ITPI20120034A1

ITPI20120034A1 - Metodo e dispositivo perfezionati per microscopia video-confocale

Info

Publication number: ITPI20120034A1
Application number: IT000034A
Authority: IT
Inventors: Pier Alberto Benedetti
Original assignee: Cnr Consiglio Naz Delle Ricer Che
Priority date: 2012-03-31
Filing date: 2012-03-31
Publication date: 2013-10-01
Also published as: US9927602B2; EP2831657B1; WO2013144891A2; WO2013144891A3; EP2831657A2; US20150097942A1

Description

"METODO E DISPOSITIVO PERFEZIONATI PER MICROSCOPIA VIDEO-CONFOCALE"

DESCRIZIONE

Ambito dell'invenzione

La presente invenzione si riferisce a un metodo perfezionato di microscopia ottica del tipo descritto in letteratura come video-confocale e a un dispositivo per attuare tale metodo.

Brevi cenni alla tecnica nota - Problemi tecnici

La tecnica di microscopia ottica nota come video-confocale utilizza come noto un'illuminazione di un campione in campo ristretto e un'acquisizione in campo largo di luce proveniente da tale campione.

Più precisamente, con riferimento alla figura 1, la tecnica video-confocale prevede fasi di:

— illuminazione a campo ristretto multi-puntuale di un campione 99, in cui una pluralità di fasci 19 di luce vengono concentrati su un piano di fuoco a del campione in modo da individuare zone illuminate del piano di fuoco, disposte secondo una distribuzione o reticolato (pattern), tipicamente un reticolato ordinato. Ad esempio, tali zone illuminate sono ordinate secondo righe e colonne;

— scansione del campione con tale illuminazione multipuntuale, spostando lateralmente il reticolato in un insieme di posizioni (u,v) del reticolato rispetto al campione, in modo da illuminare zone distinte, interposte tra quelle illuminate in precedenza. Ad esempio, la scansione può essere eseguita secondo direzioni, per semplicità anch'esse indicate con u,v, parallele al piano di fuoco a;

— per ciascuna posizione (u,v) assunta dal reticolato, acquisizione di un'immagine preliminare descritta da una funzione Iu,v(x,y) che rappresenta la distribuzione dell'intensità luminosa sul sensore di immagini, al variare della posizione (u,v). Nella scansione si ottiene quindi un insieme di tali immagini preliminari 52;

— calcolo di un'immagine finale I(x,y) da tali immagini preliminari, mediante un algoritmo che combina le immagini. La scelta dell'algoritmo viene compiuta in modo da riprodurre nel modo più fedele possibile i dettagli del campione .

In particolare, in EP0833181 sono stati descritti alcuni procedimenti per il calcolo di immagini di microscopia video-confocale, in cui si ricorre ad algoritmi come:

— I(x,y) = K [max (x,y) - min(x,y) - 2Avg(x,y)],

in cui max (x,y), min(x,y) e Avg(x,y), per ogni zona illuminata, sono immagini formate, rispettivamente, dai valori massimi, minimi e medi di luminosità tra le zone illuminate corrispondenti delle immagini acquisite, e K è un fattore di guadagno dipendente dalla forma delle zone illuminate .

In EP0833181 è inoltre descritto un dispositivo di microscopia video-confocale per ottenere le immagini preliminari, compiendo la scansione secondo u e v in modo sincronizzato, con il dispositivo predisposto per la modulazione spaziale dell'illuminazione.

I metodi descritti, come altri di tecnica antecedente, hanno tuttavia alcune limitazioni, che la presente invenzione si propone di superare, in modo da estendere l'impiego della microscopia ottica videoconfocale a vari campi della tecnica, in cui essa potrebbe proporsi come alternativa più semplice ed economica rispetto ad altre tecniche di microscopia in fluorescenza, riflessione ed eventualmente in trasmissione.

Infatti, sia la presenza di rumore, sia un numero di immagini preliminari non abbastanza alto può causare artefatti, noti come "patterning", che sono in grado di degradare le prestazioni.

D'altra parte, un aumento della densità di scansione comporta un aumento dei tempi di analisi ed anche possibili fotomodificazioni del campione preso in esame. Tali limitazioni impongono di limitare la densità di scansione a valori ragionevoli.

Inoltre, le tecniche confocali e video-confocali in uso sono in grado di offrire un potere risolutivo assiale molto inferiore al potere risolutivo laterale, anche alle più alte aperture. Tale limitazione dipende dai fenomeni di diffrazione e della stessa configurazione a campo-lontano del microscopio. Tutto ciò impedisce, assieme ad altre cause, di ottenere sezioni ottiche adeguatamente sottili, che sono indispensabili per studiare in modo accurato le caratteristiche tridimensionali di oggetti spessi.

In generale, un aumento del potere risolutivo spaziale è uno scopo desiderabile per applicazioni nella ricerca e nella routine, soprattutto in biologia e in medicina, tipicamente in oftalmologia, dermatologia, endoscopia, ma anche nello studio dei materiali in campi specifici come microelettronica, nanotecnologie, superfici lavorate, nell'ambito delle prove non distruttive ed altre applicazioni ancora.

Sintesi dell'invenzione

È quindi scopo dell'invenzione fornire un metodo e un dispositivo di microscopia video-confocale avente un potere risolutivo migliore di quanto possibile con metodi e dispositivi di tecnica nota.

È inoltre scopo della presente invenzione fornire un metodo e un dispositivo di microscopia video-confocale che permetta una migliore risoluzione spaziale anche se nelle immagini preliminari è presente rumore di qualsiasi origine.

È altresì scopo della presente invenzione fornire un metodo e un dispositivo di microscopia video-confocale che permetta una migliore risoluzione spaziale anche a partire da un numero limitato di immagini preliminari.

È un altro scopo della presente invenzione fornire un metodo e dispositivo di microscopia video-confocale che abbiano potere risolutivo assiale prossimo al potere risolutivo laterale, o in cui il potere risolutivo assiale differisca dal potere risolutivo radiale meno di quanto differisce nella tecnica nota.

È poi uno scopo della presente invenzione fornire un metodo e dispositivo di microscopia video-confocale che permetta di ottenere i risultati sopra descritti con una densità di scansione relativamente bassa.

Questi e altri scopi sono raggiunti da un metodo perfezionato di microscopia video-confocale per produrre un'immagine di una sezione ottica di un campione, il metodo comprendendo le fasi di:

— illuminazione di un campione con una pluralità di fasci di luce di illuminazione concentrati su una pluralità di zone illuminate su un piano di illuminazione α0scelto in corrispondenza della sezione ottica, tali zone illuminate essendo disposte secondo un reticolato, ordinato o casuale; — scansione del campione con tali fasci di illuminazione sul piano di illuminazione, la fase di scansione comprendendo una traslazione del reticolato secondo direzioni u,v parallele al piano di illuminazione, portando successivamente il reticolato in un insieme di posizioni sul piano di illuminazione, portando successivamente il reticolato in un insieme di posizioni sul piano di illuminazione, in modo da illuminare zone distinte, interposte tra quelle illuminate in precedenza, la scansione avendo una densità di scansione predeterminata; — per ciascuna posizione u,v del reticolato sul piano di illuminazione, raccolta della luce riemessa dal campione in un campo comprendente le zone illuminate, per effetto dei fasci di illuminazione. La luce riemessa dal campione può essere luce riflessa e/o trasmessa e/o fluorescente proveniente dal campione;

— per ciascuna posizione del reticolato, acquisizione di immaqini preliminari in un sensore di immaqini, ciascuna immaqine preliminare essendo descritta da una funzione Ιu,v(Χ,Υ) di distribuzione dell'intensità luminosa sul sensore di immaqini;

— calcolo di un'immaqine finale IAh(x,y) a partire dalle immaqini preliminari Iu,v(x,y).

In un primo aspetto dell'invenzione, la fase di calcolo dell 'immaqine finale comprende l'esecuzione di un alqoritmo che prevede il calcolo di almeno un parametro che descrive la distribuzione delle intensità luminose, anziché il calcolo di un valore di almeno un momento centrale di ordine >3 della distribuzione dell'intensità luminosa.

Il metodo ricorre quindi a parametri meno analitici rispetto alla tecnica antecedente, sopra descritta, in cui si ricorre a massimi, minimi e medie delle funzioni di distribuaizone .

Il momento centrale è definito come:

in cui:

— h è un numero intero >3;

— Avgu,v(x,y)) è la media della distribuzione di intensità I.,v(x,y), cioè è uguale a (∑u,VIU,v (x,y))/ (UxV), u=l...U,v=l...V.

I fasci di illuminazione possono includere radiazioni di lunghezza d'onda compresa tra l'infrarosso e il lontano ultravioletto, pertanto l'espressione "luce" è da intendere in senso lato, comprendendo radiazioni anche esterne al campo del visibile. Pertanto, anche l'espressione "microscopia", e simili, come intesa in questo testo, può avere un significato più vasto includendo tecniche per la raccolta di immagini, cioè tecniche di imaging, ad elevata risoluzione, con riferimento alla lunghezza d'onda della radiazione impiegata.

In una forma realizzativa, tale algoritmo è espresso dalla relazione:

In altre parole, in tale forma realizzativa l'immagine finale IAh(x,y) è ottenuta eseguendo per ciascun elemento del sensore di immagini, o pixel, di coordinate x,y il rapporto tra:

— il valore di un momento centrale mh(x,y) di ordine h>3 della distribuzione delle intensità, al variare della posizione del reticolato secondo u,v, e

— una potenza della varianza m2(x,y) di tale distribuzione, con esponente (h-l)/2.

II valore del momento centrale può essere calcolato ricorrendo direttamente alla [1], oppure mediante formule di trasformazione tra momenti semplici e momenti centrali, note ad un tecnico del ramo cui si riferisce l'invenzione.

I momenti considerati, di ordine h>3, contengono informazioni sull'andamento della distribuzione della luminosità, in modo da tenere conto della simmetria di tale distribuzione .

L'impiego di valori di momenti centrali della distribuzione dell'intensità luminosa per calcolare l'immagine finale, secondo l'invenzione, permette di ottenere prestazioni migliori di quelle consentite dai metodi di tecnica nota.

Ad esempio, la fase di calcolo dell'immagine finale avviene attraverso un algoritmo definito dalla formula [2], in cui h=3, cioè mediante la formula:

Infatti, si è osservato che la formula [3] consente di ottenere immagini con migliore risoluzione spaziale rispetto alla tecnica nota, e più immuni sia da fluttuazioni casuali che da possibili effetti di "patterning" dovuti a incoerenza spaziale tra il reticolato di scansione e quello corrispondente agli elementi del sensore di immagini, della scansione a passi discreti, fenomeni di Moiré eccetera. Più in dettaglio, si ottengono immagini che hanno una risoluzione paragonabile o superiore alla risoluzione consentita dalle tecniche note, in cui l'immagine finale è ottenuta, per esempio, attraverso la funzione:

I(x,y) = K [max (x,y) - min(x,y) - 2Avg(x,y)].

Ad esempio, la fase di calcolo dell'immagine finale può avvenire attraverso un algoritmo definito ancora dalla formula [2], in cui l'ordine h è un numero intero dispari >5. Come anticipato, i momenti di ordine h dispari, in generale, tengono conto dell'asimmetria della distribuzione. Inoltre, a condizione che la densità di scansione e il rapporto segnale-rumore siano superiori a determinati valori, tali momenti di ordine superiore permettono di ottenere informazioni via via più dettagliate al crescere dell'ordine h, per densità di scansione opportunamente elevate.

In particolare, la fase di calcolo dell'immagine finale avviene attraverso un algoritmo definito dalla formula [2], in cui l'ordine h è scelto tra 5, 7 e 9, ossia tale fase di calcolo avviene attraverso una formula scelta tra:

Infatti, l'andamento caratteristicamente asimmetrico della distribuzione delle intensità IU;V(x,y) è sensibile alla presenza di materiale particolarmente localizzato nella posizione osservata.

In una possibile forma realizzativa, tale algoritmo è espresso da una combinazione di valori di momenti centrali della distribuzione di intensità luminosa, in particolare da una combinazione lineare espressa dalla relazione:

dove:

H',H" sono numeri interi,

Ci sono coefficienti;

- mi(x,y) è il valore di un momento centrale di ordine i della distribuzione dell'intensità luminosa;

L'uso della combinazione lineare definita dalla [7] si dimostra particolarmente utile per minimizzare gli effetti di patterning dovuti a effetti di Moiré e alla scansione a passi discreti.

Naturalmente, anche nel caso delle formule [3]-[7] i valori dei momenti centrali possono essere calcolati ricorrendo direttamente alla [1], oppure mediante le formule di trasformazione tra momenti semplici e momenti centrali, sopra menzionate.

In un particolare aspetto dell'invenzione, il metodo comprende una fase di:

— scelta di una pluralità di ulteriori piani di illuminazione exjin prossimità della sezione ottica esaminata, comprendenti almeno due ulteriori piani di illuminazione disposti da parti opposte rispetto alla sezione ottica, gli ulteriori piani di illuminazione avendo rispettive distanze djdalla sezione ottica inferiori a una distanza massima predeterminata,

in cui, per ciascun ulteriore piano di illuminazione αj, il metodo comprende fasi di:

— illuminazione del campione con una pluralità di fasci di luce di illuminazione concentrati su una pluralità di zone illuminate di ciascun ulteriore piano di illuminazione, tali zone illuminate essendo disposte secondo un rispettivo reticolato, ordinato o casuale; — scansione del campione con tali fasci di illuminazione sul piano di illuminazione, comprendente una traslazione del rispettivo reticolato secondo direzioni u,v parallele all'ulteriore piano di illuminazione cxj, portando successivamente il rispettivo reticolato in un insieme di posizioni sull'ulteriore piano di illuminazione;

— per ciascuna posizione (u,v,Wj)del rispettivo reticolato sull'ulteriore piano di illuminazione, raccolta della luce riemessa dal campione in un campo comprendente le zone illuminate dell'ulteriore piano di illuminazione, per effetto di tali fasci di illuminazione;

— per ciascuna posizione del rispettivo reticolato, acquisizione di ulteriori immagini preliminari, ciascuna ulteriore immagine preliminare essendo descritta da una funzione Iu,v,Wj(x,y) di distribuzione dell'intensità luminosa sul sensore di immagini;

— calcolo di un'immagine di passaggio IAh,j(x,y) associata all'ulteriore piano di illuminazione, a partire dalle rispettive ulteriori immagini preliminari,

in cui la fase di calcolo di un'immagine di passaggio comprende l'esecuzione di un algoritmo che prevede il calcolo di un valore di un momento centrale di ordine >3 della distribuzione dell'intensità luminosa.

Per analogia con la [1], in questo caso il momento centrale di ordine h può essere calcolato in base alla definizione, ossia attraverso la formula:

<m>h,j(X/y)= Avg{ [ Iu,v,Wj(X,y)- Avg (Iu,v,w(x,y))]<h>} [1'];

in cui

— h è un numero intero >3;

— Avg (Iu,v,Wj (X/y)) è la media della distribuzione di intensità,

u=l...U,v=l...V, per ciascun ulteriore piano di illuminazione exj,

in cui, alternativamente, il valore del momento centrale può essere calcolato mediante le formule di trasformazione tra momenti semplici e momenti centrali sopra ricordate;

— calcolo di un'immagine finale IB(x,y) come una combinazione delle immagini di passaggio.

Vantaggiosamente, la distanza massima degli ulteriori piani di illuminazione dalla sezione ottica è dello stesso ordine di grandezza della lunghezza d'onda della radiazione dei fasci di illuminazione.

In una forma realizzativa vantaggiosa, è prevista una fase di traslazione di un medesimo reticolato secondo una direzione w trasversale rispetto alla sezione ottica, in particolare secondo una direzione ortogonale alla sezione ottica, in cui tale medesimo reticolato viene spostato sequenzialmente tra il piano di illuminazione disposto in corrispondenza della sezione ottica e ciascuno di degli ulteriori piani di illuminazione oq, e detta fase di scansione del campione è eseguita in successione lungo ciascuno di detti piani di illuminazione.

In particolare, detta pluralità di ulteriori piani di illuminazione comprende solo i due ulteriori piani di illuminazione ou,04 disposti da parti opposte rispetto alla sezione ottica, in particolare a distanze sostanzialmente uguali dalla sezione ottica.

In tal caso, la combinazione delle immagini di passaggio è preferibilmente definita dalla relazione:

IB(x,y) = IA (x,y) - k |lA_(x,y)- IA+(x,y) | [8]

in cui IA_(x,y) e IA+(x,y) sono immagini di passaggio riferite ai due piani α-,α+da parti opposte rispetto alla sezione ottica e k è un coefficiente di correzione compreso preferibilmente tra 0,5 e 1.

Ad esempio, le immagini di passaggio possono essere calcolate in particolare con formule analoghe alla [2]:

dove mh+(x,y) e mh_(x,y) sono valori dei momenti centrali di ordine h di distribuzioni di intensità luminosa, provenienti rispettivamente dagli ulteriori piani di illuminazione α- e α+, e

In alternativa, le immagini di passaggio possono essere calcolate mediante rispettive combinazioni di valori di momenti centrali della distribuzione di intensità luminosa, in particolare combinazioni lineari espresse da formule derivate dalla [7]:

dove mi+(x,y) e mi-(x,y) sono valori dei momenti centrali di ordine i di distribuzioni di intensità luminosa, provenienti rispettivamente dagli ulteriori piani di illuminazione α- e α+.

L'impiego di immagini di passaggio comprendenti immagini riferite a piani sopra fuoco e sotto fuoco per calcolare l'immagine finale permette di ottenere una risoluzione assiale migliore di quella consentita dai metodi di tecnica nota.

Si amplia così non solo la quantità ma anche la qualità delle informazioni che si raccolgono in funzione dello spostamento non solo laterale ma anche assiale dell'illuminazione, cioè attorno alla posizione di fuoco ottimale. Si ottengono infatti sezioni ottiche sensibilmente più sottili di quanto è possibile ottenere con i procedimenti di tecnica nota. Ciò è particolarmente vantaggioso nello studio di oggetti spessi.

Ad esempio, la fase di calcolo dell'immagine finale avviene attraverso un algoritmo definito dalla formula [8], in cui h=3, ossia mediante la formula:

In altri casi esemplificativi, la fase di calcolo dell'immagine finale avviene attraverso un algoritmo definito dalla formula [8], in cui h è un numero intero dispari >5. Anche in questo caso, se la densità di scansione e il rapporto segnale-rumore sono abbastanza elevati, l'uso di valori di momenti centrali e di immagini di passaggio di ordine superiore permette di ottenere risoluzioni laterali più dettagliate al crescere dell'ordine h. In particolare, la fase di calcolo dell'immagine finale avviene attraverso un algoritmo definito dalla formula [2], in cui h è scelto tra 5, 7 e 9.

In altre forme realizzative ancora, la fase di calcolo dell'immagine finale avviene attraverso un algoritmo definito dalla formula [7]:

In un secondo aspetto dell'invenzione, gli scopi sopra indicati sono raggiunti da un metodo perfezionato di microscopia video-confocale per produrre un'immagine di una sezione di interesse di un campione, il metodo comprendendo fasi di:

— scelta di una pluralità di piani di illuminazione Pjin prossimità della sezione di interesse esaminata, comprendenti almeno due piani di illuminazione β_,β+disposti da parti opposte rispetto alla sezione di interesse, tali piani di illuminazione di avendo rispettive distanze djdalla sezione di interesse inferiori a una distanza massima predeterminata;

— per ciascun piano di illuminazione βj, fasi di:

— illuminazione del campione con una pluralità di fasci di luce di illuminazione concentrati su una pluralità di zone illuminate di ciascun piano di illuminazione, dette zone illuminate essendo disposte secondo un rispettivo reticolato, ordinato o casuale; — scansione del campione con tali fasci di illuminazione sul piano di illuminazione, comprendente una traslazione del rispettivo reticolato secondo direzioni (u,v) parallele al piano di illuminazione βj, portando successivamente il rispettivo reticolato in un insieme di posizioni sul piano di illuminazione;

— per ciascuna posizione (u,v,Wj)del rispettivo reticolato sul piano di illuminazione, raccolta della luce riemessa dal campione in un campo comprendente le zone illuminate del piano di illuminazione, per effetto di detti fasci di illuminazione;

— per ciascuna posizione del rispettivo reticolato, acquisizione di un rispettivo insieme di immagini preliminari in un sensore di immagini, ciascuna immagine preliminare di tale insieme essendo descritta da una funzione Iu,v,Wj(X/Y) di distribuzione dell'intensità luminosa sul sensore di immagini;

— calcolo di un'immagine di passaggio Ih,j(x,y) associata al piano di illuminazione a partire dal rispettivo insieme di immagini preliminari;

Vantaggiosamente, tale distanza massima è dello stesso ordine di grandezza della lunghezza d'onda della luce dei fasci di illuminazione.In una possibile forma realizzativa, è prevista una fase di traslazione di un medesimo reticolato secondo una direzione w trasversale rispetto alla sezione di interesse, in particolare secondo una direzione ortogonale alla sezione di interesse, in cui tale medesimo reticolato viene spostato sequenzialmente tra i piani di illuminazione βj, e la fase di scansione del campione è eseguita in successione su ciascun piano di illuminazione .

Preferibilmente, detta pluralità di piani di illuminazione comprende un piano di illuminazione scelto in corrispondenza della sezione di interesse.

In particolare, detta pluralità di piani di illuminazione comprende, ad una distanza predeterminata da detta sezione di interesse, solo detti due piani di illuminazione disposti da parti opposte rispetto alla sezione di interesse, in particolare a distanze sostanzialmente uguali dalla sezione di interesse.

In tal caso, la combinazione è preferibilmente definita dalla relazione:

in cui I(x,y) è un'immagine calcolata in corrispondenza del piano di illuminazione βο, mentre I_(x,y) e I+(x,y) sono immagini di passaggio riferite ai due piani β_,β+da parti opposte rispetto alla sezione di interesse, e k sono coefficienti di correzione compreso preferibilmente tra 0,5 e 1.

Le immagini di passaggio possono essere calcolate con un algoritmo scelto tra gli algoritmi noti dai metodi di microscopia confocale e video-confocale, come gli algoritmi noti da EP 0833181, ad esempio mediante la formula:

I(x,y) = K [max (x,y) - min(x,y) - 2Avg(x,y)],

e analoghe per I_(x,y),1+ (x,y), oppure con un algoritmo definito dalla formula:

con il significato dei simboli chiarito in precedenza, e analoghe per I_(x,y), I+(x,y).

In alternativa, le immagini di passaggio sono calcolate con un algoritmo definito da formule derivate dalla [2], ossia dalle formule:

In alternativa, le immagini di passaggio sono calcolate come combinazioni lineari di momenti centrali della distribuzione di intensità luminosa, in particolare sono calcolate con un algoritmo definito dalle formule derivate dalla [7]:

Come già anticipato, più in generale, l'impiego di immagini di passaggio comprendenti immagini riferite a piani sopra fuoco e sotto fuoco per calcolare l'immagine finale, secondo l'invenzione, permette di ottenere una risoluzione assiale migliore di quella consentita dai metodi di tecnica nota.

Anche in questo caso, la luce riemessa dalle zone illuminate del piano di illuminazione possono essere fasci di luce riflessa e/o trasmessa e/o fluorescente dal campione in corrispondenza di tali zone illuminate.

Gli scopi sopra indicati sono altresì raggiunti da un apparato di microscopia video-confocale comprendente:

— mezzi per posizionare un campione;

— mezzi per generare una pluralità di fasci di luce di illuminazione ;

— mezzi per concentrare i fasci di luce di illuminazione su una pluralità di zone illuminate di un piano di illuminazione definito in prossimità di detti mezzi per posizionare detto campione, le zone illuminate essendo disposte secondo un reticolato, ordinato o casuale;

— mezzi di scansione comprendenti mezzi per traslare il reticolato secondo direzioni parallele al piano di illuminazione, atti a portare successivamente il reticolato in un insieme di posizioni sul piano di illuminazione;

— un sensore di immagini, ossia mezzi per raccogliere la luce riemessa dal campione in un campo comprendente le zone illuminate del piano di illuminazione, l'apparato essendo configurato per ricevere luce riemessa come luce riflessa e/o trasmessa e/o fluorescente dal campione;

— mezzi per formare, per ciascuna posizione del reticolato, un'immagine preliminare a partire dalla luce riemessa, ciascuna immagine preliminare essendo descritta da una funzione di distribuzione dell'intensità luminosa sul sensore di immagini;

— mezzi di calcolo per calcolare un'immagine finale a partire da tali immagini preliminari;

le caratteristiche essenziali di tale apparato essendo che i mezzi di scansione comprendono inoltre mezzi di traslazione assiale per traslare il reticolato secondo una direzione trasversale rispetto al piano di illuminazione, in particolare secondo una direzione ortogonale al piano di illuminazione, portando il reticolato su una pluralità di ulteriori piani di illuminazione situati a rispettive distanze inferiori a una distanza massima predeterminata, e che i mezzi di calcolo comprendono mezzi per calcolare una combinazione di più immagini di passaggio calcolate a partire da rispettivi insiemi di immagini preliminari di rispettivi piani di illuminazione.

In particolare, i mezzi di calcolo sono configurati per creare una combinazione (57) di immagini di passaggio di solo due ulteriori piani di illuminazione disposti da parti opposte rispetto ad un piano di illuminazione predeterminato, in particolare distanze sostanzialmente uguali dal piano di illuminazione, la combinazione essendo definita dalla relazione:

in cui I(x,y) è un'immagine calcolata in corrispondenza del piano di illuminazione β0, mentre I_(x,y) e I+(x,y) sono immagini di passaggio riferite a due ulteriori piani β_,β+disposti da parti opposte rispetto al piano β0, e k sono coefficienti di correzione compreso preferibilmente tra 0,5 e 1.

Breve descrizione dei disegni

1/ invenzione verrà di seguito illustrata con la descrizione di forme realizzative del metodo e del dispositivo secondo l'invenzione, fatta a titolo esemplificativo e non limitativo, con riferimento ai disegni annessi, in cui:

— la figura 1 mostra schematicamente un sistema di microscopia video-confocale;

— le figure 2,3,3' mostrano dettagli del sistema di microscopia di figura 1;

— la figura 4 è un'immagine di una sezione ottica di un campione ottenuta mediante microscopia video-confocale secondo la tecnica nota, in cui l'acquisizione delle immagini grezze è avvenuta in sostanziale assenza di rumore casuale ;

— la figura 5 mostra un'immagine della medesima sezione ottica di figura 4 ottenuta con il metodo secondo una forma realizzativa dell'invenzione;

— la figura 6 mostra un'immagine della medesima sezione ottica di figura 4 ottenuta con il metodo secondo un'altra forma realizzativa dell'invenzione;

— la figura 7 è un'immagine di una sezione ottica di un campione ottenuta mediante microscopia video-confocale secondo la tecnica nota, in cui l'acquisizione delle immagini grezze è avvenuta in sostanziale assenza di rumore casuale ;

— la figura 8 mostra un'immagine della medesima sezione ottica di figura 6 ottenuta con il metodo secondo la forma realizzativa dell'invenzione con cui è ottenuta la figura 5;

— la figura 9 mostra un' immagine della medesima sezione ottica di figura 6 ottenuta con il metodo secondo la forma realizzativa dell'invenzione con cui è ottenuta la figura 6;

— le figure 10-13 sono immagini della medesima sezione ottica di figura 4 ottenute con il metodo secondo alcune forme realizzative dell'invenzione;

— le figure 14-17 sono immagini della medesima sezione ottica di figura 7 ottenute con il metodo secondo le forme realizzative dell'invenzione con cui sono ottenute le immagini delle figure 10-13;

— le figure 18-20 mostrano proiezioni piane di immagini di passaggio impiegate in un metodo, secondo un altro aspetto dell'invenzione, per comporre un'immagine tridimensionale di un campione;

— la figura 21 mostra proiezioni piane di un'immagine del campione delle figure 18-20 ottenuta combinando le immagini di passaggio di tali figure;

— la figura 22 mostra le immagini tridimensionali, in prospettiva, delle figure 18-21.

Descrizione di forme realizzative preferite

Con riferimento alle figure 1 e 2, viene descritto un apparato 100 per ottenere un'immagine di una sezione ottica n di un campione 99, brevemente un microscopio videoconfocale secondo l'invenzione. L'apparato 100 comprende elementi presenti negli apparati di tecnica nota. La figura 1 si riferisce a un apparato per microscopia in riflessione, tuttavia rientrano nella presente invenzione anche schemi ottici idonei per l'analisi di campioni per trasmissione e/o per fluorescenza, con modifiche dell'apparato che sono evidenti per un tecnico del ramo.

L'apparato 100 comprende mezzi 10 per generare una pluralità di fasci di luce di illuminazione 19. In una forma realizzativa, i mezzi 10 per generare i fasci di illuminazione 19 comprendono una sorgente di luce 11 ed un ottica di concentrazione 12 associata alla sorgente 11, atta a convogliare la luce emessa dalla sorgente 11 in un unico fascio di luce 13.

Nella forma realizzativa rappresentata, i mezzi 10 per generare i fasci di luce 19 comprendono inoltre un diaframma 14 a matrice di fori 14' che è in grado di trasformare un fascio di luce incidente su una propria faccia in un pluralità di fasci di luce paralleli in uscita dalla faccia opposta. Il diaframma 14 è disposto in modo da ricevere su una propria faccia, nascosta nella rappresentazione di figura 1, il fascio di luce 13 proveniente dal collimatore 12, per cui il fascio di luce 13 viene trasformato nella pluralità di fasci di illuminazione 19, disposti secondo una matrice o reticolato .

L'apparato 100 comprende poi un divisore di fascio 16 atto a e disposto per ricevere i fasci di luce 19, per cui i fasci di luce 19 vengono deviati verso un supporto 90 idoneo a ricevere il campione 99.

L'apparato 100 comprende inoltre mezzi 20 per concentrare i fasci di luce 19 in una pluralità di zone 17 di un piano di illuminazione β, corrispondente, nella forma realizzativa mostrata in figura 1, alle zone 14' definite nel sistema di illuminazione. Nel caso di figura 1, è mostrato un campione 99 disposto sul supporto 90, per cui il piano di illuminazione β attraversa una regione da osservare del campione 99, in particolare il piano β è disposto in corrispondenza di una sezione ottica di interesse del campione 99.

L'apparato 100 comprende poi mezzi di acquisizione di luce in campo largo, tipicamente un sensore fotoelettrico di immagini 40, quale un sensore bidimensionale CCD.

Indicheremo con x,y, le coordinate di un piano definito da tale sensore bidimensionale.

L'apparato 100 è provvisto di mezzi 30',30" per eseguire una scansione della regione da osservare del campione 99, o della sezione ottica n del campione 99. Nella forma realizzativa rappresentata, i mezzi di scansione comprendono mezzi 30', non mostrati in dettaglio, per causare un moto traslatorio relativo del diaframma 14 rispetto al gruppo costituito dalla sorgente 10 e dal collimatore 12, ad esempio secondo due direzioni u',v' di allineamento dei fori 14' del diaframma 14. Ad esempio, i mezzi per causare moto traslatorio possono comprendere motori a passi. Per effetto della deviazione dei raggi 19 operata dal divisore di fascio 16, alle direzioni di traslazione u',v' del diaframma 14 corrispondono direzioni u,v di traslazione del reticolato di luce 18 sul piano di illuminazione β.

In alternativa al diaframma 14, in una forma realizzativa non rappresentata, i mezzi 10 per generare i fasci di illuminazione 19 e i mezzi di scansione 30' possono comprendere un dispositivo optoelettronico a valvole di luce a cristalli liquidi (LCD), e anche altri dispositivi privi di parti meccaniche in movimento quali array di emettitori di luce programmabili con opportuni segnali.

Con riferimento ora alla figura 2, sono inoltre previsti mezzi di scansione 30", secondo l'invenzione, per causare uno spostamento del reticolato 18 rispetto al piano di illuminazione β, secondo una direzione trasversale w rispetto a quest'ultimo, in particolare secondo una direzione w ortogonale alle direzioni u,v, cioè ortogonale al generico piano di illuminazione β, per portare il reticolato 18 su una pluralità di ulteriori piani di illuminazione βisituati a rispettive distanze δidal piano di riferimento βο. Le distanze δ± hanno lo stesso ordine di grandezza della lunghezza d'onda λ della radiazione che forma i raggi di illuminazione 19. Almeno due di tali piani di illuminazione β±si trovano da parti opposte rispetto ad un piano di riferimento βο, indicato in figura 2. Il piano di riferimento βο può essere disposto in corrispondenza della sezione ottica ovvero della sezione ottica di interesse n.

Con riferimento nuovamente alla figura 1, il sensore fotoelettrico 40 è disposto in modo da ricevere, in ciascuna posizione del reticolato 18 rispetto a un piano β, una radiazione 21 riemessa dal campione 99 in un campo comprendente le zone illuminate del piano di illuminazione β, in risposta ai fasci di illuminazione 19. Come anticipato, la luce può essere riemessa per trasmissione, per riflessione o per fluorescenza, con adattamenti della disposizione del sensore 40 rispetto ai mezzi di supporto 90 che sono ovvi per un tecnico del ramo.

Il funzionamento di una siffatta disposizione, come pure quello di una disposizione comprendente i mezzi alternativi di scansione sopra citati, è ben noto ad un tecnico del ramo e non si ritiene necessaria una spiegazione dettagliata.

L'apparato 100 comprende inoltre mezzi di calcolo 50, più in dettaglio comprende mezzi 51 per formare un insieme di immagini preliminari 52, ciascuna delle quali è descritta da una funzione Iu,v,Wj (x,y), in cui la terna di pedici u,v,v\n indica la posizione del reticolato 18 rispetto al piano di riferimento βο.

I pedici u,v indicano la posizione laterale, ossia raggiungibile mediante un movimento di tipo traslatorio del reticolato 18 parallelamente al piano di riferimento β0. I pedici u,v assumono valori dipendenti dalle caratteristiche di scansione dei mezzi di scansione 30', in particolare assumono una pluralità di valori compresi tra 0 e U,V, rispettivamente, in cui 0 indica una determinata posizione del reticolato sul piano β, mentre U,V indicano posizioni in cui ciascun fascio ha coperto l'intera distanza, meno un passo, tra tale posizione e una posizione di un nodo contiguo del reticolato 18 sul piano β rispettivamente secondo le direzioni x,y. In particolare, i pedici u,v assumono s-1 e t-1 valori rispettivamente compresi tra 0 e U e tra 0 e V, dove U e V sono il passo del reticolato 18 secondo le direzioni u,v, e s,t sono le densità di scansione nelle due direzioni u,v.

Il pedice Wjindica la distanza assiale del reticolato 18 rispetto al piano βο, ossia indica la posizione dei piani β±raggiungibili mediante un movimento di tipo traslatorio del reticolato 18 secondo la direzione w trasversale o assiale rispetto al piano di riferimento βο, in particolare secondo una direzione perpendicolare al piano di riferimento βο. Il pedice Wjassume i valori δ-2,δ-ι,δο,δ+ι,δ+2, secondo la convenzione adottata in figura 2.

Come anticipato, in una forma realizzativa il piano di riferimento βο è disposto in corrispondenza della sezione ottica n di interesse del campione 99. Come mostra la figura 3, i piani β±possono essere in numero di 2, disposti pertanto da parti opposte rispetto al piano di riferimento β.

Il valore assoluto di -δι,+δ2, o più brevemente δ, è dell'ordine di grandezza della lunghezza d'onda della radiazione dei fasci di illuminazione.

I mezzi di calcolo 50 comprendono altresì mezzi 55 per calcolare una pluralità di immagini di passaggio 56 a partire da ciascun insieme di immagini preliminari iu,v,Wj(xty)■

Secondo l'invenzione, i mezzi di calcolo 50 comprendono anche mezzi di combinazione (57) di immagini 57 per creare un' immagine finale 58 come una combinazione di più immagini di passaggio. Ad esempio, nel caso di figura 3, I mezzi di combinazione (57) di immagini 57 sono atti a combinare tre immagini di passaggio 56' ,56",56"', rappresentate da rispettive funzioni di distribuzione I(x,y), I_(x,y), I+(x,y) e corrispondenti nell' ordine al piano di illuminazione sotto fuoco β_, al piano di illuminazione di riferimento a fuoco βο, cioè disposto in corrispondenza della sezione ottica di interesse n, e al piano di illuminazione sopra fuoco β+sopra fuoco. Ad esempio, i mezzi di combinazione 57 sono atti a calcolare l'immagine finale 58 ricorrendo alla correlazione

La forma delle immagini di passaggio I(x,y), I_(x,y), I+(x,y), ossia l'algoritmo impiegato per costruire le immagini di passaggio 56',56", 56'" può essere un qualsiasi algoritmo noto per creare immagini a partire da immagini preliminari grezze 52, ad esempio uno degli algoritmi descritti in EP 0833181 e US 6,016,367.

In alternativa, l'algoritmo impiegato per costruire le immagini di passaggio 56', 56",56'" può essere definito dalla formula:

e analoghe per I_(x,y),1+(x,y), dove

— m2(x,y)= Avg{ [ Iu,v(x,y)- Avg (Iu,v(x,y))]<2>};

— mh(x,y)= Avg{ [ Iu,v(x,y)- Avg (Iu,v(x,y))]<h>};

— h è un numero intero ≥3;

— Avg (Iu,v(x,y))è la media della distribuzione di intensità Iu,v(x,y)= UxV, u=l...U,v=l...V, In alternativa, l'algoritmo impiegato per costruire le immagini di passaggio può essere definito dalla formula:

oppure dalla formula:

e analoghe per I_(x,y),I+(x,y), con significato dei simboli ormai chiaro dalla lettura di questo testo.

Esemp i

Vengono di seguito descritti alcuni esempi di immagini ottenute con il metodo secondo l'invenzione. Tali immagini confermano i miglioramenti sostanziali nelle prestazioni consentiti dall'invenzione, in termini di risoluzione spaziale, sia laterale che assiale.

Le figure dalla 4 alla 17 riportano immagini di una sezione ottica di un campione costituito da un grano di polline fluorescente del diametro approssimativo di 15 pm, ottenute con tecniche di microscopia video-confocale. Le immagini grezze o preliminari sono state ottenute con un obiettivo planapocromatico avente N.A. 1,4, con eccitazione attorno a 450 nm ed emissione attorno a 520 nm.

In un esempio, si ottengono immagini utilizzando valori di momenti centrali della distribuzione delle intensità luminose, ad esempio attraverso le formule che definiscono tali valori di momenti centrali:

m cui:

— h è un numero intero >3;

— Avg (IU(V(x,y)) è la media della distribuzione di intensità

e in cui l'immagine finale è ottenuta con la formula:

Tale tecnica ha permesso di raggiungere una risoluzione spaziale migliore di 80 nm, sia nel caso di campioni compatti che di campioni sparsi.

Ciò corrisponde a fattori di superrisoluzione laterale intorno a 3 a fattori di superrisoluzione assiale intorno a 7. Si osserva che le prestazioni raggiunte in applicazioni anche diverse sono comparabili o superiori alle prestazioni dichiarate dai fabbricanti di strumenti di nuova concezione, che hanno tuttavia un alto costo e una limitata versatilità.

In figura 4 è riportata, quale termine di confronto, un'immagine ottenuta con una tecnica video-confocale nota, mediante la formula di cui in EP 0833181 e US 6,016,367:

Le figure 5 e 6 riportano invece immagini della medesima sezione ottica, ottenute attraverso metodi di microscopia video-confocale secondo l'invenzione.

In particolare, la figura 5 mostra un'immagine finale ottenuta mediante la formula:

In tale figura si nota, rispetto alla figura 4, la minore presenza di artefatti dovuti a patterning e a rumore deterministico, quali effetti di Moiré e simili. Ciò è particolarmente evidente confrontando le regioni 24,25 dell'immagine di figura 5 con le corrispondenti regioni 22,23 dell'immagine di figura 4.

Un ulteriore miglioramento, rispetto all'immagine di figura 5, è ottenuto mediante una combinazione di valori di momenti di ordine diverso. In figura 6 è riportata un'immagine ottenuta attraverso l'espressione :

in cui, C5=0,48, C7=0,36, cg=0,24, ossia attraverso una combinazione lineare delle espressioni di cui alle formule [4], [5], [6]. Anche in questo caso, si osservano miglioramenti rispetto all'immagine fornita dalla tecnica convenzionale. Ciò è particolarmente evidente confrontando le regioni 26,27 dell'immagine di figura 6 con le corrispondenti regioni 22,23 dell'immagine di figura 4.

Come anticipato, la tecnica secondo l'invenzione comporta dei vantaggi, rispetto alla tecnica nota, anche in caso di immagini ottenute in presenza di rumore casuale. Ciò è mostrato nelle figure dalla 7 alla 9, che si riferiscono ancora a una sezione ottica di un campione di polline. Analogamente alla figura 3, la figura 7 riporta, quale termine di confronto, un'immagine ottenuta con una tecnica video-confocale nota, mediante la formula:

I(x,y) = K [max (x,y) - min(x,y) - 2Avg(x,y)]

in cui le immagini grezze sono state ottenute in presenza di rumore casuale.

Le figure 8 e 9 riportano invece immagini della medesima sezione ottica, ottenute attraverso un metodo di microscopia video-confocale secondo l'invenzione.

In particolare, la figura 8 mostra un'immagine ottenuta ancora con la formula [3]. Anche in questo caso, dal confronto con l'immagine di figura 7 si nota una minore presenza di artefatti confrontando, ad esempio, le regioni 35,36,37 dell'immagine di figura 8 con le corrispondenti regioni 32,33,34 dell'immagine di figura 7.

Anche in questo caso, un ulteriore miglioramento, rispetto all'immagine di figura 7, è ottenuto mediante una combinazione di valori di momenti di ordine diverso. In figura 9 è riportata un'immagine ottenuta attraverso l'espressione [7'], con i medesimi valori dei coefficienti. Anche in questo caso, si osservano miglioramenti rispetto all'immagine fornita dalla tecnica convenzionale. Ciò è particolarmente evidente confrontando le regioni 38,39,31 dell'immagine di figura 9 con le corrispondenti regioni 32,33,34 dell'immagine di figura 7.

Le figure 11, 12 e 13 riportano immagini della stessa sezione ottica ottenute rispettivamente attraverso le formule

e vengono riportate come riferimento per l'immagine di figura 6, che trae vantaggio dei contributi di tali immagini. Infatti, le immagini delle figure 11,12,13 presentano molte aree scure in quanto le immagini preliminari, su cui si basano le varie elaborazioni, sono state eseguite con una densità di scansione troppo bassa. Per confronto, in figura 10 si riporta, ridotta alle stesse dimensioni, la figura 5, ottenuta con la formula [3].

Considerazioni analoghe valgono, nell'ordine, per le figure 15, 16 e 17 ottenute da immagini grezze in presenza di rumore casuale, riportate come riferimento per l'immagine di figura 9 che ne costituisce la combinazione lineare secondo la [7']. Per confronto, in figura 14 si riporta, ridotta alle stesse dimensioni, la figura 8, ottenuta con la formula [3].

Con riferimento al secondo aspetto dell'invenzione, in cui l'immagine finale di una sezione ottica è ottenuta come una combinazione (57) di immagini di passaggio associate a rispettivi piani di illuminazione scelti in prossimità della sezione ottica, si è predisposto un campione contenente sferette sintetiche fluorescenti del diametro approssimativo di 0,5 pm. Con riferimento al procedimento illustrato in figura 3', di tale campione 99 sono state ottenute immagini tridimensionali mediante acquisizione di un adatto numero di sezioni ottiche n, n' disposte lungo un asse z ortogonale a ciascuna di tali sezioni ottiche.

Le figure dalla 18 alla 20 riportano immagini tridimensionali di passaggio ottenute, rispettivamente con piani di illuminazione riferiti ad una medesima sezione ottica, indicata con z=0. Più in dettaglio, ciascuna di tali immagini mostra proiezioni ortogonali secondo tre assi coordinati, indicate rispettivamente con (x,y), (Z,y) e (x,Z).

In particolare, la figura 19 si riferisce a proiezioni di un'immagine di passaggio ottenuta con un piano di illuminazione β disposto in corrispondenza della sezione ottica n, mentre le figure 18 e 20 si riferiscono rispettivamente a immagini di passaggio ottenute rispettivamente con piani di illuminazione β- e β+ paralleli e situati da parti opposte rispetto al piano β, a rispettive distanze δ-,δ+, del medesimo ordine di grandezza della lunghezza d'onda della radiazione impiegata. Le immagini di passaggio delle figure 18-20 sono state ottenute con un metodo descritto nella presente invenzione, secondo l'algoritmo descritto dalla formula

con il significato dei simboli sopra spiegato, anche se è possibile usare metodi video-confocali di tipo diverso, ad esempio i metodi descritti nella presente invenzione o noti nella tecnica o più in generale metodi idonei per produrre sezioni ottiche, ad esempio metodi di microscopia confocale.

La figura 21 riporta un'immagine finale ottenuta come combinazione delle immagini di passaggio mostrate nelle figure 18-20. In questo caso, l'immagine finale è stata Le immagini delle figure 18-20 sono state ottenute con un metodo di microscopia video-confocale pure ottenuta attraverso la formula:

in cui I-, I e 1+ sono funzioni che rappresentano rispettivamente le immagini di passaggio delle figure 18, 19 e 20, e k è pari a 0,8.

Dalla figura 21 si osserva un notevole miglioramento della risoluzione assiale rispetto a quanto offerto dalle immagini di passaggio delle figure 18-20. Infatti, solo nel caso di figura 21 le proiezioni (x,z) e (z,y) mostrano sostanzialmente la reale geometria delle due sferette, mentre le corrispondenti proiezioni delle immagini di passaggio delle figure 18-20 mostrano rappresentazioni di forma oblunga.

La figura 22 mostra immagini tridimensionali dell'intero volume del campione corrispondenti rispettivamente alle figure 18-21, che rappresentano invece una sezione ottica particolare del campione. Dalla figura 22 possono essere tratte le medesime conclusioni delle figure 18-21

La descrizione di cui sopra di forme realizzative dell'invenzione è in grado di mostrare l'invenzione dal o punto di vista concettuale in modo che altri, utilizzando la tecnica nota, potranno modificare e/o adattare in varie applicazioni tale forma realizzativa specifica senza ulteriori ricerche e senza allontanarsi dal concetto inventivo, e, quindi, si intende che tali adattamenti e modifiche saranno considerabili come equivalenti della forma realizzativa specifica. I mezzi e i materiali per realizzare le varie funzioni descritte potranno essere di varia natura senza per questo uscire dall'ambito dell'invenzione. S'intende che le espressioni o la terminologia utilizzate hanno scopo puramente descrittivo e, per questo, non limitativo.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Un metodo perfezionato di microscopia video-confocale per produrre un'immagine di una sezione ottica (n) di un campione (99), detto metodo comprendendo le fasi di: illuminazione di un campione (99) con una pluralità di fasci di luce di illuminazione (19) concentrati su una pluralità di zone illuminate (17) di un piano di illuminazione (OÌ0)scelto in corrispondenza di detta sezione ottica (n), dette zone illuminate (17) essendo disposte secondo un reticolato (18); scansione di detto campione (99) con detti fasci di illuminazione (19) lungo detto piano di illuminazione (oi0), detta fase di scansione comprendendo una traslazione di detto reticolato (18) secondo direzioni (u,v) parallele a detto piano di illuminazione (OÌO), portando successivamente detto reticolato (18) in un insieme di posizioni su detto piano di illuminazione (oi0) ; per ciascuna posizione di detto reticolato (18) su detto piano di illuminazione (α0), raccolta di luce riemessa (21) da detto campione (99) in un campo comprendente dette zone illuminate (17), per effetto di detti fasci di illuminazione (19), per ciascuna posizione (u,v) di detto reticolato (18), acquisizione di un'immagine preliminare (52) in un sensore (40) di immagini di coordinate (x,y), ciascuna immagine preliminare (52) essendo descritta da una funzione (IU(v(x(y)) di distribuzione dell'intensità luminosa su detto sensore di immagini (40); calcolo di un'immagine finale a partire da dette immagini preliminari (52), in cui detta fase di calcolo di detta immagine finale comprende l'esecuzione di un algoritmo che prevede il calcolo di un valore di un momento centrale di ordine ≥3 di detta distribuzione dell'intensità luminosa.
2. Un metodo come da rivendicazione 1, in cui detto algoritmo è espresso dalla relazione:

dove: H',H" sono numeri interi, Ci sono coefficienti; mi(x,y) è un valore di un momento centrale di ordine i di detta distribuzione dell'intensità luminosa; m2 (x,y)= Avg{ [ Iu,v (x,y)- Avg (Iu,v (x,y))]<2>}.
3. Un metodo come da rivendicazione 1, in cui detto algoritmo è espresso dalla relazione:

dove: m2 (x,y)= Avg{ [ Iu,v (x,y)- Avg (Iu,v (x,y))]<2>}; mh(x,y) è un valore di un momento centrale di ordine h di detta distribuzione dell'intensità luminosa.
4. Un metodo come da rivendicazione 1, in cui detto algoritmo è definito dalla formula: IA3 (x,y) = m3 (x,y)/m2 (x,y) [3] in cui m3(x,y) è un valore del momento centrale di ordine 3 di detta distribuzione dell'intensità luminosa.
5. Un metodo come da rivendicazione 1, in cui detto algoritmo è definito dalla relazione:

dove: m2 (x,y)= Avg{ [ Iu,v (x,y)- Avg (Iu,v (x,y))]<2>}; nih(x,y) è un valore di un momento centrale di ordine h di detta distribuzione dell'intensità luminosa, in cui h è un numero intero dispari >5, in particolare, detto algoritmo è descritto da una formula scelta tra:
6. Un metodo come da rivendicazione 1, comprendente inoltre una fase di: — scelta di una pluralità di ulteriori piani di illuminazione (oij), comprendenti almeno due ulteriori piani di illuminazione (OÌ-,OÌ+) disposti da parti opposte rispetto a detta sezione ottica (n), detti ulteriori piani di illuminazione (oij) avendo rispettive distanze (dj) da detta sezione ottica (n) inferiori a una distanza massima predeterminata, in cui detta distanza massima è dello stesso ordine di grandezza della lunghezza d'onda di detti fasci di illuminazione; in cui, per ciascun ulteriore piano di illuminazione (oij) di detta pluralità di ulteriori piani di illuminazione, il metodo comprende fasi di: — illuminazione di detto campione (99) con una pluralità di fasci di luce di illuminazione (19) concentrati su una pluralità di zone illuminate (17) di detto ciascun ulteriore piano di illuminazione (oij), dette zone illuminate essendo disposte secondo un rispettivo reticolato (18); — scansione di detto campione (99) con tali fasci di illuminazione (19) su detto ciascun ulteriore piano di illuminazione (oij), comprendente una traslazione di detto rispettivo reticolato (18) secondo direzioni (u,v) parallele a detto ciascun ulteriore piano di illuminazione (oij), portando successivamente detto rispettivo reticolato (18) in un insieme di posizioni su detto ciascun ulteriore piano di illuminazione (oij); — per ciascuna posizione (u,v,Wj) di detto rispettivo reticolato (18) su detto ciascun ulteriore piano di illuminazione (oij), raccolta di luce (21) riemessa da detto campione (99) in un campo comprendente dette zone illuminate (17) di detto ciascun ulteriore piano di illuminazione (oij) per effetto di detti fasci di illuminazione (19); — per ciascuna posizione (u,v,Wj) di detto rispettivo reticolato (18), acquisizione di ulteriori immagini preliminari (52), ciascuna ulteriore immagine preliminare essendo descritta da una funzione Iu,v,Wj(x,y) di distribuzione di intensità luminosa su detto sensore di immagini (40), — calcolo di un'immagine di passaggio (56',56",56"') associata a detto ciascun ulteriore piano di illuminazione a partire da dette ulteriori immagini preliminari (52), in cui detta fase di calcolo di un'immagine di passaggio (56',56",56"') comprende l'esecuzione di un algoritmo che prevede il calcolo di un valore di un momento centrale di ordine >3 di detta distribuzione di detta intensità luminosa, — calcolo di un'immagine finale (58) come una combinazione (57) di dette immagini di passaggio (56',56",56'" ).
Un metodo come da rivendicazione 6, comprendente una fase di traslazione di un medesimo reticolato (18) secondo una direzione (w) trasversale rispetto a detta sezione ottica (n), in particolare secondo una direzione (w) ortogonale a detta sezione ottica (n), in cui detto reticolato (18) viene spostato sequenzialmente tra detto piano di illuminazione ( OÌO ) in corrispondenza di detta sezione ottica (n) e ciascuno di detti ulteriori piani di illuminazione (oij) , e detta fase di scansione del campione ( 99 ) è eseguita in successione lungo ciascuno di detti piani di illuminazione (oio , oij) .
8. Un metodo come da rivendicazione 6, in cui detta pluralità di ulteriori piani di illuminazione (oij) comprende solo detti due ulteriori piani di illuminazione ( OÌ- , OÌ+ ) disposti da parti opposte rispetto a detta sezione ottica (n), in particolare a distanze sostanzialmente uguali (δ_,δ+) da detta sezione ottica (n).
9. Un metodo come da rivendicazione 8, in cui detta combinazione (57) di dette immagini di passaggio è definita dalla relazione: IB (x,y) = IA (x,y) - k |lA_(x,y)- IA+(x,y)| [8], in cui IA-(x,y) e IA+(x,y) sono immagini di passaggio (56',56",56"') riferite a detti due piani ( OÌ- , OÌ+ ) disposti da parti opposte rispetto a detta sezione ottica (n) e k è un numero compreso tra 0,5 e 1.
10. Un metodo come da rivendicazione 9, in cui dette immagini di passaggio IA-(x,y) e IA+(x,y) sono calcolate con un algoritmo scelto tra: — un algoritmo definito dalle formule:

e

— rispettive combinazioni di valori di momenti centrali della distribuzione di intensità luminosa, in particolare da un algoritmo definito dalle formule:

e
11. Un metodo come da rivendicazione 8, in cui detta fase di calcolo di detta immagine finale (58) avviene attraverso un algoritmo definito dalla formula [8], in cui h è un numero intero dispari >3, in particolare, in cui h è scelto tra 3, 5, 7 e 9.
12. Un metodo perfezionato di microscopia video-confocale per produrre un'immagine (58) di una sezione di interesse (n) di un campione (99), detto metodo comprendendo fasi di: scelta di una pluralità di piani di illuminazione (βj ), almeno due (β_,β+)di detti piani di illuminazione essendo disposti da parti opposte rispetto a detta sezione di interesse (n), detti piani di illuminazione avendo rispettive distanze (δj )da detta sezione di interesse (n) inferiori a una distanza massima predeterminata, per ciascun piano di illuminazione (βj )di detta pluralità di piani di illuminazione, fasi di: — illuminazione di detto campione (99) con una pluralità di fasci di luce di illuminazione (19) concentrati su una pluralità di zone illuminate (17) di detto ciascun piano di illuminazione (βj ), dette zone illuminate (17) essendo disposte secondo un rispettivo reticolato (18); — scansione di detto campione (99) con detti fasci di illuminazione (19) su detto ciascun piano di illuminazione, comprendente una traslazione di detto rispettivo reticolato (18) secondo direzioni (u,v) parallele a detto ciascun piano di illuminazione (βj), portando successivamente detto rispettivo reticolato (18) in un insieme di posizioni su detto ciascun piano di illuminazione (Pj); — per ciascuna posizione (u,v,Wj) di detto rispettivo reticolato (18) su detto ciascun piano di illuminazione β3 raccolta di luce riemessa (21) da detto campione in un campo comprendente di dette zone illuminate (17) di detto ciascun piano di illuminazione (βj), per effetto di detti fasci di illuminazione (19); — per ciascuna posizione (u,v,Wj) di detto rispettivo reticolato (18), acquisizione di un rispettivo insieme di immagini preliminari (52) in un sensore (40) di immagini, ciascuna immagine preliminare di detto rispettivo insieme di immagini preliminari essendo descritta da una funzione di distribuzione dell'intensità luminosa su detto sensore di immagini (40); — calcolo di un' immagine di passaggio (56',56",56"') associata al piano di illuminazione a partire da detto rispettivo insieme di immagini preliminari (52); in cui detta distanza massima è dello stesso ordine di grandezza della lunghezza d'onda di detti fasci di illuminazione ; calcolo di un'immagine finale (58) come una combinazione (57) di dette immagini di passaggio (56',56",56'" ).
13. Un metodo come da rivendicazione 12, comprendente una fase di traslazione di un medesimo reticolato (18) secondo una direzione (w) trasversale rispetto a detta sezione di interesse (n), in particolare secondo una direzione (w) ortogonale a detta sezione di interesse (n), in cui detto medesimo reticolato (18) viene spostato sequenzialmente tra detti piani di illuminazione (βJ e detta fase di scansione di detto campione (99) è eseguita in successione lungo ciascuno di detti piani di illuminazione (βj).
14. Un metodo come da rivendicazione 12, in cui detta pluralità di piani di illuminazione (βj) comprende un piano di illuminazione (β0) scelto in corrispondenza di detta sezione di interesse (n).
15. Un metodo come da rivendicazione 12, in cui detta pluralità di piani di illuminazione (βj) comprende, a una distanza predeterminata da detta sezione di interesse (n) solo detti due piani di illuminazione (β-,β+) disposti da parti opposte rispetto a detta sezione di interesse (n), in particolare a distanze (-δ,+δ) sostanzialmente uguali da detta sezione di interesse (n).
16. Un metodo come da rivendicazioni 14 e 15, in cui detta combinazione (57) di immagini di passaggio (56',56",56"') è definita dalla relazione:

in cui I(x,y) è un'immagine calcolata in corrispondenza di detto piano di illuminazione (βο) scelto in corrispondenza di detta sezione di interesse (n), e I-(x,y) e I+(x,y) sono immagini di passaggio (56',56",56"') riferite a detti due piani (β_,β+) da parti opposte rispetto a detta sezione di interesse (n), e k è un numero compreso tra 0,5 e 1.
17. Un metodo come da rivendicazione 16, in cui dette immagini di passaggio (56',56",56"') sono calcolate con un algoritmo scelto tra: — un algoritmo definito dalle formule:

— rispettive combinazioni di valori di momenti centrali di detta distribuzione di intensità luminosa, in particolare da un algoritmo definito dalle formule:
18. Un apparato (100) di microscopia video-confocale, detto apparato comprendendo: — mezzi (90) per posizionare un campione; — mezzi (10) per generare una pluralità di fasci di luce di illuminazione (19); — mezzi (20) per concentrare detti fasci di luce di illuminazione (19) su una pluralità di zone illuminate (17) di un piano di illuminazione (βο) scelto in prossimità di detti mezzi (90) per posizionare detto campione (99), dette zone illuminate (17) essendo disposte secondo un reticolato (18); — mezzi di scansione comprendenti mezzi (30') per traslare detto reticolato (18) secondo direzioni (u,v) parallele a detto piano di illuminazione (β0), atti a portare successivamente il reticolato (18) in un insieme di posizioni (u,v) su detto piano di illuminazione (β0); — mezzi (40) per raccogliere luce riemessa (21) da detto campione (99) in un campo comprendente dette zone illuminate (17) di detto piano di illuminazione (β0), detto apparato (100) essendo configurato per ricevere luce riemessa da detto campione (99) come luce riflessa e/o trasmessa e/o fluorescente da detto campione; — mezzi (51) per formare, per ciascuna posizione di detto reticolato (18), un'immagine preliminare (52) a partire da detta luce riemessa (21), ciascuna immagine preliminare (52) essendo descritta da una funzione di distribuzione dell'intensità luminosa su detti mezzi (40) per raccogliere luce riemessa; — mezzi di calcolo (55,57) per calcolare un'immagine finale (58) a partire da dette immagini preliminari (52); caratterizzato dal fatto che detti mezzi di scansione comprendono inoltre mezzi di traslazione assiale (30") per traslare relativamente detto reticolato (18) e detto piano di illuminazione (βο) secondo una direzione (w) trasversale, in particolare secondo una direzione (w) ortogonale a detto piano di illuminazione (β0), portando detto reticolato (18) su una pluralità di ulteriori piani di illuminazione (βj)situati a rispettive distanze (δj )inferiori a una distanza massima predeterminata, e che detti mezzi di calcolo (55,57) comprendono mezzi (57) per calcolare una combinazione di più immagini di passaggio (56',56",56"') calcolate a partire da rispettivi insiemi di immagini preliminari (52) di rispettivi piani di illuminazione (βj), in particolare detti mezzi di calcolo (55,57) sono configurati per creare una combinazione di solo due ulteriori piani di illuminazione (β-,β+)disposti da parti opposte rispetto ad un piano di illuminazione (β) predeterminato, in particolare distanze sostanzialmente uguali (-δ,+δ) dal piano di illuminazione predeterminato (βο), in particolare detta combinazione essendo definita dalla relazione:

in cui I(x,y) è un'immagine calcolata in corrispondenza di detto piano di illuminazione (β0)scelto in corrispondenza di una sezione di interesse (n) di detto campione (99), mentre I_(x,y) e I+(x,y) sono immagini di passaggio (56',56",56"') riferite a detti due ulteriori piani (β_,β+)da parti opposte rispetto a detta sezione di interesse (n), e k è un numero compreso tra 0,5 e 1.