JP5765569B2

JP5765569B2 - 顕微鏡装置

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Publication number: JP5765569B2
Application number: JP2011183858A
Authority: JP
Inventors: 山宮　広之; 広之山宮
Original assignee: Yokogawa Electric Corp
Current assignee: Yokogawa Electric Corp
Priority date: 2011-08-25
Filing date: 2011-08-25
Publication date: 2015-08-19
Anticipated expiration: 2031-08-25
Also published as: JP2013045014A

Description

本発明は、試料に照明光を照射して、試料の画像を観察する顕微鏡装置に関するものである。

顕微鏡装置は、試料に照明光を照射して、その画像を観察するために用いられる。顕微鏡装置としては、光軸方向に高い分解能を有する共焦点顕微鏡が多用されているが、さらに高い分解能を持つ４Ｐｉ共焦点顕微鏡が用いられる。

４Ｐｉ共焦点顕微鏡は、試料に焦点位置が重なるように２つの対物レンズを対向配置する。そして、２つの対物レンズから励起光を干渉させることによって、光軸方向に分解能を向上させている。また、干渉により狭められた焦点から蛍光した戻り光を２つの対物レンズから回収して、戻り光を干渉させて、さらに光軸方向の分解能を向上させている。

４Ｐｉ共焦点顕微鏡に類似した顕微鏡が特許文献１に開示されている。この特許文献１の顕微鏡は、試料を挟んで対物レンズと無限遠補正対物レンズとを設けており、無限遠補正対物レンズを透過した光を反射している。これにより、試料に光を２回通過させ、像のコントラストを増強している。

特開平４−２７９０９号公報

４Ｐｉ共焦点顕微鏡では、２つの対物レンズの焦点位置が光軸方向および光軸方向に直交する方向に厳格に一致するように光学調整を行わなければならない。また、蛍光を回収する光路も再び正確に重ね合わせる必要がある。これにより、光学調整が非常に困難になるという問題が生じていた。

また、特許文献１の顕微鏡では、試料に光を２回通過させることで、像のコントラストを強調させることができるものの、単に試料に光を２回通過させているだけである。よって、光軸方向に高い分解能の画像を得ているものではない。近年では、光軸方向に十分に高い分解能の鮮明な画像を得ることが重要になる。

そこで、本発明は、簡単な光学調整で光軸方向に高い分解能の鮮明な画像を得ることを目的とする。

以上の課題を解決するため、本発明の顕微鏡装置は、試料に照射する照明光を発振する光源と、前記試料に前記照明光の焦点を結ばせる第１対物レンズと、前記試料を透過した前記照明光を再帰反射させる再帰反射光学系と、この再帰反射光学系で再帰反射した前記照明光の焦点を前記試料に結ばせる第２対物レンズと、前記試料が前記照明光により蛍光した戻り光を検出する検出部と、前記試料と前記焦点とを前記照明光の光軸方向に相対的に移動させる相対移動機構と、この相対移動機構により相対移動させて得られる前記試料の断面情報に基づいてデコンボルーション処理の演算を行う演算部と、を備えていることを特徴とする。

この顕微鏡装置によれば、第１対物レンズにより焦点を結ぶ照明光と再帰反射して第２対物レンズにより焦点を結ぶ照明光とが試料で干渉する。そして、相対移動機構が試料の異なる断面を撮影するように移動させて、演算部がデコンボルーション処理を行うことで、光軸方向に高い分解能の鮮明な画像を取得することができる。

また、前記焦点を前記光軸方向に直交する平面上で走査させることを特徴とする。

焦点を光軸方向に直交する平面上で走査させることで、試料の所定の断面における断面情報を取得することができるようになる。この断面情報は、演算部がデコンボルーション処理を行っていることから、光軸方向に高い分解能の鮮明な画像になっている。

また、ピンホールを複数配列したピンホールディスクと、このピンホールディスクを回転させる回転部と、備え、前記照明光を前記ピンホールに通過させると共に、このピンホールを通過した光を試料に投影することによって前記試料に焦点を形成し、前記回転部が前記ピンホールディスクを回転させることによって、前記焦点を前記光軸方向に直交する平面上で走査させることを特徴とする請求項２記載の顕微鏡装置。

ピンホールディスクを回転させることで、焦点を光軸方向に直交する方向に走査させることができる。これにより、試料の所定の断面における断面情報が取得される。

また、前記焦点からの蛍光のうち、前記ピンホールを通過した成分を検出することを特徴とする。

ピンホールは焦点の範囲内の光のみを通過させ、焦点からの蛍光のうちピンホールを通過した成分を抽出することで、焦点の範囲内の光のみが情報化され、光軸方向に高い分解能を有する共焦点画像を生成することができる。

また、前記試料の焦点を１本の軸周りに回転可能な可変ミラーによって光軸に直交する平面上で走査させることを特徴とする。

ピンホールディスクを回転させるのではなく、可変ミラーを回転させることによっても、焦点を光軸方向に直交する平面上で走査させることが可能になる。

また、前記第２対物レンズと前記再帰反射光学系との間隔を変化させて前記照明光の光路長を変化させる光路長変化機構を備え、前記演算部は、前記光路長が変化したときの前記戻り光に基づいて前記演算を行うことを特徴とする。

光路長が変化することにより、試料における干渉の縞の位相が変化し、より多くの試料の情報を得ることができる。これにより、演算部が行う演算の精度が向上し、より高い分解能の画像を得ることができる。

また、前記第２対物レンズと前記再帰反射光学系との間に前記第２対物レンズの瞳位置をリレーする瞳リレーレンズ系を設けたことを特徴とする。

第２対物レンズと再帰反射光学系との間が近接しすぎている場合でも、瞳リレーレンズ系を設けることで、第２対物レンズの瞳位置に再帰反射光学系を設けることができ、且つ第２対物レンズと再帰反射光学系との間に所定の間隔を設けることができる。

本発明は、第１対物レンズにより焦点を結ぶ照明光と再帰反射して第２対物レンズにより焦点を結ぶ照明光とが試料で干渉する。そして、相対移動機構が試料の異なる断面を撮影するように移動させて、演算部がデコンボルーション処理を行うことで、光軸方向に高い分解能の鮮明な画像を取得することができる。

実施形態の顕微鏡装置の構成図である。ピンホールディスクおよびマイクロレンズディスクの構成図である。試料の焦点の強度分布を説明する図である。試料の焦点の強度分布の他の例を説明する図である。変形例１の顕微鏡装置の構成図である。変形例２の顕微鏡光学系の構成図である。変形例３および４の第１対物レンズおよび第２対物レンズの図である。変形例６の光源の構成図である。変形例６の位相制御板の位相分布の遅延を説明する図である。変形例６のＳＴＥＤレーザの焦点のパターンを説明する図である。

以下、図面を参照して、本発明の実施形態について説明する。図１は実施形態の顕微鏡装置１を示している。この顕微鏡装置１は走査光学系２と顕微鏡光学系３とを有して構成している。同図に示すように、走査光学系２は光源４とファイバ５とコリメートレンズ６とマイクロレンズディスク７とピンホールディスク８と連結ドラム９とモータ１０とダイクロイックミラー１１と第１リレーレンズ１２とミラー１３と蛍光フィルタ１４と第２リレーレンズ１５とカメラ１６と制御部１７とモニタ１８とを有して構成している。

光源４はレーザ光Ｌを発振する光源である。レーザ光Ｌは観察対象である試料Ｓを観察するための照明光となる。ファイバ５は光ファイバであり、レーザ光Ｌを導光する。ファイバ５の出射側にはコリメートレンズ６が配置されており、ファイバ５から出射されたレーザ光Ｌはコリメートレンズ６で平行光になる。

コリメートレンズ６の前方にはマイクロレンズディスク７が配置されている。マイクロレンズディスク７とピンホールディスク８とは連結ドラム９により連結されており、連結ドラム９はモータ１０に接続されている。マイクロレンズディスク７とピンホールディスク８とは回転ディスクであり、モータ１０により回転力が連結ドラム９に付与されることで、マイクロレンズディスク７とピンホールディスク８とが一体的に回転する。連結ドラム９とモータ１０とにより回転部が構成される。

図２に示すように、ピンホールディスク８には多条（図中では４条）の螺旋状の多数のピンホール８Ｐを配列して形成している。ピンホール８Ｐは試料Ｓの焦点の範囲内の光のみを通過させる微小開口部である。マイクロレンズディスク（レンズディスク）７には、ピンホール８Ｐと同一パターンで多条の螺旋状の多数のマイクロレンズ７Ｍを配列して形成している。マイクロレンズ７Ｍは対応するピンホール８Ｐにレーザ光Ｌを集光させる機能を有している。

図１および図２に示すように、マイクロレンズディスク７とピンホールディスク８との間にはダイクロイックミラー１１を設けている。ダイクロイックミラー１１は光源４が発振するレーザ光Ｌの波長を透過し、試料Ｓの蛍光の波長を反射する特性を有する光学素子である。ダイクロイックミラー１１により光が反射する位置に第１リレーレンズ１２を設けている。

この第１リレーレンズ１２によりリレーされた光はミラー１３で反射して蛍光フィルタ１４に導かれる。蛍光フィルタ１４は試料Ｓが発生する蛍光成分の波長のみを選択的に透過するフィルタである。蛍光フィルタ１４を透過した光は第２リレーレンズ１５に入射する。

そして、この光は第２リレーレンズ１５によりカメラ１６に集光される。カメラ１６は受光した光を電気信号に変換して、制御部１７に出力する。制御部１７は顕微鏡装置１の全体を制御するコンピュータであり、カメラ１６から入力した電気信号に基づいて試料Ｓの画像を生成する。制御部１７は所定の演算を行う演算部として動作する。生成した画像はモニタ１８に表示する。

次に、顕微鏡光学系３について説明する。図１に示すように、顕微鏡光学系３は撮影レンズ１９とミラー２０と第１対物レンズ２１とディッシュ２２と第２対物レンズ２３とコーナーキューブ２４とディッシュ駆動機構２５とを有して構成している。

撮影レンズ１９はピンホール８Ｐを通過したレーザ光Ｌを平行光にする。この平行光はミラー２０で反射して第１対物レンズ２１に導かれる。第１対物レンズ２１によりレーザ光Ｌはディッシュ２２に搭載された試料Ｓに焦点を結ぶ。ディッシュ２２は試料Ｓを搭載する搭載部である。

レーザ光Ｌは試料Ｓを透過して、透過した位置に第２対物レンズ２３を配置している。第１対物レンズ２１と第２対物レンズ２３との焦点面は一致させるように配置する。第２対物レンズ２３によりレーザ光Ｌは平行光になって、コーナーキューブ２４に入射する。コーナーキューブ２４は３枚のミラーを相互に直角に組み合わせて立方体を形成した再帰反射光学系である。

ディッシュ２２にはディッシュ駆動機構２５が取り付けられている。ディッシュ駆動機構２５はディッシュ２２をレーザ光Ｌの光軸方向に微小に移動させる相対移動機構である。この相対移動機構はレーザ光Ｌの焦点と試料Ｓとを相対的に移動させる。相対移動機構は制御部１７により制御がされて、ディッシュ２２が光軸方向に移動する。

次に、動作について説明する。制御部１７は、光源４からレーザ光Ｌを発振させる。レーザ光Ｌはファイバ５に集光されて、ファイバ５の端部から広がりを持って出射される。このレーザ光Ｌはコリメートレンズ６によって、平行光に変換されて、マイクロレンズディスク７のマイクロレンズ７Ｍに入射する。

マイクロレンズ７Ｍは集光レンズの作用を有しており、レーザ光Ｌはダイクロイックミラー１１を透過した後に、マイクロレンズ７Ｍに対応するピンホール８Ｐに焦点を結ぶ。ピンホール８Ｐは通過したレーザ光Ｌは撮影レンズ１９に入射する。撮影レンズ１９によりレーザ光Ｌはピンホール８Ｐの位置に対応する傾きを有する平行光に変換される。この平行光はミラー２０で反射して光路が９０度変換されて、第１対物レンズ２１に入射する。

そして、第１対物レンズ２１によりディッシュ２２に搭載された試料Ｓに焦点を結ぶ。このとき、試料Ｓを通過したレーザ光Ｌは第２対物レンズ２３によって、焦点位置に対応した傾きを有する平行光に変換される。つまり、光軸中心に焦点がある場合は光軸に平行な平行光になり、光軸中心から焦点がずれるほど、光軸に対して傾きを持った平行光になる。

第２対物レンズ２３により平行光となったレーザ光Ｌは、コーナーキューブ２４で入射方向と同じ方向に再帰反射する。従って、入射したときと同じ光路を辿って戻ることになり、再び第２対物レンズ２３に入射する。そして、第２対物レンズ２３の作用により、レーザ光Ｌは再び試料Ｓに焦点を結ぶ。

試料Ｓにはレーザ光Ｌの波長の光が蛍光する蛍光色素や蛍光タンパク等が導入されている。よって、第１対物レンズ２１および第２対物レンズ２３からレーザ光Ｌが焦点を試料Ｓで結ぶことにより、試料Ｓが蛍光する。発生した蛍光は第１対物レンズ２１および第２対物レンズ２３に向かう。

第２対物レンズ２３に向かう蛍光は、コーナーキューブ２４で再帰反射して、再び試料Ｓで焦点を結ぶ。そして、この蛍光は第１対物レンズ２１に向かう。一方、もともと試料Ｓで発生した蛍光は第１対物レンズ２１に向かう。

よって、試料Ｓで発生した蛍光は直接的に第１対物レンズ２１に向かう光とコーナーキューブ２４で再帰反射した光との２つの蛍光により構成される。これにより、試料Ｓで発生した蛍光は上下２方向から回収できるため、蛍光の収率が向上する。第１対物レンズ２１に向かう２つの蛍光を戻り光Ｒとする。なお、２つの蛍光は可干渉距離が短いため、相互に殆ど干渉を起こさない。

戻り光Ｒは第１対物レンズ２１で平行光になって、ミラー２０で反射する。ミラー２０で反射した戻り光Ｒは、撮影レンズ１９からピンホール８Ｐに集光される。ピンホール８Ｐは試料Ｓの焦点の範囲内の光のみを通過させるため、カメラ１６により生成される画像は共焦点画像になる。ピンホール８Ｐを通過した戻り光Ｒはダイクロイックミラー１１で反射する。

そして、ダイクロイックミラー１１で反射した戻り光Ｒは第１リレーレンズ１２でリレーされて、ミラー１３で反射する。ミラー１３で反射した戻り光Ｒは蛍光フィルタ１４に入射して、試料Ｓの蛍光成分以外が取り除かれる。これにより、蛍光画像のみがカメラ１６で撮影される。

蛍光フィルタ１４を透過した戻り光Ｒは第２リレーレンズ１２によりカメラ１６に結像される。カメラ１６は結像された戻り光Ｒを電気信号に変換して、制御部１７に出力する。制御部１７では入力した電気信号に基づいて所定の画像処理を行う。

ここで、制御部１７はモータ１０を制御して回転力を付与する。これにより、連結ドラム９が回転して、マイクロレンズディスク７とピンホールディスク８とが一体的に回転する。マイクロレンズディスク７には多数のマイクロレンズ７Ｍが配列されており、ピンホールディスク８には同じパターンの多数のピンホール８Ｐが配列されている。

よって、マイクロレンズディスク７とピンホールディスク８とを一体的に回転させることで、図２に示すように、レーザ光Ｌが通過するピンホール８Ｐは回転に伴って順次変化する。これにより、レーザ光Ｌは試料Ｓの焦点面を水平面上に走査される。且つ、戻り光Ｒは再びピンホール８Ｐを通過した後にダイクロイックミラー１１で反射して、カメラ１６の結像面上を走査される。

従って、マイクロレンズディスク７とピンホールディスク８とを一体的に回転させることで、試料Ｓの水平面方向にレーザ光Ｌを高速に走査することができる。これにより、カメラ１６は順次走査された戻り光Ｒの電気信号を出力するため、制御部１７は高速に試料Ｓの画像生成を行うことができる。そして、生成された試料Ｓの画像はモニタ１８に表示される。

このとき、試料Ｓに照射されるレーザ光Ｌおよびカメラ１６に結像される戻り光Ｒはピンホール８Ｐを通過している。ピンホール８Ｐは試料Ｓの焦点内の光のみを通過させ、それ以外の光を通過させないため、カメラ１６に結像される戻り光Ｒは試料Ｓの焦点の範囲内の光のみになる。これにより、深さ方向に高い分解能の共焦点画像が生成される。

カメラ１６は平面方向（Ｘ方向およびＹ方向）に所定の画素を有している。つまり、Ｘ方向に複数画素、Ｙ方向に複数画素を有しており、これが試料Ｓの水平面方向の所定領域の画像になる。カメラ１６の画素のうち１つの画素について着目する。この画素は試料Ｓの１点の蛍光の情報になっているが、この蛍光の情報はレーザ光Ｌの光軸方向（Ｚ方向）にぼけを生じている。

つまり、Ｚ方向の空間情報が１つの平面画像に混ざって写し込まれており、光学的に畳み込まれた情報になっている。これを元の情報に戻すために、逆畳み込み積分（デコンボルーション）処理を行う。デコンボルーション処理を行うときには、Ｚ方向の複数の断面の情報が必要になる。

そこで、制御部１７は、ディッシュ駆動機構２５を駆動させる。これにより、ディッシュ２２が微小駆動し、ディッシュ２２に搭載された試料Ｓがレーザ光Ｌの光軸（Ｚ方向）に微小に移動する。この移動により、Ｚ方向の異なる断面の情報が取得できる。制御部１７はディッシュ駆動機構２５を連続して駆動させて、Ｚ方向の各断面の情報を取得する。

ここで、試料Ｓに対しては、第１対物レンズ２１から照射されるレーザ光Ｌとコーナーキューブ２４で再帰反射して第２対物レンズ２３から照射されるレーザ光Ｌとの２つのレーザ光Ｌが焦点を結ぶ。従って、これらの２つのレーザ光Ｌが試料Ｓで干渉する。

試料Ｓでレーザ光Ｌが最初に焦点を結んでからコーナーキューブ２４で再帰反射してから再び焦点を結ぶまでの光路長がレーザ光Ｌの波長λの半分（λ／２）の偶数倍となる場合には、焦点面において光は強め合う。ここで、光路長はコーナーキューブ２４において生じる反射による位相の変化を考慮したものとする。また、焦点面からλ／２だけ離間した位置においては２つの光の位相はλだけずれるので強め合う。そして、干渉の効果がない位置の光の強度は焦点面から離間するにつれて弱まるため、焦点における強度分布は図３のようになる。

つまり、図３に示すように、前記の光路長がレーザ光Ｌのλ／２の偶数倍の場合には、焦点Ｆは焦点面における狭小な領域Ｆ１において光が強め合い、焦点面からλ／２だけ離間した領域Ｆ２において光が強め合う。また、焦点面からλだけ離間した領域Ｆ３において光が強め合う。ただし、光が強い領域は「Ｆ１＞Ｆ２＞Ｆ３」となる。

一方、前記の光路長がレーザ光Ｌの波長λの半分（λ／２）の奇数倍となる場合には、焦点面において光は弱め合う。また、焦点面からλ／４だけ離間した領域Ｆ１で光が強め合い、３λ／４だけ離間した領域Ｆ２で光が強め合う。ただし、光が強め合う領域は「Ｆ１＞Ｆ２」となる。

光が強め合う領域は、前記の光路長によって変化し、また光路上の試料等の屈折率分布等にも影響を受けて変化するが、概ね図３や図４のような分布で変化する。

カメラ１６の１点の画素には光軸方向（Ｚ方向）の空間情報が写し込まれており、つまり図３或いは図４の情報がぼけの情報になって写し込まれている。カメラ１６が受光した戻り光Ｒは電気信号に変換して、制御部１７に出力される。制御部１７はこの電気信号に基づいてデコンボルーション処理の演算を行う。

制御部１７はデコンボルーション処理を行うためにＰＳＦパターンを有している。ＰＳＦパターンは予め実測したものであってもよいし、試料Ｓを観察した画像から推測したものであってもよい。例えば、予め実測によりＰＳＦパターンを得ておく方法としては、逆フィルター法や漸近法があり、観察した画像から推測する方法としてはブラインド法がある。

制御部１７は前記の光路長に応じたＰＳＦパターンを有しており、ディッシュ駆動機構２５によりディッシュ２２を微小移動（つまり、試料Ｓを光軸方向に微小移動）させたときの試料Ｓの各断面の画像に基づいて、デコンボルーション処理を行う。これにより、カメラ１６の１点の画素に写し込まれている空間情報を元の情報に戻すことができる。

つまり、多重に重なっている成分の情報を除去することができる。これにより、高分解能の成分の情報を取得することができる。例えば、図３或いは図４で言えば、焦点Ｆのうち、領域Ｆ１のみの情報が他の断面（断層）の情報が写し込まれることなく、ぼけの生じていないクリアな画像を生成することができる。

このため、焦点Ｆのうち、Ｚ方向（光軸方向）に極めて狭小な領域Ｆ１の画像の情報がぼけのないクリアな画像で取得することができる。このため、高い分解能の鮮明な画像を取得することができる。しかも、コーナーキューブ２４を用いて再帰反射をしているため、光軸と直交する方向における光軸調整に４Ｐｉ共焦点顕微鏡ほどの光軸調整の精度は要求されない。且つ、戻り光の光路を一致させるように調整を行う必要もない。よって、簡単な光学調整で実現することが可能になる。

カメラ１６はＸＹ方向に所定の画素数を有している。各画素について、前述したデコンボルーション処理を行う。これにより、試料Ｓの所定領域の水平面の断層像を取得することができる。この断層像はＺ方向に高い分解能を有しており、且つ鮮明な画像になっている。

以上において、コーナーキューブ２４は３枚のミラーを相互に直角に組み合わせて立方体を形成した光学系である。ミラーとしては、ガラスを研磨して全反射させるようにしたものを用いてもよく、反射膜を施したものを用いてもよい。要は、入射した光を入射方向に戻す再帰反射をするものであれば任意の光学素子を用いることができる。

また、相対移動機構としてディッシュ駆動機構２５がディッシュ２２を光軸方向に移動させることにより、レーザ光Ｌの焦点に対して試料Ｓを相対的に移動させていた。この点、ディッシュ２２（つまり、試料Ｓ）を固定して、レーザ光Ｌの焦点を移動させるようにしてもよい。この場合には、ディッシュ２２以外の他の光学系（第１対物レンズ２１や第２対物レンズ２３等）をディッシュ２２に対して相対的に移動させるようにする。

次に、図５を参照して、変形例１について説明する。本変形例１では、走査光学系２および顕微鏡光学系３の構成が実施形態と異なる。まず、走査光学系２について説明する。図５に示すように、走査光学系２は光源３１とダイクロイックミラー３２と走査光学ユニット３３と走査系瞳リレーレンズ３４と蛍光フィルタ３５と集束レンズ３６とピンホール３７と検出器３８と制御部１７とモニタ１８とを備えて構成している。制御部１７およびモニタ１８は実施形態と同じである。

また、顕微鏡光学系３は実施形態の構成に追加して、第１瞳リレーレンズ４１と第２瞳リレーレンズ４２とを追加している。第１瞳リレーレンズ４１と第２瞳リレーレンズ４２とにより瞳リレーレンズ系が構成され、当該瞳リレーレンズ系は第２対物レンズ２３とコーナーキューブ２４との間に設けられる。そして、コーナーキューブ２４には、当該コーナーキューブ２４をレーザ光Ｌの光軸方向に移動させるキューブ駆動機構４３が設けられている。

以上の構成において、制御部１７は光源３１から平行光のレーザ光Ｌを発振する。このレーザ光Ｌはダイクロイックミラー３２で反射して走査光学ユニット３３に導かれる。走査光学ユニット３３は１本の軸周りに回転可能な第１可変ミラー３３ａとこの第１可変ミラー３３ａの軸にほぼ直交する軸回りに回転可能な第２可変ミラー３３ｂとを備えている。

第１可変ミラー３３ａと第２可変ミラー３３ｂとにより試料Ｓの水平面方向にレーザ光Ｌが走査される。この走査光学ユニット３３を経た光が走査系瞳リレーレンズ３４から走査光学系２を出射し、顕微鏡光学系３の撮影レンズ１９に入射する。そして、第１対物レンズ２１により試料Ｓに焦点を結ぶ。

試料Ｓを透過したレーザ光Ｌは第２対物レンズ２３により平行光にされて、第１瞳リレーレンズ４１、第２瞳リレーレンズ４２の瞳リレーレンズ系によりコーナーキューブ２４まで導かれる。そして、コーナーキューブ２４で再帰反射をして、第１瞳リレーレンズ４１、第２瞳リレーレンズ４２を経て、第２対物レンズ２３により、試料Ｓで再び焦点を結ぶ。

これにより、試料Ｓに上下２方向からレーザ光Ｌが照射されて、前述したように、２つのレーザ光Ｌが干渉する。試料Ｓで焦点を結んだレーザ光Ｌが干渉することにより、試料Ｓが蛍光を発生して、戻り光Ｒが発生する。戻り光Ｒはミラー２０で反射をして、撮影レンズ１９から走査系瞳リレーレンズ３４、走査光学ユニット３３を介して、ダイクロイックミラー３２に入射する。

そして、ダイクロイックミラー３２を透過して、蛍光フィルタ３５で蛍光成分の波長のみが選択されて、集束レンズ３６により検出器３８に収束する。このとき、ピンホール３７を光路上に設けており、このピンホール３７は第１対物レンズ２１の焦点と共役な位置関係に配置している。よって、戻り光Ｒのうち試料Ｓの焦点の範囲内のみの光が通過する。これにより、生成される画像は共焦点画像になる。

このとき、ディッシュ駆動機構２５がディッシュ２２を微小移動させることにより、試料Ｓの異なる断面の画像を取得する。これにより、図３或いは図４のように焦点の強度分布となっている画像のＰＳＦパターンからデコンボルーション処理を行い、目的となる強度成分（例えば、図３の場合には焦点面の領域Ｆ１）以外の成分を除去する。このため、Ｚ方向の複数の断面の情報が１つの画像に写し込まれることによるぼけを解消し、光軸方向に高い分解能の鮮明な画像を取得することができる。

ここで、本変形例１では、コーナーキューブ２４を光軸方向に移動させるキューブ駆動機構４３を設けている。キューブ駆動機構４３がコーナーキューブ２４を光軸方向に移動させることにより、レーザ光Ｌが試料Ｓで焦点を結んでからコーナーキューブ２４で再帰反射をして再び試料Ｓに焦点を結ぶまでの光路長を変化させることができる。

つまり、前記の光路長を変化させることにより、図３のような強度分布のパターンと図４のような強度分布のパターンとの両者を採用することができ、またその間の適宜のパターンも採用することができる。つまり、任意の強度分布のパターンに変化させることができる。

これにより、焦点における干渉の縞の位相を任意に変化させることができる。このときに、制御部１７は干渉縞の位相の異なる画像情報を考慮してデコンボルーション処理を行う（図３や図４のような異なる画像情報を考慮して演算処理を行う）。これにより、位相の異なる干渉縞の画像情報を使用してデコンボルーション処理を行うことができることから、演算の精度を向上させることができる。つまり、より多くの情報量に基づいて、試料Ｓの画像を得ることができるため、実施形態のときよりもさらに光軸方向に高い分解能の画像を得ることができる。

ここで、第２対物レンズ２３の瞳位置は第２対物レンズ２３から非常に近い位置になる場合や、第２対物レンズ２３の鏡胴内部に位置する場合がある。ここで、コーナーキューブ２４は第２対物レンズ２３の瞳位置（後ろ側焦点位置）に配置することで最も高い光利用効率を得ることができるが、第２対物レンズ２３の瞳位置が鏡胴内部に位置すると、コーナーキューブ２４を第２対物レンズ２３の瞳位置に配置することができない。

そこで、第２対物レンズ２３の瞳位置をリレーする第１瞳リレーレンズ４１、第２瞳リレーレンズ４２を設ける。これにより、第２対物レンズ２３の瞳位置がリレーされて、第２対物レンズ２３から離れた位置にあるコーナーキューブ２４にまで瞳位置をリレーすることができる。これにより、第２対物レンズ２３の瞳から出るほぼ全ての光が再帰反射によって再び第２対物レンズ２３に入射するため、高い光利用効率を得ることができる。

また、本変形例１では、検出器３８は戻り光Ｒを１点で受光している。つまり、試料Ｓの１点の情報を受光していることになる。このため、走査光学ユニット３３により、試料ＳのＸ方向およびＹ方向にレーザ光Ｌを走査する。これにより、試料Ｓの水平面方向の所定領域の画像を取得することができる。

次に、変形例２について説明する。図６は本変形例２の顕微鏡装置１を示している。なお、図６では、顕微鏡光学系３のみを示しており、走査光学系２を省略している。走査光学系２は前述した実施形態と同じである。この変形例２の顕微鏡光学系３はコーナーキューブ２４の代わりに、テレセントリック結像レンズ５１と反射ミラー５２とを有して構成している。

第２対物レンズ２３により平行光にされたレーザ光Ｌはテレセントリック結像レンズ５１により反射ミラー５２で焦点を結ぶと共に、テレセントリック結像レンズ５１から第２対物レンズ２３に戻る。従って、テレセントリック結像レンズ５１と反射ミラー５２とにより、入射したレーザ光Ｌを再帰反射する再帰反射光学系を構成してもよい。

次に、変形例３について説明する。図７は変形例３における第１対物レンズ２１、ディッシュ２２、第２対物レンズ２３を示している。この変形例３では第１対物レンズ２１はドライ対物レンズを用いる。ここでは、２０倍のドライ対物レンズ、開口数０．７５、ワーキングディスタンス０．６ｍｍ程度のものを用いるものとするが、勿論これら以外の数値のものを用いてもよい。

第１対物レンズ２１のワーキングディスタンスは非常に短いため、第２対物レンズ２３に同様のドライ対物レンズを用いると、第１対物レンズ２１と第２対物レンズ２３との間に試料Ｓを搭載したディッシュ２２を配置することが困難になる。

そこで、第２対物レンズ２３には水浸対物レンズを用いる。水浸対物レンズとしては、例えば電気生理用の対物レンズでカバーガラスを必要としない水浸レンズを用いることが望ましい。例えば、４０倍水浸レンズ、開口数０．８、ワーキングディスタンスが３．３ｍｍ程度のものを用いることが望ましい。

このような水浸対物レンズを第２対物レンズ２３として用いることで、十分なワーキングディスタンスを確保することができ、試料Ｓを搭載したディッシュ２２を配置することが容易になる。また、試料Ｓが細胞の生物試料のような場合には、一般に培養液Ｗの中にあることが多いため、水浸対物レンズを用いると好適である。

次に、変形例４について説明する。第１対物レンズ２１、ディッシュ２２、第２対物レンズ２３の構成は変形例３と同じ図７の構成になる。この変形例４では、第１対物レンズ２１は油浸対物レンズを用いる。ここでは、１００倍の油浸対物レンズ、開口数が１．４、ワーキングディスタンスが０．１ｍｍ程度のものを用いるとするが、勿論これら以外のものを用いてもよい。

変形例３と同様に、第１対物レンズ２１のワーキングディスタンスは非常に短いため、第２対物レンズ２３に同様の油浸対物レンズを用いると、第１対物レンズ２１と第２対物レンズ２３との間に試料Ｓを搭載したディッシュ２２を配置することが困難になる。

そこで、第２対物レンズ２３には水浸対物レンズを用いる。水浸対物レンズとしては、例えば電気生理用の対物レンズでカバーガラスを必要としない水浸レンズを用いることが望ましい。例えば、６０倍の水浸レンズ、開口数が１．１、ワーキングディスタンスが１．１ｍｍ程度のものを用いると、十分なワーキングディスタンスを確保することができる。

変形例４では、第１対物レンズ２１と比較して第２対物レンズ２３の開口数が小さくなっている。このため、コーナーキューブ２４で再帰反射して第２対物レンズ２３により試料Ｓにおいて結ばれる焦点は若干大きくなり、また干渉の濃淡も薄くなる。

そこで、制御部１７は、デコンボルーション処理を行うときに、レーザ光Ｌの光軸方向における高周波成分のみを抽出する処理を行う。これにより、第２対物レンズ２３の開口数が小さくなっていることによる分解能の劣化を回避することができるようになる。

次に、変形例５について説明する。変形例５は変形例１の顕微鏡装置１を飽和励起顕微鏡に適用している。この変形例５の顕微鏡装置１では、光源３１のレーザ光Ｌの発振強度を高くする。また、レーザ光Ｌの発振周波数を一定の周波数ｆで変調する。これにより、特に点像分布（ＰＳＦ）の強度の頂上付近でのみ蛍光の飽和を生じる。

これにより、蛍光の方を生じた領域からの蛍光信号の時間変化に歪みを生じて、歪んだ波には２倍、３倍の周波数を含む高調波が出現する。この高調波を含む信号成分を検出することで、水平方向（ＸＹ方向）および光軸方向（Ｚ方向）の分解能が高画像を得ることができる。

このときに、第１対物レンズ２１により焦点を結ぶレーザ光Ｌと再帰反射して第２対物レンズ２３により焦点を結ぶレーザ光Ｌとが試料Ｓで干渉する。また、ディッシュ駆動機構２５がディッシュ２２を光軸方向に微小移動して、試料Ｓの異なる断面の画像を取得する。そして、制御部１７が取得した画像に基づいてデコンボルーション処理を行うことで、光軸方向に高い分解能の鮮明な画像を取得することができる。

従って、本変形例５では、光軸方向に高い分解能を得ることができる顕微鏡装置を飽和顕微鏡に適用することで、光軸方向だけでなく、水平方向にも高い分解能を得ることができ、３次元的に高い分解能の画像を得ることができるようになる。

次に、変形例６について説明する。変形例６は変形例１の顕微鏡装置１を誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）顕微鏡に適用している。図８は変形例６で使用される光源３１を示している。この図に示すように、光源３１は励起用レーザ光源６０とＳＴＥＤレーザ光源６１と位相制御板６２とミラー６３とダイクロイックミラー６４とを有している。

励起用レーザ光源６０はレーザ光Ｌを発振する光源である。ＳＴＥＤレーザ光源６１はＳＴＥＤレーザＬＳを発振する光源である。ＳＴＥＤレーザＬＳは誘導放出用のレーザ光である。位相制御板６２は、図９に示すような位相分布の遅延を発生させる光学素子である。

ミラー６３はＳＴＥＤレーザＬＳを反射させる。ダイクロイックミラー６４はレーザ光Ｌを透過し、ＳＴＥＤレーザＬＳを反射させる特性を有する光学素子である。なお、図３で示したダイクロイックミラー３２は、レーザ光ＬおよびＳＴＥＤレーザＬＳを反射し、蛍光を透過する特性を有している。

図８で示した光源３１を使用すると、ＳＴＥＤレーザＬＳは位相制御板６２の作用を受けて、ダイクロイックミラー６４で反射する。これにより、レーザ光ＬとＳＴＥＤレーザＬＳとは光路が同一になる。そして、第１対物レンズ２１により試料Ｓに焦点を結んだときに、ＳＴＥＤレーザＬＳの焦点は、ＸＹ平面においては図１０に示すようなリング状のパターンとなる。

このリング状のパターンの中心の領域を小さくすることにより、蛍光が発生する領域を極めて小さくすることが可能である。これにより、ＸＹ方向に高い分解能の画像を得ることが可能になる。

従って、本変形例５では、光軸方向に高い分解能を得ることができる顕微鏡装置をＳＴＥＤ顕微鏡に適用することで、光軸方向だけでなく、水平方向にも高い分解能を得ることができ、３次元的に高い分解能の画像を得ることができるようになる。

１顕微鏡装置
２走査光学系
３顕微鏡光学系
４光源
７マイクロレンズディスク
８ピンホールディスク
１１ダイクロイックミラー
１６カメラ
１７制御部
２１第１対物レンズ
２２ディッシュ
２３第２対物レンズ
２４コーナーキューブ
２５ディッシュ駆動機構
４１第１瞳リレーレンズ
４２第２瞳リレーレンズ
４３キューブ駆動機構
Ｌレーザ光
Ｒ戻り光
Ｓ試料

Claims

試料に照射する照明光を発振する光源と、
前記試料に前記照明光の焦点を結ばせる第１対物レンズと、
前記試料を透過した前記照明光を再帰反射させる再帰反射光学系と、
この再帰反射光学系で再帰反射した前記照明光の焦点を前記試料に結ばせる第２対物レンズと、
前記試料が前記照明光により蛍光した戻り光を検出する検出部と、
前記試料と前記焦点とを前記照明光の光軸方向に相対的に移動させる相対移動機構と、
この相対移動機構により相対移動させて得られる前記試料の断面情報に基づいてデコンボルーション処理の演算を行う演算部と、
を備えていることを特徴とする顕微鏡装置。
前記焦点を前記光軸方向に直交する平面上で走査させること
を特徴とする請求項１記載の顕微鏡装置。
ピンホールを複数配列したピンホールディスクと、
このピンホールディスクを回転させる回転部と、
を備え、
前記照明光を前記ピンホールに通過させると共に、このピンホールを通過した光を試料に投影することによって前記試料に焦点を形成し、前記回転部が前記ピンホールディスクを回転させることによって、前記焦点を前記光軸方向に直交する平面上で走査させること
を特徴とする請求項２記載の顕微鏡装置。
前記焦点からの蛍光のうち、前記ピンホールを通過した成分を検出すること
を特徴とする請求項３記載の顕微鏡装置。
前記試料の焦点を１本の軸周りに回転可能な可変ミラーによって光軸に直交する平面上で走査させること
を特徴とする請求項２記載の顕微鏡装置。
前記第２対物レンズと前記再帰反射光学系との間隔を変化させて前記照明光の光路長を変化させる光路長変化機構を備え、
前記演算部は、前記光路長が変化したときの前記戻り光に基づいて前記演算を行うこと
を特徴とする請求項１乃至５の何れか１項に記載の顕微鏡装置。
前記第２対物レンズと前記再帰反射光学系との間に前記第２対物レンズの瞳位置をリレーする瞳リレーレンズ系を設けたこと
を特徴とする請求項６記載の顕微鏡装置。