CN108885336B - 用于研究样品的方法和显微镜 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于研究样品的方法。该方法的特征在于，同时在多个彼此不同的样品平面中分别沿一条照射线分别利用一个照射光束照射所述样品，并且分别利用一个探测PSF扫描每个沿照射线照射的样品区域并且同时且空间上分开地探测来自所照射的样品区域的探测光。此外，本发明涉及一种显微镜、尤其是用于实施这样的方法的显微镜。

Description

用于研究样品的方法和显微镜

技术领域

本发明涉及一种用于研究样品的方法。此外，本发明涉及一种显微镜、尤其是用于实施这样的方法的显微镜。

背景技术

在研究样品时经常重要的是能够使全部的样品体积快速成像。为此，尤其是考虑使用SPIM显微镜。

在SPIM技术(单平面照射显微术)中，对样品进行逐层照射，这种技术相比于例如逐点地扫描样品允许更快速地且更能保护样品地获取图像数据。SPIM技术的已知应用领域是荧光显微术领域，其中，利用激光来激发样品中的荧光团。在此，在SPIM技术中，仅在其中一个照射光片中进行激发。由此避免在其它平面中因照射光而损坏样品。

在DE 102 57 423 A1中描述一种按照SPIM方法工作的光学装置。在所述显微镜中，利用薄光片来照射样品，同时垂直于照射光片的平面进行观察。在此，通过两个单独的光学光路进行照射和探测，所述光路分别具有单独的光学系统、尤其是具有两个单独的相互垂直的物镜。

由DE 10 2009 044 983 A1已知一种显微镜，该显微镜具有照射装置，利用该照射装置产生用于照射样品区域的光片，该样品区域沿照射光路的照射轴线的方向并且沿横跨所述照射轴线的横向轴线的方向近似平面地伸展。此外，所述显微镜具有探测装置，利用该探测装置探测沿探测光束路径的探测轴线从样品区域中发射出的光，其中，照射轴线和探测轴线以及横向轴线和探测轴线彼此成不同于零的角度，并且所述探测装置此外在探测光束路径中包括探测物镜。此外，在这种显微镜中，所述探测装置包括与探测物镜的前透镜在空间上分开设置的并且与所述前透镜无关可调节的光学探测元件，借助所述探测元件，探测图像场的大小可无级地变化，和/或借助所述探测元件，样品区域中的探测焦平面可无级地移动。

由Fahrbach F.O.、Voigt F.F.、Schmid B.、Helmchen F.和Huisken J.发表在《光学快讯》21，21010(2013)上的“具有可调透镜的快速3D光片显微镜(Rapid 3D light-sheetmicroscopy with a tunable lens)”已知，为了快速成像体积，沿探测轴线快速移动光片并且利用可调节透镜追踪探测光学系统的清晰度平面。

由DE 10 2013 205 115 A1已知一种SPIM装置，该装置具有用于产生照射样品的光片的照射装置以及具有探测器的用于探测来自样品的探测光的探测装置。所述SPIM装置在有效的且经济的样品研究方面利用结构上简单的器件这样设计和进一步构成，使得探测装置具有用于将光片的不同焦面配置给探测器不同区域的装置。该装置例如可以具有多焦点光栅(Multi-Focus-Grating)或色度校正光栅(Chromatic-Correction-Grating)。

发明内容

因此，本发明的任务是给出一种方法，该方法允许快速地且高分辨率地成像样品体积。

所述任务通过一种方法来解决，该方法的特征在于，同时在多个彼此不同的样品平面中分别沿一条线(照射线)分别利用一个照射光束来照射样品，并且分别利用一个自己的探测PSF扫描每个沿照射线照射的样品区域并且同时且彼此在空间上分开地探测来自照射样品区域的探测光。

因此，本发明的另一个任务是给出一种显微镜，该显微镜允许快速地且高图像对比度地和高分辨率地成像样品体积。

所述另一个任务通过一种显微镜来解决，该显微镜的特征在于一种照射装置，该照射装置具有照射物镜，并且该照射装置构造用于同时在多个彼此不同的样品平面中分别沿一条照射线分别利用一个照射光束来照射样品，并且其特征在于一种探测装置，该探测装置具有探测物镜和至少一个探测器，并且该探测装置构造用于分别利用一个自己的探测PSF扫描每个沿照射线照射的样品区域并且同时且彼此在空间上分开地探测来自照射样品区域的探测光。

本发明在高分辨率的情况下能够实现同时从不同的、尤其是彼此平行的样品平面产生图像数据，以获得图像数据的三维堆叠。

本发明的特点在于，同时在多个样品平面中分别沿一个处于相应样品平面中的照射线来照射样品。所述操作方式以特别有利的方式能够实现将照射线相对于彼此错开，从而有效地避免单个样品平面中的探测光串扰到其它样品平面的探测通道上。

如图1说明的，探测物镜1将部分来自沿第一照射线2照射的样品区域的探测光成像到行扫描探测器3上，该行扫描探测器在楔形体积4中以与物镜1的数字口径有关的张角2α传播。参考图1，所述第一照射线垂直于纸平面(z方向)。探测光束路径以及尤其是探测物镜1的成像限定探测体积、即探测PSF 5(PSF：点扩散函数)，其中，所述来自探测PSF 5的探测光穿过楔形体积4到达探测物镜1。

为了避免将探测物镜1的来自沿另一条照射线照射的另一个样品区域的探测光成像到配置给第一样品区域的行扫描探测器3上，所述另一条照射线优选以所述张角2α设置在楔形体积4之外、即以张角2β设置在所述两个楔形区域6之一中。这优选使得所述另一条照射线设置在另一个样品区域中，这允许通过同时侧向地移动照射线同时扫描两个不同的样品平面，而没有出现串扰。当然，这借助两条照射线阐述的原理也能够用较高数量的照射线实现，其中，分别相邻的照射线以所述方式错开。

通过如下方式有利地避免串扰，即两条相邻照射线之间的距离大于在照射光束的平面中照射光束半径与相邻探测PSF半径之和。以尤其特别有利的方式这样选择照射线的位置，使得照射光束分别不是位于其它平面中其它行的(探测PSF的)探测锥形区中。

如已经提到的，本发明允许同时分别利用至少一条照射线扫描多个尤其是彼此平行的样品平面，其中，所述照射线优选同时分别沿所述样品平面(即沿平行于样品平面的矢量)移动。在此，尤其可以规定：照射线沿样品平面的方向并且垂直于照射光传播方向彼此错开地设置。替代地或附加地也可能的是，照射线沿样品平面的方向并且垂直于探测物镜的光轴彼此错开地设置。如已经阐述的，为了避免串扰特别有利的是，在来自样品区域的探测光束中未设置有其它的照射线。

特别高的图像对比度可以通过如下方式实现，即参考每条照射线分别进行一次共焦线探测。这通过使用与照射线设置成共焦的狭缝探测装置实现。

例如，有利地可以规定：由在前面设置有狭缝光阑的探测器、尤其是面探测器探测分别来自沿照射线照射的样品区域的探测光。这样的狭缝光阑例如可以由光学元件构成，在该光学元件中空出狭缝的表面被镜面化。然而，就此而言使用机械狭缝光阑是复杂的，因为在移动照射线时同时也必须移动狭缝探测装置或替代地例如借助设置在探测光束路径中在偏转角度方面可调节的光束偏转装置去扫描(Descan)探测光，以便来自运动的照射线的探测光分别可以入射到狭缝光阑。对此其它的细节尤其是进一步在下面参考各实施例找到。

尤其是，设置在前面的所述狭缝光阑可以是一种如其应用于单反相机那样的机械快门幕(Verschlussvorhang)。面探测器在所述实施形式中可以关于其整个传感面、尤其是也在同步于沿照射线移动的照射光束移动狭缝光阑期间是激活的。

狭缝光阑可以特别有利地也实施为非机械构件。例如，狭缝光阑可以构造为局部可切换的镜或构造为局部可切换的吸收器(例如基于液晶)。

替代地也可能的是，由用作狭缝探测器的探测器探测分别来自沿照射线照射的样品区域的探测光，其中，所述狭缝探测器由面探测器、例如CMOS探测器或sCMOS探测器的相应激活的部分构成。例如有利地可能的是，仅读取面探测器的一部分、即恰好对应于狭缝探测器的部分(激活的部分)，而面探测器的其余部分、即在狭缝探测器之外的部分未被读取(未激活的部分)。以这种方式共焦探测也是可能的。

在这样的实施形式中避免了机械构件、例如附加的机械狭缝光阑，当涉及在探测平面中移动狭缝探测器时，这是尤其有利的。当然，在这样的实施形式中所述面探测器同样地可以尤其是相对于探测物镜和/或相对于照射物镜和/或相对于样品和/或相对于射入的探测光保持位置固定，其中，面探测器的传感面的时间上依次不同的部分被激活，所述部分然后分别形成狭缝探测器；也就是使得分别仅探测入射到激活的部分上的探测光，而入射到面探测器的相应未激活的部分上的探测光不被探测。

如果面探测器的分别在时间上直接依次激活的部分分别在空间上直接依次设置，则结果是狭缝探测器在空间上未中断地移动，而为此机械部件不必移动。具体来说，例如激活的像素的区域可以是相同形状的并且与沿照射线照射的照射光束同步地沿面探测器的传感面延伸。就此而言，这种实施形式具有长耐久性的特别优点，因为避免了例如机械光阑的由移动所决定的损耗。

在一种特别的实施形式中，每个照射的样品区域配设有一个自己的探测器。尤其是在此配设给不同样品区域的探测器可以设置在不同的探测平面中并且因此考虑如下情况：分别沿照射线照射的样品区域设置在不同的样品平面中。

替代地也可能的是，每个照射的样品区域在一个共同的面探测器上配设有一个自己的探测区域。为了实现在使用一个共同的面探测器时在相同探测平面(即面探测器的探测平面)中聚焦所有样品区域的探测光，在不同的探测光束路径分支中可以设置有用于适配光路的不同元件(例如不一样厚的玻璃块)，和/或不同聚焦的或散焦的元件(例如可调节的透镜)。

在一种特别的实施形式中，来自样品的探测光根据其产生的位置、即利用照射线照射的样品区域的位置借助至少一个分束器被分配到不同的探测光束路径分支上。

借助图1上面阐述的原理也可以如下方式实现，同时至少沿两条相邻的照射线(代替分别利用一个自己的照射光束)利用一条同时照射两条照射光线的光片来照射样品。在此，所述光片平面优选是倾斜的，即以不同于零度的角度相对于样品平面设置。通过倾斜放置光片可以有利地减少其中一条照射线的探测光与配设给另一条照射线的探测器的串扰。为了实现所述目标有利地可以规定，相邻照射线的平行偏移Δx大于探测PSF半径与光片的沿垂直于光传播方向的样品平面的方向一半尺寸之和，如这图3说明的那样。

按照本发明的方法例如可以用如下方式实施，即，借助照射物镜聚焦照射光并且来自样品的探测光穿过探测物镜，其中，照射物镜的光轴和探测物镜的光轴设置在彼此垂直的平面中。

在一种可以特别灵活实施的实施形式中，在该实施形式中尤其是能够实现良好的样品可接近性，照射物镜的光轴和探测物镜的光轴彼此平行地或同轴地定向。尤其是，在照射物镜的后面可以设置有换向机构，该换向机构在照射光穿过照射物镜之后将照射光例如成直角地换向。此外，这样的构造能实现使用直立的或倒置的标准显微镜支架。

按照本发明的显微镜可以有利地在扫描显微镜的基础上、优选在共焦扫描显微镜的基础上构造。就此而言，使用(可能在实验室本来存在的)用于实施按照本方法的扫描显微镜具有特别的优点。

如已经提到的，可以有利地规定：照射光束在照射平面中相对于样品移动。为此，例如可以使用在偏转角度方面可调节的光束转向装置。这样的光束转向装置例如可以具有至少一个电流计反射镜。尤其是，例如也可以使用扫描显微镜的、尤其是共焦扫描显微镜的本来存在的光束转向装置；这尤其是当按照本发明的显微镜通过改装扫描显微镜而制成时或按照本发明的方法借助扫描显微镜被实施时。

为了产生沿照射线照射的照射光束，许多方法是可能的。例如，简单的光栅或特殊的衍射元件可以设置在与照射物镜的光瞳共轭的平面中，所述光栅或衍射元件恰好产生所希望数量的射线并且同时优选也确保所有的照射光束一样亮。在此重要的是，沿探测轴线所希望的射束错位与沿样品平面方向的足够的错位相关。这可以在光栅中通过如下方式实现，即，光栅结构在x-y平面中(即围绕照射光束路径的光轴)旋转。替代地或附加地，通过借助双折射材料或通过使用声光部件，通过偏振的分割是可能的。所述光栅例如也可以灵活地通过SLM(空间光调制器)实现。

此外，也可能的是，在使用样品中的多个荧光团时，在不同的样品平面中激发例如具有不同激光线的不同荧光团。因此，结果是可以在探测光束路径中借助彩色滤波器、尤其是彩色带通滤波器，和/或借助彩色分束器进行分离。

按照本发明的显微镜有利地可以具有尤其是电子的和/或基于计算机的控制装置，该控制装置同步控制沿照射线照射的照射光的移动和/或控制狭缝探测器的或去扫描的光束转向装置的移动。

附图说明

在附图中示例性地且示意性地示出并且借助以下附图描述本发明的主题，其中，相同的或相同作用的元件大多设置有相同的附图标记。其中：

图1示出在探测时用于阐述关系的探测光束路径的示意图，

图2示出按照本发明的显微镜的第一种实施例的照射以及探测光束路径的示意图，

图3示出按照本发明的显微镜的第二种实施例的照射以及探测光束路径的示意图，

图4示出按照本发明的显微镜的第三种实施例的照射以及探测光束路径的示意图，

图5示出按照本发明的显微镜的第四种实施例的照射以及探测光束路径的示意图，

图6示出按照本发明的显微镜的第五种实施例的照射以及探测光束路径的示意图，

图7示出按照本发明的显微镜的第六种实施例的照射以及探测光束路径的示意图，

图8示意性地示出用于产生多个照射光束的装置的一种示例，所述照射光束用于沿多个错开的照射线同时照射。

具体实施方式

图2示出按照本发明的显微镜的第一种实施例的照射以及探测光束路径的示意图。在所述实施例中，沿垂直于图平面的第一照射线7借助沿该第一照射线7传播的第一照射光束8照射样品。所述第一照射光束8具有照射光束半径ρ。所述第一照射线7位于其第一样品平面9中。

在设置成平行于第一样品平面9的第二样品平面10中，沿第二照射线11借助沿该第二照射线11传播的第二照射光束12照射样品。所述第二照射线11设置成平行于第一照射线7。第二照射线11以数值Δx垂直于探测物镜1的光轴错开地设置，其中，所述第一样品平面9和第二样品平面10彼此具有距离Δy。

由此，沿第三照射线13在第三样品平面14中借助第三照射光束15照射样品。

来自借助第一照射光束8照射的样品区域的探测光经由探测物镜1(或者说探测光学系统)成像到第一行扫描探测器16上。来自借助第二照射光束12照射的样品区域的探测光成像到第二行扫描探测器17上。来自借助第三照射光束15照射的样品区域的探测光成像到第三行扫描探测器18上。所述行扫描探测器16、17和18位于不同的探测平面中，所述探测平面与相应的照射平面共轭。在所示出的实施例中示例性地利用三条照射光束8、12、15进行照射并且利用三个行扫描探测器16、17、18进行探测。然而原则上不存在可使用的照射光束以及照射的样品平面的数量界限。就此而言也可能的是，同时利用仍较高数量的照射光束在也较高数量的样品平面中照射样品。

相邻的照射线在x方向上的错位这样选择，使得适用：Δx＞δ+ρ。在此，参量δ是在相应样品平面9、10、14中探测PSF的半径(大致δ＝Δy·tan(α)，其中，α＝arcsin(NA/n)物镜侧的张角，NA是数值孔径并且n是折射率)并且ρ是如下路程，该路程通过公式ρ＝r/cos(α)由相应相邻的照射光束的半径r得出。由三个照射光束8、12、15照射的样品区域根据所选择的几何形状清晰成像到在相应图平面中的探测器上，其中，避免在分别其它探测器上的串扰。

相邻的照射线在y方向上的错位Δy例如这样选择，使得相应照射光束的半径r之和大于Δy。(这在图2中未示出。)

图3示出第二种实施例的照射和探测光束路径的示意图，在该实施例中与在图2中所示出的示例不同，照射线7、11、13的照射不是利用在空间上分开的各照射光束8、12、15、而是利用倾斜放置的光片19进行。所述光片19沿照射线7、11、13(即垂直于图平面)的方向传播。通过将光片19的光片平面相对于样品平面9、10、14倾斜放置，沿设置在不同样品平面9、10、14中的照射线7、11、13的照射是可能的，其中，通过使用行扫描探测器同样避免至少直到一定程度的串扰。所述实施形式视觉上不是完全如在图2中示出的实施形式那样高质量的，因为仅能够较小程度地避免串扰，这基本上归因于光片19的必然较大的厚度。

图4示出按照本发明的显微镜的第三种实施例的照射以及探测光束路径的示意图。沿照射线7在第一样品平面中照射样品区域的照射光束8、沿第二照射线11在第二样品平面10中照射第二样品区域的第二照射光束12以及沿第三照射线13在第三样品平面14中照射第三样品区域的第三照射光束15同时地沿样品平面9、10、14移动，以便连续地扫描每个样品平面9、10、14并且以便结果产生样品数据的三维堆叠。

所述探测光束路径具有偏转镜22，来自借助第一照射光束8照射的第一样品区域的探测光借助该偏转镜转向到第一面探测器23上。此外，探测光束路径具有第一分束器21，该分束器将来自借助第二照射光束12照射的样品区域的探测光换向到第二面探测器24上。此外，探测光束路径包含第二分束器20，该分束器将来自利用第三照射光束15照射的样品区域的探测光换向至第三面探测器25。

所述面探测器23、24、25这样设置，使得分别出现照射样品区域的一个清晰成像。在探测时，相应探测光束的焦点对应于照射光束8、10、15沿面探测器23、24、25的表面的移动。在此，有利地可以规定，每个面探测器23、24、25的各自仅一个窄条带被激活，而相邻区域分别未被激活。以这种方式实现分别一个狭缝探测器，该狭缝探测器允许共焦探测。

通过同步于照射光束8、12、15的移动的面探测器23、24、25的布线，可以实现相应面探测器23、24、25的分别激活的部分的一起移动以及因此一种“卷帘快门(rolling-shutter)”即同步于照射光束8、12、15的移动而一起移动的狭缝探测器布置结构。所述方法的特别有利的子类在于，在不同的样品平面中例如以不同激光线激发不同荧光团。因此，结果可以在探测光束路径中借助彩色滤波器、尤其是彩色带通滤波器，和/或借助彩色分束器进行分离。

图5示出第四种实施例的照射以及探测光束路径的示意图。在所述实施例中，在探测光束路径中是在偏转角度方面可调节的光束偏转装置26，该光束偏转装置包含借助电流计驱动装置可旋转支承的镜27。所述光束偏转装置同步于照射光束8、10、12的移动这样控制，使得探测光的焦点不同于在图4中所示出的实施形式不在行扫描探测器16、17、18的表面上迁移，而是保持位置固定。这样的实施形式具有如下优点：尤其是也可以使用固定的机械光阑。

图6示出按照本发明的显微镜的第五种实施例的照射以及探测光束路径的示意图。与在图5中示出的实施形式不同，存在唯一的面探测器28，其中，每个照射的样品区域在共同的面探测器28上配设有一个自己的探测区域。为了确保全部的探测光束清楚地成像在面探测器28上，在每个分探测器光路中设置有一个用于影响光路长度的器件29。在此，涉及第一较薄的玻璃块30、第二稍微较厚的玻璃块31和第三还较厚的玻璃块32。所述玻璃块可以具有相应成形的表面以避免像差、尤其是球形的像差。

图7示出第六种实施例的照射以及光路的示意图。所述实施例包含在探测光束路径中另一个在偏转角度方面可调节的光束转向装置，以便同步于照射光束8、12、15的移动再次扫描通过共焦光阑33过滤的条带图案，从而分别利用一个面探测器23、24、25，不需要空间上连续激活，各样品平面的共焦图像数据能够直接被接收。

图8示意性地示出用于产生多个照射光束8、12、15的装置的一种示例，所述照射光束用于沿多条错开的照射线同时照射。所述装置具有光栅34，该光栅在空间上分割初级照射光束35，尤其是可以由激光源产生的照射光束35。照射光束8、12、15随后穿过望远镜装置36，该望远镜装置附加地也可以包含滤波器41。随后紧跟在偏转角度方面可调节的光束转向装置37，以便能够使照射光束8、12、15分别在其样品平面中移动。来自光束转向装置37的照射光束8、12、15经过扫描透镜38、镜筒透镜39并且最后到达照射物镜40。在经过照射物镜40之后，照射光束8、12、15直接地或在重新换向之后到达(在此未示出的)样品。

附图标记列表

1 物镜

2 照射线

3 行扫描探测器

4 楔形体积

5 探测PSF

6 楔形区域

7 第一照射线

8 第一照射光束

9 第一样品平面

10 第二样品平面

11 第二照射线

12 第二照射光束

13 第三照射线

14 第三样品平面

15 第三照射光束

16 第一行扫描探测器

17 第二行扫描探测器

18 第三行扫描探测器

19 光片

20 第二分束器

21 第一分束器

22 偏转镜

23 第一面探测器

24 第二面探测器

25 第三面探测器

26 光束偏转装置

27 可旋转支承的镜

28 面探测器

29 用于影响光路长度的器件

30 第一玻璃块

31 第二玻璃块

32 第三玻璃块

33 共焦的光阑

34 光栅

35 初级照射光束

36 望远镜装置

37 光束偏转装置

38 扫描透镜

39 镜筒透镜

40 照射物镜

41 滤波器

Claims (18)

1.用于研究样品的方法，其特征在于，同时在多个彼此不同的样品平面(9、10、14)中分别沿一条照射线(7、11、13)分别利用一个照射光束(8、12、15)照射所述样品，并且通过使用同一个探测物镜(1)分别利用一个自己的探测PSF扫描每个沿照射线(7、11、13)照射的样品区域并且同时且彼此在空间上分开地探测来自照射的样品区域的探测光，其中两条相邻的照射线(7、11、13)之间的距离大于在照射光束的平面中照射光束半径与相邻探测PSF半径之和。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品平面(9、10、14)彼此平行地定向。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

a.所述照射线(7、11、13)在沿样品平面(9、10、14)并且垂直于照射光束(8、12、15)的照射光传播方向的方向上彼此错开地设置，和/或

b.所述照射线(7、11、13)在沿样品平面(9、10、14)并且垂直于探测物镜(1)的光轴的方向上彼此错开地设置，和/或

c.在来自利用照射线(7、11、13)照射的样品区域的探测光束中未设置其它的照射线(7、11、13)。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，连续地通过同步地平行移动相应的照射光束(8、12、15)以及相应的探测PSF扫描每个所述样品平面(9、10、14)。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

a.进行共焦线探测，和/或

b.由在前面设置有狭缝光阑的探测器探测分别来自沿照射线(7、11、13)照射的样品区域的探测光，和/或

c.由用作狭缝探测器的探测器探测分别来自沿照射线(7、11、13)照射的样品区域的探测光，其中，所述狭缝探测器由面探测器的相应激活的部分构成。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，每个照射的样品区域配设有一个自己的探测器，或每个照射的样品区域在一个共同的面探测器上配设有一个自己的探测区域。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，来自样品的探测光根据其产生的位置借助至少一个分束器(20、21)被分配到不同的探测光束路径分支上。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

a.同时至少沿两条相邻的照射线(7、11、13)利用光片(19)代替分别利用一个自己的照射光束(8、12、15)照射样品，和/或

b.同时至少沿两条相邻的照射线(7、11、13)利用光片(19)代替分别利用一个自己的照射光束(8、12、15)照射样品，其中，所述两条相邻的照射线(7、11、13)的距离大于相邻探测PSF半径(δ)与所述光片的沿垂直于光传播方向的样品平面的方向一半尺寸之和。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

a.借助照射物镜(40)聚焦照射光并且来自样品的探测光穿过探测物镜(1)，其中，照射物镜(40)的光轴和探测物镜(1)的光轴设置在彼此垂直的平面中，或

b.借助照射物镜(40)聚焦照射光并且来自样品的探测光穿过探测物镜(1)，其中，照射物镜(40)的光轴和探测物镜(1)的光轴彼此平行地或同轴地定向。

10.显微镜，其特征在于具有一种照射装置，该照射装置具有照射物镜(40)并且该照射装置构造用于同时在多个彼此不同的样品平面(9、10、14)中分别沿一条照射线(7、11、13)分别利用一个照射光束(8、12、15)照射样品，并且具有一种探测装置，该探测装置具有探测物镜(1)和至少一个探测器，并且该探测装置构造用于通过使用同一个探测物镜(1)分别利用一个自己的探测PSF扫描每个沿照射线(7、11、13)照射的样品区域并且同时且彼此在空间上分开地探测来自照射的样品区域的探测光，其中两条相邻照射线(7、11、13)之间的距离大于在照射光束的平面中照射光束半径(ρ)与相邻探测PSF半径(δ)之和。

11.根据权利要求10所述的显微镜，其特征在于，所述样品平面(9、10、14)彼此平行地定向。

12.根据权利要求10所述的显微镜，其特征在于，

a.所述照射线在沿样品平面(9、10、14)并且垂直于照射光束(8、12、15)的照射光传播方向的方向上彼此错开地设置，和/或

b.所述照射线(7、11、13)在沿样品平面(9、10、14)并且垂直于探测物镜(1)的光轴的方向上彼此错开地设置，和/或

c.在来自利用照射线(7、11、13)照射的样品区域的探测光束中未设置其它的照射线(7、11、13)。

13.根据权利要求10所述的显微镜，其特征在于，

a.所述照射装置具有在偏转角度方面可调节的光束偏转装置(26)，借助该光束偏转装置，照射光束(8、12、15)能够被平行移动，和/或

b.所述探测装置具有在偏转角度方面可调节的光束偏转装置(26)，该光束偏转装置实现去扫描探测光。

14.根据权利要求10所述的显微镜，其特征在于，每个照射的样品区域配设有一个自己的探测器，或每个照射的样品区域在一个共同的面探测器上配设有一个自己的探测区域。

15.根据权利要求10所述的显微镜，其特征在于，

a.进行共焦线探测，和/或

b.由在前面设置有狭缝光阑的探测器探测分别来自沿照射线(7、11、13)照射的样品区域的探测光，和/或

c.由用作狭缝探测器的探测器探测分别来自沿照射线(7、11、13)照射的样品区域的探测光，其中，所述狭缝探测器由面探测器的相应激活的部分构成。

16.根据权利要求10所述的显微镜，其特征在于，所述探测装置具有至少一个分束器(20、21)，该分束器将来自样品的探测光根据其产生的位置分配到不同的探测光束路径分支上。

17.根据权利要求10所述的显微镜，其特征在于，

a.所述照射装置产生光片(19)，该光片同时沿至少两条相邻的照射线(7、11、13)照射要研究的样品，以代替分别利用一个自己的照射光束(8、12、15)照射，和/或

b.所述照射装置产生光片(19)，该光片同时沿至少两条相邻的照射线(7、11、13)照射要研究的样品，以代替分别利用一个自己的照射光束(8、12、15)照射，其中，所述两条相邻的照射线(7、11、13)的距离大于相邻探测PSF半径与所述光片的沿垂直于光传播方向的样品平面(9、10、14)的方向一半尺寸之和。

18.根据权利要求10所述的显微镜，其特征在于，

a.照射物镜(40)的光轴和探测物镜(1)的光轴设置在彼此垂直的平面中，或

b.照射物镜(40)的光轴和探测物镜(1)的光轴彼此平行地或同轴地定向。

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