JP6996048B2 - 広視野高分解能顕微鏡 - Google Patents

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関連出願
本出願は、２０１５年１１月１日に出願された米国特許仮出願第６２／２４９，３４２号、２０１６年１月２２日に出願された米国特許仮出願第６２／２８６，１０８号、２０１６年１月２３日に出願された米国特許仮出願第６２／２８６，３１７号、および２０１６年１月２８日に出願された米国特許仮出願第６２／２８８，１２２号の利益を主張する。米国特許仮出願第６２／２４９，３４２号、第６２／２８６，１０８号、第６２／２８６，３１７号、および第６２／２８８，１２２号の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、顕微鏡法に関し、より詳細には、広い視野を有する高分解能２光子顕微鏡法（ＴＰＭ）に関する。

２光子顕微鏡法（ＴＰＭ）は、散乱性の組織における画像化においても、高分解能および高コントラストを提供することができる。ＴＰＭを使用して、組織の最大１ミリメートルの深さまで、ニューロンおよびニューロン未満の構造などの単一の細胞を解像することが可能である。ＴＰＭは、たとえ動物の行動の最中であっても、無傷な脳のニューロンの集団においてカルシウムの動態などの動的なプロセスを測定するために、広く使用されてきた。最大数百ものニューロンが同時に画像化されているが、大部分は、単一の脳領域内の０．５ミリメートル程度の視野に限定されている。

点走査レーザ走査顕微鏡法（ＬＳＭ）においては、集光させられたレーザが、試料を横切って３次元に移動させられる。レーザ走査は、走査されるビームの光軸に垂直な平面（ｘ－ｙ平面）においては、比較的容易に達成することができるが、ビームの方向に平行な光軸（ｚ）に沿ったレーザ走査は、はるかに困難である。多くの顕微鏡においては、ビームを光軸に沿って走査するために、対物レンズを物理的に移動させることによって焦点のｚ位置を変化させるが、これは、大きな質量を移動させるため、比較的速度が遅く、取得できる画像の種類および実際に設計できる顕微鏡の種類が限定される。あるいは、対物レンズの位置を固定したままで、試料を支持するステージを光軸に沿って移動させることもできるが、これも、大きな質量を移動させることを伴う。

いくつかの用途においては、細胞の分解能を保持しつつ、はるかに広い視野を有する顕微鏡が、好都合であると考えられる。比較的単純な動物の行動であっても、複数の脳領域が関与しており、それらの脳領域は連続していないことが多い。これらの空間的に離れた の相互作用を調べるために、両方の脳領域をほぼ同時に画像化する必要がある。霊長類においては、対象の皮質領域が、多くの場合に、脳回を横切って数ミリメートル離れている。他の用途として、発生中の胚における細胞構造の継続的観察が挙げられる。標準的な顕微鏡を用いて複数の脳領域を同時に画像化することは、不可能である。高分解能の顕微鏡は、視界が小さい一方で、大視野の顕微鏡は、細胞の分解能を有さない。神経作用についての高感度なたんぱく質標識（例えば、カルシウム標識）およびこれらの標識を発現するトランスジェニック動物の出現が、メソスケールの画像化の可能性を開く。メソスケールの顕微鏡法が、細胞の分解能ならびに複数の脳領域または生物全体（数ミリメートル）にわたる視野での画像化として定義されることに、留意されたい。

本明細書で説明される実施形態によるメソスケール顕微鏡は、例えば、ほぼ同一平面にあるマウスの脳内の大部分の皮質領域をサンプリングすることを可能にする５ｍｍ程度、またはそれ以上の視野を含む。この顕微鏡は、細胞よりも細かい分解能を有し、すなわち顕微鏡の２光子励起体積が、体細胞（例えば、直径約１０μｍ）の典型的なサイズよりもはるかに小さい。いくつかの実施形態においては、０．６という顕微鏡の励起用の開口数（ＮＡ）が選択され、これは約０．５μｍの横方向分解能および４μｍよりも良好な軸方向分解能をもたらす。この顕微鏡は、励起ビームの波長の範囲にわたって（例えば、９１０～１０７０ｎｍの波長範囲（例えば、ＧＦＰおよび種々の赤色蛍光たんぱく質に基づく蛍光たんぱく質センサが２光子励起を使用して励起される波長範囲）にわたって）回折限界の性能および高い２光子励起効率を生み出すが、他の励起波長も使用可能である。また、この顕微鏡は、例えば励起用ＮＡ（０．６）よりも大きい収集対物レンズＮＡを使用することによって、蛍光信号を収集するための高い収集効率を有する。

メソスケールの走査顕微鏡にとって重要な課題は、速度である。より高速な走査は、神経作用の測定のためのより良好な時間分解能、光損傷の低減、およびより多くのニューロンを追跡できる可能性を提供する。迅速な走査方法は、共振ミラーおよび音響光学偏向器（ＡＯＤ）を利用することができる。しかしながら、共振ミラーおよびＡＯＤは、どちらも走査角度が比較的小さく、視野の全体に及ぶ試料平面内での走査を生み出せない。本発明のいくつかの実施形態は、複数のスキャナを直列に有する走査エンジンを使用することによって、この問題を解決する。例えば、いくつかの実施形態においては、共振スキャナ（例えば、ライン速度が２４ｋＨｚである）が、約０．５ミリメートルにわたる高速走査を生み出すことができる一方で、より低速なガルバノメータスキャナ（例えば、ライン速度が１ｋＨｚである）が、顕微鏡の視野の全体に及ぶ偏向を生み出すことができる。これにより、広範囲に分散した脳領域における活動をほぼ同時にサンプリングするために、高速な共振走査をランダムアクセスのやり方で試料を横切って移動させることが可能になる。

もう１つの課題は、顕微鏡の光軸（ｚ軸）に沿った励起ビームの走査の制御である。典型的な走査顕微鏡において、顕微鏡の焦点面のｚ軸位置は、焦点面内のｘ－ｙ走査よりも２桁以上遅い速度で生じる励起対物レンズの移動によって制御される。これは、メソスケールの画像化にとって容認できず、なぜならば、異なる脳領域内のほぼ同時にサンプリングされる対象の構造が、ｚ方向に数百マイクロメートル離れた異なる焦点面に位置している可能性があるからである。しかしながら、本発明の実施形態は、迅速なリモート集光の形態を実現することによって、この問題に対処する。

いくつかの機器が、２光子励起顕微鏡法における広い視野のために設計されている。Ｔｓａｉら（“Ｕｌｔｒａ－ｌａｒｇｅ ｆｉｅｌｄ－ｏｆ－ｖｉｅｗ ｔｗｏ－ｐｈｏｔｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．”Ｏｐｔｉｃｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ ２３：１３８３３－１３８４７）が、１０ｍｍの走査範囲を生む既製の部品に基づく走査システムを設計している。Ｓｔｉｒｍａｎら（“Ｗｉｄｅ ｆｉｅｌｄ－ｏｆ－ｖｉｅｗ，ｔｗｉｎ－ｒｅｇｉｏｎ ｔｗｏ－ｐｈｏｔｏｎ ｉｍａｇｉｎｇ ａｃｒｏｓｓ ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｎｅｔｗｏｒｋｓ．”ｂｉｏＲｘｉｖ）が、３．５ｍｍの視野を可能にする特別注文の対物レンズを使用している。しかしながら、いずれのシステムも、細胞レベルの分解能を提供していない。これらの機器は、多くの種類の機能画像化にとって遅すぎる標準的な低速ガルボミラー（例えば、ライン速度が２９０Ｈｚ）に依存している。さらに、これらの顕微鏡は、ただ１つの励起波長（それぞれ、８００ｎｍおよび９１０ｎｍ）についてしか補正されておらず、使用が蛍光分子のわずか一部に限定される。これらの顕微鏡は、蛍光の収集に関して開口数が比較的小さく、したがって信号の歩留まり（すなわち、検出される蛍光光子の割合）が低くなり、標準的なＴＰＭ顕微鏡と比較して信号対雑音比が数倍も低下する。最後に、これらの顕微鏡は、迅速な軸方向の走査を実現しない。

顕微鏡の分解能でランダムアクセス体積を提供する２光子ランダムアクセスメソスコープ（２ｐ－ＲＡＭ）の設計、構成、および特徴が、本明細書に開示される。２ｐ－ＲＡＭは、ｘおよびｙ方向において５ｍｍを超える視野にわたって回折限界の分解能を提供することができ、ｚ方向の１ｍｍ程度またはそれ以上のリモート集光と、組織体積のランダムアクセス走査とを有する。

顕微鏡の特定の実施形態の仕様として、以下が挙げられる。
・５ｍｍのＦＯＶ－例えば、マウスの脳の平坦な部分に対応。
・９１０～１０７０ｎｍの励起光－２光子励起を使用するとき、ＧＦＰ系の蛍光分子およびＲＦＰ系の蛍光分子の両方に適合。
・励起ＮＡ＝０．６で回折限界の分解能。（点広がり関数、おおむね横方向０．６μｍ×軸方向４μｍ）－ニューロンより小さい。
・収集ＮＡ＝１．０；高効率の信号検出のため。
・トリプルカバーガラス（４５０μｍのガラス）の完全な補正。
・２光子励起に最適化－これは、すべてのフィールドポイントについて顕微鏡開口を横切る伝播時間遅延差が＜２０ｆｓ（ｒｍｓ）であることを意味する。
・作動距離が＞３ｍｍ。
・ＦＯＶを横切ってストレール比が＞０．８。
・＞７００μｍの深度範囲にわたる横方向視野の全体について完全に光学的に補正された迅速なリモート集光－試料対物レンズ（試料に隣接する浸漬対物レンズ）とリモート集光対物レンズとの特別注文の調和した設計ゆえに可能。

顕微鏡によって平面内でビームを走査するために、共振走査が、リレーとして機能し、共振走査のビーム（例えば、試料平面において±６００μｍ）を視野全体にわたって動かすことも可能にする複数のより低速なスキャナと直列に使用される。例えば、１組のスキャナが共振走査ＦＯＶ走査を位置決めするロービング走査を使用することができる。走査ミラーをリレーとして使用することにより、収差を大幅に低減することができ、効果的に大きな走査角度を可能にすることができる。

数ミリ秒程度の時間でのｚ方向の１ｍｍを超える励起光の焦点の移動を可能にするリモート集光の新たな形態が、本明細書において開示され、これは、広い３次元のＦＯＶを走査可能にし、対象の構造が数ｍｍ離れた位置にある異なる焦点面に存在する場合にとりわけ有用である。対象の多くの試料（例えば、脳）は、湾曲した構造を含むため、迅速なｚ集光の実行が必要である。従来の顕微鏡は、広い視野と高い分解能との間で妥協を行っている。脳および他の器官は、数ミリメートル程度またはそれ以上のサイズを有するが、それらの細胞成分は、数マイクロメートル程度のサイズの構造を有する。細胞の分解能で脳構造の全体を画像化するために、本明細書に記載の顕微鏡を、インビボ画像化に使用することができる。一実施形態において、顕微鏡は、約５ｍｍの視野にわたって回折限界の分解能（横方向０．５μｍ、軸方向４μｍ）を有する２光子顕微鏡法に向けて設計される。このＦＯＶのサイズは、マウスから霊長類までの多くの種における脳の関心の部分のサイズに相当するがゆえに選択される。この顕微鏡は、以下の独自の性能を備えた顕微鏡の設計基準を満たす。
・高い２光子励起効率を維持するために、すべてのフィールドポイントにおいて、顕微鏡の開口を横切る伝搬時間遅延差が小さい。
・顕微鏡の視野にわたって０．８を超えるストレール比。
・上記の基準が、緑色蛍光たんぱく質の励起のための９００ｎｍから赤色蛍光たんぱく質の励起のための１０７０ｎｍまでの広い範囲の励起波長について達成される。
・作動距離は、２．５ｍｍ超であり、立体障害のない脳組織の＞１ｍｍまでの画像化が可能である。
・細胞よりも細かい分解能（横方向０．６μｍ、軸方向４μｍ）をもたらす高分解能の画像化を保証する励起用の大きな開口数（例えば、ＮＡ＝０．６という開口数）。
・励起用の開口数よりも大幅に大きい蛍光検出用の開口数（例えば、ＮＡ＝１．０）。
・対物レンズと試料との間のカバーガラスの４５０マイクロメートルの完全な補正。厚いガラスの使用は、画像化の用途において典型的であり、２ｐ－ＲＡＭは、このガラスについてすでに補正されている。
・走査システムは、共振走査システムによって生み出される高速なラスター走査をランダムアクセスのやり方で試料全体に移動させる直列な２つの走査システムに基づく。これにより、柔軟かつ迅速な走査を使用して視野全体にアクセスすることができる。
・このシステムは、迅速なリモート集光の新規な形態を使用する。大規模な構造が平面的であることはまれであるため、迅速な集光が重要であり、走査深度を横方向の走査とともに迅速に調整する必要がある。

この顕微鏡は、広い視野と高い分解能との独自の組み合わせ、ならびに以前の顕微鏡よりも桁違いに大きい巨大な組織の体積を迅速に移動する能力を提供する。

試料対物レンズ（ＳＯ）（励起対物レンズ（ＥＯ）としても知られる）が、０．６のＮＡおよび直径５ｍｍの視野を有する多光子顕微鏡用など、異常に大きい光学エテンデュを必要とする場合、リモート集光対物レンズ（ＲＦＯ）を、ビームが横方向に走査される前のビーム経路に配置することができる。これにより、ＲＦＯのエテンデュ、したがってサイズ、複雑さ、およびコストを、ＳＯと比べてはるかに小さくすることができる。他の実施形態においては、ＲＦＯを、ビームが横方向に走査された後のビーム経路に配置することができる。さらに、ビーム経路におけるＲＦＯの下流の光学系を、リモート集光が横方向の走査に対して不変であるようにでき、したがって回折限界の集光を、この配置によって大きな体積にわたって達成することができる。

用語「エテンデュ」を、システムがサポートするよう設計された光線の４次元「体積」と考えることができることに留意されたい。その視野（面積Ａを有する）にわたって一定の開口数（ＮＡ）を有する顕微鏡の場合、エテンデュは、π＊Ａ＊ＮＡ^２で与えられる。画像化性能が視野にわたって回折限界であると仮定すると、サポートされるエテンデュは、利用可能な画像内の光学的に解像可能な点（リセル）の数に比例する。

さらに、リモート集光は、きわめて広い視野を有する顕微鏡で使用するための重要な技術である。第１に、全体的な光学設計が比較的大きな量の像面湾曲を有することを許容し、この像面湾曲をリモート集光移動によってリアルタイムで補償することができる。例えば、ビームが励起光の伝播方向に垂直な平面において横方向に走査されるときに、リモート集光対物レンズを、励起光のビーム経路内の光学要素の像面湾曲を補償するように自動的に制御して、励起ビームの焦点を試料内の平面内に維持することができる。あるいは、補正されていない像面湾曲は、集光された領域が環状リングの形態である画像を生成する。収集画像をｚ軸に沿って走査することにより、相応に配置して合成することができる一連の同心な環状リングが生成される。

光学系の比較的大きい像面湾曲を許容することができる光学設計は、ＲＦＯにおける横方向走査を排除することによって達成される単純化に加えて、大きなエテンデュのシステムの光学設計を単純化し、広視野の顕微鏡を可能にする。

本発明の一実施形態は、光源と、光を試料内の焦点面に集光するように構成された試料対物レンズと、前記焦点面に垂直な軸に沿って前記焦点面の位置を変更するように構成されたリモート集光ユニットと、前記集光された光を前記焦点面内の位置へと導くように構成された１つ以上の光学要素と、前記試料内の前記焦点面から発せられる光を検出するように構成された検出器と、を備えており、前記１つ以上の光学要素は、前記軸に沿った前記焦点面の前記位置の変更が、前記集光された光が前記焦点面内の位置へと導かれる前に実行されるように、前記光源から前記試料対物レンズへの光のビーム経路に沿って前記リモート集光ユニットの後に位置している、顕微鏡システムを提供する。

本発明の一実施形態は、光ビームを焦点面内で走査するように構成された第１の回転可能なミラー、第２の回転可能なミラー、および第３の回転可能なミラーを備える横方向走査ユニットであって、前記第１および第２のミラーの回転は、ビームが前記第１および第２のミラーの下流の瞳を中心にして回転するように、同じ平面内で前記光ビームを走査し、前記第３のミラーは、前記瞳に位置し、前記第３のミラーの回転は、前記第１および第２のミラーによるビームの走査の平面に直交する平面内で前記光ビームを走査する、横方向走査ユニットを提供する。

本発明の一実施形態は、光源を用意するステップと、試料対物レンズによって、光を試料内の焦点面に集光するステップと、リモート集光ユニットによって、前記焦点面の位置を該焦点面に垂直な軸に沿って変更するステップと、横方向走査ユニットによって、前記集光された光を前記焦点面内の位置へと導くステップと、検出器によって、前記試料内の前記焦点面から発せられた光を検出するステップと、を含んでおり、前記１つ以上の光学要素は、前記軸に沿った前記焦点面の前記位置の変更が、前記集光された励起光の前記焦点面内での走査の前に実行されるように、前記光源から前記試料対物レンズへの励起光のビーム経路に沿って前記リモート集光ユニットの後に位置している、顕微鏡画像化方法を提供する。

本発明の一実施形態は、光ビームを焦点面内で走査するための方法であって、第１の回転可能なミラーおよび第２の回転可能なミラーを、ビームが前記第１および第２のミラーの下流の瞳を中心にして回転するように、同じ平面内で光ビームを走査するように回転させるステップと、第３のミラーを前記瞳に位置させるステップと、前記第３のミラーを、前記第１および第２のミラーによるビームの走査の平面に直交する平面内で前記光ビームを走査するように回転させるステップと、を含む方法を提供する。

一実施形態による顕微鏡システムのブロック図を示している。

一実施形態による顕微鏡システムの概略図を示している。

一実施形態による顕微鏡のＦＯＶ全体にわたる共振走査ビームの移動のための走査パターンおよび走査パラメータの例を示している。

一実施形態による試料のランダムアクセス走査を示している。

実質的に共役なガルボペアを含む一実施形態による走査ミラーの構成を示している。

一実施形態による像面湾曲の特徴および補正を示している。

一実施形態による典型的な対物レンズの概略図である。

一実施形態によるＰＭＴの概略図であり、レンズの前方の集光レンズと、レンズとＰＭＴとの間の浸漬液とを有している。

一実施形態による広視野画像化を示している。

本発明の原理による例示の実施形態の説明は、書面による説明全体の一部と見なされるべき添付の図面と併せて検討されるように意図されている。本明細書に開示される本発明の実施形態の説明において、方向または向きへの言及は、あくまでも説明を便利にすることを目的としているにすぎず、決して本発明の技術的範囲を限定しようとするものではない。「下側」、「上側」、「水平」、「鉛直」、「上方」、「下方」、「上」、「下」、「上部」、および「下部」、などの相対的な用語、ならびにこれらの派生語（例えば、「水平方向に」、「下方へと」、「上方へと」、など）は、説明時の向きまたは該当の図面に示されている向きを指すものと解釈されるべきである。これらの相対的な用語は、あくまでも説明を便利にするためのものにすぎず、とくに明示的に示されない限り、装置を特定の向きにて構成し、あるいは動作させることを、必要とするものではない。「取り付けられ」、「添えられ」、「接続され」、「連結され」、および「相互接続され」などの用語、ならびに同様の用語は、とくに明示的に説明されない限り、構造体が互いに直接的または介在の構造体を介して間接的に固定され、あるいは取り付けられる関係、ならびに可動または不動の両方の取り付けまたは関係を指す。さらに、本発明の特徴および利点が、典型的な実施形態に関して説明される。したがって、本発明が、単独で存在しても、他の組み合わせにて存在してもよい特徴について、これらに限られるわけではないいくつかの考えられる組み合わせを説明しているにすぎないそのような典型的な実施形態に限られないことは明らかであり、本発明の技術的範囲は、添付の特許請求の範囲によって定められる。

本明細書は、現時点において考えられる本発明の最良の実施の態様を説明する。この説明は、限定の意味で理解されてはならず、当業者に本発明の利点および構成を教示するために、添付の図面を参照することによってあくまでも例示の目的で提示される本発明の一例を提供する。図面の種々の図において、同様の参照符号は、同様または類似の部分を指している。

開示される実施形態が、本明細書における革新的な教示の多数の好都合な使用のいくつかの例にすぎないことに、注意することが重要である。一般に、本出願の明細書においてなされる言明は、必ずしも種々の請求項に記載の発明のいずれかを限定するものではない。さらに、いくつかの言明は、本発明の特徴のいくつかに当てはまるかもしれないが、他の特徴には当てはまらないかもしれない。一般に、とくに示されない限り、一般性を失うことなく、単数の構成要素は複数であってもよく、逆もまた然りである。

図１は、一実施形態による顕微鏡システムの高度のブロック図である。顕微鏡システムは、光源１０１と、試料１０５内の焦点面に光を集光するための試料対物レンズ１０４と、試料対物レンズのｚ軸に沿って焦点面の位置を変更するためのリモート集光ユニット１０２と、集光された光を焦点面内に向けるための照明光学系１０３と、集光された励起光に応答して試料内の焦点面から発せられる光を検出するための検出器１０６とを含む。当業者であれば、１つ以上の光学要素からなる構成または同等物を使用して光を平面内の位置に向けることができることに、留意されたい。

平面内で位置を走査することにより、走査顕微鏡法を実行することができる。一実施形態による顕微鏡システムの特定の実施例が、図２に示されている。図２に示されるとおり、励起光源２０２（例えばＴｉ：Ｓａｐｈｈ）が、励起光を供給する。電気光学変調器（ＥＯＭ）２０４が、ビーム強度を迅速に変調するために使用される。プリズムに基づくプリチャープ構造２０６が、顕微鏡の屈折光学系によって導入される群遅延分散（ＧＤＤ）を補償するために使用される。ビームは、１／４波長板（ＱＷＰ）２０８を多段ペリスコープ２１０へと通過する。顕微鏡２１２は、試料への柔軟なアクセスを可能にするために動力式である。一実施形態において、顕微鏡は、大まかな集光のために、ｘ、ｙに移動することができ、試料平面を通過する顕微鏡の長軸に平行な軸を中心にして回転でき、ビーム軸に沿って上下に移動することができる。顕微鏡がレーザに対して移動するため、ビームは、多段ペリスコープ２１０を介して顕微鏡へと通される。顕微鏡の主要部において、ビームは、最初に偏光ビーム分割キューブ（ＰＢＳ）２１４および１／４波長板（ＱＷＰ）２１６を介してリモート集光ユニット（ＲＦＵ）２２２に進入する。ＲＦＵ２２２は、リモート集光対物レンズ（ＲＦＯ）２１８と、可動ステージ２２０に取り付けられた小型ミラー２６０とを含む。ビームは、ＲＦＯ２１８を通過し、ミラー２６０において反射し、ＲＦＯ２１８を再び通過する。次いで、ＱＷＰ２１６およびＰＢＳ２１４が協働して、ビームを横走査ユニット（ＬＳＵ）２２４へと導く。

一実施形態において、可動ステージ２２０は、ミラー２６０をＲＦＯ２１８の軸に沿って前後に移動させるボイスコイルを含む。他の実施形態においては、例えば、圧電装置が、ボイスコイルに代え、あるいはボイスコイルと組み合わせて、ミラーの位置を移動させるために使用される。

ＲＦＵ２２２は、試料における励起光の焦点の位置を、試料における励起光の伝播方向に沿う方向に制御するために使用される。ＲＦＯの入口開口は、画像化対物レンズ（ＩＯ）の入口開口と共役である。ミラー２６０は、試料平面における焦点にほぼ共役である。ミラー２６０の軸方向移動は、試料における焦点の軸方向位置を変化させる。

可動ステージに取り付けられたミラーでの反射後に、励起ビームを、ビームスプリッタによって反射させ、共振走査ミラー２３０へと導き、次いで１つ以上のガルバノミラーによって導くことができる。走査ミラーは、試料において、励起光の焦点を、試料における励起光の伝播方向に垂直な方向（例えば、ｘおよびｙ方向）に走査することができる。

共振ミラーおよびガルバノミラーの後で、励起ビームは、ダイクロイックビームスプリッタ２４８で反射され、試料対物レンズ（ＳＯ）２５０によって試料２５２内の焦点へと集光される。励起ビームは、試料対物レンズの後方瞳の全表面を満たす必要はなく、励起光学系の開口数は、約０．６になり得る。

試料から放出された蛍光発光は、試料対物レンズによって収集され、次いでビームスプリッタ２４２を介して１つ以上の検出器（ＰＭＴ）２４０、２４４へともたらされる。試料対物レンズの後方瞳の全体が、蛍光放射の収集に使用されるため、検出光学系の開口数は、約１．０になり得る。

ＲＦＯの光学特性を、励起光の焦点面を移動させるためのＲＦＯの使用に起因して集束／発散の非平面波が試料対物レンズの後方瞳へともたらされることによって生じる試料へともたらされる励起ビームに導入される球面収差および色収差を、補償するように選択することができる。

図２には、リレー画像化瞳面について、典型的な光学素子２２６、２３２、および２３６も示されている。

図３が、共振走査ビームを顕微鏡の全ＦＯＶにわたって移動させるための走査パターンおよび走査パラメータの例を示している。走査パターンは、さまざまな異なる数のストライプを使用することができ、或るストライプから別のストライプへの移動が、比較的低速のスキャナでビームを移動させることを伴う一方で、ストライプ内のラインによるビームの走査は、比較的高速な共振スキャナでビームを移動させることを伴う。例えば、幅が約６００μｍまでのパッチについて、（例えば、２４ｋＨｚというライン速度に対応する１走査ラインにつき４２μｓという時間での）高速共振走査を行うことができる。１パッチあたりの時間は、４２μｓ×ライン数となることができ、全視野を９個のストライプでカバーすることができる。低速（例えば、１．５Ｈｚ）な高分解能の走査は、１ストライプにつき最大５，０００本のラインを有することができる。より高速（４．３Ｈｚ）な低分解能の走査は、１ストライプにつき最大５００本のラインを有することができる。他の走査は、複数のより小さなパッチを高い分解能およびフレームレートでサンプリングすることを含むことができる。

図４は、ランダムアクセス走査の一例を示す概略図である。例えば、画像化体積の全体は、直径５ｍｍおよび深さ１ｍｍの円柱を含むことができる。高速走査を、励起ビームの伝播方向に垂直な複数の異なる平面内で行うことができ、試料体積内で焦点のｚ方向位置を変化させるＲＦＯを使用することによる平面間のジャンプによって、異なる平面にアクセスすることができる。

大部分のレーザ走査顕微鏡は、視野の異なる部分にアクセスすべくレーザビームを操るために２つの走査ミラーを使用する。走査ミラーが互いに共役にされていない場合（共役は、例えば一方の走査ミラーをリレー画像化光学系によって他方の走査ミラーへと画像化することによって達成できる）、ミラーの走査時にビーム／波面が下流の光学瞳に対して横方向にずれ、著しい光学収差が生じる。

多くのレーザ走査顕微鏡において、この瞳のずれは、高視野点においてケラレ（部分的な遮光）を発生させ、光学的に最も単純なレーザ走査顕微鏡（すべての光学瞳が平面のビーム波面に出会う）を除くすべてのレーザ走査顕微鏡において、この瞳のずれは、著しい光学収差を引き起こす可能性がある。大部分の顕微鏡において、走査ミラーを共役にするために使用される唯一の方法は、（典型的には、４ｆ設計の）リレー画像化光学系を使用することである。これは、在庫の対物レンズを使用する顕微鏡においては、やはり在庫から入手することができる光学系を使用する比較的単純な光学系の設計が、このリレー画像化を適切に実行でき、回折限界の性能を維持することができるため、通常は問題でない。しかしながら、本明細書に記載の５ｍｍの視野（ＦＯＶ）および０．６のＮＡを有する２光子レーザ走査顕微鏡など、従来からの顕微鏡と比べて異常に大きいエテンデュ（ｅｔｅｎｄｕｅ）を使用するように設計された顕微鏡において、４ｆの画像化リレーレンズは、専用設計でなければならず、比較的大型かつ製造が高価になり、顕微鏡の最も複雑かつ高価な部分になる可能性があると考えられる。

しかしながら、この光学リレーの増大したサイズおよび費用は、いかなる追加の光学系も使用することなくｘおよびｙ走査の瞳が一致するように２つではなく３つの走査ミラーを使用して励起ビームを試料内でｘおよびｙ次元に走査することによって、回避することができる。一実施形態においては、ビームが両方のミラーの下流の瞳の周りを回転するように、２つのミラーが同時に、同じ平面内で走査される。この瞳は、直交する方向に走査される第３のミラー上に位置する。最初の２つのミラーの走査位置を相互に関連付ける関数が、厳密な比例関係である場合、下流の瞳は、大きな走査範囲にわたって実質的に静止したままであり得る。瞳を大きな走査範囲にわたって任意に静止させるために、他の高次関数を使用することが可能である。

図５Ａ～図５Ｃは、ビームの方向を変えることができる仮想瞳を生成するために協働する２つの走査ミラー５０１，５０２の概略図である。ビームは左上から入射し、仮想瞳は右下に位置する。図５Ａ～図５Ｃは、異なる視野／走査位置に対応する異なる光線経路を示している。２つのミラーは同時に走査され、ビームの方向が仮想瞳の周りを回転するよう、両方が同じ平面内でビームを走査するように、平行な軸の周りを回転する。例えば、図５Ａ～図５Ｃに示されるように、右下の仮想瞳における異なる光線は、２つの上流のミラーの異なる角度方向ゆえに、異なる方向を有しているが、同じ平面（例えば、ｘ－ｚ平面）内を伝播している入射ビームを示している。直交平面（例えば、ｙ－ｚ平面）内でビームを走査する走査ミラーを、右下の瞳に配置することができる。

図５Ｄは、３つの走査ミラーのすべてを示す概略図であり、３つの走査ミラーは、ビームの方向を回転させるべく協働する２つの上流の走査ミラー５０１，５０２と、仮想瞳におけるビームの回転／走査の方向に直交する方向にビームを走査する下流の走査ミラー５０３とを含む。最初の２つのミラー５０１，５０２は、互いに協働して動作して、仮想瞳を第３のミラー５０３の位置に維持する。最初の２つのミラーが、互いに協働して動作して、仮想瞳において第１の平面内でビームの方向を回転させ、仮想瞳を横切るビームの平行移動はわずかである一方で、第３のミラーは、第１の平面に垂直な第２の平面内でビームの方向を回転させるように動作する。最初の２つのミラーがこのように動作するとき、最初の２つのミラーの組み合わせは、第３のミラーに実質的に共役である。

点走査レーザ走査顕微鏡法（ＬＳＭ）においては、集光させられたレーザが、試料を横切って３次元に移動させられる。レーザ走査は、光軸に対して横方向には容易に達成できるが、光軸（ｚ）に沿ってははるかに困難である。大部分の顕微鏡においては、対物レンズが移動して、焦点のｚ位置を移動させる。これらの移動は、大きな質量を伴い、したがって比較的低速であり、取得することができる画像の種類および実際に設計することができる顕微鏡の種類を制限する。本発明の実施形態は、焦点をビームの軸に沿って迅速に移動させるために、横方向には走査されないリモート集光顕微鏡を使用する。この対物レンズの焦点空間内に配置された対物レンズおよびミラーは、レーザビームを、横方向に走査される前に、まずは軸方向空間において走査するために使用される。次いで、ビームは、別の対物レンズによって集光され、ＬＳＭ用の試料を励起する。伝統的なリモート集光においては、ビームが、最初に横方向に走査され、次いで２つの対物レンズからなるリモート集光システムへと送られる。

図１に示されるように、一実施形態において、システムは、試料内の焦点を試料における励起光の伝播方向に垂直な方向に走査するようにガルボミラーを自動的に制御するために使用される少なくとも１つのプロセッサを有する演算システム１０７を含む。別の実施形態において、演算システム１０７は、試料内の励起光の焦点の位置を、焦点が伝播に垂直な方向に走査されるときに伝播方向に垂直な平面内に保つように、リモート集光システム１０２を自動的に制御するためにも使用される。

例えば、励起光学系の像面湾曲を、励起ビームに対して既知の蛍光発光応答を有する薄い較正試料へと、集光された励起ビームを試料対物レンズを通してもたらすことによって、パラメータ化することができる。次いで、ビームが伝搬方向に垂直な方向に走査されるときに、較正試料からの蛍光発光応答を監視して、励起光学系の像面湾曲を決定し、あるいはビームが平面に平行な方向に走査されるときに焦点が平面からｚ方向にどれだけずれるのかを決定することができる。

ひとたび励起光学系がパラメータ化されると、パラメータ化を、ビームがビームの伝播方向に垂直な方向に走査されるときに、ビームの焦点を平面内に維持するために使用することができる。例えば、ビームの焦点が横方向へとｘおよびｙ方向に走査されるとき、リモート集光システムは、ｚ方向に沿った焦点の位置を動的に制御することによって、励起光学系によって導入され得る像面湾曲にかかわらず、焦点の位置を平面内に保つことができる。このように、リモート集光システムを、励起光の焦点を（例えば、試料の３Ｄ画像を生成するために）異なる平面へとｚ方向に移動させるために使用できるだけでなく、焦点が平面内を走査されるときに試料対物レンズの像面湾曲を補正するためにも使用することができる。いくつかの実施例においては、ＲＦＯを、ビームがガルボミラーによって走査されるときにリアルタイムで、ガルボミラーによって引き起こされるビームの位置に応答して制御することができる一方で、ＲＦＯは、共振走査ミラーの向きに応答して制御されることがない。いくつかの実施例においては、ＲＦＯを、ビームがガルボミラーによって走査されるときにリアルタイムで、ガルボミラーによって引き起こされるビームの焦点の位置および共振走査ミラーの向きによって引き起こされる焦点の位置の両方に応答して制御することができる。

図６Ａ～図６Ｄが、像面湾曲の特徴および補正を示している。図６Ａは、薄いフルオレセイン試料（例えば、顕微鏡スライドと厚さ４５０μｍのカバーガラスとの間に挟まれた厚さ１１．２μｍのフルオレセイン試料）を用いて測定される像面湾曲を示している。特定のリモート集光位置において、試料の画像は、励起ビームの環状のリングだけがフルオレセイン試料からの蛍光発光を励起させる光学系の像面湾曲ゆえに、蛍光リングである。リングの直径を、リモート集光位置の関数として測定することができる。図６Ｂが、像面湾曲を補正しない場合の試料の画像の概略図であり、試料が細いリングとして現れている。図６Ｃは、測定した像面湾曲（実線：像面湾曲の補正前、破線：像面湾曲の補正後）の概略図である。図６Ｄは、リモート集光ミラーが像面湾曲を補償するようにプログラムされたときに得られる試料の画像の概略図である。補償は、線ごとのやり方で、線における共振ミラーの平均位置を補正すべき点として行われる。図６Ｄに示した例において、像面湾曲の補償は、各々のストライプに沿った像面湾曲を補正するが、共振ミラーがＲＦＯの動的応答による追従能力よりも高速で移動するがゆえ、共振走査における像面湾曲は補正しない。

いくつかの実施形態において、試料対物レンズは、２光子レーザ走査顕微鏡（ＴＰＭ）に使用される場合、試料へともたらされる２光子励起放射のための第１のＮＡと、蛍光放射の収集のための第１のＮＡよりも大きい第２のＮＡとを有することができる。例えば、対物レンズは、（直径５ｍｍのＦＯＶにおいて）約０．６の励起ＮＡおよび約１．０の収集ＮＡを有することができる。対物レンズ内のレンズの物理的な開口が、ＮＡ１．０の収集を可能にする一方で、対物レンズは、入射する励起ビームがより低い励起ＮＡに対応する幅を有する場合、回折限界の画像化のみをサポートする。

ＴＰＭシステムの対物レンズは、２つの役割を果たし、すなわち（効率的な２光子励起と高い分解能とを達成するために）励起ビームを可能な限り小さな点へと集光する役割、および２光子励起から得られた蛍光を収集して光検出器へと伝える役割の両方を果たす。集光の役割は、対物レンズが、理想的には、有用なＮＡおよび視野（ＦＯＶ）の仕様のために、複雑な光学設計および困難な製造公差を必要とする回折限界の光学性能を有することを必要とする。これらの困難は対物レンズのＮＡが増加するにつれて超線形にて増加するため、励起ＮＡの選択は、ＮＡとともに向上する必要な２光子励起効率および分解能を、レンズのコストおよび製造性とバランスさせることを必要とする。

収集される光の量は、おおむね（ＮＡ）^２として増加するため、高ＮＡは、効率的な蛍光の収集においても重要である。しかしながら、励起とは対照的に、収集される光は画像化されず、単に単一の大きな感光面（典型的には、ＰＭＴ光電陰極）へと集められるにすぎないため、収集に関する対物レンズの性能は、回折限界の励起性能に関して必要とされるよりも（波面誤差の点で）数桁悪くてもよい。したがって、ＴＰＭ画像化のための理想的な対物レンズ設計は、その励起ＮＡよりも大きい収集ＮＡをサポートする。これは、（エッジ厚さによって制限される）レンズの最大の妨げのない開口がより大きな収集ＮＡをサポートできる一方で、対物レンズの後方瞳の全体未満が励起光によって照らされる場合に対物レンズの個々のレンズを通ってもたらされる励起放射について回折限界の性能も可能にするように、対物レンズの個々のレンズを充分に厚くなるように選択することによって達成できる。

図７は、試料からの蛍光発光を収集するために使用されるときのレンズのＮＡよりも小さいＮＡを有する回折限界の励起を提供する典型的な対物レンズの概略図である。破線７０４は、ＮＡ０．６における回折限界の励起経路を示している。実線７０２は、ＮＡ１．０における収集経路を示している。励起および収集経路が、異なる瞳位置を有することに留意されたい。例えば、２つの励起経路（破線で示されている）が、励起ビームを試料内の比較的広いＦＯＶにわたって走査できることを示すために、励起ビームの焦点が試料内の異なる位置へともたらされることを示している。また、励起経路（破線）７０４は、瞳の全体が照らされる場合よりも小さなＮＡで、回折限界の性能が得られるように、励起が対物レンズの後方瞳の全体を満たさず、むしろ後方瞳の一部分だけを照らす様子を示している。蛍光経路（実線）７０２は、どのようにして試料へと励起光をもたらすための対物レンズの有効ＮＡよりも大きなＮＡで対物レンズによって発光を収集できるのかを示している。

２光子レーザ走査顕微鏡においては、信号光子を無駄にせずに検出器によって集めるために、光検出器（例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ））のエテンデュが、対物レンズによる蛍光集光のエテンデュに匹敵するか、あるいは対物レンズによる蛍光集光のエテンデュを超えなければならない。大部分の顕微鏡において、顕微鏡法に使用される大部分のＰＭＴによれば、これは、これらのＰＭＴが対物レンズの視野（ＦＯＶ）よりもはるかに大きい有効光電陰極面積を持ち、かなり大きい収集角度をサポートするため、問題ではない。しかしながら、インビボ画像化のための本明細書に記載の広視野高分解能顕微鏡（２ｐ－ＲＡＭ）においては、対物レンズが、直径約６ｍｍのＦＯＶにわたって１．０のＮＡで蛍光を収集し、この収集された発光のエテンデュは、直径５ｍｍの有効収集面積および約０．９の使用可能なＮＡを有するにすぎない使用される技術水準のＰＭＴ（例えば、ＧａＡｓＰ光電陰極ＰＭＴ）のエテンデュを上回るため、この蛍光のすべてを検出することは不可能になる。ＰＭＴに集光レンズを追加し、レンズとガラスＰＭＴ外皮との間に浸漬液を配置することで、ＰＭＴの収集ＮＡを１．０よりも大きくすることができ、一実施形態においては、油による浸漬を集光レンズとＰＭＴとの間に使用した場合に、ＰＭＴにおける蛍光が１．４というＮＡに達し、対物レンズによって収集される蛍光のすべて（反射損失はカウントしない）を検出のためにＰＭＴへと投影することができる。

いくつかの実施例においては、特別注文の集光レンズを、蛍光発光を光電子増倍管へと集光するために、蛍光発光が通過するレンズとＰＭＴとの間の空間を満たす浸漬油などの中間光学浸漬液と組み合わせて使用することができる。専用設計の金属部品が、機械的安定性のためにレンズをＰＭＴに堅固に取り付けるために使用される。

図８が、ＰＭＴ８０２の概略図であり、レンズの前方の集光レンズ８１２と、レンズとＰＭＴとの間の浸漬液８０８とを有している。蛍光発光８１４が、集光レンズによってＰＭＴ検出器の光電陰極８０６へと集光される。高い屈折率の流体が、集光レンズの平坦面に接触させて光電陰極とレンズとの間に配置されると、レンズの縁部から集められた光さえも、レンズの平坦な表面において全反射によって阻止されるよりもむしろ、レンズを出てＰＭＴへと移動することができる。

図９が、一実施形態による広視野画像化を示している。図６Ａ～図６Ｄに示されるとおりの試料対物レンズの像面湾曲の補正の代わりに、図９は、補償されていない像面湾曲が、集光領域が環状リングの形状である画像を生成することを示している。収集画像をｚ軸に沿って走査することにより、相応に配置して合成することができる一連の同心な環状リングが生成される。

本明細書に開示した本発明の実施形態は、既存のシステムおよび技術に対して独特の利点を有する。上述したように、リモート集光顕微鏡法の技術は、１対の対物レンズと、一方の対物レンズ（リモート集光対物レンズＲＦＯ）の焦点空間における軸方向に移動するミラーとを使用し、他方の対物レンズ（試料対物レンズＳＯ）の焦点面を最小限の光学収差で迅速に変更することを可能にする。この技術の既存の実施例は、ビームが横方向に走査された後のビーム経路にＲＦＯを配置し、ＲＦＯおよびＳＯは同等の光学エテンデュを有する。この配置は、同じ光学エテンデュをすでにサポートする市販の対物レンズがＲＦＯおよびＳＯとして使用される場合に最適である。しかしながら、ＳＯが異常に大きい光学エテンデュを有する必要がある場合、ビームが横方向に走査される前のビーム経路にＲＦＯが配置される実施形態による配置が好ましい。これにより、ＲＦＯのエテンデュ、したがってサイズ、複雑さ、およびコストを、ＳＯと比べてはるかに小さくすることができる。一実施形態において、ＲＦＯに続く光学系は、リモート集光が横方向の走査に対して不変であるようにされ、したがって回折限界の集光が、この配置によって大きな体積にわたって達成される。さらに、リモート集光は、全体の光学設計が比較的大きな量の像面湾曲を有することを許容し、この像面湾曲をリモート集光移動によってリアルタイムで補償することができるため、きわめて広い視野を有する顕微鏡に用いられるきわめて重要な技術である。像面湾曲を有する光学設計は、ＲＦＯにおける横方向走査を排除することによって達成される単純化に加えて、大きなエテンデュのシステムの光学設計を劇的に単純化する。

本発明を、いくつかの上述の実施形態に関して、かなり長く、或る程度詳細に説明したが、本発明は、決してそのような詳細または実施形態あるいは特定の実施形態に限定されるべきものではなく、むしろ添付の特許請求の範囲を参照して、それらの請求項について先行技術に鑑みて可能な限り最も広い解釈をもたらし、したがって本発明について意図される技術的範囲を実質的に包含するように、解釈されなければならない。

本明細書において、顕微鏡の特定の実施形態で使用される特定のパラメータに言及したが、本発明が、特定の実施形態で使用されたいかなる特定のパラメータにも限定されないことを、理解すべきである。本明細書に記載されるすべての例および条件の表現は、本発明の原理および技術の進歩への本発明の発明者による貢献の考え方の理解において読み手を助けるための教育的な目的を意図しており、そのような具体的に記載される例および条件への限定を伴わないものとして解釈されなければならない。さらに、本発明の原理、態様、および実施形態、ならびにそれらの具体例についての本明細書におけるあらゆる言明は、それらの構造および機能の両方における同等物を包含するように意図されている。加えて、そのような同等物は、現時点において公知の同等物ならびに将来開発される同等物、すなわち構造にかかわらず同じ機能を果たす開発されるあらゆる構成要素の両方を含むことが意図される。

Claims (11)

1. 光源（１０３）と、
   光を試料（１０５）内の焦点面に集光するように構成された試料対物レンズ（１０４）と、
   前記焦点面に垂直なｚ方向に沿って前記焦点面の位置を変更するように構成されたリモート集光ユニット（１０２）と、
   前記集光された光をｘ及びｙ方向に向けて５ｍｍを超える視野を持つ前記焦点面内の位置へと導くように構成された、第１の回転可能なミラー、第２の回転可能なミラー、および第３の回転可能なミラーを備える横方向走査ユニットと、
   前記集光された光に応答して前記試料内の前記焦点面から発せられた光を検出するように構成された検出器（１０６）とを備えており、
   前記横方向走査ユニットは、前記ｚ方向に沿った前記焦点面の前記位置の変更が、前記光が前記ｘ及びｙ方向に向けて前記焦点面内の前記位置へと導かれる前に実行されるように、前記光源から前記試料対物レンズへの光のビーム経路に沿って前記リモート集光ユニット（１０２）の後に位置し、
   前記集光された光ビームの方向が前記第１および第２のミラーの下流の瞳を中心にして回転するように、前記第１および第２のミラーの回転により同じ平面内で前記集光された光ビームを走査し、前記第１のミラーの回転角度が前記第２のミラーの回転角度に厳密に比例しながら前記第１および第２のミラーが平行な軸を中心に同時に回転する
   前記第３のミラーは、前記瞳に位置し、
   前記第３のミラーの回転により、前記第１および第２のミラーによるビームの走査の平面に直交する平面内で前記光ビームを走査する、
   顕微鏡システム。
2. 前記集光された光のサイズは、回折限界である、
   請求項１に記載の顕微鏡システム。
3. 前記試料対物レンズは、前記焦点面に回折限界のスポットをもたらすように構成された第１の有効開口数を有し、前記第１の有効開口数は、少なくとも０．５である、
   請求項１に記載の顕微鏡システム。
4. 前記第１の有効開口数は、０．６である、
   請求項３に記載の顕微鏡システム。
5. 前記試料対物レンズは、前記検出器への画像化のために前記焦点面から発せられた光を収集するように構成された第２の有効開口数を有し、前記第２の有効開口数は、少なくとも１．０である、
   請求項４に記載の顕微鏡システム。
6. 前記光源は、前記発せられて検出された光が、集光された励起光に応答する蛍光発光であるように、前記試料へと励起光を提供する、
   請求項１に記載の顕微鏡システム。
7. 前記励起光の波長は、２光子励起プロセスに応答して生成される前記蛍光発光の波長の２倍の長さである、
   請求項６に記載の顕微鏡システム。
8. 前記焦点面の位置が該焦点面に垂直な軸に沿って走査されるときの一連の画像を合成および処理するように構成された画像プロセッサ（１０７）をさらに備える、
   請求項１に記載の顕微鏡システム。
9. 前記リモート集光ユニットは、リモート集光対物レンズ（２１８）と、可動ステージ（２２０）上に取り付けられたミラー（２６０）とを備え、
   前記リモート集光対物レンズの入口開口は、前記画像化対物レンズの入口開口と共役であり、前記ミラーは、前記試料平面内の焦点にほぼ共役である、
   請求項１に記載の顕微鏡システム。
10. 前記ステージは、ボイスコイルによって移動させられる、
    請求項９に記載の顕微鏡システム。
11. 光源を用意するステップと、
    試料対物レンズによって、光を試料内の焦点面に集光するステップと、
    リモート集光ユニットによって、前記焦点面の位置を該焦点面に垂直なｚ方向に沿って変更するステップと、
    第１の回転可能なミラー、第２の回転可能なミラー、および第３の回転可能なミラーを備える横方向走査ユニットによって、前記集光された光をｘ及びｙ方向に向けて５ｍｍを超える視野を持つ前記焦点面内の位置に導くステップと、
    検出器によって、前記試料内の前記焦点面から発せられた光を検出するステップとを含んでおり、
    前記横方向走査ユニットは、前記ｚ方向に沿った前記焦点面の前記位置の変更が、前記集光された光が前記ｘ及びｙ方向に向けて前記焦点面内の前記位置へと導かれる前に実行されるように、前記光源から前記試料対物レンズへの光のビーム経路に沿って前記リモート集光ユニットの後に位置し、
    前記集光された光ビームの方向が前記第１および第２のミラーの下流の瞳を中心にして回転するように、前記第１および第２のミラーの回転により同じ平面内で前記集光された光ビームを走査し、前記第１のミラーの回転角度が前記第２のミラーの回転角度に厳密に比例しながら前記第１および第２のミラーが平行な軸を中心に同時に回転する
    前記第３のミラーは、前記瞳に位置し、
    前記第３のミラーの回転により、前記第１および第２のミラーによるビームの走査の平面に直交する平面内で前記光ビームを走査する、
    顕微鏡画像化方法。

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