JP6622154B2 - 波面制御器を用いた３次元屈折率映像撮影および蛍光構造化照明顕微鏡システムと、これを利用した方法 - Google Patents

波面制御器を用いた３次元屈折率映像撮影および蛍光構造化照明顕微鏡システムと、これを利用した方法 Download PDF

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Description

下記の実施形態は、波面制御器を利用した超高速３次元屈折率映像撮影および蛍光構造化照明顕微鏡システムと、これを利用した方法に関し、より詳細には、単一波面制御器を利用して細胞の３次元高解像度蛍光イメージと３次元屈折率立体映像を同時に測定することのできる技術に関する。
現在、細胞内部の構造を光学的に測定するために用いられている方法には、蛍光タンパク質を細胞内部の特定の構造に発現させて蛍光信号を測定する蛍光イメージ方法と、細胞内部の３次元屈折率分布を測定する３次元屈折率断層撮影法とがある。
蛍光タンパク質の標識なく、入射した波面に対する細胞の反応を測定して細胞内部の３次元屈折率分布を測定する３次元屈折率断層撮影法が用いられている。測定された屈折率値は、細胞内の主要な構成成分であるタンパク質の濃度と線形的に比例するため、測定された細胞内部の３次元屈折率分布からは、細胞内の構造的な特性だけではなく、タンパク質濃度の分布のような生化学的な特性も得ることができる。さらに、蛍光タンパク質の標識を使用しないため、非浸湿的に生きている細胞への適用が可能であり、光退色（ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ）が起こらないため、長時間に渡って細胞の反応を測定できるようになった。
このような細胞の３次元屈折率イメージを測定するために、様々な種類の波面制御器を利用した３次元屈折率断層が提示された（非特許文献１）。コヒーレント光源（ｃｏｈｅｒｅｎｔ ｌｉｇｈｔ ｓｏｕｒｃｅ）から出た光を細胞に入射させ、このように細胞で回折した透過光を、干渉計を利用してホログラムを測定する。
このとき、波面制御器を使用して細胞に入射させる角度を回転させながら複数枚の２次元ホログラムを測定し、測定されたホログラム情報をアルゴリズムに基づいて分析すれば、細胞の３次元屈折率分布を測定することができる。
最近では、波面制御器の１つであるデジタルマイクロミラーデバイス（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｍｉｃｒｏｍｉｒｒｏｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を利用して超高速３次元光断層撮影が可能となった（非特許文献２）。
しかし、光回折断層撮影法では、細胞内部のタンパク質分布は得ることができるが、分子特異的な測定ではないため、特定のタンパク質を区別することが困難という限界がある。
さらに、細胞の蛍光イメージのためには、細胞の特定の器官（分子）に蛍光タンパク質や染料を発現させたり付けたりする。このように発現した蛍光物質に励起光源（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｌｉｇｈｔ ｓｏｕｒｃｅ）を入射させると、蛍光タンパク質はこれを吸収した後、他の波長で蛍光信号を放出する。この蛍光信号を利用して細胞内部の特定の構造のイメージを区別して測定する。
最近では、このような蛍光イメージの解像度（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）を増加させる方法として構造化照明顕微鏡技術の使用が始まった。構造化照明顕微鏡技術は、励起光源を特定のパターンに入射させ、光学的に測定可能な範囲外の信号を測定することで回折限界値を凌駕する超高解像度のイメージが得られる方法である。
初期には、構造化照明顕微鏡技術は、回折格子を通過させることによってパターンを生成してイメージを得ていた（非特許文献３）。構造化照明顕微鏡技術は、格子模様を回転および平行移動させて多様なパターンでイメージを測定し、このような低解像度イメージからアルゴリズムを利用して高解像度のイメージを求める。以後、波面制御器を利用することにより、パターン模様の制御によってより容易に高解像度のイメージが得られるようになった。
さらに、最近では、非線形構造化照明顕微鏡技術（ｎｏｎｌｉｎｅａｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を利用することにより、さらに優れた解像度を生成することができるようになった（非特許文献４）。しかし、蛍光イメージの場合は、蛍光タンパク質を発現させるために細胞を染色する過程が浸湿的であり、長時間に渡って蛍光イメージを測定すると光退色が起こることから、それ以上の測定が不可能になるという短所がある。
Ｗｏｌｆ，Ｅ．（１９６９）．"Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｍｉ−ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔ ｏｂｊｅｃｔｓ ｆｒｏｍ ｈｏｌｏｇｒａｐｈｉｃ ｄａｔａ．" Ｏｐｔｉｃｓ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １（４）：１５３−１５６． Ｓｈｉｎ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２０１５）．"Ａｃｔｉｖｅ ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ａ ｄｉｇｉｔａｌ ｍｉｃｒｏｍｉｒｒｏｒ ｄｅｖｉｃｅ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｐｈａｓｅ ｉｍａｇｉｎｇ．" Ｏｐｔｉｃｓ ｌｅｔｔｅｒｓ ４０（２２）：５４０７−５４１０． Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ，Ｍ．Ｇ．（２０００）．"Ｓｕｒｐａｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｌａｔｅｒａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ ｂｙ ａ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ｔｗｏ ｕｓｉｎｇ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．"Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ １９８（２）：８２−８７． Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ，Ｍ．Ｇ．（２００５）．"Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ−ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：ｗｉｄｅ−ｆｉｅｌｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｗｉｔｈ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｌｙ ｕｎｌｉｍｉｔｅｄ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．"Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０２（３７）：１３０８１−１３０８６． Ｌｅｅ，Ｗ．−Ｈ．（１９７９）．"Ｂｉｎａｒｙ ｃｏｍｐｕｔｅｒ−ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｈｏｌｏｇｒａｍｓ．"Ａｐｐｌｉｅｄ Ｏｐｔｉｃｓ １８（２１）：３６６１−３６６９．
実施形態は、波面制御器を利用した超高速３次元屈折率映像撮影および蛍光構造化照明顕微鏡システムと、これを利用した方法に関し、より詳細には、単一波面制御器を利用して細胞の３次元高解像度蛍光イメージと３次元屈折率立体映像を同時に測定することのできる技術を提供する。
実施形態は、生きている細胞と組職内部の３次元屈折率分布を光学的に測定し、蛍光タンパク質によって標識された特定の内部構造を同時に区別することのできる波面制御器を利用した超高速３次元屈折率映像撮影および蛍光構造化照明顕微鏡システムと、これを利用した方法を提供する。
一実施形態に係る波面制御器を利用した超高速３次元屈折率映像撮影および蛍光構造化照明顕微鏡システムを利用した方法は、波面制御器（Ｗａｖｅｆｒｏｎｔ Ｓｈａｐｅｒ）を利用してサンプルに入射させる平面波の照射角度を調節する段階、前記平面波の照射角度による前記サンプルを通過した２次元光電場を測定する段階、および測定された前記２次元光電場の情報を光回折断層撮影法（ｏｐｔｉｃａｌ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）またはフィルタ逆投影アルゴリズム（ｆｉｌｔｅｒｅｄ ｂａｃｋ ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を利用して３次元屈折率映像を取得する段階を含む。
前記平面波面の位相およびパターンを制御して３次元高解像度蛍光イメージを取得する段階をさらに含み、前記波面制御器を利用して前記サンプルの前記３次元高解像度蛍光イメージと前記３次元屈折率立体映像を同時に測定してもよい。
前記波面制御器を利用してサンプルに入射させる平面波の照射角度を調節する段階は、前記サンプルに入射させる前記平面波の進行角度を制御するために、デジタルマイクロミラーデバイスに表示（ｄｉｓｐｌａｙ）するパターンを変更して多様な進行角度の平面波を形成してもよい。
前記波面制御器を利用してサンプルに入射させる平面波の照射角度を調節する段階は、前記平面波の照射角度を調節して回折光を前記サンプルに入射させ、残りを遮断して１つの平面波の進行方向を制御する段階、およびデジタルマイクロミラーデバイスのパターンを調節して所望する位相情報を取得する段階を含んでもよい。
前記平面波の照射角度を調節して回折光を前記サンプルに入射させ、残りを遮断して１つの平面波の進行方向を制御する段階は、空間フィルタ（ｓｐａｔｉａｌ ｆｉｌｔｅｒ）を利用して前記デジタルマイクロミラーデバイスによる回折光のうち特定の回折光を１つだけ使用してもよい。
前記平面波の照射角度による前記サンプルを通過した２次元光電場を測定する段階は、前記サンプルを通過した前記２次元光電場と参照波（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅａｍ）の干渉計を生成し、前記平面波の照射角度を多様に変更して前記２次元光電場を測定してもよい。
前記平面波面の位相およびパターンを制御して３次元高解像度蛍光イメージを取得する段階は、前記平面波を特定のパターンで入射させ、パターンを構成する前記平面波間の位相を調節する段階、前記位相を調節し、制御されたパターンに基づいて蛍光イメージを取得する段階、および複数の前記蛍光イメージをアルゴリズムに基づいて高解像度の２次元蛍光イメージを再建して３次元高解像度蛍光イメージを取得する段階を含んでもよい。
前記平面波面の位相およびパターンを制御して３次元高解像度蛍光イメージを取得する段階は、デジタルマイクロミラーデバイスのパターンに基づき、角度と位相が調節可能光電場区別のためのＮ個のパターンと方位角スキャン（ａｚｉｍｕｔｈａｌ ａｎｇｌｅ ｓｃａｎｎｉｎｇ）のためのＭ個のパターンとしてＮ×Ｍ個のパターンを形成してもよい。
前記平面波を発生させる光源として低干渉性光を使用し、ｚ軸で特定の部分だけを区別して測定してもよい。
前記平面波面の位相およびパターンを制御して３次元高解像度蛍光イメージを取得する段階は、ステージや集光レンズ（ｃｏｎｄｅｎｓｅｒ ｌｅｎｓ）をｚ軸に移動させ、前記サンプルのｚ軸の各部分を測定して前記３次元高解像度蛍光イメージを取得してもよい。
他の実施形態に係る波面制御器を利用した超高速３次元屈折率映像撮影および蛍光構造化照明顕微鏡システムは、波面制御器（Ｗａｖｅｆｒｏｎｔ Ｓｈａｐｅｒ）を利用してサンプルに入射させる平面波の照射角度を調節する変調部、前記平面波の照射角度による前記サンプルを通過した２次元光電場を測定する干渉計、および測定された前記２次元光電場の情報を光回折断層撮影法（ｏｐｔｉｃａｌ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）またはフィルタ逆投影アルゴリズム（ｆｉｌｔｅｒｅｄ ｂａｃｋ ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を利用して３次元屈折率映像を取得する屈折率映像部を備える。
前記平面波面の位相およびパターンを制御して３次元高解像度蛍光イメージを取得する蛍光イメージ部をさらに備え、前記波面制御器を利用して前記サンプルの前記３次元高解像度蛍光イメージと前記３次元屈折率立体映像を同時に測定してもよい。
前記変調部は、前記平面波の照射角度を調節して回折光を前記サンプルに入射させ、残りを遮断して１つの平面波の進行方向を制御し、デジタルマイクロミラーデバイスのパターンを調節して所望する位相情報を取得してもよい。
前記変調部は、空間フィルタ（ｓｐａｔｉａｌ ｆｉｌｔｅｒ）を利用して前記デジタルマイクロミラーデバイスによる回折光のうち特定の回折光を１つだけ使用してもよい。
前記干渉計は、前記サンプルを通過した前記２次元光電場と参照波（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅａｍ）の干渉計を生成し、前記平面波の照射角度を多様に変更して前記２次元光電場を測定してもよい。
前記蛍光イメージ部は、前記平面波を特定のパターンで入射させてパターンを構成する前記平面波間の位相を調節し、制御されたパターンに基づいて蛍光イメージを取得し、複数の前記蛍光イメージをアルゴリズムに基づいて高解像度の２次元蛍光イメージを再建して３次元高解像度蛍光イメージを取得してもよい。
実施形態によると、単一波面制御器を利用して細胞の３次元高解像度蛍光イメージと３次元屈折率立体映像を同時に測定することのできる波面制御器を利用した超高速３次元屈折率映像撮影および蛍光構造化照明顕微鏡システムと、これを利用した方法を提供することができる。
実施形態によると、生きている細胞と組職内部の３次元屈折率分布を光学的に測定し、蛍光タンパク質によって標識された特定の内部構造を同時に区別することのできる波面制御器を利用した超高速３次元屈折率映像撮影および蛍光構造化照明顕微鏡システムと、これを利用した方法を提供することができる。
一実施形態における、波面制御器を利用した超高速３次元屈折率映像撮影および蛍光構造化照明顕微鏡システムを説明するための図である。 一実施形態における、平面波の相対的な位相差を説明するための図である。 一実施形態における、空間周波数の調節を説明するための図である。 一実施形態における、３次元超高解像度蛍光イメージの取得方法を説明するための図である。 一実施形態における、波面制御器を利用した超高速３次元屈折率映像撮影および蛍光構造化照明顕微鏡システムを示したブロック図である。 一実施形態における、波面制御器を利用した超高速３次元屈折率映像撮影および蛍光構造化照明顕微鏡システムを利用した方法を示したフローチャートである。
以下、添付の図面を参照しながら、本発明の実施形態について説明する。しかし、記述される実施形態は多様な他の形態に変形されてもよく、本発明の範囲が以下で説明される実施形態によって限定されることはない。また、多様な実施形態は、当業者に本発明をより完全に説明するために提供されるものである。なお、図面において、要素の形状および大きさなどは、より明確な説明のために誇張されることがある。
生きている細胞内部の構造を３次元的に把握し、リアルタイムで構造の変化を測定することは、生物学的ならびに病理学的研究に大きく寄与することのできる技術である。
後述する実施形態は、波面制御器（Ｗａｖｅｆｒｏｎｔ Ｓｈａｐｅｒ）を活用して３次元屈折率断層撮影技術（３Ｄ ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ ｉｎｄｅｘ ｔｏｍｏｇｒａｍ）と３次元構造化照明顕微鏡技術（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）とをすべて実現するシステムおよび方法を提示する。
実施形態は、単一波面制御器を利用して細胞の３次元高解像度蛍光イメージと３次元屈折率立体映像を同時に測定することのできる技術を提供するものであって、より詳細には、生きている細胞と組職内部の３次元屈折率分布を光学的に測定し、蛍光タンパク質によって標識された特定の内部構造を同時に区別することのできる波面制御器を利用した超高速３次元屈折率映像撮影および蛍光構造化照明顕微鏡システムと、これを利用した方法を提供するものである。
図１は、一実施形態における、波面制御器を利用した超高速３次元屈折率映像撮影および蛍光構造化照明顕微鏡システムを説明するための図である。
図１を参照すると、波面制御器（Ｗａｖｅｆｒｏｎｔ Ｓｈａｐｅｒ）を活用して３次元高解像度蛍光イメージと３次元屈折率分布を照射波面制御方法によって測定する１つのシステムを示している。
３次元屈折率断層撮影法によって屈折率分布を得るためには、任意の多様な角度の平面波に基づいたサンプルイメージが必要となる。また、構造化照明顕微鏡技術のためには、入射波面の位相およびパターンを制御する必要がある。
波面制御器を活用する場合は、平面波の入射角度を調節できるだけでなく、平面波面の位相およびパターンも制御することができる。したがって、波面制御器を活用することにより、３次元高解像度蛍光イメージと３次元屈折率分布イメージとをすべて得ることができる。
一実施形態における、波面制御器を利用した超高速３次元屈折率映像撮影および蛍光構造化照明顕微鏡システムは、変調部、干渉計、屈折率映像部、および蛍光イメージ部を備えて構成されてもよい。
例えば、変調部は、波面制御器１１０、チューブレンズ１２０、および集光レンズ１３０を含んで構成されてもよい。また、実施形態に応じて、変調部は、空間フィルタ（ｓｐａｔｉａｌ ｆｉｌｔｅｒ）をさらに含んで構成されてもよい。
波面制御器１１０は、例えば、デジタルマイクロミラーデバイスであってもよい。すなわち、デジタルマイクロミラーデバイス（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｍｉｃｒｏｍｉｒｒｏｒ Ｄｅｖｉｃｅ）は、波面制御器として多数のマイクロミラーを含む配列を備えてもよい。
チューブレンズ１２０および集光レンズ１３０は、平面波の進行角度を拡大してサンプルに入射させてもよい。
ここで、サンプル（ｓａｍｐｌｅ）とは、測定しようとする対象を意味するものであって、細胞、細菌、または微生物などであってもよいし、細胞などを含んでいる対象物であってもよい。
また、干渉計は、サンプルを通過した２次元光電場を少なくとも１つ以上の入射光によって測定してもよい。
屈折率映像部は、測定された２次元光電場の情報に基づいて３次元屈折率映像を取得してもよい。
蛍光イメージ部は、平面波面の位相およびパターンを制御して３次元高解像度蛍光イメージを取得してもよい。
これにより、波面制御器を利用することにより、サンプルの３次元高解像度蛍光イメージと３次元屈折率立体映像とを同時に測定することができる。
以下では、一実施形態における、波面制御器を利用した超高速３次元屈折率映像撮影および蛍光構造化照明顕微鏡システムについてさらに詳しく説明する。
先ず、３次元屈折率断層撮影イメージを得るためにＬｅｅ Ｈｏｌｏｇｒａｍ（非特許文献５）方法を使用し、波面制御器によって入射平面波の照射角度を調節してもよい。入射させる平面波の進行角度を制御するために、デジタルマイクロミラーデバイス（ｄｉｇｉｔａｌ ｍｉｃｒｏｍｉｒｒｏｒ ｄｅｖｉｃｅ）に表示（ｄｉｓｐｌａｙ）するＬｅｅ ｈｏｌｏｇｒａｍパターンを適切に変更してもよい。
より具体的に、多様な進行角度の平面波をデジタルマイクロミラーデバイスで形成するために、デジタルマイクロミラーデバイスに下記の数式のようなＬｅｅ ｈｏｌｏｇｒａｍパターンを入力してもよい。
ここで、u、vは空間周波数であって、デジタルマイクロミラーデバイスのピクセルに基づいて調節される値であり、は平面波の相対的な位相差を示している。
このうち、２番目の式において、３つの項のうち２番目の項に該当する回折光だけをサンプルに入射させ、残りを遮断すれば、１つの平面波の進行方向を制御することが可能となる。
光軸をｚ軸に定め、表現しようとする波長λを有するレーザ平面波のｘ軸、ｙ軸方向の角度をそれぞれθx、θyとするとき、これに該当する波面の位相情報は、下記の数式のように示されてもよい。
したがって、数式１でデジタルマイクロミラーデバイスのパターンを調節すれば、数式２を利用して所望する位相情報が得られるようになる。このとき、１つの反射光を使用するために、空間フィルタ（ｓｐａｔｉａｌ ｆｉｌｔｅｒ）を利用してデジタルマイクロミラーデバイスによる回折光のうち特定の回折光を１つだけ使用できるようになる。
サンプルを通過した２次元光電場と参照波（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅａｍ）の干渉計を生成し、平面波の照射角度を多様に変えて光電場を測定してもよい。このように測定された２次元光電場の情報を光回折断層撮影法（ｏｐｔｉｃａｌ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）またはフィルタ逆投影アルゴリズム（ｆｉｌｔｅｒｅｄ ｂａｃｋ ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）技術を活用して３次元屈折率映像を得ることができる。
次に、超高解像度の蛍光イメージを得るために構造化照明顕微鏡技術を利用する。
構造化照明顕微鏡技術において、超高解像度イメージを得るためには、特定のパターンを入射し、パターンを構成する平面波間の位相を調節しなければならない。
一例として、正弦波パターン（ｓｉｎｕｓｏｉｄａｌ ｐａｔｔｅｒｎ）を次の数式のように示してもよい。
ここで、u、vは空間周波数であって、上述したように、デジタルマイクロミラーデバイスのピクセルに基づいて調節される値であり、φは平面波の相対的な位相差であって、デジタルマイクロミラーデバイスのパターンの形態に基づいて調節が可能である。
図２は、一実施形態における、平面波の相対的な位相差を説明するための図である。図２を参照すると、平面波の相対的な位相差φは、デジタルマイクロミラーデバイスのパターンの形態に基づいて調節が可能である。
３次元屈折率断層撮影法では、数式１または数式３に示す３つの項のうち２番目の項のみを使用したが、構造化照明顕微鏡技術では、数式の３つの項をすべて使用してもよい。
このとき、入射された正弦波パターンを構成する３つの項それぞれに対する試験片の光電場を区別するために位相変換方法（ｐｈａｓｅ ｓｈｉｆｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）を使用し、相対的位相差φを３ステップ以上の異なる値で制御しなければならない。
また、図３を参照すると、解像度の方位対称（ａｚｉｍｕｔｈａｌ ｓｙｍｍｅｔｒｙ）を維持するために空間周波数を調節し、正弦波パターンの方向を回しながら多様な方位角θを測定してもよい。
すなわち、光電場の区別のためのＮ個のパターン、方位角スキャン（ａｚｉｍｕｔｈａｌ ａｎｇｌｅ ｓｃａｎｎｉｎｇ）のためのＭ個のパターンとして合計Ｎ×Ｍ個のパターンが必要となる。必要なパターンは、デジタルマイクロミラーデバイスのパターンに基づいて角度と位相の調節が可能となる。
このとき、位相φは、デジタルマイクロミラーのピクセル数をΛとするとき、２π／Λのステップで調節される。図４を参照すると、制御されたパターンに基づいて蛍光イメージを得ており、このようなイメージをアルゴリズムに基づいて超高解像度の２次元蛍光イメージを再建してもよい。
また、光源として低干渉性光を使用すれば、ｚ軸で特定の部分だけを区別して測定するようになり、ステージや集光レンズ（ｃｏｎｄｅｎｓｅｒ ｌｅｎｓ）４３０をｚ軸に動かしてサンプル４４０のｚ軸の各部分を測定すれば、３次元超高解像度蛍光イメージを得ることができる。一方、図１を参照しながら説明したように、変調部は、波面制御器４１０、チューブレンズ４２０、および集光レンズ４３０を備えて構成されてもよい。さらに、実施形態に応じて、変調部は、空間フィルタ（ｓｐａｔｉａｌ ｆｉｌｔｅｒ）をさらに備えて構成されてもよい。
このような３次元屈折率映像撮影映像および３次元高解像度蛍光イメージを取得するシステムとその方法について、以下でさらに詳しく説明する。
図５は、一実施形態における、波面制御器を利用した超高速３次元屈折率映像撮影および蛍光構造化照明顕微鏡システムを示したブロック図である。
図５を参照すると、一実施形態における、波面制御器を利用した超高速３次元屈折率映像撮影および蛍光構造化照明顕微鏡システム５００は、変調部５１０、干渉計５２０、および屈折率映像部５３０を備えて構成されてもよい。実施形態に応じて、波面制御器を利用した超高速３次元屈折率映像撮影および蛍光構造化照明顕微鏡システム５００は、蛍光イメージ部５４０をさらに備えて構成されてもよい。
変調部５１０は、波面制御器（Ｗａｖｅｆｒｏｎｔ Ｓｈａｐｅｒ）を利用してサンプルに入射させる平面波の照射角度を調節してもよい。
より具体的に、変調部５１０は、波面制御器を使用し、入射光の照射角度および波面パターンのうち少なくともいずれか１つ以上を変更してサンプルに入射させてもよい。ここで、波面制御器としては、光の位相を制御することのできる機器または位相の制御が可能な固定形態のフィルムが使用されてもよい。例えば、波面制御器は、超高速で波面を制御することのできるデジタルマイクロミラーデバイスを含んでもよい。デジタルマイクロミラーデバイス（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｍｉｃｒｏｍｉｒｒｏｒ Ｄｅｖｉｃｅ）は、波面制御器として多数のマイクロミラーを含む配列を備えてもよい。
すなわち、変調部５１０は、サンプルに入射させる平面波の進行角度を制御するために、デジタルマイクロミラーデバイスに表示（ｄｉｓｐｌａｙ）するパターンを変更して多様な進行角度の平面波を形成してもよい。
また、変調部５１０は、平面波の照射角度を調節して回折光をサンプルに入射させ、残りを遮断して１つの平面波の進行方向を制御し、デジタルマイクロミラーデバイスのパターンを調節して所望する位相情報を取得してもよい。
このとき、変調部５１０は、空間フィルタ（ｓｐａｔｉａｌ ｆｉｌｔｅｒ）を利用してデジタルマイクロミラーデバイスによる回折光のうち特定の回折光を１つだけ使用してもよい。
一方、平面波を発生させる光源として低干渉性光を使用し、ｚ軸で特定の部分だけを区別して測定してもよい。
例えば、変調部５１０は、デジタルマイクロミラーデバイス、チューブレンズ、および集光レンズを含んで構成されてもよい。また、実施形態に応じて、変調部５１０は、空間フィルタ（ｓｐａｔｉａｌ ｆｉｌｔｅｒ）をさらに含んで構成されてもよい。
干渉計５２０は、少なくとも１つ以上の入射光から干渉信号を抽出するものであって、サンプルを通過した２次元光電場を少なくとも１つ以上の入射光によって測定してもよい。
すなわち、干渉計５２０は、平面波の照射角度によるサンプルを通過した２次元光電場を測定してもよい。
干渉計５２０は、サンプルを通過した２次元光電場と参照波（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅａｍ）の干渉計を生成し、平面波の照射角度を多様に変更して２次元光電場を測定してもよい。
屈折率映像部５３０は、測定された２次元光電場の情報に基づいて３次元屈折率映像を取得することにより、高速かつ精密に３次元屈折率を測定することができる。
より具体的に、屈折率映像部５３０は、測定された２次元光電場の情報を光回折断層撮影法（ｏｐｔｉｃａｌ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）またはフィルタ逆投影アルゴリズム（ｆｉｌｔｅｒｅｄ ｂａｃｋ ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を利用して３次元屈折率映像を取得してもよい。
蛍光イメージ部５４０は、平面波面の位相およびパターンを制御して３次元高解像度蛍光イメージを取得してもよい。これにより、波面制御器を利用してサンプルの３次元高解像度蛍光イメージと３次元屈折率立体映像を同時に測定することができる。
より具体的に、蛍光イメージ部５４０は、平面波を特定のパターンで入射させ、パターンを構成する平面波間の位相を調節し、制御されたパターンに基づいて蛍光イメージを取得し、複数の蛍光イメージをアルゴリズムに基づいて高解像度の２次元蛍光イメージを再建して３次元高解像度蛍光イメージを取得してもよい。
このような蛍光イメージ部５４０は、デジタルマイクロミラーデバイスのパターンに基づき、角度と位相が調節可能光電場区別のためのＮ個のパターンと方位角スキャン（ａｚｉｍｕｔｈａｌ ａｎｇｌｅ ｓｃａｎｎｉｎｇ）のためのＭ個のパターンとしてＮ×Ｍ個のパターンを形成してもよい。
蛍光イメージ部５４０は、ステージや集光レンズ（ｃｏｎｄｅｎｓｅｒ ｌｅｎｓ）をｚ軸に移動させ、サンプルのｚ軸の各部分を測定して３次元高解像度蛍光イメージを取得してもよい。
実施形態によると、生きている細胞と組職内部の３次元屈折率分布を光学的に測定し、蛍光タンパク質によって標識された特定の内部構造を同時に区別することのできる波面制御器を利用した超高速３次元屈折率映像撮影および蛍光構造化照明顕微鏡システムと、これを利用した方法を提供することができる。
図６は、一実施形態における、波面制御器を利用した超高速３次元屈折率映像撮影および蛍光構造化照明顕微鏡システムを利用した方法を示したフローチャートである。
一実施形態における、波面制御器を利用した超高速３次元屈折率映像撮影および蛍光構造化照明顕微鏡システムを利用した方法は、波面制御器（Ｗａｖｅｆｒｏｎｔ Ｓｈａｐｅｒ）を利用してサンプルに入射させる平面波の照射角度を調節する段階６１０、平面波の照射角度によるサンプルを通過した２次元光電場を測定する段階６２０、および測定された２次元光電場の情報を光回折断層撮影法（ｏｐｔｉｃａｌ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）またはフィルタ逆投影アルゴリズム（ｆｉｌｔｅｒｅｄ ｂａｃｋ ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を利用して３次元屈折率映像を取得する段階６３０を含む。
また、平面波面の位相およびパターンを制御して３次元高解像度蛍光イメージを取得する段階６４０をさらに含んでもよい。
これにより、波面制御器を利用することで、サンプルの３次元高解像度蛍光イメージと３次元屈折率立体映像を同時に測定することができる。
以下では、一実施形態における、波面制御器を利用した超高速３次元屈折率映像撮影および蛍光構造化照明顕微鏡システムを利用した方法の一例についてさらに詳しく説明する。
一実施形態における、波面制御器を利用した超高速３次元屈折率映像撮影および蛍光構造化照明顕微鏡システムを利用した方法は、図５を参照しながら説明した、一実施形態における、波面制御器を利用した超高速３次元屈折率映像撮影および蛍光構造化照明顕微鏡システムを利用してさらに具体的に説明することができる。
一実施形態における、波面制御器を利用した超高速３次元屈折率映像撮影および蛍光構造化照明顕微鏡システム５００は、変調部５１０、干渉計５２０、および屈折率映像部５３０を備えて構成されてもよい。実施形態に応じて、波面制御器を利用した超高速３次元屈折率映像撮影および蛍光構造化照明顕微鏡システム５００は、蛍光イメージ部５４０をさらに備えてもよい。
段階６１０で、変調部５１０は、波面制御器（Ｗａｖｅｆｒｏｎｔ Ｓｈａｐｅｒ）を利用してサンプルに入射させる平面波の照射角度を調節してもよい。
例えば、波面制御器（Ｗａｖｅｆｒｏｎｔ Ｓｈａｐｅｒ）は、デジタルマイクロミラーデバイスなどを利用してもよい。すなわち、変調部５１０は、サンプルに入射させる平面波の進行角度を制御するために、デジタルマイクロミラーデバイスに表示（ｄｉｓｐｌａｙ）するパターンを変更して多様な進行角度の平面波を形成してもよい。
また、変調部５１０は、平面波の照射角度を調節して回折光をサンプルに入射させ、残りを遮断して１つの平面波の進行方向を制御し、デジタルマイクロミラーデバイスのパターンを調節して所望する位相情報を取得してもよい。
このとき、変調部５１０は、空間フィルタ（ｓｐａｔｉａｌ ｆｉｌｔｅｒ）を利用してデジタルマイクロミラーデバイスによる回折光のうち特定の回折光を１つだけ使用してもよい。
段階６２０で、干渉計５２０は、平面波の照射角度によるサンプルを通過した２次元光電場を測定してもよい。
より具体的に、干渉計５２０は、サンプルを通過した２次元光電場と参照波（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅａｍ）の干渉計を生成し、平面波の照射角度を多様に変更して２次元光電場を測定してもよい。
段階６３０で、屈折率映像部５３０は、測定された２次元光電場の情報を光回折断層撮影法（ｏｐｔｉｃａｌ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）またはフィルタ逆投影アルゴリズム（ｆｉｌｔｅｒｅｄ ｂａｃｋ ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を利用して３次元屈折率映像を取得してもよい。
段階６４０で、蛍光イメージ部５４０は、平面波面の位相およびパターンを制御して３次元高解像度蛍光イメージを取得してもよい。これにより、波面制御器を利用してサンプルの３次元高解像度蛍光イメージと３次元屈折率立体映像を同時に測定することができる。
より具体的に、蛍光イメージ部５４０は、平面波を特定のパターンで入射させ、パターンを構成する平面波間の位相を調節し、制御されたパターンに基づいて蛍光イメージを取得し、複数の蛍光イメージをアルゴリズムに基づいて高解像度の２次元蛍光イメージを再建して３次元高解像度蛍光イメージを取得してもよい。
このような蛍光イメージ部５４０は、デジタルマイクロミラーデバイスのパターンに基づき、角度と位相が調節可能光電場区別のためのＮ個のパターンと方位角スキャン（ａｚｉｍｕｔｈａｌ ａｎｇｌｅ ｓｃａｎｎｉｎｇ）のためのＭ個のパターンとしてＮ×Ｍ個のパターンを形成してもよい。
一方、平面波を発生させる光源として低干渉性光を使用し、ｚ軸で特定の部分だけを区別して測定してもよい。
言い換えれば、蛍光イメージ部５４０は、回折格子や波面制御器の種類の１つであるデジタルマイクロミラーデバイスを使用し、パターン化した低干渉性光（ｌｏｗ ｃｏｈｅｒｅｎｔ ｌｉｇｈｔ）とｚ軸移動ステージを利用した光学的な区間測定（ｏｐｔｉｃａｌ ｓｅｃｔｉｏｎｉｎｇ）によって３次元の蛍光イメージを得ることができる。
蛍光イメージ部５４０は、ステージや集光レンズ（ｃｏｎｄｅｎｓｅｒ ｌｅｎｓ）をｚ軸に移動させ、サンプルのｚ軸の各部分を測定して３次元高解像度蛍光イメージを取得してもよい。
実施形態によると、１つのシステムで、生きている細胞の３次元超高解像度蛍光イメージと３次元屈折率分布イメージとをすべて測定できるようになる。この技術を利用することにより、細胞内部の３次元タンパク質分布と３次元超高解像度蛍光イメージによって標識された特定の構造とを区別して測定することができる。
さらに、細胞内部の構造を長時間に渡って測定することができるため、時間による構造および生化学的な変化を測定することもできる。本発明で提示した技術は、細胞水準の生物学および病理学的研究に大きく寄与することができる。
以上のように、実施形態を、限定された実施形態と図面に基づいて説明したが、当業者であれば、上述した記載から多様な修正および変形が可能である。例えば、説明された技術が、説明された方法とは異なる順序で実行されたり、かつ／あるいは、説明されたシステム、構造、装置、回路などの構成要素が、説明された方法とは異なる形態で結合されたりまたは組み合わされたり、他の構成要素または均等物によって対置されたり置換されたとしても、適切な結果を達成することができる。
したがって、異なる実施形態であっても、特許請求の範囲と均等なものであれば、添付される特許請求の範囲に属する。
５００：波面制御器を利用した超高速３次元屈折率映像撮影および蛍光構造化照明顕微鏡システム
５１０：変調部
５２０：干渉計
５３０：屈折率映像部
５４０：蛍光イメージ部

Claims (2)

  1. 波面制御器としてのデジタルマイクロミラーデバイスに低干渉性光を照射し、前記デジタルマイクロミラーデバイスによる回折光のうち一つの回折光を、空間フィルタを通して選択された平面波をサンプルに入射させ、
    前記サンプルを通過した２次元光電場と参照波との干渉を生成し、前記平面波の照射角度を変化させながら前記２次元光電場を測定し、
    測定された前記２次元光電場の情報を光回折断層撮影法またはフィルタ逆投影アルゴリズムを用いて３次元屈折率映像を取得し、
    前記デジタルマイクロミラーデバイスのパターンとして、光電場の区別のためのＮ個のパターンと、多様な方位角を測定する方位角スキャンのためのＭ個のパターンとしてＮ×Ｍ個のパターンを形成して、前記平面波の位相および前記Ｎ×Ｍ個のパターンを制御して３次元高解像度蛍光イメージを取得し、
    前記デジタルマイクロミラーデバイスを用いて前記サンプルの前記３次元高解像度蛍光イメージと、前記３次元屈折率映像と、を測定し、
    前記平面波を発生させる光源として前記低干渉性光を使用し、前記サンプルのｚ軸方向において特定の部分だけを区別して測定すること
    を特徴とする、波面制御器を用いた３次元屈折率映像撮影および蛍光構造化照明顕微鏡システムを利用した方法。
  2. 前記波面制御器により前記平面波の位相および前記Ｎ×Ｍ個のパターンを制御して３次元高解像度蛍光イメージを取得する際に、
    ステージや集光レンズを、前記サンプルのｚ軸方向に移動させ、前記サンプルのｚ軸の各部分を測定して前記３次元高解像度蛍光イメージを取得すること
    を特徴とする、請求項１に記載の波面制御器を用いた３次元屈折率映像撮影および蛍光構造化照明顕微鏡システムを利用した方法。
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