JP6667539B2 - 光遠隔測定装置 - Google Patents

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Description

本発明は、物体の三次元位置を測定し、とりわけ生物体の三次元顕微鏡撮像に適用される方法及び光遠隔測定装置に関し、また（飛行時間型測定を行わない）パッシブ光遠隔測定方法にも関する。
いわゆる超解像顕微鏡技術は、これらが導入されてから数年後に生物試料の研究分野、特に、細胞内のタンパク質集合（数ナノメートルから百ナノメートルの間の寸法の分子錯体）の構造および空間的動態の研究において大幅に発達している。今日では、細胞により直接合成可能な、またはサンプル内に添加した蛍光化合物により生成される、蛍光標識の添加によって生物体内の事実上あらゆるタンパク質を機能化させることが可能となっている。この結果、光で破壊される前に、数十万から数百万の間の数から成る光子を放出できるエミッタが構成される。例えば、“Photo-Activated Location Microscopy”（光活性位置顕微鏡法）の頭文字をとったPALM、または、“(direct) Stochastical Optical Reconstruction Microscopy”（（直接）確率的光学再構築顕微鏡法）の頭文字をとった(d)STORMとしてなどとして知られている超解像技術と、ナノスケール位置特定および同時に動作しているトランスミッタ数の制御を組み合わせて得た、細胞サンプルの二次元イメージは、分解能が10から50nmであり従来の回折限界よりはるかに低い。
しかしながら、これらの技術は現在では主に二次元撮像に使用されており、ナノスケールの細胞構造の三次元組織へのアクセスには多くの困難を示し続けている。B.Hajjらによる論評（“Accessing the third dimension in localization-based super-resolution microscopy”，Phys. Chem. Chem. Phys.，16号：16340-16348ページ，2014年）は、三次元超解像顕微鏡法で使用している技術を総合して提示しており、これらの技術をまとめていくつかのカテゴリ、具体的には、PSF（“Point Spread Function”(点広がり関数)の頭文字であり、撮像システムのインパルス応答関数を表している）形状制御に基づいた技術、いわゆる「多層」手法に基づく技術、および干渉分光法を用いた技術に分類している。
撮像システムのインパルス応答（PSF）の形状制御に基づいた技術は、顕微鏡対象物がPSFの軸対称性を崩して、PSFの横方向断面とエミッタの軸方向位置との間に、撮像システムの焦平面に対する、全単射関係を持たせることを含む。顕微鏡対象物の瞳孔面に配置し、PSFの横方向断面を二つのローブ（lobe）に分割して、二つのローブの相対位置がエミッタの軸方向位置を測定可能にする、特定の位相マスク（A Backer他、“A bisected pupil for studying single-molecule orientational dynamics and its application to three-dimensional super-resolution microscopy”，Applied Physics Letters 104，193701ページ,2014年参照）が最近開示されている。しかしながら、この技術はこの種の他の技術と同様に、粒子の密度が増えるとすぐにローブの重複、あるいはより一般的には拡大されたPSFが観察されるため、大きく密集した分子を同時に分析することができない。さらに、深部撮像の場合にはサンプルによって自然と導入される光学収差により、PSFの形状と軸方向位置との間の単射関係を解消する傾向にあり、細胞の第一層におけるこれらの技術の使用を制限する。
多層手法では、軸方向が異なる各平面において送信機の信号を同時に撮像する。S.Abrahamssonらによる論文（“fast multicolor 3D imaging using aberration-corrected multifocus microscopy”，Nature Methods, 第10巻, 第1号，2013年）は、例えば、９つの回折次数に対応する９つの像を一つの検出器上に生成することを可能にする特定の格子の配置について著している。しかしながら、所定の画像数に応じてトランスミッタの“光子の予算”を分割するという多層技術の制限により、結果として感度の低下ひいては精度の低下につながっている。
超解像顕微鏡法における軸方向精度は、エミッタから放出された波を２つの顕微鏡対象物の焦点で干渉させることにより格段と向上させることができる（G.Shtengel他，“Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure”,Proc Natl Acad Sci USA,106号,3125ページ,2009年参照）。いわゆる“4π”測定システムを使用する、つまり、概ね4πステラジアンでの集光のために２つの接近した対象物を使用して、放出光子の３−干渉計型検出を組み合わせたこの後者の技術は、今日では軸方向位置特定において最高の精度を提供するが、実験がかなり複雑になるため生物学研究所での使用はわずかとなっている。この技術は、4π取り付け（mounting）における前方あるいは後方でのサンプルの交差から結果として生じる微収差（differential aberration）に対しても感度が高く、これはあらゆるサンプルに対して効果がある。
本発明は、一つの検出器のみで、上記の技術の不都合を有しない干渉法技術を提供し、特に蛍光エミッタ連続体の検出に適した全視野撮像を可能にする。本発明は、超解像顕微鏡法に応用できるが典型的な顕微鏡法にも応用でき、また、パッシブ光遠隔測定、つまり、飛行時間型分析を行うことなく、ある状況内の対象物の距離を測定することに応用できる。
第１の態様によれば、本発明は、 基準面（PREF）に対する対象物（O）の光点（Pi）からの距離を測定する装置（100, 200, 300, 400, 500）であって、
検出面（PDET）を含む二次元検出器（30）と、
目標空間及び像空間を規定し、前記光点により放出されたビームから、前記像空間内に位置する新たなビームを生成する撮像システム（10）であって、前記像空間内の検出面（PDET）または検出面の共役面（P’DET）に近接して位置する像面（11’）に、対象となる目標面（11）上に位置する光点（Pi）からの像を形成するようになっており、前記像面（11’）は、前記対象となる目標面（１１）と共役であり、前記目標空間内の前記検出面の共役面は、前記基準面（P REF ）を規定する、撮像システム（10）と、
前記新たなビームから、互いにコヒーレントで前記ビームが干渉する空間的重なり領域を有する少なくとも二つのビームの形成を可能にする、前記像空間に配置された分離要素（20）であって、前記像空間内の前記検出面（P DET ）または前記検出面の前記共役面（P’ DET ）は、前記領域に位置し、互いにコヒーレントな前記ビームの光学的干渉から生ずる干渉パターンは前記検出面に形成される、分離要素（20）と、
前記検出面の共役面が前記基準面（PREF）を形成し、前記検出面に形成された干渉パターンの変調周期から、前記光点から前記基準面（P REF ）までの距離の測定を可能にする信号処理手段（50）
とを含む装置に関する。
本明細書の目的のために、対象物の「光点」または、「点光源」の概念は、全ての放出点が互いに空間的にコヒーレントであり、これらが合わせて検出器上に一つの像点を形成する対象物の基本区域まで広く拡張して使用される。このため、超解像顕微鏡法へ適用する場合には、点光源は蛍光エミッタ、または撮像システムの回折点より小さい空間的寸法を有する「量子ドット」でも良い。逆に、他のマクロ的な適用例においては、点光源はより拡張されて対象物と空間的にコヒーレントで、撮像システムのインパルス応答（またはPSF）よりもはるかに大きい寸法の検出面上に「像点」を形成する、領域を含むこともある。
従って、本明細書の装置は、特に、対象物の制御照射を行うための手段を導入する必要なく三次元において対象物を再構築することを可能にする。よって、記載の装置は、例えば、自身の光を放出している対象物（顕微鏡法における蛍光エミッタの場合）あるいは、（日常的な状況のように）自身の照射を全く制御しない状態で光を再放出している対象物を三次元において再構築することを可能にする。
本明細書における装置で規定されている分離要素は、「像点」、つまり検出面上に形成された対象物の光点の像、の中に光点から来る波の相対曲率に依存する周期の、ひいては対象物の相対高低写像を生じる変調をプリントすることを可能にする。このため、検出器に連結した分離要素は対象物の異なる光の点から来る波の曲率センサのように動作し、これにより各像点内にその解像度を劣化させることなく変調をプリントする。
好都合に、像点で少なくとも二つの縞を形成して十分に正確な測定値の取得に十分に小さい周期を有する分離要素で像点内に変調をプリントできる。
好都合に、また特に超解像顕微鏡法に適用する場合において、検出面に形成された干渉縞（「縞間」）の周期は、撮像システム（またはPSF）インパルス応答の直径より小さく、光点から検出面に形成された最も小さい像である。
一つの実施例によれば、分離要素は像面に近接した回折格子、例えば二次元回折格子を含んでいる。
一つの実施例によれば、回折格子はゼロ次を伝送も反射もしない伝送または反射格子である。
一つの実施例によれば、装置は三次元撮像に適用され、撮像システムは顕微鏡対象物を含んでいる。
一つの実施例によれば、装置は撮像システムの像空間において検出面の共役面を形成可能にする光学リレーをも含んでいる。
第２の態様によれば、本発明は、
基準面（PREF）に対して対象となっている対象物（O）の光点（Pi）の距離を測定する方法であって、
目標空間及び像空間を規定し、前記光点により放出されたビームから前記像空間内に位置する新たなビームを生成し、二次元検出器の前記検出面（PDET）、または前記検出面の共役面（P’DET）に近接して位置する像面（11’）上に、前記光点（Pi）から像を形成することと、
前記光点（Pi）から放出されて前記撮像システム（10）から出て来るビーム（B’）から、分離要素（20）を用いて、互いにコヒーレントで干渉する空間的重なり領域を有する少なくとも二つのビーム（B’1,B’2）を形成することと、
前記検出面（PDET）上に形成された、前記コヒーレントビーム間の光干渉によって生じた前記干渉パターンから、前記光点（Pi）から前記基準面（P REF ）までの距離を測定する
ことを含み、
前記像面（11’）は、前記対象となる像面（１１）と共役であり、前記目標空間内の前記検出面は、前記検出面（P DET ）を規定し、
前記像空間内の前記検出面（P DET ）または前記検出面の前記共役面（P’ DET ）は、前記領域に位置し、互いにコヒーレントな前記ビームの光学的干渉から生ずる干渉パターンは、前記検出面に形成される。
一つの実施例によれば、光点から基準面までの距離は干渉パターンの縞の周期の測定値から取得する。
本発明の他の利点および特徴は、以下に記載の説明を読むことにより明確になり、これらは以下の図面に示している。
図１Ａは、本明細書による遠隔測定装置の例を示す。 図１Ｂは、本明細書による遠隔測定装置の例を示す。 図２Ａは、一つの例により実施した手法の原理を示す。 図２Ｂは、一つの例により実施した手法の原理を示す。 図２Ｃは、一つの例により実施した手法の原理を示す。 図２Ｄは、一つの例により実施した手法の原理を示す。 図３は、２つの特定の例による、縞間の値（変調の擬似周期）を基準面に対する原点の軸方向位置の関数として表す曲線を示す。 図４Ａは、他の例による遠隔測定装置を示す。 図４Ｂは、他の例による遠隔測定装置を示す。 図５は、本明細書による装置を三次元顕微鏡撮像に適用した例を示す。 図６Ａは、図５に示す取り付けタイプを用いて実施した、超解像顕微鏡適用例におけるテレメトリの異なるピッチのイメージを示し、CHO細胞（「チャイニーズハムスター卵巣」）を含んだ生物サンプルと、これらの細胞の細胞骨格から得たチューブリンタンパク質にラベル付けしたイメージを示す。 図６Ｂは、図５に示す取り付けタイプを用いて実施した、超解像顕微鏡適用例におけるテレメトリの異なるピッチのイメージを示し、CHO細胞（「チャイニーズハムスター卵巣」）を含んだ生物サンプルと、これらの細胞の細胞骨格から得たチューブリンタンパク質にラベル付けしたイメージを示す。 図６Ｃは、図５に示す取り付けタイプを用いて実施した、超解像顕微鏡適用例におけるテレメトリの異なるピッチのイメージを示し、CHO細胞（「チャイニーズハムスター卵巣」）を含んだ生物サンプルと、これらの細胞の細胞骨格から得たチューブリンタンパク質にラベル付けしたイメージを示す。 図７Ａは、異なる軸方向位置における、図６Ａから図６Ｃの像を得るために使用したものと同様の構成（取り付け方法およびサンプル）の単一蛍光エミッタ（量子ドット）について得た干渉パターンの形状イメージを示す。 図７Ｂは、異なる軸方向位置における、図６Ａから図６Ｃの像を得るために使用したものと同様の構成（取り付け方法およびサンプル）の単一蛍光エミッタ（量子ドット）について得た干渉パターンの形状イメージを示す。 図７Ｃは、異なる軸方向位置における、図６Ａから図６Ｃの像を得るために使用したものと同様の構成（取り付け方法およびサンプル）の単一蛍光エミッタ（量子ドット）について得た干渉パターンの形状イメージを示す。 図８Ａは、それぞれ標準的な蛍光像と、図６Ａから図６Ｃの像を得るために使用したものと同様の構成（アセンブリおよび試料）で得た生物サンプルを示す。 図８Ｂは、それぞれ標準的な蛍光像と、図６Ａから図６Ｃの像を得るために使用したものと同様の構成（アセンブリおよび試料）で得た生物サンプルを示す。 図９は、ある情景においてパッシブ光テレメトリに適用した本明細書による装置を示す。
一貫性を持たせるために、異なる図面における同一要素は同一参照番号を付して示す。
図１Ａおよび図１Ｂは、所定の基準面を基準にした、ある情景内の対象となる対象物Ｏの光点Pi（あるいは、「光源点」）からの距離測定に適した、本明細書による遠隔測定装置の２つの例を示す。
図１Ａに示す遠隔測定装置１００は、概ね、信号処理手段５０に連結した検出面PDETを有する二次元検出器３０と、検出器の検出面３１に近接して位置する像面１１’内に対象となる対象物の面１１の光点Piの像の形成に適した撮像システム１０を含んでいる。図１Ｂにて概略的に示す遠隔測定装置２００において、像面１１’は、検出面PDETの共役面P’DETに近接して位置している。この装置はさらに、撮像システム１０の像空間内の検出面から共役面を形成することを可能とする光学リレー４０を含んでいる。
像面から検出面（あるいは検出面の共役）までの近さは、求める測定距離の精度に依存する。
確かに、検出面PDET（または光学リレー４０による検出面の共役面P’DET）の所定位置に対して、撮像システム１０の目標空間において、「基準面」と呼ばれる目標面PREFのいずれの側にも定義され、撮像システムの目標空間内の検出面の共役面に対応する測定領域を定義できる。想定される適用例の一部として、測定領域は基準面に対する光点からの距離の測定値の精度が十分となる領域に対応する。
このため、例えば、三次元的顕微鏡法の適用例において、撮像システムにおける対象物の被写界深度よりはるかに低く位置した基準面に対するエミッタの正確な位置を求める場合には、測定領域の全長Lmは撮像システムにおける対象物の被写界深度dzの４倍より短く、良好な測定精度を確実にするために好都合に撮像システムにおける対象物の被写界深度dzの２倍より短いことがある。
デジタル式絞り撮像システムNAについて、対象物の被写界深度dzは次式によって規定できる。
ここで、λは集めた光の平均波長であり、ｎは撮像システムの液浸指数、つまり撮像システム１０の（光の伝搬方向の）最初のジオプタ（dioptre）の直前に配置されている媒体の指数である。通常、パッシブテレメトリ適用例など空中での液浸撮像システムではｎ＝１であり、超解像顕微鏡適用例など液浸油に浸した撮像システムではｎ≒１.５である。
結果として、例えば、三次元顕微鏡を適用した場合には、検出面（あるいは検出面の共役）および撮像システム１０による対象となる対象物の面１１の共役像面１１’は互いの距離が撮像システムにおける像の被写界深度の2倍より小さくてもよく、また、光点の距離測定の良好な精度を有効にするために、好都合に、撮像システムにおける像の被写界深度の１倍より小さい距離でもよい。
例えば、パッシブ遠隔測定などの他の適用例において、検出面（あるいは検出面の共役）と撮像システム１０による対象となる対象物の面１１の共役像面１１’の距離は、位置精度を悪化させ、従っておおよそ被写界深度となる、像の被写界深度の１０倍あるいは２０倍までにも延ばすことができる。このような動作モードは、超解像を使用しなくても対象物の軸方向位置を知るために十分な、主にパッシブ遠隔測定で測定する場合に関心の対象となる。
従って、図１Ａおよび図１Ｂに示す例では、基準面PREFと概ね一致する対象となる対象物の面１１上に配置された光点P１の距離を測定可能なだけでなく、求める確度の関数として定義される長さ測定領域Lm内にそれらが位置することを条件として、基準面の両側に位置する光点P2および光点P3間の距離をも測定可能である。
遠隔測定装置は、光点Piから基準面PREFまでの距離を測定するために分離要素２０を含み、これにより光点Piから放出されて照明システム１０から出て来るビームB’から少なくとも二つの（図１Ａおよび図１Ｂに不図示の）コヒーレントビームを形成可能にし、先のコヒーレントビームは互いに作用し合う空間的に重なり合う領域を有する。
以下にてより詳細に説明する分離要素２０は、例えば、（図１Ａに例示する）検出面PDETあるいは（図１Ｂに例示する）検出面PDETの共役面P’DETに近接して位置する格子、好都合には二次元格子を含むことができる。また、残りの記載にて例示して説明するように分離要素２０は分離スライドまたは分離キューブも含むことができる。
分離要素は、検出面あるいは検出面の共役面が、分離要素から来るコヒーレントビームが相互に空間的重ね合わせ領域に位置するように配置されている。このため、分離要素から出てくるビームの干渉から生じる干渉パターンを伴う、撮像システム（PSF）のインパルス応答の畳み込み（convolution）である、各点光源点Piごとの像が検出器の検出面上に形成される。
分離要素のパラメータ（例えば、回折格子分離要素の場合には格子のピッチ、また分割スライド（splitter slide）型分離要素の場合には分割スライドの光学指数と厚さ）を選択することにより、干渉像の縞間（interfringe）を設定でき、また像の中に
により得られる撮像システムのインパルス応答の直径Φより好都合に小さい周期の変調をプリントできる。
ここで、ｒはPSFの半径であり、NAは撮像システムのデジタル口径であり、ｇｙは倍率である。以下にて詳細に説明するように、変調周期（つまり、干渉パターンの縞間（interfringe））は、撮像システム１０の目標空間における検出面PDETの共役面である基準面PREFに対する点光源の相対位置に依存する。よって、検出器と関連して説明した分離要素は、対象物の各点光源によって放射された波の相対曲率のセンサとしての役割を果たし、これにより対象物の相対的高低写像を細かく求められる。
図２Ａないし図２Ｄは、格子２１を含んだ分離要素の一つの例により実施された手法の原理をより詳細に示す。
格子２１は、好都合に二次元回折格子である。従って、一つの点光源に対して、独立した（格子の各軸に沿って一つずつ）２つの軸方向位置の測定値（例えば、基準面に対する距離測定値）を求めることができ、これにより軸方向の位置決め（localization）精度を向上させながらあらゆる光源分布（蛍光体の連続体、日常生活の情景等）を有することのできる像について測定を可能にする。
格子２１は、アセンブリでの送信時に、全入射光エネルギーの送信に適した実施例による透過回折格子、つまり、位相格子であるが、アセンブリの反射時に全入射光エネルギーの反射に適した変形反射回折格子による透過回折格子でも良い。これらの一つあるいは他の変形例は、三次元位置の信号対雑音比を最大にする。
好ましくは、ゼロ次回折をほとんど送信または反射しない透過格子または反射格子を選択しなければならない。これにより、各次の回折によって形成された干渉を光の波長から独立させることを可能にする。ゼロ次の排除は、例えば、一定期間に渡って導入された位相変動の変調をπ[２π]に調整することにより得られる。これは、例えば、格子の基板をエッチングまたは基板の指数を局所的に変更することにより行われる。ゼロ次を抑制するための別の可能性としては、格子のフーリエ空間におけるゼロ次を抑制することであるが、この場合、光子の損失が発生し、よって信号対雑音比が低下する。
格子のピッチpは、好ましくは、対象物の点光源の「像点」ごとに一つ以上の縞を形成するように選択される。ここで、超解像顕微鏡適用例などの場合のように、像点は撮像システムのインパルス応答あるいはPSFとマージさせる。一般に、像点の半径の三分の一から像点の半径の三倍の間に含まれる格子のピッチが、横方向のサンプリングの縞を十分にさせながらオーバーサンプリングを制限するために選択できる。一般に、ピッチpは像点ごとに２つの縞を有するように像点の直径のオーダーで選択できる。そして、超解像顕微鏡適用例では、rを上記の方程式（２）で得られるPSFの半径とすると、ピッチpはr/3と3rの間で、好ましくは2r程度である。
図２Ａないし図２Ｄは、回折格子２１を含む測定装置の場合の波の伝搬および、二つの異なる軸方向位置に配置された二つの点光源の場合の、検出面において横方向に測定した光度を一例として概略的に示す。
理論的実証を容易にするために、この例ではピッチpの一次元格子を想定し、また、この格子は＋１および−１の次数のみを回折するものと想定する。例えば、J.Primot他の開示において記載されているような複素振幅格子は、このような回折格子（”Extended Hartmann test based on the pseudoguiding property of a Hartmann mask completed by a phase chessboard”, Applied Optics, 39巻, 31号, 5715-5720ページ、2000年）を構成している。しかしながら実際には、より簡単に製造できる（Primot他で引用している論文などに記載されている「碁盤の目状の位相」を有する位相格子）ような、ゼロ次を除く全ての次数を回折する格子を選ぶこともあり、これにより光子の損失を防ぐことを可能にする。
図２Ｂおよび図２Ｄで見られるように、稿間Λの変化が点光源からの距離の関数として基準面（つまり、撮像システムの目標空間における検出面の共役面）で観察される。稿間（変調周期）の関係、および、基準面からの点光源の距離は、一例を用いて以下の通りに示す選択した回折格子のパラメータから理論的に求めることができる。
図２Ａおよび図２Ｃに示す例では、格子２１は検出面PDETから距離dに位置している。この例では、格子により符号B’1およびB’2を付して示す、それぞれ＋１および−１の次数に対応した二つの同位相の回折ビームの形成を可能にしている。格子２１は、＋１の次数の光を直接光の伝搬（つまり、図中で単純破線にて示す格子のゼロ次）に対してαの角度を付けて回折する。図２Ａおよび図２Ｃにおいて、回折次数１の検出面への到達点と、ゼロ次の（理論的）到達点との間の横方向オフセットは符号εを付して示す。横方向オフセットは、二つの同位相回折ビームB’1およびB’2で形成された二つの「レプリカ」の到達点間の横方向半オフセットに対応する。
ビームB’1およびB’2に対応する回折次数＋１および−１の波数ベクトルは、
として、それぞれ以下にて表す。
ここで、λは波長である。
Eは、検出器の検出面における点光源の像から来るスカラー電磁場を示す。
として表すことができる。ただし、ここで
とする。
方程式（３）を次数１までテイラー展開することにより、以下を推定する。
上記にて説明した事例においては、方程式（５）に示すように、ゼロ次が抑制された格子の選択は、特に強度信号の波長への依存を除くことができ、よって自身への色の影響を排除する。
上記の方程式（５）を求めるために使用する近似式は、z→dのときにピッチΛ→±∞となる。実際の事例においては、ガウスビーム法を考えることもでき、この場合z→dのときにS→0（よって、Λ→p/2）である。
図３は、ピッチ=20μmを有する図２Ａないし図２Ｄによって示すタイプの回折格子を用いた、それぞれε1=10μm（実線で表す曲線）と、ε2=4μm（点線で表す曲線）の二つの横方向オフセット値εの場合の、ガウス法を用いたzの関数としてのΛの変化を図示している。上記の値ε1=10μmおよびε2=4μmはそれぞれ格子と検出面との間の距離の値d1=200μmおよびd2=80μmに対応する。この曲線上で、測定した稿間Λは格子の半周期で正規化しており、距離zは被写界深度の関数として正規化している。
まず第一に、これら二つの曲線は、稿間の値を始点として点光源の像と検出器との間の距離zを求めることができることを示しており、従ってこの距離から撮像システムの像空間にける対象物の点光源と基準面との間の距離を推定できることを示す。また、図３における各曲線は、各レプリカ間の横方向半シフトεの値の関数とした曲線の形を示す。ここで横方向半シフトは格子と検出面との間の距離dに比例する。これらの曲線は、εを利用することにより測定可能な光軸に沿って領域を拡大できるが位置特定精度を失うことを示す。
全ての事例において、格子は好ましくは検出面に十分近い距離に配置され、このため各レプリカ間に導入した横方向オフセットは像点の直径より小さい。例として、超解像顕微鏡法適用例でのPSFの直径（φ、方程式（２））となる。換言すれば、
が得られるようにしたい。
不等式（６）は、選択した顕微鏡対象物に依存し、通常は10と50との間の値より小さいd/p比での顕微鏡対象物の選択の関数となる。このため、通常10と30μmとの間の格子ピッチについては、選択した顕微鏡対象物に応じて、10ミクロンと1mmとの間で変化し得る値より小さい距離dが選択される。
二つの格子次数を有する一次元格子の場合について記載しているが、図２Ａないし図２Ｄを用いて示す原理は、他の回折格子の例にも及び、特に各点光源につき二つの独立した軸方向測定値（各格子軸につき一つ）をもたらす二次元格子まで及ぶ。
図２Ａないし図２Ｄおよび図３を用いて示すように、像を形成している点光源の軸方向位置は、検出面上に形成されたインターフェログラムの周期または局部周波数を測定することにより得られる。
好都合に、各点光源の位置決めは、検出面に形成されたインターフェログラムの周期または局部周波数の測定値と、点光源の軸方向位置の関数としての周期または周波数の較正曲線とを比較することによって求まる。較正曲線は、理論的に（例えば図３に示す曲線として）あるいは軸方向位置がわかっている各点光源の像上で得た周波数の測定値から実験的に得ることができる。
実際には、検出器上で形成されたインターフェログラムの周期または局部周波数の測定値はいくつかの方法によって得ることができる。
測定は、インターフェログラムを表す関数（例えば、上記方程式（１）参照）を用いて、像の局部自動調節（調整）により直接空間（つまり、直接像上で）において行うことができる。これにより、インターフェログラムの局部周期にもどすことを可能にする。
また測定は、フーリエ空間における主ピーク、つまり、検討している像領域における局部周波数を見つけるために、局部フーリエ変換により行うことができる。
また代りにウェーブレット変換（先の二つの例の中間事例）を用いて行うこともできる。
もちろん、上記にて説明した回折格子は、例えば、空間光変調器（SLM）または可変鏡などの、等価位相および／または吸収機能を生じさせることのできるあらゆるシステムで置き換えることができる。しかしながら、SLMを用いると、偏向に対応する必要性があり、特に顕微鏡法適用例において有害な光子の損失へとつながる。可変鏡を用いるとアクチュエータ数の減少に制限されて、等価格子には過大な周期となる。
説明した曲率センサを形成するために、本明細書による装置に他の種類の分離要素を組み込んでもよい。このような分離要素で、点光源から放射された入射光を各ビームが干渉する空間的重ね合わせ領域を有する、少なくとも二つのコヒーレントビームに分離可能にすることには十分である。
図４Ａおよび図４Ｂは、本明細書による測定装置の二つの例を示す。図４Ａの例における分離要素は、マーティ（Murty）干渉計型のインターフェログラム・アセンブリを形成するための半反射スライドなどの分離スライド（separating slide）を含んでおり、図４Ｂの例における分離要素は、マッハツェンダー型干渉計を形成するための分離キューブを含んでいる。
図４Ａに示す遠隔測定装置３００は、図１Ｂに示す例と同様に、検出面PDETを有する二次元検出器３０および、検出面PDETの共役面P’DET近くの像面１１’における対象とした対象物面１１の点光源Piの像の形成に適した撮像システム１０を含んでいる。遠隔測定装置３００は、面P’DETを検出面PDETと共役にすることを可能にする光学リレー４０をさらに含んでいる。
図４Ａに示す例における遠隔測定装置３００は、例えば、指数nのガラス製スライドなどの厚さeの半反射スライド２２をさらに含んでいる。各ビームが干渉できる空間的重ね合わせ領域を有する、図４ＡにおいてB’1およびB’2として示す二つのコヒーレントビームを形成するように、半反射スライド２２は各ガラス−空気の界面上で部分反射できるように配置されている。図４Ａの例における半反射スライドは、撮像システムの光軸に対して４５度の角度を形成するように配置されて、これによりマーティ（Murty）干渉計として知られている干渉計を形成している。
格子の利用に基づく先に説明した理論上の記載のように、半反射スライド（ここでは検出器の面と一致している）のリレー撮像システム（４０）による像から距離zにある点光源の像により検出面上に形成されたインターフェログラムI(x)は以下のように表すこともできる。
（ガウス仮説）
ただし、この例におけるパラメータεは以下のように表す。
ここで、nはガラス製スライドを構成するガラスの指数であり、eはスライドの厚さである。
図４Ｂに示す遠隔測定装置４００は、図１Ｂに示す例と同様に、検出面PDETを有する二次元検出器３０および、検出面PDETの共役面P’DET近くの像面１１’における対象とした対象物面１１の点光源Piの像の形成に適した撮像システム１０を含んでいる。遠隔測定装置４００は、面P’DETを検出面PDETと共役にすることを可能にする光学リレーをさらに含んでいる。
この例における光学リレーは、二つの光学素子４１、４２を含んでおり、これらの間にはマッハツェンダー２干渉計によりここに形成されている分離要素が配置されている。この例における干渉計は、点光源Piを源とし、撮像システム１０から出て来るB’ビームから二つのコヒーレントビームB’1およびB’2の形成を可能にする分離プレートS1（または分離キューブ）を含んでいる。これらのビームは、それぞれ全反射鏡（M1,M2）を収容している二つの独立したアームへと伝搬する。これらのビームは、分離キューブ（またはスライド）S2を用いて再結合する。これらのビームは、図４Ｂにおいて明確となるようにそれらの光軸で表している。
先の例と同様に、ビームB’1とB’2との間に２εのオフセットが生じる。このズレを求めて、分離プレート（S1,S2）の一方を光軸と交差するように移動することにより、あるいは鏡（M1,M2）の一方を傾けることにより調整できる。マーティ干渉計の場合と同様の方程式（７）が得られる。
記載したこれら３つの分離要素の例のうち回折格子で、より安定した測定値を得ることができる。この理由は、互いに干渉し合う各コヒーレントビームの自由空間伝搬長さがより短く、また測定値に影響を及ぼす自由パラメータの数がより少ないという事実による。（特に、マーティ干渉計の場合の分離スライドの角度、および、マッハツェンダー干渉計の場合の鏡角度と半反射スライド。）また回折格子は、例えば、マッハツェンダーアセンブリではできなかった、点光源から来る全ての光子を用いることを可能にする。このため、分離要素として回折格子を使用することが好ましい。上記にて説明しているように、他の分離要素とは違って、格子はゼロ次を抑制するために無彩色干渉を形成可能にもする。
図５には、特に分子錯体から形成された生物試料の撮像のための、三次元顕微鏡撮像に適用される本明細書による装置例を図示して示す。平均的な大きさが小さい分子錯体では通常数ナノメートルから大半の立派な構造体については約100ナノメートルの錯体は、光信号を発することのできる蛍光プローブなどのプローブを使った既知の技術によって分類され、これによりその像を形成するために使用する光学システムの回折限界より小さい寸法を有する放出粒子を形成している。局在させるべき粒子は、例えばゲル状の、また例えば生体媒体の、液体または固体であっても良い包埋剤内で発達する。包埋剤は、ホルダ上に直接配置するか、スライド上に配置するか、ガラス製プレートなどの二枚のプレート間に保持してもよい。包埋剤およびその中で発達する放出粒子、また（各）保持プレートがあれば、これらは対象物Ｏ（図５）と表示している。
図５の例における三次元撮像装置５００は、好都合に、CCD, CMOSカメラ、EMCCD型の増幅カメラ（英語で”Electron Multiplying Coupled Charge Display”と表すものの略）、sCMOSカメラ、光電子増倍管のマトリックスを例としたマトリックス検出器などの検出器３０の検出面PDET上に放出粒子（つまり、点光源）の像を形成できる撮像システム１０を含んでいる。
この例における撮像システム１０は、筒レンズと呼ばれる対物レンズ１３と関連つけられた例えば、焦点-無限大動作の構成を有する光焦点に修正された顕微鏡対象物１２を含んでおり、中間検出面１１’上に像を形成可能としている。対象物顕微鏡と筒レンズアセンブリで典型的な顕微鏡光学システムを形成する。
撮像装置５００は、さらにリレーレンズ４０を含んで、撮像システム１０の像空間において検出器３０の検出面PDETの共役面P’DETを形成可能としている。ここで像面１１’は、共役面P’DETの近くに配置されている。放出粒子の寸法が非常に小さい（撮像システムの回折限界より小さい）ため、対象物と撮像システムあるいはPSFのインパルス応答とのコンボルーションである像は、ここでは概ねインパルス応答と一致する。電動式プラットフォーム（不図示）があってもよく、これによりサンプルＯが顕微鏡対象物の光軸に垂直なXY平面上で移動することを可能にする。機械的軸方向焦点装置（不図示）があってもよく、顕微鏡対象物１２の目標焦点面に対するサンプルの軸方向位置を調整し、これにより、関心の対象となる領域を撮像可能とする。サンプルホルダ、電動式プラットフォーム、軸方向焦点装置、顕微鏡対象物１２および筒レンズ１３は、公知の型の顕微鏡体６０内に配置されている。顕微鏡体は、従来の方法で集光装置と関連付けられたサンプルに光を当てるための源である接眼レンズも含むことがある。
図５の例において、顕微鏡体は倒立型（サンプルの下に顕微鏡対象物が位置する）のものであるが、正立顕微鏡（サンプルの上に顕微鏡対象物が位置する）であっても等しく問題が無い。
撮像装置５００は、検出器にて空間的重ね合わせ領域を有する少なくとも二つのコヒーレントビームを形成するために共役面P’DET近くに例えば、二次元格子などの分離要素２０も含んで、これにより本明細書による距離測定方法を実施する。
先に説明したように、格子は例えば、ゼロ次を抑制可能にし、そのピッチが検出器上に顕微鏡の横方向分解能より小さい周期の干渉を形成するように選択されている位相格子である。この格子は、光軸に対して垂直に配置されており、これらの間のコヒーレントレプリカが重ね合わされて互いに干渉し合えるようになっている。
図６Ａないし図６Ｃは、図５に示す装置タイプで超解像顕微鏡法を適用した例における、本明細書による方法を適用して異なるステージで得た像を示す。
対象物Ｏは、パラホルムアルデヒドで固定したCHO細胞（チャイニーズハムスター卵巣）の生物サンプルである。細胞骨格のチューブリンタンパク質は、蛍光抗体でラベル付けされた。各蛍光プローブは、アレクサ（Alexa）647型のものであり、Vectashield封入剤（ベクターラボラトリー社）と635nmのレーザを用いて明滅を得た、dSTORM技術を使用したCMOS型基質検出器３０を利用してサンプルを観察した。
図６Ａには、dSTORM取得の初期時点での蛍光像を示す。ここで、蛍光分子の密度は未だに重要であり、結果として蛍光発光の空間的連続をもたらす。しかしながら、干渉が既に見られる。図６Ｂは、発光密度がより低い取得した像の一部を拡大して示す。各コヒーレントレプリカ間の干渉から結果として生じる変調をその中で識別できる、単一蛍光エミッタの反応（量子ドット）が観察される。この変調の周期性は、上記にて説明した通り、基準面に対するエミッタの軸方向位置の測定を可能にする。横方向の配置は、その点のフィルタリング（ローパス周波数）により変調を抑制した後に、重心を利用してスポット（または像点）の中心を測定することにより、あるいは理想的には撮像システム１０のPSFを表すガウス分布（Gaussian）で点を調整することにより得られる。図６Ｃは、本明細書（６Ｂにおけるように）による、各エミッタの確率的明滅のおかげで、各蛍光エミッタの三次元位置特定を用いたことによるdSTORM再構築三次元像を示す。グレースケールは各エミッタの軸方向位置を表している。これらの像は、本手法を標準的な三次元撮像手法（例えば、PSF形状制御に基づく技術）ではうまく行かない蛍光連続体にも適用した場合を示す。
図７Ａ、７Ｂ、および７Ｃは、被写界深度に残った（すなわち、像の大きさに変化が無い）ままで、検出器の共役面に（７Ｂ）または検出器の共役面の前に（７Ｃ）または検出器の共役面の後ろ（７Ａ）に位置する（ナノ結晶半導体または量子ドット型の）単一蛍光エミッタが存在する場合に、５００型装備を利用して測定した光分布の実験的測定値を示す。被写界深度が範囲内にあるにもかかわらず(i)稿間Λはエミッタの軸方向位置の関数として変化すること、(ii) トランスミッタの像の寸法が従来のイメージングと比較して拡大（錯乱円）されていないことが明確に見られる。
比較として、図８Ａおよび８Ｂには、再びパラホルムアルデヒドで固定したCHO細胞（チャイニーズハムスター卵巣）の同じ生物サンプルを、標準的な落射蛍光（８Ａ）イメージング技術と本明細書において提案している技術を利用したdSTORM三次元イメージング（８Ｂ）で得られた実験的イメージを表している。８Ａに対する横方向分解能の増加（８Ｂ）および細胞骨格の三次元空間的発生をたどることを可能にする軸方向位置決めが明確に観察される。
さらに出願者らは、三次元顕微鏡法適用例に加えて、ある情景における対象物の距離を測定するために、本明細書による距離測定方法を「パッシブ」テレメトリ、つまり、飛行時間型測定なし、にも応用できることを示している。
図９には、測定装置６００から異なる距離に置かれているいくつかの対象物Ｏ１，Ｏ２を有する状況を示している。各対象物は、自然光で照射されており、これにより自然光は後方散乱されて対象物Ｏiの各点が点光源Piを形成している。
上記と同様に、装置６００は、検出面PDETを有する検出器３０、情景から検出面PDETの近くの像面への像の形成に適した撮像システム１０、例えば、検出面PDET近くの回折格子などの、各ビームが干渉する空間的重ね合わせ領域を有する少なくとも二つのコヒーレントビーム（「レプリカ」）の形成を可能にする分離要素２０を含んでいる。撮像システム１０は、例えば、無限遠で動作する光またはビデオレンズを含んでいる。
各点光源の軸方向位置の再構築は、撮像システムの被写界深度の数倍（から１０倍）の量（volume）で行うことができる。軸方向分解能は、被写界深度程度であり、後者の1/100までである。使用している光またはビデオレンズ（口径、焦点距離）に応じて、軸方向分解能と被写界深度の絶対値が変わる。対象物の種々の点の軸方向位置測定値の動きが、所定の情景における全ての対象となる対象物を包含するように、焦点距離を定めた口径を調節することが有利なこともある。つまり、対象となる各対象物が被写界深度の数倍内に含まれる。また、焦点距離と口径が固定されている場合、横方向オフセットの修正ε（例えば、格子を利用している場合、検出面に対して光軸に沿って平行移動）により、情景の全ての対象となる対象物を再構築するために、記載の技術を使用して軸方向位置測定値の動きの調整を可能にする。
この実施例における一つの点から別の点までの稿間の変化の測定値は、情景の構成要素の三次元プロフィールまでたどることを可能にする。
いくつかの詳細な実施例について記載しているが、本発明によるテレメトリおよび本方法を実施するための装置は種々の変更、改良および改善を含んでおり、これらの種々の変更、改良および改善は以下に定義した請求項に記載の発明の範囲の一部を形成することは当業者に明らかであることを理解されたい。

Claims (10)

  1. 基準面（PREF）に対する対象物（O）の光点（Pi）からの距離を測定する装置（100, 200, 300, 400, 500）であって、
    検出面（PDET）を含む二次元検出器（30）と、
    目標空間及び像空間を規定し、前記光点により放出されたビームから、前記像空間内に位置する新たなビームを生成する撮像システム（10）であって、前記像空間内の検出面（PDET）または検出面の共役面（P’DET）に近接して位置する像面（11’）に、対象となる目標面（11）上に位置する光点（Pi）からの像を形成するようになっており、前記像面（11’）は、前記対象となる目標面（１１）と共役であり、前記目標空間内の前記検出面の共役面は、前記基準面（P REF ）を規定する、撮像システム（10）と、
    前記新たなビームから、互いにコヒーレントで前記ビームが干渉する空間的重なり領域を有する少なくとも二つのビームの形成を可能にする、前記像空間に配置された分離要素（20）であって、前記像空間内の前記検出面（P DET ）または前記検出面の前記共役面（P’ DET ）は、前記領域に位置し、互いにコヒーレントな前記ビームの光学的干渉から生ずる干渉パターンは前記検出面に形成される、分離要素（20）と、
    前記検出面の共役面が前記基準面（PREF）を形成し、前記検出面に形成された干渉パターンの変調周期から、前記光点から前記基準面（P REF ）までの距離の測定を可能にする信号処理手段（50）
    とを含む装置。
  2. 形成された前記干渉パターンの縞の周期（Λ）は前記撮像システムの分解能より小さい、請求項１に記載の装置。
  3. 前記分離要素は前記像面（11’）に近接した回折格子（21）を含む、請求項１または２に記載の装置。
  4. 前記回折格子は二次元回折格子である、請求項３に記載の装置。
  5. 前記回折格子はゼロ次を伝送も反射もしない伝送または反射格子である、請求項３または４に記載の装置。
  6. 前記撮像システムの前記像空間に前記検出面の共役面を形成可能にする光リレー（40）をさらに含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の装置。
  7. 前記撮像システムが顕微鏡対象物（12）を含んでいる、三次元顕微鏡撮像に適用される請求項１から６のいずれか１項に記載の装置。
  8. 前記撮像システムは、光レンズまたはビデオレンズを含む、パッシブテレメトリに適用する請求項１から６のいずれか１項に記載の装置。
  9. 基準面（PREF）に対して対象となっている対象物（O）の光点（Pi）の距離を測定する方法であって、
    目標空間及び像空間を規定し、前記光点により放出されたビームから前記像空間内に位置する新たなビームを生成し、二次元検出器の前記検出面（PDET）、または前記検出面の共役面（P’DET）に近接して位置する像面（11’）上に、前記光点（Pi）から像を形成することと、
    前記光点（Pi）から放出されて前記撮像システム（10）から出て来るビーム（B’）から、分離要素（20）を用いて、互いにコヒーレントで干渉する空間的重なり領域を有する少なくとも二つのビーム（B’1,B’2）を形成することと、
    前記検出面（PDET）上に形成された、前記コヒーレントビーム間の光干渉によって生じた前記干渉パターンから、前記光点（Pi）から前記基準面（P REF ）までの距離を測定する
    ことを含み、
    前記像面（11’）は、前記対象となる像面（１１）と共役であり、前記目標空間内の前記検出面は、前記検出面（P DET ）を規定し、
    前記像空間内の前記検出面（P DET ）または前記検出面の前記共役面（P’ DET ）は、前記領域に位置し、互いにコヒーレントな前記ビームの光学的干渉から生ずる干渉パターンは、前記検出面（P DET ）に形成される方法。
  10. 前記光点（Pi）から前記基準面までの前記距離は、前記干渉パターンの各縞の周期（Λ）の測定値から得られる、請求項９に記載の方法。
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