズ２４とを有する。

第１共焦点ユニット２３は、ニポウディスク５１と、ユニット内ダイクロイックミラー５２と、ユニット内折曲ミラー５３，５４と、ディスク駆動装置５９とを有する。なお、第１共焦点ユニット２３に付随して、第１共焦点ユニット２３の外部に第１レーザ光源５５が設けられている（図１参照）。第１レーザ光源５５からの所定波長、具体的には波長４８８ｎｍ（第１波長）の励起光である第１レーザ光ＩＬ１は、ユニット内折曲ミラー５４によって折り曲げられ、ユニット内ダイクロイックミラー５２に導かれる。このユニット内ダイクロイックミラー５２は、バンドパスフィルタであり、照明系の一部として波長４８８ｎｍの光を透過させる（図３（Ａ）の破線参照）。このようなダイクロイックミラー５２の特性により、第１レーザ光源５５からの第１レーザ光ＩＬ１は、第１光路ＰＡ１において、顕微鏡本体１０の対物レンズ１１側に向けて直進する。一方、このユニット内ダイクロイックミラー５２は、波長５６０ｎｍ〜６００ｎｍ（第３波長）の光を反射させる（図３（Ａ）の実線領域参照）。このようなダイクロイックミラー５２の特性により、顕微鏡本体１０からの第１蛍光ＯＬ１は、第１光路ＰＡ１において、反射されつつＣＣＤカメラ４０側に導かれる。

ニポウディスク５１は、一対のピンホールディスク５１ａとマイクロレンズディスク５１ｂとを有する。ピンホールディスク５１ａは、多数のピンホール５１ｃが所定間隔で配置された構造を有する。マイクロレンズディスク５１ｂは、ピンホールディスク５１ａに形成されたピンホール５１ｃに対応する位置に多数のマイクロレンズ５１ｄが所定間隔で配置された構造を有する。第１光路ＰＡ１の照明系において、第１レーザ光源５５から発せられた第１レーザ光ＩＬ１は、適当なビーム径でニポウディスク５１を構成するマイクロレンズ５１ｄに入射する。ここに入射した第１レーザ光ＩＬ１は、マイクロレンズディスク５１ｂの照射領域内の各マイクロレンズ５１ｄを通り、各々に対応して配置されたピンホールディスク５１ａのピンホール５１ｃ上に集光される。ピンホール５１ｃを通過した第１レーザ光ＩＬ１は、結合分岐部７１やコンデンサレンズ１４等を介して対物レンズ１１を通過し、観察試料Ｗを励起する（図１参照）。観察試料Ｗの照明領域から逆方向に出射した第１蛍光ＯＬ１は、再び対物レンズ１１を通過し、結合分岐部７１を透過して第１共焦点ユニット２３のピンホール５１ｃを通過し、第１光路ＰＡ１上のユニット内ダイクロイックミラー５２及びユニット内折曲ミラー５３で反射されてＣＣＤカメラ４０の光電変換面４１の第１領域Ａ１に導かれる。

一方、第２光学系３０は、第２共焦点ユニット３３と、結像レンズ３４と、リレーレンズ３１，３６と、折曲ミラー３２，３５とを有する。

第２共焦点ユニット３３は、ニポウディスク６１と、ユニット内ダイクロイックミラー６２と、ユニット内折曲ミラー６３，６４と、ディスク駆動装置６９とを有する。なお、第２共焦点ユニット３３に付随して、第２共焦点ユニット３３の外部に第２レーザ光源６５が設けられている（図１参照）。第２レーザ光源６５からの所定波長、具体的には波長５３２ｎｍ（第２波長）の励起光である第２レーザ光ＩＬ２は、ユニット内折曲ミラー６４によって折り曲げられ、ユニット内ダイクロイックミラー６２に導かれる。このユニット内ダイクロイックミラー６２は、バンドパスフィルタであり、照明系の一部として波長５３２ｎｍの光を透過させる（図３（Ｂ）の破線参照）。このようなダイクロイックミラー６２の特性により、第２レーザ光源６５からの第２レーザ光ＩＬ２は、第２光路ＰＡ２において、顕微鏡本体１０の対物レンズ１１側に向けて直進する。一方、このユニット内ダイクロイックミラー６２は、波長５６０ｎｍ〜６００ｎｍ（第３波長）の光を反射させる（図３（Ｂ）の実線領域参照）。このようなダイクロイックミラー６２の特性により、顕微鏡本体１０からの第２蛍光ＯＬ２は、第２光路ＰＡ２において、反射されつつＣＣＤカメラ４０側に導かれる。

ニポウディスク６１は、第１共焦点ユニット２３のニポウディスク５１と同様のものであり、一対のピンホールディスク５１ａとマイクロレンズディスク５１ｂとを有する。ピンホールディスク５１ａは、多数のピンホール５１ｃが所定間隔で配置された構造を有する。マイクロレンズディスク５１ｂは、ピンホールディスク５１ａに形成されたピンホール５１ｃに対応する位置に多数のマイクロレンズ５１ｄが所定間隔で配置された構造を有する。第２光路ＰＡ２の照明系において、第２レーザ光源６５から発せられた第２レーザ光ＩＬ２は、適当なビーム径でマイクロレンズ５１ｄに入射する。ここに入射した第２レーザ光ＩＬ２は、ニポウディスク６１を構成するマイクロレンズディスク５１ｂの照射領域内の各マイクロレンズ５１ｄを通り、各々に対応して配置されたピンホールディスク５１ａのピンホール５１ｃ上に集光される。ピンホール５１ｃを通過した第２レーザ光ＩＬ２は、折曲ミラー３２や、リレーレンズ３１、結合分岐部７１、コンデンサレンズ１４等を介して対物レンズ１１を通過し、観察試料Ｗを励起する（図１参照）。観察試料Ｗの照明領域から逆方向に出射した第２蛍光ＯＬ２は、再び対物レンズ１１を通過し、結合分岐部７１で反射されて第２共焦点ユニット３３のピンホール５１ｃを通過し、第１光路ＰＡ１上のユニット内ダイクロイックミラー６２及びユニット内折曲ミラー６３で反射されて第２共焦点ユニット３３外に射出され、折曲ミラー３５で反射されリレーレンズ３６で集光されて合成部７３に導かれる。なお、後に詳述するが、結合分岐部７１で反射されて第２共焦点ユニット３３に導かれる第２蛍光ＯＬ２は、結合分岐部７１を透過して第１共焦点ユニット２３に導かれる第１蛍光ＯＬ１と略同一波長を有するものとなっている。

結合分岐部７１は、特殊なダイクロイックミラーであり、波長領域に応じて反射及び透過の特性が異なっており、入射光の分岐や結合を行う（図３（Ｃ）の破線参照）。結合分岐部７１を構成するダイクロイックミラーは、第１共焦点ユニット２３が配置される第１光路ＰＡ１の照明系の一部として、波長４８８ｎｍの第１レーザ光ＩＬ１を透過させる。また、結合分岐部７１を構成するダイクロイックミラーは、第２共焦点ユニット３３が配置される第２光路ＰＡ２の照明系の一部として、波長５３２ｎｍの第２レーザ光ＩＬ２を反射する。さらに、結合分岐部７１を構成するダイクロイックミラーは、第１共焦点ユニット２３が配置される第１光路ＰＡ１の結像系の一部として、波長５６０ｎｍ〜６００ｎｍの蛍光のうち略半分の光量に相当する第１蛍光ＯＬ１を透過させるとともに、第２共焦点ユニット３３が配置される第２光路ＰＡ２の結像系の一部として、波長５６０ｎｍ〜６００ｎｍの蛍光のうち残りの略半分の光量に相当する第２蛍光ＯＬ２を透過させる。つまり、結合分岐部７１は、第１共焦点ユニット２３側からの第１レーザ光ＩＬ１と、第２共焦点ユニット３３側からの第２レーザ光ＩＬ２とを顕微鏡本体１０に導くとともに、顕微鏡本体１０から射出される観察光である蛍光を第１蛍光ＯＬ１と第２蛍光ＯＬ２とに分岐して第１共焦点ユニット２３と第２共焦点ユニット３３とに導く。

合成部７３は、斜面にミラーを設けたプリズムであり、紙面に垂直な回転軸のまわりに微小回転可能になっている。合成部７３は、第２光学系３０の第２共焦点ユニット３３から射出され、折曲ミラー３５で反射されリレーレンズ３６で集光された第２蛍光ＯＬ２を、第１光路ＰＡ１に平行な方向に反射してＣＣＤカメラ４０の光電変換面４１の第２領域Ａ２に導く。これにより、第２光路ＰＡ２を第１光路ＰＡ１に平行で隣接するものとすることができ、第１光学系２０によって形成される第１蛍光ＯＬ１の観察像と、第２光学系３０によって形成される第２蛍光ＯＬ２の観察像とをＣＣＤカメラ４０の光電変換面４１上に隣接して投射することができる。

なお、第２光学系３０の第２光路ＰＡ２は、第１光学系２０の第１光路ＰＡ１よりも迂回する長いものとなっている。そして、第２光学系３０において、結像レンズ３４やリレーレンズ３１，３６の焦点距離や配置を調整することにより、第１光学系２０によって形成される第１蛍光ＯＬ１の観察像のサイズと、第２光学系３０によって形成される第２蛍光ＯＬ２の観察像のサイズとを光電変換面４１上で略一致させることができる。さらに、リレーレンズ３１の配置を調整することにより、第１光学系２０によって形成される第１蛍光ＯＬ１の観察像に対応する観察試料Ｗ上の焦点位置ＦＰ１と、第２光学系３０によって形成される第２蛍光ＯＬ２の観察像に対応する観察試料Ｗ上の焦点位置ＦＰ２とを同一又は異なるものとできる。つまり、第１光学系２０の焦点位置ＦＰ１の深さ位置と、第２光学系３０の焦点位置ＦＰ２の深さ位置との差Δを予め任意の距離に設定できる。

以下、図１等に示す共焦点顕微鏡画像システム１００の動作について説明する。まず、顕微鏡本体１０において、試料台１２上に観察試料Ｗを載置する。次に、第１光学系２０において、第１共焦点ユニット２３及び第１レーザ光源５５を動作させて、第１レーザ光ＩＬ１によって観察試料Ｗを照明しつつ、観察試料Ｗの蛍光像をＣＣＤカメラ４０で観察する。これと同時に、第２光学系３０において、第２共焦点ユニット３３及び第２レーザ光源６５を動作させて、第２レーザ光ＩＬ２によって観察試料Ｗを照明しつつ、観察試料Ｗの蛍光像をＣＣＤカメラ４０で観察する。この際、第１光学系２０の焦点位置ＦＰ１は、例えば対物レンズ１１から光軸ＯＡ方向に関して相対的に離れた位置に設定され、第２光学系３０の焦点位置ＦＰ２は、例えば対物レンズ１１に光軸ＯＡ方向に関して相対的に近い位置に設定されているので、観察試料Ｗの深さ方向に関して異なる焦点位置ＦＰ１，ＦＰ２の蛍光像を得ることができる。具体的な実施例では、リレーレンズ３１を光軸ＯＡ方向に微小変位させることによって、焦点位置ＦＰ１，ＦＰ２の差Δを例えば０〜５μｍの範囲で調整した。

なお、共焦点顕微鏡画像システム１００で観察する観察試料Ｗは、ｉｎｖｉｖｏ及びｉｎｖｉｔｒｏのいずれの観察試料も用いることができる。例えば、ｉｎｖｉｖｏの場合、小動物個体や組織切片等における生体運動等をイメージングすることができる。また、ｉｎｖｉｔｒｏの場合、精製したタンパク質やＤＮＡ等の生体分子の挙動等をイメージングすることができる。本発明の共焦点顕微鏡画像システム１００を用いることにより、このような生物観察試料において、異なる深さ（Ｚ位置）の観察画像を同時に取得することができる。

以上説明した第１実施形態の共焦点顕微鏡画像システムによれば、光路が異なる第１光学系２０及び第２光学系３０での光軸ＯＡ方向における第１及び第２焦点位置ＦＰ１，ＦＰ２の位置が互いに異なることにより、異なるＺ位置の観察画像を同時に取得することができる。そのため、連続撮影の時間分解能は、２つのＺ位置の画像取得速度の制限を受けず、ＣＣＤカメラ４０の画像取得速度のみに依存することとなり、対象を異なる深さで迅速に計測することができる。

以下、図面を参照しつつ、共焦点顕微鏡画像システム１００によって得られた観察画像について説明する。図４（Ａ）、４（Ｂ）のうち左側半分の画像は、第１光学系２０の波長４８８ｎｍで励起した観察画像であり、右側半分の画像は、第２光学系３０の波長５２３ｎｍで励起した観察画像である。なお、観察試料Ｗは、図４（Ａ）においては、基準位置（Ｚ位置＝０μｍ）に設けられており、図４（Ｂ）においては、基準位置からＺ軸方向に５μｍ移動した位置（Ｚ位置＝５μｍ）に設けられている。

図４（Ａ）からわかるように、第２光学系３０の焦点位置ＦＰ２に対応するＺ位置が０μｍの位置において、右側半分の第２光学系３０の観察画像にピントが合っており、左側半分の第１光学系２０の観察画像がぼやけている。一方、図４（Ｂ）からわかるように、第１光学系２０の焦点位置ＦＰ１に対応するＺ位置が５μｍの位置において、左側半分の第１光学系２０の観察画像にピントが合っており、右側半分の第２光学系３０の観察画像がぼやけている。

図５は、水溶液中の蛍光粒子（直径０．２μｍ）を波長４８８ｎｍと５３２ｎｍとで同時に励起した観察画像である。図５の右側半分は、Ｚ位置５μｍにおける観察画像であり、図５の左側半分は、Ｚ位置０μｍにおける観察画像である。

図５からわかるように、右側半分及び左側半分の観察画像において、画像が異なるものの蛍光粒子のピントがそれぞれ合っており、同時にＺ位置の異なる画像を取得できる。

〔第２実施形態〕
以下、第２実施形態に係る共焦点顕微鏡画像システムについて説明する。なお、第２実施形態に係る共焦点顕微鏡画像システムは、第１実施形態を変形したものである。特に説明しない部分については、第１実施形態と同様であるものとする。

図６及び図７に示すように、共焦点顕微鏡画像システム２００は、顕微鏡本体２１０と、複合観察光学系２８０とを備える。ここで、顕微鏡本体２１０は、詳細は後述するが、複合観察光学系２８０のうち第２光学系２３０の構成要素との関係で位相差光学系を構成する。複合観察光学系２８０は、第１光学系２０と、第２光学系２３０と、結合分岐部７１と、合成部７３と、ＣＣＤカメラ４０とを備える。

図６等に示すように、共焦点顕微鏡画像システム１００は、観察対象側と撮像側との両端を共通化した２つの異なる観察用光学系を有するものとなっており、中央の並列的な部分として、第１光路ＰＡ１の独立した部分に沿って設けられる第１光学系２０と、第２光路ＰＡ２の独立した部分に沿って設けられる第２光学系２３０とを備える。ここで、第１光学系２０は、顕微鏡本体２１０側に照明光を導く照明系として機能するとともに顕微鏡本体２１０側からの画像光をＣＣＤカメラ４０側に導く結像系として機能する第１共焦点ユニット２３を有する。また、第２光学系２３０は、顕微鏡本体２１０側からの画像光をＣＣＤカメラ４０側に導く結像系として機能する位相差光学系の一部である位相差板２３９等を有する。

図７に具体的に示すように、第１光学系２０は、第１共焦点ユニット２３と、結像レンズ２４とを有する。

第１共焦点ユニット２３において、第１レーザ光源５５からの所定波長、具体的には波長５３２ｎｍの励起光である第１レーザ光ＩＬ１は、ユニット内折曲ミラー５４によって折り曲げられ、ユニット内ダイクロイックミラー５２に導かれる。このユニット内ダイクロイックミラー５２は、バンドパスフィルタであり、照明系の一部として波長５３２ｎｍの光を透過させる（図８（Ａ）の破線参照）。このようなダイクロイックミラー５２の特性により、第１レーザ光源５５からの第１レーザ光ＩＬ１は、第１光路ＰＡ１において、顕微鏡本体２１０の対物レンズ１１側に向けて直進する。一方、このユニット内ダイクロイックミラー５２は、波長５６０ｎｍ〜６００ｎｍの光を反射させる（図８（Ａ）の実線領域参照）。このようなダイクロイックミラー５２の特性により、顕微鏡本体２１０からの第１蛍光ＯＬ１は、第１光路ＰＡ１において、反射されつつＣＣＤカメラ４０側に導かれる。

ニポウディスク５１を通過した第１レーザ光ＩＬ１は、結合分岐部７１やコンデンサレンズ１４等を介して、対物レンズ１１を通過し観察試料Ｗを励起する（図６参照）。観察試料Ｗの照明領域から逆方向に出射した第１蛍光ＯＬ１は、再び対物レンズ１１を通過し、結合分岐部７１を透過して第１共焦点ユニット２３のニポウディスク５１を通過し、第１光路ＰＡ１上のユニット内ダイクロイックミラー５２及びユニット内折曲ミラー５３で反射されてＣＣＤカメラ４０の光電変換面４１の第１領域Ａ１に導かれる。

一方、第２光学系２３０は、色フィルタ２３８と、リレーレンズ２３４，２３６と、折曲ミラー３２，３５と、位相差板２３９とを有する。

第２光学系２３０が上述した位相差光学系を構成するために、顕微鏡本体２１０には、コンデンサレンズ１４の前側焦点位置にリング絞り２１８が設けられており、第２光学系２３０の第２光路ＰＡ２上には、対物レンズ１１の後側焦点位置に位相差板２３９が設けられている。このリング絞り２１８と位相差板２３９との作用によって位相差光学系を構成する。

レンズ絞り２１８には、リング形状の開口部２１８ａが形成されている。また、位相差板２３９は、透明板２３９ａにレンズ絞り２１８の開口部２１８ａと略同形状となるように位相差制御膜２３９ｂが形成されたものである。この位相差制御膜２３９ｂは、位相差制御膜２３９ｂを透過した透過光の位相に遅れ或いは進みを生じさせるとともに、透過光量を低下させるものである。顕微鏡本体１０の不図示の光源から照射された光は、レンズ絞り２１８の開口部２１８ａを通過するとリング状の光となる。このリング状の光は、観察試料Ｗを透過し、顕微鏡本体１０のコンデンサレンズ１４等によって平行光となる。その後、観察試料Ｗを透過した透過光は、第２光路ＰＡ２上の位相差板２３９に導かれる。

第２光学系２３０において、観察試料Ｗ中に凹凸や屈折率の差等がない場合、レンズ絞り２１８で絞られた照明光は、観察試料Ｗを透過して位相差板２３９の位相差制御膜２３９ｂを直接光として通過し、そのまま結像面に投影される。一方、観察試料Ｗ中に凹凸や屈折率の差等がある場合、この観察試料Ｗの凹凸や屈折率の差等がある部分を通過する光は回折して、回折光は、位相差板２３９の位相差制御膜２３９ｂ以外の部分を透過する。この結果、回折光は直接光に対して位相がずれる。具体的には、屈折率の差が小さく、かつ厚みが薄いものであれば、位相のずれは略λ／４となる。レンズ絞り２１８は前側焦点位置に、位相差板２３９は後側焦点位置に配置されているため、直接光は必ず位相差板２３９の位相差制御膜２３９ｂを通過する。したがって、位相差板２３９により、直接光の波長を回折光に対してλ／４だけ遅れる方向又は進む方向にずらせるようにし、かつこの透過光量を回折光の光量と略同じ程度に設定すると、直接光と回折光とが干渉して結像面に結ばれる像に明暗の差が生じ、その結像は位相差像となる。

色フィルタ２３８は、所定波長、具体的には波長４５０ｎｍ〜４９０ｎｍの光のみを選択的に透過させるものである。

第２光路ＰＡ２の照明系において、顕微鏡本体２１０の不図示の光源から発せられた照明光は、観察試料Ｗを照明する（図６参照）。観察試料Ｗの照明領域から対物レンズ１１側に出射した透過光は、対物レンズ１１を通過し、結合分岐部７１で反射されて色フィルタ２３８及び位相差板２３９を透過し、折曲ミラー３５で反射されリレーレンズ２３６で集光されて合成部７３に導かれる。

結合分岐部７１は、特殊なダイクロイックミラーであり、波長領域に応じて反射及び透過の特性が異なっており、入射光の分岐や結合を行う（図８（Ｂ）の破線参照）。結合分岐部７１を構成するダイクロイックミラーは、第１共焦点ユニット２３が配置される第１光路ＰＡ１の照明系の一部として、波長５３２ｎｍの第１レーザ光ＩＬ１を透過させる。また、結合分岐部７１を構成するダイクロイックミラーは、第１共焦点ユニット２３が配置される第１光路ＰＡ１の結像系の一部として、波長５６０ｎｍ〜６００ｎｍの第１蛍光ＯＬ１を透過させるとともに、第２光路ＰＡ２の結像系の一部として、波長４５０ｎｍ〜４９０ｎｍの検出光である透過光ＯＬ３を反射させる。つまり、結合分岐部７１は、第１共焦点ユニット２３側からの第１レーザ光ＩＬ１を顕微鏡本体２１０に導くとともに、顕微鏡本体２１０から射出される観察光である蛍光と透過光とを第１蛍光ＯＬ１と透過光ＯＬ３とに分岐して第１共焦点ユニット２３と位相差板２３９とに導く。

合成部７３は、第２光学系２３０の位相差板２３９を透過し、折曲ミラー３５で反射されリレーレンズ３６で集光された透過光ＯＬ３を、第１光路ＰＡ１に平行な方向に反射してＣＣＤカメラ４０の光電変換面４１の第２領域Ａ２に導く。これにより、第２光路ＰＡ２を第１光路ＰＡ１に平行で隣接するものとすることができ、第１光学系２０によって形成される第１蛍光ＯＬ１の観察像と、第２光学系２３０によって形成される透過光ＯＬ３の観察像と、をＣＣＤカメラ４０の光電変換面４１上に隣接して投射することができる。

なお、第２光学系２３０の第２光路ＰＡ２は、第１光学系２０の第１光路ＰＡ１よりも迂回する長いものとなっている。そして、第２光学系２３０において、リレーレンズ２３４，２３６の焦点距離や配置を調整することにより、第１光学系２０によって形成される第１蛍光ＯＬ１の観察像のサイズと、第２光学系２３０によって形成される透過光ＯＬ３の観察像のサイズとを光電変換面４１上で略一致させることができる。さらに、リレーレンズ２３４の配置を調整することにより、第１光学系２０によって形成される第１蛍光ＯＬ１の観察像に対応する観察試料Ｗ上の焦点位置ＦＰ１と、第２光学系２３０によって形成される透過光ＯＬ３の観察像に対応する観察試料Ｗ上の焦点位置ＦＰ２とを同一又は異なるものとできる。つまり、第１光学系２０の焦点位置ＦＰ１の深さ位置と、第２光学系２３０の焦点位置ＦＰ２の深さ位置との差Δを予め任意の距離に設定できる。

以下、図６等に示す共焦点顕微鏡画像システム２００の動作について説明する。まず、顕微鏡本体２１０において、試料台１２上に観察試料Ｗを載置する。次に、第１光学系２０において、第１共焦点ユニット２３及び第１レーザ光源５５を動作させて、第１レーザ光ＩＬ１によって観察試料Ｗを照明しつつ、観察試料Ｗの蛍光像をＣＣＤカメラ４０で観察する。これと同時に、第２光学系２３０において、顕微鏡本体２１０の光源を動作させて、照明光によって観察試料Ｗを照明しつつ、観察試料Ｗの観察像をＣＣＤカメラ４０で観察する。この際、第１光学系２０の焦点位置ＦＰ１は、例えば対物レンズ１１から相対的に離れた位置に設定され、第２光学系２３０の焦点位置ＦＰ２は、例えば対物レンズ１１に相対的に近い位置に設定されているので、観察試料Ｗの深さ方向に関して異なる焦点位置ＦＰ１，ＦＰ２の蛍光像及び観察像をそれぞれ得ることができる。具体的な実施例では、リレーレンズ２３４を光軸ＯＡ方向に微小変位させることによって、焦点位置ＦＰ１，ＦＰ２の差Δを例えば０〜５μｍの範囲で調整した。

以上説明した第２実施形態の共焦点顕微鏡画像システムによれば、２つの光路を作り出すため、共焦点スキャナを第１共焦点ユニット２３の１台にして蛍光像を得ると同時に、第２光路ＰＡ２から位相差像の光学像を得ることもできる。

以下、図面を参照しつつ、共焦点顕微鏡画像システム２００によって得られた観察画像について説明する。図９の右側半分は、水溶液中の蛍光粒子（直径１μｍ）を波長５３２ｎｍで励起した観察画像である。図９の左側半分は、顕微鏡本体２１０の照明光（波長４５０ｎｍ〜４９０ｎｍ）を照射した観察画像である。なお、両画像は、基準位置（Ｚ位置＝０μｍ）からＺ軸方向に５μｍ移動した位置における観察画像である。また、第１及び第２光学系２０，２３０の焦点位置ＦＰ１，ＦＰ２は同一となっている。

図９からわかるように、右側半分及び左側半分の観察画像において、同一のＺ位置の画像で蛍光粒子のピントがそれぞれ合っており、同時に蛍光像及び位相差像の異なる照明系による画像を取得できる。

以上実施形態に即して本発明を説明したが、本発明は、上記実施形態に限定されるものではなく、さまざまな変形が可能である。例えば、上記実施形態において、第１及び第２レーザ光ＩＬ１，ＩＬ２等の波長は例示であり、適宜変更することができる。

また、上記実施形態において、拡大率の異なる画像を一枚の画像として取得できるようにすることもできる。例えば、リレーレンズ３１，２３４の焦点距離を変え、それに合わせて、リレーレンズ３１，２３４の位置を調整すればよい。

また、上記実施形態において、偏光の異なる画像を一枚の画像として取得できるようにすることもできる。例えば、結合分岐部７１を偏光ビームスプリッタにすればよい。

また、第２実施形態において、第２光学系２３０を位相差光学系としたが、第２光学系２３０を暗視野光学系、微分干渉光学系、落射蛍光光学系、及び透過蛍光光学系等とし、共焦点像と、暗視野像等とを同一焦点位置又は異なる焦点位置で同時に観察することができる。

また、上記実施形態において、図１及び図６では倒立型の顕微鏡を図示しているが、正立型の顕微鏡を用いることもできる。

１０，２１０…顕微鏡本体、１１…対物レンズ、１２…試料台、１４…コンデンサレンズ、２０…第１光学系、３０，２３０…第２光学系、２３，３３…共焦点ユニット、３１，３６，２３４，２３６…リレーレンズ、２４，３４…結像レンズ、４０…ＣＣＤカメラ、５１，６１…ニポウディスク、５５，６５…レーザ光源、７１…結合分岐部、７３…合成部、８０，２８０…複合観察光学系、１００，２００…共焦点顕微鏡画像システム、２１８…レンズ絞り、２３９…位相差板、ＦＰ１，ＦＰ２…焦点位置、ＩＬ１，ＩＬ２…レーザ光、ＯＡ…光軸、ＰＡ１…第１光路、ＰＡ２…第２光路、Ｗ…観察試料

Claims

対物レンズを有する顕微鏡本体を備える共焦点顕微鏡画像システムであって、
前記対物レンズを通る第１光路上に配置されて対象の観察を可能にする共焦点型の第１光学系と、
前記対物レンズを通るとともに前記第１光路から分岐される第２光路上に配置されて対象の観察を可能にする第２光学系と、
を備え、
前記第２光学系に関する前記対物レンズの光軸方向における第１焦点面の位置は、前記第１光学系に関する前記光軸方向における第２焦点面の位置に対して異なるものに設定可能であることを特徴する共焦点顕微鏡画像システム。
前記第１光学系は、共焦点型の照明系及び結像系を形成する共焦点ユニットを有し、
前記第２光路は、前記共焦点ユニットよりも前記対物レンズ側で前記第１光路から分岐されることを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡画像システム。
前記共焦点ユニットは、対象の観察点を前記光軸に垂直な面内で走査する共焦点スキャナユニットであることを特徴とする請求項１及び請求項２のいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡画像システム。
前記第１光路と前記第２光路とを隣接させて観察部に導く合成系をさらに備えることを特徴とする請求項１から請求項３までのいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡画像システム。
前記第２光路は、前記第１光路よりも長いことを特徴とする請求項１から請求項４までのいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡画像システム。
前記第２光学系は、共焦点型の照明系及び結像系を形成する別の共焦点ユニットを有することを特徴する請求項１から請求項５までのいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡画像システム。
前記第１光学系における共焦点ユニットに付随する照明用の第１レーザ光源の第１波長は、前記第２光学系における別の共焦点ユニットに付随する照明用の第２レーザ光源の第２波長と異なることを特徴とする請求項６に記載の共焦点顕微鏡画像システム。
前記第１光学系と前記第２光学系とが分岐する位置に、前記第１波長のレーザ光と前記第２波長のレーザ光とを結合する光分岐結合素子を有することを特徴とする請求項６及び請求項７のいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡画像システム。
前記光分岐結合素子は、前記対象の観察点からの蛍光の光量を略半分に分割する半透過性のフィルタであることを特徴とする請求項８に記載の共焦点顕微鏡画像システム。
前記対象の観察点からの蛍光は、前記第１及び第２波長と異なる第３波長であることを特徴とする請求項７から請求項９までのいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡画像システム。
前記第２光学系は、位相差光学系、暗視野光学系、微分干渉光学系、落射蛍光光学系、及び透過蛍光光学系のいずれかであることを特徴する請求項１から請求項５までのいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡画像システム。
前記第２光学系は、複数のリレーレンズを有し、前記複数のリレーレンズのうち少なくとも１つのリレーレンズを動かすことによって、前記対物レンズを前記観察試料との距離を維持しつつ前記光軸における焦点面を移動させることを特徴とする請求項１から請求項１１までのいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡画像システム。