JP2013167654A - 共焦点顕微鏡画像システム - Google Patents
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Abstract
【課題】異なるZ位置を同時に観察することができ、観察対象物の深さ方向に関して異なる位置を迅速に計測することができる共焦点顕微鏡画像システムを提供すること。
【解決手段】対物レンズ11を有する顕微鏡本体10を備える共焦点顕微鏡画像システム100であって、対物レンズ11を通る第1光路上PA1に配置されて対象の観察を可能にする共焦点型の第1光学系20と、対物レンズ11を通るとともに第1光路PA1から分岐される第2光路PA2上に配置されて対象の観察を可能にする第2光学系30と、を備え、第2光学系30に関する対物レンズ11の光軸方向における第1焦点面の位置は、第1光学系に関する光軸方向における第2焦点面の位置に対して異なるものに設定可能である。
【選択図】図1
【解決手段】対物レンズ11を有する顕微鏡本体10を備える共焦点顕微鏡画像システム100であって、対物レンズ11を通る第1光路上PA1に配置されて対象の観察を可能にする共焦点型の第1光学系20と、対物レンズ11を通るとともに第1光路PA1から分岐される第2光路PA2上に配置されて対象の観察を可能にする第2光学系30と、を備え、第2光学系30に関する対物レンズ11の光軸方向における第1焦点面の位置は、第1光学系に関する光軸方向における第2焦点面の位置に対して異なるものに設定可能である。
【選択図】図1
Description
本発明は、2つの異なる光学系を有する共焦点顕微鏡画像システムに関する。
共焦点顕微鏡画像システムとして、対物レンズをZ軸(光軸)方向に移動させて逐次的にスキャンすることで観察試料の画像を得るものがある(特許文献1参照)。また、観察試料を移動させることなく、観察する一対の焦点位置のうち一方を変化させる光学装置がある(特許文献2参照)。
しかしながら、特許文献1のような共焦点顕微鏡画像システムでは、対物レンズをZ軸方向に移動させて異なるZ位置における観察試料の画像を逐次的にスキャンするため、異なるZ位置の状態を同時に観察することができない。また、このような共焦点顕微鏡画像システムでは、対物レンズを移動する際に振動が発生するおそれがあるため、異なるZ位置の画像を得るには50ms程度の時間を必要とする。そのため、移動等する観察対象物を高時間分解で計測することが困難であった。さらに、共焦点像と同時に位相差像等を得ることはできなかった。
また、特許文献2の光学装置では、一般的な顕微鏡への応用が説明されており、特許文献2の手法を共焦点型の光学系にそのまま適用することができない。
そこで、本発明は、異なるZ位置を同時に観察することができ、観察対象物の深さ方向に関して異なる位置を迅速に計測することができる共焦点顕微鏡画像システムを提供することを目的とする。
上記課題を解決するため、本発明に係る共焦点顕微鏡画像システムは、対物レンズを有する顕微鏡本体を備える共焦点顕微鏡画像システムであって、対物レンズを通る第1光路上に配置されて対象の観察を可能にする共焦点型の第1光学系と、対物レンズを通るとともに第1光路から分岐される第2光路上に配置されて対象の観察を可能にする第2光学系と、を備え、第2光学系に関する対物レンズの光軸方向における第1焦点面の位置は、第1光学系に関する光軸方向における第2焦点面の位置に対して異なるものに設定可能である。
上記共焦点顕微鏡画像システムでは、光路が異なる第1光学系及び第2光学系での光軸方向における第1及び第2焦点面の位置が互いに異なることにより、異なるZ位置の観察画像を同時に取得することができる。そのため、連続撮影の時間分解能は、2つのZ位置の画像取得速度の制限を受けず、カメラの画像取得速度のみに依存することとなり、対象を異なる深さで迅速に計測することができる。
本発明の具体的な態様又は側面では、上記共焦点顕微鏡画像システムにおいて、第1光学系は、共焦点型の照明系及び結像系を形成する共焦点ユニットを有し、第2光路は、共焦点ユニットよりも対物レンズ側で第1光路から分岐される。この場合、第1及び2光路の第1及び第2光学系が互いに影響し合うのを制限して第1光路の共焦点ユニットの機能を高めることができる。
本発明の別の側面では、共焦点ユニットは、対象の観察点を光軸に垂直な面内で走査する共焦点スキャナユニットである。この場合、対象を二次元的に走査することができ、対象である観察試料の焦点面を所望の領域で画像化することができる。
本発明のさらに別の側面では、第1光路と第2光路とを隣接させて観察部に導く合成系をさらに備える。この場合、第1光学系及び第2光学系によって得られる観察試料の各画像を並列的に配置した状態で同時に取得することができる。
本発明のさらに別の側面では、第2光路は、第1光路よりも長い。この場合、第1光路を主たる光路とし、第2光路を迂回光路として、第1及び第2光路の使い分けを行うことができる。
本発明のさらに別の側面では、第2光学系は、共焦点型の照明系及び結像系を形成する別の共焦点ユニットを有する。この場合、例えば共焦点顕微鏡画像システム内の光分岐素子、例えばダイクロイックミラーの反射特性を最適に設計することで、同種蛍光物質標識の切片画像と異種蛍光物質標識の切片画像の両方に対応することができる。
本発明のさらに別の側面では、第1光学系における共焦点ユニットに付随する照明用の第1レーザ光源の第1波長は、第2光学系における別の共焦点ユニットに付随する照明用の第2レーザ光源の第2波長と異なる。この場合、例えば共焦点顕微鏡画像システム内の光分岐素子、例えばダイクロイックミラーの反射特性を最適に設計することで、異種蛍光物質標識の切片画像の両方に対応することができる。
本発明のさらに別の側面では、第1光学系と第2光学系とが分岐する位置に、第1波長のレーザ光と第2波長のレーザ光とを結合する光分岐結合素子を有する。この場合、照明系における第1光路と第2光路とを結合して対象にレーザ光を導くことができる。
本発明のさらに別の側面では、光分岐結合素子は、対象の観察点からの蛍光の光量を略半分に分割する半透過性のフィルタである。この場合、対象の蛍光を略半分の光量で第1光路と第2光路とにそれぞれ導くことができる。
本発明のさらに別の側面では、対象の観察点からの蛍光は、第1及び第2波長と異なる第3波長である。
本発明のさらに別の側面では、第2光学系は、位相差光学系、暗視野光学系、微分干渉光学系、落射蛍光光学系、及び透過蛍光光学系のいずれかである。この場合、2つの光路を作り出すため、共焦点スキャナを1台にして蛍光像その他の共焦点画像を得ると同時に、他の光路から位相差像等の他の光学像を得ることもできる。
本発明のさらに別の側面では、第2光学系は、複数のリレーレンズを有し、複数のリレーレンズのうち少なくとも1つのリレーレンズを動かすことによって、対物レンズを観察試料との距離を維持しつつ光軸における焦点面を移動させる。この場合、対物レンズを移動させることなく観察試料の第2焦点位置を変えることができるため、対象を異なる深さで迅速に計測することができる。
〔第1実施形態〕
以下、本発明の第1実施形態である共焦点顕微鏡画像システムについて、図面を参照しつつ説明する。
以下、本発明の第1実施形態である共焦点顕微鏡画像システムについて、図面を参照しつつ説明する。
図1及び図2に示すように、共焦点顕微鏡画像システム100は、顕微鏡本体10と、複合観察光学系80とを備える。ここで、顕微鏡本体10は、一般的なものであり、複合観察光学系80は、第1光学系20と、第2光学系30と、結合分岐部71と、合成部73と、CCDカメラ40とを備える。
共焦点顕微鏡画像システム100のうち、顕微鏡本体10は、対物レンズ11と、観察試料Wを載せた試料台12と、コンデンサレンズ14と、光路折り曲げ用のミラー15とを有する。また、図示は省略するが、顕微鏡本体10は、特定波長域に設定可能な観察用光源、観察鏡筒等を有する。
複合観察光学系80において、直進的な主光路としての第1光路PA1と、迂回的な副光路としての第2光路PA2とは、結合分岐部71よりも顕微鏡本体10側で互いに重複しており、合成部73よりもCCDカメラ40側でも互いに重複している。つまり、共焦点顕微鏡画像システム100は、観察対象側と撮像側との両端を共通化した2つの異なる観察用光学系を有するものとなっており、中央の並列的な部分として、第1光路PA1の独立した部分に沿って設けられる第1光学系20と、第2光路PA2の独立した部分に沿って設けられる第2光学系30とを備える。ここで、第1光学系20は、顕微鏡本体10側に照明光を導く照明系として機能するとともに顕微鏡本体10側からの画像光をCCDカメラ40側に導く結像系として機能する第1共焦点ユニット23等を有する。また、第2光学系30は、顕微鏡本体10側に照明光を導く照明系として機能するとともに顕微鏡本体10側からの画像光をCCDカメラ40側に導く結像系として機能する第2共焦点ユニット33等を有する。
図2に具体的に示すように、第1光学系20は、第1共焦点ユニット23と、結像レンズ24とを有する。
第1共焦点ユニット23は、ニポウディスク51と、ユニット内ダイクロイックミラー52と、ユニット内折曲ミラー53,54と、ディスク駆動装置59とを有する。なお、第1共焦点ユニット23に付随して、第1共焦点ユニット23の外部に第1レーザ光源55が設けられている(図1参照)。第1レーザ光源55からの所定波長、具体的には波長488nm(第1波長)の励起光である第1レーザ光IL1は、ユニット内折曲ミラー54によって折り曲げられ、ユニット内ダイクロイックミラー52に導かれる。このユニット内ダイクロイックミラー52は、バンドパスフィルタであり、照明系の一部として波長488nmの光を透過させる(図3(A)の破線参照)。このようなダイクロイックミラー52の特性により、第1レーザ光源55からの第1レーザ光IL1は、第1光路PA1において、顕微鏡本体10の対物レンズ11側に向けて直進する。一方、このユニット内ダイクロイックミラー52は、波長560nm〜600nm(第3波長)の光を反射させる(図3(A)の実線領域参照)。このようなダイクロイックミラー52の特性により、顕微鏡本体10からの第1蛍光OL1は、第1光路PA1において、反射されつつCCDカメラ40側に導かれる。
ニポウディスク51は、一対のピンホールディスク51aとマイクロレンズディスク51bとを有する。ピンホールディスク51aは、多数のピンホール51cが所定間隔で配置された構造を有する。マイクロレンズディスク51bは、ピンホールディスク51aに形成されたピンホール51cに対応する位置に多数のマイクロレンズ51dが所定間隔で配置された構造を有する。第1光路PA1の照明系において、第1レーザ光源55から発せられた第1レーザ光IL1は、適当なビーム径でニポウディスク51を構成するマイクロレンズ51dに入射する。ここに入射した第1レーザ光IL1は、マイクロレンズディスク51bの照射領域内の各マイクロレンズ51dを通り、各々に対応して配置されたピンホールディスク51aのピンホール51c上に集光される。ピンホール51cを通過した第1レーザ光IL1は、結合分岐部71やコンデンサレンズ14等を介して対物レンズ11を通過し、観察試料Wを励起する(図1参照)。観察試料Wの照明領域から逆方向に出射した第1蛍光OL1は、再び対物レンズ11を通過し、結合分岐部71を透過して第1共焦点ユニット23のピンホール51cを通過し、第1光路PA1上のユニット内ダイクロイックミラー52及びユニット内折曲ミラー53で反射されてCCDカメラ40の光電変換面41の第1領域A1に導かれる。
一方、第2光学系30は、第2共焦点ユニット33と、結像レンズ34と、リレーレンズ31,36と、折曲ミラー32,35とを有する。
第2共焦点ユニット33は、ニポウディスク61と、ユニット内ダイクロイックミラー62と、ユニット内折曲ミラー63,64と、ディスク駆動装置69とを有する。なお、第2共焦点ユニット33に付随して、第2共焦点ユニット33の外部に第2レーザ光源65が設けられている(図1参照)。第2レーザ光源65からの所定波長、具体的には波長532nm(第2波長)の励起光である第2レーザ光IL2は、ユニット内折曲ミラー64によって折り曲げられ、ユニット内ダイクロイックミラー62に導かれる。このユニット内ダイクロイックミラー62は、バンドパスフィルタであり、照明系の一部として波長532nmの光を透過させる(図3(B)の破線参照)。このようなダイクロイックミラー62の特性により、第2レーザ光源65からの第2レーザ光IL2は、第2光路PA2において、顕微鏡本体10の対物レンズ11側に向けて直進する。一方、このユニット内ダイクロイックミラー62は、波長560nm〜600nm(第3波長)の光を反射させる(図3(B)の実線領域参照)。このようなダイクロイックミラー62の特性により、顕微鏡本体10からの第2蛍光OL2は、第2光路PA2において、反射されつつCCDカメラ40側に導かれる。
ニポウディスク61は、第1共焦点ユニット23のニポウディスク51と同様のものであり、一対のピンホールディスク51aとマイクロレンズディスク51bとを有する。ピンホールディスク51aは、多数のピンホール51cが所定間隔で配置された構造を有する。マイクロレンズディスク51bは、ピンホールディスク51aに形成されたピンホール51cに対応する位置に多数のマイクロレンズ51dが所定間隔で配置された構造を有する。第2光路PA2の照明系において、第2レーザ光源65から発せられた第2レーザ光IL2は、適当なビーム径でマイクロレンズ51dに入射する。ここに入射した第2レーザ光IL2は、ニポウディスク61を構成するマイクロレンズディスク51bの照射領域内の各マイクロレンズ51dを通り、各々に対応して配置されたピンホールディスク51aのピンホール51c上に集光される。ピンホール51cを通過した第2レーザ光IL2は、折曲ミラー32や、リレーレンズ31、結合分岐部71、コンデンサレンズ14等を介して対物レンズ11を通過し、観察試料Wを励起する(図1参照)。観察試料Wの照明領域から逆方向に出射した第2蛍光OL2は、再び対物レンズ11を通過し、結合分岐部71で反射されて第2共焦点ユニット33のピンホール51cを通過し、第1光路PA1上のユニット内ダイクロイックミラー62及びユニット内折曲ミラー63で反射されて第2共焦点ユニット33外に射出され、折曲ミラー35で反射されリレーレンズ36で集光されて合成部73に導かれる。なお、後に詳述するが、結合分岐部71で反射されて第2共焦点ユニット33に導かれる第2蛍光OL2は、結合分岐部71を透過して第1共焦点ユニット23に導かれる第1蛍光OL1と略同一波長を有するものとなっている。
結合分岐部71は、特殊なダイクロイックミラーであり、波長領域に応じて反射及び透過の特性が異なっており、入射光の分岐や結合を行う(図3(C)の破線参照)。結合分岐部71を構成するダイクロイックミラーは、第1共焦点ユニット23が配置される第1光路PA1の照明系の一部として、波長488nmの第1レーザ光IL1を透過させる。また、結合分岐部71を構成するダイクロイックミラーは、第2共焦点ユニット33が配置される第2光路PA2の照明系の一部として、波長532nmの第2レーザ光IL2を反射する。さらに、結合分岐部71を構成するダイクロイックミラーは、第1共焦点ユニット23が配置される第1光路PA1の結像系の一部として、波長560nm〜600nmの蛍光のうち略半分の光量に相当する第1蛍光OL1を透過させるとともに、第2共焦点ユニット33が配置される第2光路PA2の結像系の一部として、波長560nm〜600nmの蛍光のうち残りの略半分の光量に相当する第2蛍光OL2を透過させる。つまり、結合分岐部71は、第1共焦点ユニット23側からの第1レーザ光IL1と、第2共焦点ユニット33側からの第2レーザ光IL2とを顕微鏡本体10に導くとともに、顕微鏡本体10から射出される観察光である蛍光を第1蛍光OL1と第2蛍光OL2とに分岐して第1共焦点ユニット23と第2共焦点ユニット33とに導く。
合成部73は、斜面にミラーを設けたプリズムであり、紙面に垂直な回転軸のまわりに微小回転可能になっている。合成部73は、第2光学系30の第2共焦点ユニット33から射出され、折曲ミラー35で反射されリレーレンズ36で集光された第2蛍光OL2を、第1光路PA1に平行な方向に反射してCCDカメラ40の光電変換面41の第2領域A2に導く。これにより、第2光路PA2を第1光路PA1に平行で隣接するものとすることができ、第1光学系20によって形成される第1蛍光OL1の観察像と、第2光学系30によって形成される第2蛍光OL2の観察像とをCCDカメラ40の光電変換面41上に隣接して投射することができる。
なお、第2光学系30の第2光路PA2は、第1光学系20の第1光路PA1よりも迂回する長いものとなっている。そして、第2光学系30において、結像レンズ34やリレーレンズ31,36の焦点距離や配置を調整することにより、第1光学系20によって形成される第1蛍光OL1の観察像のサイズと、第2光学系30によって形成される第2蛍光OL2の観察像のサイズとを光電変換面41上で略一致させることができる。さらに、リレーレンズ31の配置を調整することにより、第1光学系20によって形成される第1蛍光OL1の観察像に対応する観察試料W上の焦点位置FP1と、第2光学系30によって形成される第2蛍光OL2の観察像に対応する観察試料W上の焦点位置FP2とを同一又は異なるものとできる。つまり、第1光学系20の焦点位置FP1の深さ位置と、第2光学系30の焦点位置FP2の深さ位置との差Δを予め任意の距離に設定できる。
以下、図1等に示す共焦点顕微鏡画像システム100の動作について説明する。まず、顕微鏡本体10において、試料台12上に観察試料Wを載置する。次に、第1光学系20において、第1共焦点ユニット23及び第1レーザ光源55を動作させて、第1レーザ光IL1によって観察試料Wを照明しつつ、観察試料Wの蛍光像をCCDカメラ40で観察する。これと同時に、第2光学系30において、第2共焦点ユニット33及び第2レーザ光源65を動作させて、第2レーザ光IL2によって観察試料Wを照明しつつ、観察試料Wの蛍光像をCCDカメラ40で観察する。この際、第1光学系20の焦点位置FP1は、例えば対物レンズ11から光軸OA方向に関して相対的に離れた位置に設定され、第2光学系30の焦点位置FP2は、例えば対物レンズ11に光軸OA方向に関して相対的に近い位置に設定されているので、観察試料Wの深さ方向に関して異なる焦点位置FP1,FP2の蛍光像を得ることができる。具体的な実施例では、リレーレンズ31を光軸OA方向に微小変位させることによって、焦点位置FP1,FP2の差Δを例えば0〜5μmの範囲で調整した。
なお、共焦点顕微鏡画像システム100で観察する観察試料Wは、in vivo及びin vitroのいずれの観察試料も用いることができる。例えば、in vivoの場合、小動物個体や組織切片等における生体運動等をイメージングすることができる。また、in vitroの場合、精製したタンパク質やDNA等の生体分子の挙動等をイメージングすることができる。本発明の共焦点顕微鏡画像システム100を用いることにより、このような生物観察試料において、異なる深さ(Z位置)の観察画像を同時に取得することができる。
以上説明した第1実施形態の共焦点顕微鏡画像システムによれば、光路が異なる第1光学系20及び第2光学系30での光軸OA方向における第1及び第2焦点位置FP1,FP2の位置が互いに異なることにより、異なるZ位置の観察画像を同時に取得することができる。そのため、連続撮影の時間分解能は、2つのZ位置の画像取得速度の制限を受けず、CCDカメラ40の画像取得速度のみに依存することとなり、対象を異なる深さで迅速に計測することができる。
以下、図面を参照しつつ、共焦点顕微鏡画像システム100によって得られた観察画像について説明する。図4(A)、4(B)のうち左側半分の画像は、第1光学系20の波長488nmで励起した観察画像であり、右側半分の画像は、第2光学系30の波長523nmで励起した観察画像である。なお、観察試料Wは、図4(A)においては、基準位置(Z位置=0μm)に設けられており、図4(B)においては、基準位置からZ軸方向に5μm移動した位置(Z位置=5μm)に設けられている。
図4(A)からわかるように、第2光学系30の焦点位置FP2に対応するZ位置が0μmの位置において、右側半分の第2光学系30の観察画像にピントが合っており、左側半分の第1光学系20の観察画像がぼやけている。一方、図4(B)からわかるように、第1光学系20の焦点位置FP1に対応するZ位置が5μmの位置において、左側半分の第1光学系20の観察画像にピントが合っており、右側半分の第2光学系30の観察画像がぼやけている。
図5は、水溶液中の蛍光粒子(直径0.2μm)を波長488nmと532nmとで同時に励起した観察画像である。図5の右側半分は、Z位置5μmにおける観察画像であり、図5の左側半分は、Z位置0μmにおける観察画像である。
図5からわかるように、右側半分及び左側半分の観察画像において、画像が異なるものの蛍光粒子のピントがそれぞれ合っており、同時にZ位置の異なる画像を取得できる。
〔第2実施形態〕
以下、第2実施形態に係る共焦点顕微鏡画像システムについて説明する。なお、第2実施形態に係る共焦点顕微鏡画像システムは、第1実施形態を変形したものである。特に説明しない部分については、第1実施形態と同様であるものとする。
以下、第2実施形態に係る共焦点顕微鏡画像システムについて説明する。なお、第2実施形態に係る共焦点顕微鏡画像システムは、第1実施形態を変形したものである。特に説明しない部分については、第1実施形態と同様であるものとする。
図6及び図7に示すように、共焦点顕微鏡画像システム200は、顕微鏡本体210と、複合観察光学系280とを備える。ここで、顕微鏡本体210は、詳細は後述するが、複合観察光学系280のうち第2光学系230の構成要素との関係で位相差光学系を構成する。複合観察光学系280は、第1光学系20と、第2光学系230と、結合分岐部71と、合成部73と、CCDカメラ40とを備える。
図6等に示すように、共焦点顕微鏡画像システム100は、観察対象側と撮像側との両端を共通化した2つの異なる観察用光学系を有するものとなっており、中央の並列的な部分として、第1光路PA1の独立した部分に沿って設けられる第1光学系20と、第2光路PA2の独立した部分に沿って設けられる第2光学系230とを備える。ここで、第1光学系20は、顕微鏡本体210側に照明光を導く照明系として機能するとともに顕微鏡本体210側からの画像光をCCDカメラ40側に導く結像系として機能する第1共焦点ユニット23を有する。また、第2光学系230は、顕微鏡本体210側からの画像光をCCDカメラ40側に導く結像系として機能する位相差光学系の一部である位相差板239等を有する。
図7に具体的に示すように、第1光学系20は、第1共焦点ユニット23と、結像レンズ24とを有する。
第1共焦点ユニット23において、第1レーザ光源55からの所定波長、具体的には波長532nmの励起光である第1レーザ光IL1は、ユニット内折曲ミラー54によって折り曲げられ、ユニット内ダイクロイックミラー52に導かれる。このユニット内ダイクロイックミラー52は、バンドパスフィルタであり、照明系の一部として波長532nmの光を透過させる(図8(A)の破線参照)。このようなダイクロイックミラー52の特性により、第1レーザ光源55からの第1レーザ光IL1は、第1光路PA1において、顕微鏡本体210の対物レンズ11側に向けて直進する。一方、このユニット内ダイクロイックミラー52は、波長560nm〜600nmの光を反射させる(図8(A)の実線領域参照)。このようなダイクロイックミラー52の特性により、顕微鏡本体210からの第1蛍光OL1は、第1光路PA1において、反射されつつCCDカメラ40側に導かれる。
ニポウディスク51を通過した第1レーザ光IL1は、結合分岐部71やコンデンサレンズ14等を介して、対物レンズ11を通過し観察試料Wを励起する(図6参照)。観察試料Wの照明領域から逆方向に出射した第1蛍光OL1は、再び対物レンズ11を通過し、結合分岐部71を透過して第1共焦点ユニット23のニポウディスク51を通過し、第1光路PA1上のユニット内ダイクロイックミラー52及びユニット内折曲ミラー53で反射されてCCDカメラ40の光電変換面41の第1領域A1に導かれる。
一方、第2光学系230は、色フィルタ238と、リレーレンズ234,236と、折曲ミラー32,35と、位相差板239とを有する。
第2光学系230が上述した位相差光学系を構成するために、顕微鏡本体210には、コンデンサレンズ14の前側焦点位置にリング絞り218が設けられており、第2光学系230の第2光路PA2上には、対物レンズ11の後側焦点位置に位相差板239が設けられている。このリング絞り218と位相差板239との作用によって位相差光学系を構成する。
レンズ絞り218には、リング形状の開口部218aが形成されている。また、位相差板239は、透明板239aにレンズ絞り218の開口部218aと略同形状となるように位相差制御膜239bが形成されたものである。この位相差制御膜239bは、位相差制御膜239bを透過した透過光の位相に遅れ或いは進みを生じさせるとともに、透過光量を低下させるものである。顕微鏡本体10の不図示の光源から照射された光は、レンズ絞り218の開口部218aを通過するとリング状の光となる。このリング状の光は、観察試料Wを透過し、顕微鏡本体10のコンデンサレンズ14等によって平行光となる。その後、観察試料Wを透過した透過光は、第2光路PA2上の位相差板239に導かれる。
第2光学系230において、観察試料W中に凹凸や屈折率の差等がない場合、レンズ絞り218で絞られた照明光は、観察試料Wを透過して位相差板239の位相差制御膜239bを直接光として通過し、そのまま結像面に投影される。一方、観察試料W中に凹凸や屈折率の差等がある場合、この観察試料Wの凹凸や屈折率の差等がある部分を通過する光は回折して、回折光は、位相差板239の位相差制御膜239b以外の部分を透過する。この結果、回折光は直接光に対して位相がずれる。具体的には、屈折率の差が小さく、かつ厚みが薄いものであれば、位相のずれは略λ/4となる。レンズ絞り218は前側焦点位置に、位相差板239は後側焦点位置に配置されているため、直接光は必ず位相差板239の位相差制御膜239bを通過する。したがって、位相差板239により、直接光の波長を回折光に対してλ/4だけ遅れる方向又は進む方向にずらせるようにし、かつこの透過光量を回折光の光量と略同じ程度に設定すると、直接光と回折光とが干渉して結像面に結ばれる像に明暗の差が生じ、その結像は位相差像となる。
色フィルタ238は、所定波長、具体的には波長450nm〜490nmの光のみを選択的に透過させるものである。
第2光路PA2の照明系において、顕微鏡本体210の不図示の光源から発せられた照明光は、観察試料Wを照明する(図6参照)。観察試料Wの照明領域から対物レンズ11側に出射した透過光は、対物レンズ11を通過し、結合分岐部71で反射されて色フィルタ238及び位相差板239を透過し、折曲ミラー35で反射されリレーレンズ236で集光されて合成部73に導かれる。
結合分岐部71は、特殊なダイクロイックミラーであり、波長領域に応じて反射及び透過の特性が異なっており、入射光の分岐や結合を行う(図8(B)の破線参照)。結合分岐部71を構成するダイクロイックミラーは、第1共焦点ユニット23が配置される第1光路PA1の照明系の一部として、波長532nmの第1レーザ光IL1を透過させる。また、結合分岐部71を構成するダイクロイックミラーは、第1共焦点ユニット23が配置される第1光路PA1の結像系の一部として、波長560nm〜600nmの第1蛍光OL1を透過させるとともに、第2光路PA2の結像系の一部として、波長450nm〜490nmの検出光である透過光OL3を反射させる。つまり、結合分岐部71は、第1共焦点ユニット23側からの第1レーザ光IL1を顕微鏡本体210に導くとともに、顕微鏡本体210から射出される観察光である蛍光と透過光とを第1蛍光OL1と透過光OL3とに分岐して第1共焦点ユニット23と位相差板239とに導く。
合成部73は、第2光学系230の位相差板239を透過し、折曲ミラー35で反射されリレーレンズ36で集光された透過光OL3を、第1光路PA1に平行な方向に反射してCCDカメラ40の光電変換面41の第2領域A2に導く。これにより、第2光路PA2を第1光路PA1に平行で隣接するものとすることができ、第1光学系20によって形成される第1蛍光OL1の観察像と、第2光学系230によって形成される透過光OL3の観察像と、をCCDカメラ40の光電変換面41上に隣接して投射することができる。
なお、第2光学系230の第2光路PA2は、第1光学系20の第1光路PA1よりも迂回する長いものとなっている。そして、第2光学系230において、リレーレンズ234,236の焦点距離や配置を調整することにより、第1光学系20によって形成される第1蛍光OL1の観察像のサイズと、第2光学系230によって形成される透過光OL3の観察像のサイズとを光電変換面41上で略一致させることができる。さらに、リレーレンズ234の配置を調整することにより、第1光学系20によって形成される第1蛍光OL1の観察像に対応する観察試料W上の焦点位置FP1と、第2光学系230によって形成される透過光OL3の観察像に対応する観察試料W上の焦点位置FP2とを同一又は異なるものとできる。つまり、第1光学系20の焦点位置FP1の深さ位置と、第2光学系230の焦点位置FP2の深さ位置との差Δを予め任意の距離に設定できる。
以下、図6等に示す共焦点顕微鏡画像システム200の動作について説明する。まず、顕微鏡本体210において、試料台12上に観察試料Wを載置する。次に、第1光学系20において、第1共焦点ユニット23及び第1レーザ光源55を動作させて、第1レーザ光IL1によって観察試料Wを照明しつつ、観察試料Wの蛍光像をCCDカメラ40で観察する。これと同時に、第2光学系230において、顕微鏡本体210の光源を動作させて、照明光によって観察試料Wを照明しつつ、観察試料Wの観察像をCCDカメラ40で観察する。この際、第1光学系20の焦点位置FP1は、例えば対物レンズ11から相対的に離れた位置に設定され、第2光学系230の焦点位置FP2は、例えば対物レンズ11に相対的に近い位置に設定されているので、観察試料Wの深さ方向に関して異なる焦点位置FP1,FP2の蛍光像及び観察像をそれぞれ得ることができる。具体的な実施例では、リレーレンズ234を光軸OA方向に微小変位させることによって、焦点位置FP1,FP2の差Δを例えば0〜5μmの範囲で調整した。
以上説明した第2実施形態の共焦点顕微鏡画像システムによれば、2つの光路を作り出すため、共焦点スキャナを第1共焦点ユニット23の1台にして蛍光像を得ると同時に、第2光路PA2から位相差像の光学像を得ることもできる。
以下、図面を参照しつつ、共焦点顕微鏡画像システム200によって得られた観察画像について説明する。図9の右側半分は、水溶液中の蛍光粒子(直径1μm)を波長532nmで励起した観察画像である。図9の左側半分は、顕微鏡本体210の照明光(波長450nm〜490nm)を照射した観察画像である。なお、両画像は、基準位置(Z位置=0μm)からZ軸方向に5μm移動した位置における観察画像である。また、第1及び第2光学系20,230の焦点位置FP1,FP2は同一となっている。
図9からわかるように、右側半分及び左側半分の観察画像において、同一のZ位置の画像で蛍光粒子のピントがそれぞれ合っており、同時に蛍光像及び位相差像の異なる照明系による画像を取得できる。
以上実施形態に即して本発明を説明したが、本発明は、上記実施形態に限定されるものではなく、さまざまな変形が可能である。例えば、上記実施形態において、第1及び第2レーザ光IL1,IL2等の波長は例示であり、適宜変更することができる。
また、上記実施形態において、拡大率の異なる画像を一枚の画像として取得できるようにすることもできる。例えば、リレーレンズ31,234の焦点距離を変え、それに合わせて、リレーレンズ31,234の位置を調整すればよい。
また、上記実施形態において、偏光の異なる画像を一枚の画像として取得できるようにすることもできる。例えば、結合分岐部71を偏光ビームスプリッタにすればよい。
また、第2実施形態において、第2光学系230を位相差光学系としたが、第2光学系230を暗視野光学系、微分干渉光学系、落射蛍光光学系、及び透過蛍光光学系等とし、共焦点像と、暗視野像等とを同一焦点位置又は異なる焦点位置で同時に観察することができる。
また、上記実施形態において、図1及び図6では倒立型の顕微鏡を図示しているが、正立型の顕微鏡を用いることもできる。
10,210…顕微鏡本体、 11…対物レンズ、 12…試料台、 14…コンデンサレンズ、 20…第1光学系、 30,230…第2光学系、 23,33…共焦点ユニット、 31,36,234,236…リレーレンズ、 24,34…結像レンズ、 40…CCDカメラ、 51,61…ニポウディスク、 55,65…レーザ光源、 71…結合分岐部、 73…合成部、 80,280…複合観察光学系、 100,200…共焦点顕微鏡画像システム、 218…レンズ絞り、 239…位相差板、 FP1,FP2…焦点位置、 IL1,IL2…レーザ光、 OA…光軸、 PA1…第1光路、 PA2…第2光路、 W…観察試料
Claims (12)
- 対物レンズを有する顕微鏡本体を備える共焦点顕微鏡画像システムであって、
前記対物レンズを通る第1光路上に配置されて対象の観察を可能にする共焦点型の第1光学系と、
前記対物レンズを通るとともに前記第1光路から分岐される第2光路上に配置されて対象の観察を可能にする第2光学系と、
を備え、
前記第2光学系に関する前記対物レンズの光軸方向における第1焦点面の位置は、前記第1光学系に関する前記光軸方向における第2焦点面の位置に対して異なるものに設定可能であることを特徴する共焦点顕微鏡画像システム。 - 前記第1光学系は、共焦点型の照明系及び結像系を形成する共焦点ユニットを有し、
前記第2光路は、前記共焦点ユニットよりも前記対物レンズ側で前記第1光路から分岐されることを特徴とする請求項1に記載の共焦点顕微鏡画像システム。 - 前記共焦点ユニットは、対象の観察点を前記光軸に垂直な面内で走査する共焦点スキャナユニットであることを特徴とする請求項1及び請求項2のいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡画像システム。
- 前記第1光路と前記第2光路とを隣接させて観察部に導く合成系をさらに備えることを特徴とする請求項1から請求項3までのいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡画像システム。
- 前記第2光路は、前記第1光路よりも長いことを特徴とする請求項1から請求項4までのいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡画像システム。
- 前記第2光学系は、共焦点型の照明系及び結像系を形成する別の共焦点ユニットを有することを特徴する請求項1から請求項5までのいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡画像システム。
- 前記第1光学系における共焦点ユニットに付随する照明用の第1レーザ光源の第1波長は、前記第2光学系における別の共焦点ユニットに付随する照明用の第2レーザ光源の第2波長と異なることを特徴とする請求項6に記載の共焦点顕微鏡画像システム。
- 前記第1光学系と前記第2光学系とが分岐する位置に、前記第1波長のレーザ光と前記第2波長のレーザ光とを結合する光分岐結合素子を有することを特徴とする請求項6及び請求項7のいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡画像システム。
- 前記光分岐結合素子は、前記対象の観察点からの蛍光の光量を略半分に分割する半透過性のフィルタであることを特徴とする請求項8に記載の共焦点顕微鏡画像システム。
- 前記対象の観察点からの蛍光は、前記第1及び第2波長と異なる第3波長であることを特徴とする請求項7から請求項9までのいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡画像システム。
- 前記第2光学系は、位相差光学系、暗視野光学系、微分干渉光学系、落射蛍光光学系、及び透過蛍光光学系のいずれかであることを特徴する請求項1から請求項5までのいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡画像システム。
- 前記第2光学系は、複数のリレーレンズを有し、前記複数のリレーレンズのうち少なくとも1つのリレーレンズを動かすことによって、前記対物レンズを前記観察試料との距離を維持しつつ前記光軸における焦点面を移動させることを特徴とする請求項1から請求項11までのいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡画像システム。
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